引用本文： 徐瑩, 劉建亮, 趙玉澤, 王晨旭, 付忻澔, 李曉雙, 王曉莉, 趙巖松. 基于核苷酸結合的寡聚結構域1/受體相互作用蛋白2通路探討N-乙酰-5-羥色胺調控大鼠視網膜缺血再灌注后小膠質細胞極化的機制. 中華眼底病雜志, 2024, 40(4): 287-295. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20231007-00408 復制
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視網膜缺血再灌注損傷（RIRI）與青光眼、早產兒視網膜病變（ROP）及視網膜動脈阻塞等的發生密切相關[1-2]。小膠質細胞是視網膜的常駐巨噬細胞，神經細胞破壞時，小膠質細胞激活，并發揮吞噬、遷移和分泌多種細胞因子等多種功能[3]。研究表明，RIRI可激活小膠質細胞，并促進其向M1型極化、抑制其向M2型極化，激活炎癥反應[4]。因此，如能靶向調控小膠質細胞極化，可以抑制炎癥反應，減少RIRI后M1型小膠質極化或促進RIRI后M2型小膠質細胞極化，從而改善視網膜神經節細胞（RGC）損傷，并減輕組織損傷[5-6]。N-乙酰-5-羥色胺（NAS）屬于吲哚類激素，是褪黑素的前體物質，具有更強的抗炎療效。有文獻報道，褪黑素可調控小膠質細胞的極化減輕腦損傷，推測NAS可通過相同方式減輕RIRI[7]。核苷酸結合的寡聚結構域1（NOD1）/受體相互作用蛋白2（Rip2）通路在調節細胞炎癥反應方面發揮關鍵作用[8-9]。既往研究表明，組織缺血缺氧后，NOD1表達上調，激活下游的Rip2并誘導相關細胞因子產生，引起炎癥反應[10]；本課題組前期研究已證實NAS治療可減輕RIRI后炎癥反應，從而減少視網膜損傷[11]，但NAS能否下調NOD1/Rip2通路，調控小膠質細胞極化，減輕視網膜炎癥損傷尚未闡明。由此，本研究擬采用高眼壓法建立大鼠RIRI模型，轉錄組測序篩查并結合分子生物學方法鑒定差異基因，組織學染色結合分子生物學方法觀察NAS對RIRI大鼠視網膜小膠質細胞極化的影響，并基于NOD1/Rip2信號通路探討其機制，以期為NAS在視網膜損傷疾病的臨床應用提供理論依據。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 主要實驗材料、實驗動物分組及建模
NAS（美國Sigma公司）；兔抗NOD1、Rip2一抗（江蘇Affinity Biosciences公司），鼠抗腦特異性POU結構域同源盒基因3a（Brn-3a）、鼠抗精氨酸酶1（Arg1）、鼠抗離子鈣接頭蛋白1（Iba-1）、兔抗Fc段受體（CD16）一抗（美國 Santa Cruz公司）；抗兔或抗鼠二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）；兔抗Iba-1、鼠抗β-肌動蛋白（actin）（武漢三鷹生物技術有限公司）；二辛可寧酸（北京索萊寶科技有限公司）；正置光學顯微鏡（BX-51，日本Olympus公司）；高性能成像系統（美國Protein Simple公司）。
雄性Sprague Dawley大鼠60只，7～8周齡，體重200～220 g，無特定病原體級，濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供[許可證號：SCXK（魯）20220006]。飼養環境及實驗操作均符合國家科學技術委員會《實驗動物管理條例》規定，并獲得濰坊醫學院動物倫理委員會許可（倫理編號：2021SDL182）。采用隨機數字表法將大鼠分為假手術組（Sham組）、RIRI組、NAS組，分別為21、21、18只，以右眼為實驗眼。
RIRI組、NAS組大鼠按體重50 mg/kg的劑量腹腔注射10 g/L戊巴比妥鈉麻醉，鹽酸奧布卡因滴眼液局部麻醉。27G針頭沿角膜緣刺入前房并固定，針頭另一端連接生理鹽水瓶，升高垂直高度，使眼壓增至110 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），此時可見大鼠角膜水腫；直接檢眼鏡檢查可見視盤蒼白、視網膜血流中斷。維持前房加壓60 min后，視網膜血流恢復，建模成功。抗生素眼藥水點眼預防感染。Sham組大鼠僅將針頭自顳側角膜緣刺入右眼前房，不做其他處理。NAS組大鼠于建模前及建模后30 min按10 mg/（kg·次）的劑量腹腔注射NAS；Sham組、RIRI組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。
1.2 蘇木精-伊紅（HE）染色觀察大鼠視網膜組織病理變化并計數RGC
建模后24 h，各組取6只大鼠腹腔麻醉處死，摘除眼球并置于眼球固定液中固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，常規石蠟包埋。平行于視神經矢狀軸切片，厚度約4 μm。HE染色，光學顯微鏡下觀察大鼠視網膜細胞形態學變化。使用CellSens Dimension 1.6圖像分析軟件檢測并計算平均視網膜內層（內界膜至外叢狀層內緣）厚度和單位面積RGC數量。
