光遺傳學技術以精準調控細胞活動的能力，在眼科領域展現出獨特的應用價值。通過光敏蛋白基因的精確導入，光遺傳學實現了對視網膜細胞功能的光控激活或抑制，為不可逆性視力損害提供了新的治療策略。在視網膜退行性疾病和視神經損害性疾病的治療中，光遺傳學已展現出顯著的療效，該技術在視覺功能研究中亦取得突破性進展。此外，光遺傳學技術與光控干細胞技術和光控基因編輯技術的結合，揭示了其在臨床轉化中的巨大潛力。隨著科技進步和臨床實踐的深入，光遺傳學在眼科領域的應用前景廣闊，有望為視覺障礙患者帶來創新性的治療策略。
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視網膜退行性疾病和視神經損害性疾病，如視網膜色素變性（RP）、年齡相關性黃斑變性（AMD）和青光眼，是導致全球不可逆性視力損害的主要原因[1]。目前，AMD的抗血管內皮生長因子（VEGF）治療和青光眼的降眼壓治療雖能緩解癥狀，無法逆轉疾病進程。RP的營養神經和抗炎療法治療效果有限，受損細胞的感光功能難以恢復。盡管基因治療在一些視網膜疾病中可改善視覺功能的潛力，但受限于特定基因型[2-3]。干細胞治療由于其潛在的定向分化能力和自我更新能力而備受關注，但存在腫瘤形成的風險[4]。因此，開發新型、高效且安全的治療策略已成為醫學研究的迫切需求。光遺傳學融合了光控技術與基因工程，能夠精準調控特定細胞的功能，為神經科學的研究提供了全新視角[5-6]。近年來，隨著光遺傳學的不斷創新與拓展，其在眼科疾病研究與治療方面的潛力逐漸顯露[5]。眼的自然透光特性為光遺傳學提供了理想的應用平臺，無需侵入性手術即可實現對視網膜細胞信號轉導的精準控制，為視力的恢復和改善開辟了新途徑。現就光遺傳學技術在眼科應用的研究進展作一綜述。
1 光遺傳學技術原理
光遺傳學將編碼特定光敏蛋白的基因片段精確導入非感光神經細胞中，使原本對光無反應的細胞表達出光敏通道蛋白，當特定波長的光照射時，觸發細胞內的電生理反應，激活或抑制細胞活動[7]。光遺傳學的時間分辨率達到毫秒級別，且能特異性作用于特定類型的細胞，為復雜生物系統的精確調控提供了可能性[8]。
1.1 光敏蛋白的發現和改良
光敏蛋白是光遺傳學技術的核心，最初在細菌和藻類中被發現，微生物利用光敏蛋白進行光合作用和光感應[9]。視紫紅質因其在視網膜中感知光線并觸發視覺信號傳遞的關鍵作用，成為研究的焦點[10]。Boyden等[11]將綠藻來源的通道視紫紅質（ChR）2引入哺乳動物神經元，實現了光控神經元活動，標志著光遺傳學的誕生。
光遺傳學通過激活型和抑制型光敏蛋白調控神經元活動。激活型光敏蛋白如ChR2及其突變體、衣藻和團藻來源的ChR1的嵌合突變體和嗜鹽菌來源的ChR等，本質上是陽離子通道蛋白，接收光信號后促使陽離子流入細胞內，引發去極化和動作電位[12-15]。抑制型光敏蛋白如第三代光驅動內向氯泵、嗜鹽菌來源的光驅動外向質子泵以及真菌來源的藍色激光激活的質子泵等，其激活導致陰離子流入或質子泵出，引起超極化，抑制動作電位[16-17]。光敏蛋白按照來源分為微生物視蛋白和動物視蛋白，它們功能上存在一定的差異[1]。微生物視蛋白通常不參與視覺過程，主要在光能的感應和利用中發揮作用，對微生物的能量代謝和生理活動至關重要[18-20]。動物視蛋白則在視覺成像中扮演重要角色，同時參與調節生物體晝夜節律的非視覺活動[21-23]。
光遺傳學的革新與進步促進了光敏蛋白的優化與改良，提升了光敏蛋白的性能并拓寬了其應用領域。最初的ChR2盡管功能強大，但在光敏度、選擇性及效率方面存在局限性[24]。新型光敏蛋白通過蛋白質工程改良后顯著優化了光譜特性，降低了暗電流，具有更高的光學靈敏度，同時保留了優異的時間精度[25-29]。在眼科應用中，微生物來源的光敏蛋白如ChR、光敏氯離子泵等，以及動物視蛋白如黑視蛋白、中波敏感視蛋白和視桿細胞來源的視紫紅質等，均在視覺恢復中展現出有效潛力[21-23, 30-31]。動物視蛋白具有低免疫原性和低光強度需求，為視覺恢復提供了更為安全、溫和的治療選擇[22]。