1.3 轉錄組測序篩選Sham組、RIRI組大鼠差異基因
建模后24 h，Sham組、RIRI組分別各收集3只眼，提取視網膜總RNA，?80 ℃保存，上海鯨舟基因科技有限公司進行轉錄組測序。篩選各組顯著差異表達基因（DEG），篩選標準為|log2差異表達倍數|≥1且P≤0.05[12]。通過RSEM軟件（v1.2.12）計算基因表達水平，DESeq2軟件（v1.4.5）分析DEG。采用R軟件中pheatmap函數繪制聚類熱圖，分析DEG變化。對篩選出的DEG進行基因功能注釋和信號通路富集分析。
1.4 免疫組織化學染色檢測大鼠視網膜中NOD1、Rip2蛋白表達及RGC變化
建模后24 h，石蠟切片脫蠟至水，抗原修復后分別加入兔抗NOD1、Rip2一抗或鼠抗Brn-3a一抗過夜，沖洗，分別滴加抗兔或抗鼠二抗，顯色、染核、脫水、透明后封片。光學顯微鏡下觀察拍照并計數視網膜組織單位面積內NOD1+、Rip2+細胞數，以及神經節細胞層（GCL）Brn-3a+細胞數。
1.5 免疫熒光染色法檢測大鼠視網膜組織中小膠質細胞極化及小膠質細胞中NOD1、Rip2的表達
建模后24 h，石蠟切片脫蠟至水，抗原修復后，分別滴加Iba-1/Arg1、Iba-1/CD16、Iba-1/NOD1、Iba-1/Rip2一抗。４℃孵育過夜，分別滴加Alexa Fluor 488標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）與Alexa Fluor 594標記的山羊抗鼠IgG熒光二抗混合液，37 ℃孵育1 h，含4'，6-二脒基-2-苯基吲哚標記的熒光封片劑封片。熒光顯微鏡下觀察、拍照并計數視網膜單位面積GCL及內核層（INL）的Iba-1+CD16+與Iba-1+Arg1+細胞數，即M1型與M2型小膠質細胞數以及小膠質細胞中NOD1+、Rip2+細胞數。
1.6 蛋白質免疫印跡法（Western blot）檢測大鼠視網膜組織中NOD1、Rip2蛋白相對表達量
建模后24 h，取各組6只大鼠視網膜新鮮組織，二辛可寧酸法檢測NOD1、Rip2蛋白含量。10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，電轉膜、封閉后，分別加入兔抗NOD1、Rip2或鼠抗β-actin一抗，4 ℃孵育過夜，分別加入山羊抗兔或山羊抗鼠二抗。洗膜后，加入化學發光底物，應用高性能成像系統曝光、拍照，Image J軟件進行條帶灰度分析。以β-actin為內參照，通過分析目的蛋白與內參照灰度比值計算目的蛋白相對表達量
1.7 實時定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測大鼠視網膜組織和小膠質細胞中NOD1、Rip2 mRNA相對表達量
建模后24 h，提取各組6只大鼠視網膜總RNA，逆轉錄合成cDNA。采用20 μl體系，包括cDNA模板1 μl、無酶水8.2 μl、SYBR Premix熒光定量反應試劑10 μl，正向、反向引物各0.4 μl。應用Express 3.0軟件設計引物序列（表1）。反應條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，共40個循環。置于RT-PCR儀中進行擴增并輸出循環閾值（Cq值），以甘油醛-3-磷酸脫氫酶為內參照，依照公式2-ΔΔCq計算RNA相對表達量。
表1
基因擴增和測序引物
1.8 統計學方法
采用SPSS22.0軟件行統計分析。計量資料以均數±標準差（x±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析；方差齊性時，組間兩兩比較采用最小顯著差法檢驗。相關性分析采用 Pearson相關性分析結合一般線性回歸分析。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 NAS減輕RIRI大鼠視網膜損傷
HE染色結果顯示，Sham組大鼠視網膜組織各層細胞形態規則、排列整齊，視網膜厚度適中，可見大量RGC；建模后24 h，RIRI組大鼠視網膜組織各層細胞形態不規則、排列松散，GCL至INL出現視網膜水腫、RGC大量減少；與RIRI組比較，NAS組大鼠視網膜各層細胞排列整齊，視網膜水腫減輕（圖1A～1C）。免疫組織化學染色結果顯示，Sham組大鼠視網膜GCL可見大量Brn-3a+細胞；建模后24 h，RIRI組大鼠視網膜Brn-3a+細胞數顯著減少；與RIRI組比較，NAS組大鼠視網膜Brn-3a+細胞數顯著增加（圖1D～1F）。
圖1
NAS減輕RIRI大鼠視網膜的損傷
1A～1C分別示Sham組、RIRI組、NAS組HE染色光學顯微鏡像（×400），Sham組視網膜各層形態完整，細胞排列有序，可見大量RGC（1A）；RIRI組視網膜水腫，細胞排列紊亂，RGC大量減少（1B）；NAS組視網膜各層細胞排列較整齊，與RIRI組比較，RGC增加（1C）。 1D～1E分別示Sham組、RIRI組、NAS組免疫組織化學染色光學顯微鏡像（×400），Sham組大鼠視網膜GCL可見大量Brn-3a+細胞（紅箭）；RIRI組大鼠視網膜Brn-3a+細胞（紅箭）顯著減少；與RIRI組比較，NAS組大鼠視網膜Brn-3a+細胞（紅箭）顯著增加。1G～1I分別示Sham組、RIRI組、NAS組大鼠RGC數量、視網膜厚度、視網膜Brn-3a+細胞數量比較（
Sham組、RIRI組、NAS組大鼠視網膜內層厚度（F=18.206）以及RGC（F=105.182）、Brn-3a+（F=10.876）細胞數比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖1G~1I）。RIRI組與Sham組、NAS組兩兩比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。
2.2 NAS對RIRI大鼠小膠質細胞極化的影響
熒光顯微鏡觀察結果顯示，Sham組大鼠視網膜組織中可見少量M1、M2型小膠質細胞；建模后24 h，RIRI組大鼠視網膜組織中可見大量M1、M2型小膠質細胞，且顯著高于Sham組；與RIRI組比較，NAS組大鼠視網膜組織中M1型小膠質細胞數顯著減少，M2型小膠質細胞數顯著升高。三組大鼠視網膜M1、M2型小膠質細胞數比較，差異均有統計學意義（F= 42.056、359.971，P＜0.05）；RIRI組與Sham組、NAS組兩兩比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖2）。
圖2
NAS對大鼠小膠質細胞極化的影響
2A～2D分別示Sham組、RIRI組、NAS組M1型小膠質細胞免疫熒光顯微鏡像（×400）及細胞數量比較（
2.3 差異表達基因鑒定及驗證
轉錄組測序結果顯示，共篩選出1 620個DEG，其中上調基因813個，下調基因807個。Sham組、RIRI組同時表達的基因為1 585個，僅在Sham組、RIRI組表達的基因分別為11、24個（圖3A）。差異基因富集分析結果顯示，NOD樣受體等信號通路顯著性富集；建模后24 h，視網膜NOD1及其下游分子Rip2為重要差異基因（圖3B）。
圖3
差異表達基因鑒定
3A示聚類熱圖，紅色越深表示DEG表達水平越高，綠色越深表示DEG表達水平越低；3B示富集分析圖，圓點越大，基因權重越高 Sham：假手術；RIRI：視網膜缺血再灌注損傷；FC：差異倍數；VEGF：血管內皮生長因子；TNF：腫瘤壞死因子；TGF：轉化生長因子；PPAR：過氧化物酶體增殖物活化受體；PI3K-Akt：磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶；NF：核因子；MAPK：絲裂原活化蛋白激酶；JAK-STAT：酪氨酸激酶-信號轉導子和轉錄激活子；HIF：缺氧誘導因子；cAMP：環腺苷酸；AGE：晚期糖基化終末產物；RAGE：AGE受體
2.4 NAS抑制RIRI大鼠視網膜組織及小膠質細胞中NOD1、Rip2表達
RT-PCR、Western blot檢測結果顯示，建模后24 h，與Sham組比較，RIRI組大鼠視網膜中NOD1、Rip2 mRNA及蛋白相對表達量均顯著升高；與RIRI組比較，NAS組大鼠視網膜中NOD1、Rip2 mRNA及蛋白相對表達量均顯著降低。三組大鼠視網膜中NOD1、Rip2 mRNA及蛋白相對表達量比較，差異均有統計學意義（F=98.126、169.099，P＜0.05）；RIRI組與Sham組、NAS組兩兩比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖4）。
圖4
Sham組、RIRI組、NAS組大鼠視網膜中NOD1、Rip2 mRNA及蛋白相對表達量比較（n=3）
4A示NOD1、Rip2 mRNA相對表達量，**
免疫組織化學染色及免疫熒光染色結果顯示，建模后24 h，與Sham組比較，RIRI組大鼠視網膜組織及小膠質細胞中NOD1+、Rip2+細胞數顯著增多；與RIRI組比較，NAS組大鼠視網膜組織及小膠質細胞中NOD1+、Rip2+細胞數顯著減少，但仍顯著多于Sham組。各組大鼠視網膜組織（F=10.749、61.660）及小膠質細胞（F=60.571、103.499）中NOD1+、Rip2+細胞數比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；RIRI組與Sham組、NAS組兩兩比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖5，6）。
圖5
NAS抑制RIRI大鼠視網膜中NOD1、Rip2表達
5A～5D分別示Sham組、RIRI組、NAS組NOD1+細胞免疫組織化學染色光學顯微鏡像（×400）及細胞數量比較（
圖6
NAS抑制RIRI大鼠視網膜小膠質細胞中NOD1、Rip2表達
6A～6D分別示Sham組、RIRI組、NAS組NOD1+細胞免疫熒光染色熒光顯微鏡像（×400）及細胞數量比較（
2.5 NAS組及RIRI組大鼠視網膜中NOD1、Rip2表達與小膠質細胞極化的相關性
相關性分析結果顯示，建模后24 h，NAS組、RIRI組大鼠視網膜中NOD1+、Rip2+細胞數與M1型小膠質細胞數差值呈正相關（r=0.851、0.895），與M2型小膠質細胞數差值呈負相關（r=?0.797、?0.819），差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖7）。
圖7
NAS與RIRI組大鼠視網膜中NOD1+、Rip2+細胞數差值與M1、M2型小膠質細胞差值的相關性分析（n=6）
7A、7B和7C、7D分別示NOD1+、Rip2+細胞數差值與M1、M2型小膠質細胞差值分析結果 RIRI：視網膜缺血再灌注損傷；NAS：N-乙酰-5-羥色胺；NOD1：核苷酸結合的寡聚結構域1；Rip2：受體相互作用蛋白2
3 討論
RIRI是急性青光眼、早產兒視網膜病變等缺血性視網膜疾病的重要病理基礎，可嚴重損傷視力甚至最終致盲[13-14]。本研究通過前房高眼壓灌注法建立模型，模擬大鼠RIRI病理過程，分析其可能機制。結果顯示，RIRI后24 h，大鼠視網膜各層細胞形態不規則、排列松散，視網膜水腫、RGC減少。這說明RIRI模型建立成功。同時我們還發現，NAS干預后，視網膜組織各層細胞形態及排列改善，視網膜水腫減輕，RGC相對增多。這表明NAS干預可改善RIRI大鼠視網膜細胞形態，減輕RIRI，具有神經保護作用。
RIRI過程中會伴隨一系列炎癥反應，而小膠質細胞在此過程中扮演重要角色[15-16]。小膠質細胞作為視網膜中的常駐免疫細胞，具有免疫監視、維持視網膜微環境穩態的功能[17-18]。視網膜微環境中的小膠質細胞在RIRI后會從靜息狀態轉變為激活狀態。激活的小膠質細胞在視網膜局部缺氧微環境中發生極化，其中M1型小膠質細胞主要分泌炎癥因子，加重炎癥反應，M2型小膠質細胞分泌抑炎因子，發揮抑制炎癥的作用。鑒于NAS具有抗炎和神經保護作用，本研究探討NAS在RIRI中如何減輕炎癥反應，發揮其神經保護作用，為其臨床應用提供科學理論依據。Iba-1是小膠質細胞標記物，CD16、Arg1分別是M1、M2型小膠質細胞特異性標記物[5]。我們通過免疫熒光染色發現，RIRI組M1、M2型小膠質細胞數均較Sham組增多；NAS組M1型小膠質細胞較RIRI組顯著減少，M2型小膠質細胞較RIRI組顯著增多。這表明小膠質細胞參與了RIRI后的炎癥反應，NAS可以通過抑制小膠質細胞向M1表型極化來促進其向M2表型極化，進而減輕RIRI，但NAS調控小膠質細胞的機制仍需進一步研究。
為了研究RIRI發病機制，本研究對Sham組和RIRI組進行轉錄組測序獲得DEG，并進一步對信號通路進行富集分析。結果表明，大鼠RIRI后視網膜NOD1、Rip2為重要差異基因。NOD1是胞漿內先天免疫受體，參與胞內微生物的模式識別[19]，在感知病原體或組織損傷后，其自身構象發生改變形成受體復合物并通過相互作用與Rip2結合，進一步引起核因子-κB抑制蛋白的磷酸化降解，核因子-κB p65活化并轉位入細胞核內，促進白細胞介素-6和腫瘤壞死因子-α等炎癥基因的轉錄，誘導產生一系列炎癥反應[20-22]。與測序結果一致，RT-PCR、Western blot檢測結果顯示，建模后24 h，RIRI組大鼠視網膜中NOD1、Rip2 mRNA、蛋白相對表達量均顯著高于Sham組，NAS組大鼠視網膜NOD1及Rip2的mRNA、蛋白相對表達量均較RIRI組顯著降低；免疫組織化學及免疫熒光染色結果顯示，RIRI組大鼠視網膜組織及小膠質細胞中NOD1+、Rip2+細胞數均較Sham組顯著升高，NAS組大鼠視網膜組織及小膠質細胞中NOD1+、Rip2+細胞數均較RIRI組顯著降低。以上結果提示，NAS抑制了RIRI大鼠視網膜組織及小膠質細胞中NOD1、Rip2的表達。這表明RIRI后小膠質細胞活化并發生極化，明確小膠質細胞極化的機制并進行調控，對于RIRI的治療具有重要意義。Lin等[10]報道，在腦出血模型中給予NOD1或Rip2抑制劑可阻止小膠質細胞極化和神經炎癥，減輕腦損傷，提示NOD1/Rip2信號通路與小膠質細胞極化密切相關。本研究進一步對NAS組與RIRI組NOD1+、Rip2+細胞數差值分別同M1、M2型小膠質細胞數差值進行相關性分析。結果顯示，建模后24 h，NAS組及RIRI組大鼠視網膜中NOD1+、Rip2+細胞數差值均與M1型小膠質細胞數差值呈正相關，且與M2型小膠質細胞數差值呈負相關。這提示NAS可調控小膠質細胞極化，減輕視網膜RIRI，其機制與NOD1/Rip2通路相關。
本研究結果表明，NAS可促進RIRI大鼠視網膜小膠質細胞M2型極化，抑制其M1型極化，進而減輕大鼠RIRI，發揮神經保護作用，其機制與NOD1/Rip2通路相關，為NAS的臨床應用提供了理論依據。但有關NAS如何下調NOD1/Rip2通路，進而調控RIRI大鼠視網膜小膠質細胞極化尚有待進一步研究。
視網膜缺血再灌注損傷（RIRI）與青光眼、早產兒視網膜病變（ROP）及視網膜動脈阻塞等的發生密切相關[1-2]。小膠質細胞是視網膜的常駐巨噬細胞，神經細胞破壞時，小膠質細胞激活，并發揮吞噬、遷移和分泌多種細胞因子等多種功能[3]。研究表明，RIRI可激活小膠質細胞，并促進其向M1型極化、抑制其向M2型極化，激活炎癥反應[4]。因此，如能靶向調控小膠質細胞極化，可以抑制炎癥反應，減少RIRI后M1型小膠質極化或促進RIRI后M2型小膠質細胞極化，從而改善視網膜神經節細胞（RGC）損傷，并減輕組織損傷[5-6]。N-乙酰-5-羥色胺（NAS）屬于吲哚類激素，是褪黑素的前體物質，具有更強的抗炎療效。有文獻報道，褪黑素可調控小膠質細胞的極化減輕腦損傷，推測NAS可通過相同方式減輕RIRI[7]。核苷酸結合的寡聚結構域1（NOD1）/受體相互作用蛋白2（Rip2）通路在調節細胞炎癥反應方面發揮關鍵作用[8-9]。既往研究表明，組織缺血缺氧后，NOD1表達上調，激活下游的Rip2并誘導相關細胞因子產生，引起炎癥反應[10]；本課題組前期研究已證實NAS治療可減輕RIRI后炎癥反應，從而減少視網膜損傷[11]，但NAS能否下調NOD1/Rip2通路，調控小膠質細胞極化，減輕視網膜炎癥損傷尚未闡明。由此，本研究擬采用高眼壓法建立大鼠RIRI模型，轉錄組測序篩查并結合分子生物學方法鑒定差異基因，組織學染色結合分子生物學方法觀察NAS對RIRI大鼠視網膜小膠質細胞極化的影響，并基于NOD1/Rip2信號通路探討其機制，以期為NAS在視網膜損傷疾病的臨床應用提供理論依據。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 主要實驗材料、實驗動物分組及建模
NAS（美國Sigma公司）；兔抗NOD1、Rip2一抗（江蘇Affinity Biosciences公司），鼠抗腦特異性POU結構域同源盒基因3a（Brn-3a）、鼠抗精氨酸酶1（Arg1）、鼠抗離子鈣接頭蛋白1（Iba-1）、兔抗Fc段受體（CD16）一抗（美國 Santa Cruz公司）；抗兔或抗鼠二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）；兔抗Iba-1、鼠抗β-肌動蛋白（actin）（武漢三鷹生物技術有限公司）；二辛可寧酸（北京索萊寶科技有限公司）；正置光學顯微鏡（BX-51，日本Olympus公司）；高性能成像系統（美國Protein Simple公司）。
雄性Sprague Dawley大鼠60只，7～8周齡，體重200～220 g，無特定病原體級，濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供[許可證號：SCXK（魯）20220006]。飼養環境及實驗操作均符合國家科學技術委員會《實驗動物管理條例》規定，并獲得濰坊醫學院動物倫理委員會許可（倫理編號：2021SDL182）。采用隨機數字表法將大鼠分為假手術組（Sham組）、RIRI組、NAS組，分別為21、21、18只，以右眼為實驗眼。
RIRI組、NAS組大鼠按體重50 mg/kg的劑量腹腔注射10 g/L戊巴比妥鈉麻醉，鹽酸奧布卡因滴眼液局部麻醉。27G針頭沿角膜緣刺入前房并固定，針頭另一端連接生理鹽水瓶，升高垂直高度，使眼壓增至110 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），此時可見大鼠角膜水腫；直接檢眼鏡檢查可見視盤蒼白、視網膜血流中斷。維持前房加壓60 min后，視網膜血流恢復，建模成功。抗生素眼藥水點眼預防感染。Sham組大鼠僅將針頭自顳側角膜緣刺入右眼前房，不做其他處理。NAS組大鼠于建模前及建模后30 min按10 mg/（kg·次）的劑量腹腔注射NAS；Sham組、RIRI組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。
1.2 蘇木精-伊紅（HE）染色觀察大鼠視網膜組織病理變化并計數RGC
建模后24 h，各組取6只大鼠腹腔麻醉處死，摘除眼球并置于眼球固定液中固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，常規石蠟包埋。平行于視神經矢狀軸切片，厚度約4 μm。HE染色，光學顯微鏡下觀察大鼠視網膜細胞形態學變化。使用CellSens Dimension 1.6圖像分析軟件檢測并計算平均視網膜內層（內界膜至外叢狀層內緣）厚度和單位面積RGC數量。
1.3 轉錄組測序篩選Sham組、RIRI組大鼠差異基因
建模后24 h，Sham組、RIRI組分別各收集3只眼，提取視網膜總RNA，?80 ℃保存，上海鯨舟基因科技有限公司進行轉錄組測序。篩選各組顯著差異表達基因（DEG），篩選標準為|log2差異表達倍數|≥1且P≤0.05[12]。通過RSEM軟件（v1.2.12）計算基因表達水平，DESeq2軟件（v1.4.5）分析DEG。采用R軟件中pheatmap函數繪制聚類熱圖，分析DEG變化。對篩選出的DEG進行基因功能注釋和信號通路富集分析。
1.4 免疫組織化學染色檢測大鼠視網膜中NOD1、Rip2蛋白表達及RGC變化
建模后24 h，石蠟切片脫蠟至水，抗原修復后分別加入兔抗NOD1、Rip2一抗或鼠抗Brn-3a一抗過夜，沖洗，分別滴加抗兔或抗鼠二抗，顯色、染核、脫水、透明后封片。光學顯微鏡下觀察拍照并計數視網膜組織單位面積內NOD1+、Rip2+細胞數，以及神經節細胞層（GCL）Brn-3a+細胞數。
1.5 免疫熒光染色法檢測大鼠視網膜組織中小膠質細胞極化及小膠質細胞中NOD1、Rip2的表達
建模后24 h，石蠟切片脫蠟至水，抗原修復后，分別滴加Iba-1/Arg1、Iba-1/CD16、Iba-1/NOD1、Iba-1/Rip2一抗。４℃孵育過夜，分別滴加Alexa Fluor 488標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）與Alexa Fluor 594標記的山羊抗鼠IgG熒光二抗混合液，37 ℃孵育1 h，含4'，6-二脒基-2-苯基吲哚標記的熒光封片劑封片。熒光顯微鏡下觀察、拍照并計數視網膜單位面積GCL及內核層（INL）的Iba-1+CD16+與Iba-1+Arg1+細胞數，即M1型與M2型小膠質細胞數以及小膠質細胞中NOD1+、Rip2+細胞數。
1.6 蛋白質免疫印跡法（Western blot）檢測大鼠視網膜組織中NOD1、Rip2蛋白相對表達量
建模后24 h，取各組6只大鼠視網膜新鮮組織，二辛可寧酸法檢測NOD1、Rip2蛋白含量。10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，電轉膜、封閉后，分別加入兔抗NOD1、Rip2或鼠抗β-actin一抗，4 ℃孵育過夜，分別加入山羊抗兔或山羊抗鼠二抗。洗膜后，加入化學發光底物，應用高性能成像系統曝光、拍照，Image J軟件進行條帶灰度分析。以β-actin為內參照，通過分析目的蛋白與內參照灰度比值計算目的蛋白相對表達量
1.7 實時定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測大鼠視網膜組織和小膠質細胞中NOD1、Rip2 mRNA相對表達量
建模后24 h，提取各組6只大鼠視網膜總RNA，逆轉錄合成cDNA。采用20 μl體系，包括cDNA模板1 μl、無酶水8.2 μl、SYBR Premix熒光定量反應試劑10 μl，正向、反向引物各0.4 μl。應用Express 3.0軟件設計引物序列（表1）。反應條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，共40個循環。置于RT-PCR儀中進行擴增并輸出循環閾值（Cq值），以甘油醛-3-磷酸脫氫酶為內參照，依照公式2-ΔΔCq計算RNA相對表達量。
表1
基因擴增和測序引物
1.8 統計學方法
采用SPSS22.0軟件行統計分析。計量資料以均數±標準差（x±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析；方差齊性時，組間兩兩比較采用最小顯著差法檢驗。相關性分析采用 Pearson相關性分析結合一般線性回歸分析。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 NAS減輕RIRI大鼠視網膜損傷
HE染色結果顯示，Sham組大鼠視網膜組織各層細胞形態規則、排列整齊，視網膜厚度適中，可見大量RGC；建模后24 h，RIRI組大鼠視網膜組織各層細胞形態不規則、排列松散，GCL至INL出現視網膜水腫、RGC大量減少；與RIRI組比較，NAS組大鼠視網膜各層細胞排列整齊，視網膜水腫減輕（圖1A～1C）。免疫組織化學染色結果顯示，Sham組大鼠視網膜GCL可見大量Brn-3a+細胞；建模后24 h，RIRI組大鼠視網膜Brn-3a+細胞數顯著減少；與RIRI組比較，NAS組大鼠視網膜Brn-3a+細胞數顯著增加（圖1D～1F）。
圖1
NAS減輕RIRI大鼠視網膜的損傷
1A～1C分別示Sham組、RIRI組、NAS組HE染色光學顯微鏡像（×400），Sham組視網膜各層形態完整，細胞排列有序，可見大量RGC（1A）；RIRI組視網膜水腫，細胞排列紊亂，RGC大量減少（1B）；NAS組視網膜各層細胞排列較整齊，與RIRI組比較，RGC增加（1C）。 1D～1E分別示Sham組、RIRI組、NAS組免疫組織化學染色光學顯微鏡像（×400），Sham組大鼠視網膜GCL可見大量Brn-3a+細胞（紅箭）；RIRI組大鼠視網膜Brn-3a+細胞（紅箭）顯著減少；與RIRI組比較，NAS組大鼠視網膜Brn-3a+細胞（紅箭）顯著增加。1G～1I分別示Sham組、RIRI組、NAS組大鼠RGC數量、視網膜厚度、視網膜Brn-3a+細胞數量比較（
Sham組、RIRI組、NAS組大鼠視網膜內層厚度（F=18.206）以及RGC（F=105.182）、Brn-3a+（F=10.876）細胞數比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖1G~1I）。RIRI組與Sham組、NAS組兩兩比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。
2.2 NAS對RIRI大鼠小膠質細胞極化的影響
熒光顯微鏡觀察結果顯示，Sham組大鼠視網膜組織中可見少量M1、M2型小膠質細胞；建模后24 h，RIRI組大鼠視網膜組織中可見大量M1、M2型小膠質細胞，且顯著高于Sham組；與RIRI組比較，NAS組大鼠視網膜組織中M1型小膠質細胞數顯著減少，M2型小膠質細胞數顯著升高。三組大鼠視網膜M1、M2型小膠質細胞數比較，差異均有統計學意義（F= 42.056、359.971，P＜0.05）；RIRI組與Sham組、NAS組兩兩比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖2）。
圖2
NAS對大鼠小膠質細胞極化的影響
2A～2D分別示Sham組、RIRI組、NAS組M1型小膠質細胞免疫熒光顯微鏡像（×400）及細胞數量比較（
2.3 差異表達基因鑒定及驗證
轉錄組測序結果顯示，共篩選出1 620個DEG，其中上調基因813個，下調基因807個。Sham組、RIRI組同時表達的基因為1 585個，僅在Sham組、RIRI組表達的基因分別為11、24個（圖3A）。差異基因富集分析結果顯示，NOD樣受體等信號通路顯著性富集；建模后24 h，視網膜NOD1及其下游分子Rip2為重要差異基因（圖3B）。
圖3
差異表達基因鑒定
3A示聚類熱圖，紅色越深表示DEG表達水平越高，綠色越深表示DEG表達水平越低；3B示富集分析圖，圓點越大，基因權重越高 Sham：假手術；RIRI：視網膜缺血再灌注損傷；FC：差異倍數；VEGF：血管內皮生長因子；TNF：腫瘤壞死因子；TGF：轉化生長因子；PPAR：過氧化物酶體增殖物活化受體；PI3K-Akt：磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶；NF：核因子；MAPK：絲裂原活化蛋白激酶；JAK-STAT：酪氨酸激酶-信號轉導子和轉錄激活子；HIF：缺氧誘導因子；cAMP：環腺苷酸；AGE：晚期糖基化終末產物；RAGE：AGE受體
2.4 NAS抑制RIRI大鼠視網膜組織及小膠質細胞中NOD1、Rip2表達
RT-PCR、Western blot檢測結果顯示，建模后24 h，與Sham組比較，RIRI組大鼠視網膜中NOD1、Rip2 mRNA及蛋白相對表達量均顯著升高；與RIRI組比較，NAS組大鼠視網膜中NOD1、Rip2 mRNA及蛋白相對表達量均顯著降低。三組大鼠視網膜中NOD1、Rip2 mRNA及蛋白相對表達量比較，差異均有統計學意義（F=98.126、169.099，P＜0.05）；RIRI組與Sham組、NAS組兩兩比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖4）。
圖4
Sham組、RIRI組、NAS組大鼠視網膜中NOD1、Rip2 mRNA及蛋白相對表達量比較（n=3）
4A示NOD1、Rip2 mRNA相對表達量，**
免疫組織化學染色及免疫熒光染色結果顯示，建模后24 h，與Sham組比較，RIRI組大鼠視網膜組織及小膠質細胞中NOD1+、Rip2+細胞數顯著增多；與RIRI組比較，NAS組大鼠視網膜組織及小膠質細胞中NOD1+、Rip2+細胞數顯著減少，但仍顯著多于Sham組。各組大鼠視網膜組織（F=10.749、61.660）及小膠質細胞（F=60.571、103.499）中NOD1+、Rip2+細胞數比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；RIRI組與Sham組、NAS組兩兩比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖5，6）。
圖5
NAS抑制RIRI大鼠視網膜中NOD1、Rip2表達
5A～5D分別示Sham組、RIRI組、NAS組NOD1+細胞免疫組織化學染色光學顯微鏡像（×400）及細胞數量比較（
圖6
NAS抑制RIRI大鼠視網膜小膠質細胞中NOD1、Rip2表達
6A～6D分別示Sham組、RIRI組、NAS組NOD1+細胞免疫熒光染色熒光顯微鏡像（×400）及細胞數量比較（
2.5 NAS組及RIRI組大鼠視網膜中NOD1、Rip2表達與小膠質細胞極化的相關性
相關性分析結果顯示，建模后24 h，NAS組、RIRI組大鼠視網膜中NOD1+、Rip2+細胞數與M1型小膠質細胞數差值呈正相關（r=0.851、0.895），與M2型小膠質細胞數差值呈負相關（r=?0.797、?0.819），差異均有統計學意義（P＜0.05）（圖7）。
圖7
NAS與RIRI組大鼠視網膜中NOD1+、Rip2+細胞數差值與M1、M2型小膠質細胞差值的相關性分析（n=6）
7A、7B和7C、7D分別示NOD1+、Rip2+細胞數差值與M1、M2型小膠質細胞差值分析結果 RIRI：視網膜缺血再灌注損傷；NAS：N-乙酰-5-羥色胺；NOD1：核苷酸結合的寡聚結構域1；Rip2：受體相互作用蛋白2
3 討論
RIRI是急性青光眼、早產兒視網膜病變等缺血性視網膜疾病的重要病理基礎，可嚴重損傷視力甚至最終致盲[13-14]。本研究通過前房高眼壓灌注法建立模型，模擬大鼠RIRI病理過程，分析其可能機制。結果顯示，RIRI后24 h，大鼠視網膜各層細胞形態不規則、排列松散，視網膜水腫、RGC減少。這說明RIRI模型建立成功。同時我們還發現，NAS干預后，視網膜組織各層細胞形態及排列改善，視網膜水腫減輕，RGC相對增多。這表明NAS干預可改善RIRI大鼠視網膜細胞形態，減輕RIRI，具有神經保護作用。
RIRI過程中會伴隨一系列炎癥反應，而小膠質細胞在此過程中扮演重要角色[15-16]。小膠質細胞作為視網膜中的常駐免疫細胞，具有免疫監視、維持視網膜微環境穩態的功能[17-18]。視網膜微環境中的小膠質細胞在RIRI后會從靜息狀態轉變為激活狀態。激活的小膠質細胞在視網膜局部缺氧微環境中發生極化，其中M1型小膠質細胞主要分泌炎癥因子，加重炎癥反應，M2型小膠質細胞分泌抑炎因子，發揮抑制炎癥的作用。鑒于NAS具有抗炎和神經保護作用，本研究探討NAS在RIRI中如何減輕炎癥反應，發揮其神經保護作用，為其臨床應用提供科學理論依據。Iba-1是小膠質細胞標記物，CD16、Arg1分別是M1、M2型小膠質細胞特異性標記物[5]。我們通過免疫熒光染色發現，RIRI組M1、M2型小膠質細胞數均較Sham組增多；NAS組M1型小膠質細胞較RIRI組顯著減少，M2型小膠質細胞較RIRI組顯著增多。這表明小膠質細胞參與了RIRI后的炎癥反應，NAS可以通過抑制小膠質細胞向M1表型極化來促進其向M2表型極化，進而減輕RIRI，但NAS調控小膠質細胞的機制仍需進一步研究。
為了研究RIRI發病機制，本研究對Sham組和RIRI組進行轉錄組測序獲得DEG，并進一步對信號通路進行富集分析。結果表明，大鼠RIRI后視網膜NOD1、Rip2為重要差異基因。NOD1是胞漿內先天免疫受體，參與胞內微生物的模式識別[19]，在感知病原體或組織損傷后，其自身構象發生改變形成受體復合物并通過相互作用與Rip2結合，進一步引起核因子-κB抑制蛋白的磷酸化降解，核因子-κB p65活化并轉位入細胞核內，促進白細胞介素-6和腫瘤壞死因子-α等炎癥基因的轉錄，誘導產生一系列炎癥反應[20-22]。與測序結果一致，RT-PCR、Western blot檢測結果顯示，建模后24 h，RIRI組大鼠視網膜中NOD1、Rip2 mRNA、蛋白相對表達量均顯著高于Sham組，NAS組大鼠視網膜NOD1及Rip2的mRNA、蛋白相對表達量均較RIRI組顯著降低；免疫組織化學及免疫熒光染色結果顯示，RIRI組大鼠視網膜組織及小膠質細胞中NOD1+、Rip2+細胞數均較Sham組顯著升高，NAS組大鼠視網膜組織及小膠質細胞中NOD1+、Rip2+細胞數均較RIRI組顯著降低。以上結果提示，NAS抑制了RIRI大鼠視網膜組織及小膠質細胞中NOD1、Rip2的表達。這表明RIRI后小膠質細胞活化并發生極化，明確小膠質細胞極化的機制并進行調控，對于RIRI的治療具有重要意義。Lin等[10]報道，在腦出血模型中給予NOD1或Rip2抑制劑可阻止小膠質細胞極化和神經炎癥，減輕腦損傷，提示NOD1/Rip2信號通路與小膠質細胞極化密切相關。本研究進一步對NAS組與RIRI組NOD1+、Rip2+細胞數差值分別同M1、M2型小膠質細胞數差值進行相關性分析。結果顯示，建模后24 h，NAS組及RIRI組大鼠視網膜中NOD1+、Rip2+細胞數差值均與M1型小膠質細胞數差值呈正相關，且與M2型小膠質細胞數差值呈負相關。這提示NAS可調控小膠質細胞極化，減輕視網膜RIRI，其機制與NOD1/Rip2通路相關。
本研究結果表明，NAS可促進RIRI大鼠視網膜小膠質細胞M2型極化，抑制其M1型極化，進而減輕大鼠RIRI，發揮神經保護作用，其機制與NOD1/Rip2通路相關，為NAS的臨床應用提供了理論依據。但有關NAS如何下調NOD1/Rip2通路，進而調控RIRI大鼠視網膜小膠質細胞極化尚有待進一步研究。