1.2 光遺傳學工具的基因傳遞策略
將光敏感蛋白精準導入目標細胞是光遺傳學技術應用的關鍵。基因載體的選擇直接關系到傳遞的效率與成功率。病毒載體因其高效性和穩定性，在光遺傳學中被廣泛采用。病毒載體具備卓越的轉染能力和基因攜帶能力，能夠有效地將光敏蛋白基因片段傳遞至目標細胞[32]。腺相關病毒（AAV）因其低免疫原性、高組織特異性和低致病性成為首選的病毒載體[33]。
非病毒載體，如DNA納米復合體，脂質載體和陽離子聚合物載體等，通過親水或疏水的離子、多肽、脂質等物質聚合包裹DNA形成穩定的復合體，以提高基因的穩定性和細胞內遞送效率[34]。盡管非病毒載體具有較高的安全性及較大的基因載荷容量，但較低的傳遞效率限制了其在光遺傳學中的廣泛應用[35]。
基因編輯技術，如成簇的規律間隔的短回文重復序列（CRISPR）和CRISPR相關蛋白9（Cas9）系統和遠紅光激活的分裂Cas9系統，精準且高效，為光遺傳學提供新的研究思路[36-38]。這些技術不僅能使光敏感蛋白基因在目標細胞的基因組中精確整合，還能長期穩定表達[36]。Chen等[39]利用AAV-CRISPR-Cas9系統成功治療了由RPGR基因突變引起的視網膜退行性病變。
2 光遺傳學在視網膜和視神經疾病中的應用
2.1 光遺傳學治療遺傳性視網膜退行性疾病
遺傳性視網膜退行性疾病中，RP較為常見，其他包括Leber氏先天黑矇（LCA）和Stargardt黃斑營養不良（SD）等，這些疾病的共性特征是光感受器細胞的進行性損傷與死亡，導致患者視力損害和失明[40]。然而，盡管患者失去了大部分光感受器細胞，但視網膜內層結構如雙極細胞（RBC）和神經節細胞（RGC）仍長期保持相對完整[41-42]。光遺傳學賦予原本非感光的RBC或RGC光響應能力，為遺傳性視網膜退行性疾病提供了新治療路徑。
RP的全球平均患病率介于1/7 000～1/3 000，影響著數百萬人的視力健康[43]。研究表明，RP小鼠模型中表達光敏蛋白ChR2，可在視覺皮質區域觀察到光誘發電位的恢復[44]；Lin等[45]進一步利用哺乳動物的黑視蛋白恢復了RP小鼠的部分視覺功能，如瞳孔光反射和光回避行為。Gaub等[46]研究表明，與微生物視紫紅質通道蛋白相比，哺乳動物視紫紅質蛋白在提高光敏感性方面具有顯著優勢。Ameline等[47]研究報道，犬退化視網膜中長期表達光敏蛋白的安全性，為光遺傳學治療晚期視網膜退化提供了初步證據。Sahel等[48]通過光遺傳學結合特制激發眼鏡成功恢復了1例失明RP患者的部分視覺功能，為RP的治療提供了新的參考。
相較于傳統基因治療，光遺傳學的優勢在于其廣泛適用性，不受特定基因突變類型限制。光遺傳學不僅在RP治療中具有巨大潛力，同樣適用于SD和LCA等遺傳性視網膜疾病。SD通常在兒童或青少年時期發病，影響黃斑區域，導致中心視力下降[49]。多特征視蛋白（MCO）是光遺傳學療法MCO-010的核心成分。臨床試驗表明，玻璃體腔注射MCO至LCA患者視網膜細胞，結果發現MCO-010具有良好的耐受性，未引起嚴重不良事件，患者的視力得到改善，日常生活能力有所提升[50]。LCA患者的光感受器細胞經歷漸進性的退化和死亡，導致嚴重的視力減退或失明[51]。研究表明，在LCA小鼠模型中，MCO-010治療顯著減輕了視網膜細胞損失，提升了視力，且耐受性良好[52]。
2.2 光遺傳學治療年齡相關性視網膜退行性疾病
年齡相關性視網膜退行性疾病的典型代表是AMD，該病是全球50歲以上老年人視力喪失的主要原因之一[4, 53]。AMD晚期分為新生血管性AMD（nAMD）與“地圖樣”萎縮（GA）。nAMD以脈絡膜新生血管（CNV）為特征，導致黃斑區視網膜損傷及中心視力急劇下降。抗VEGF療法可在一定程度上改善nAMD患者的視功能[53]。GA的核心表現為視網膜色素上皮（RPE）細胞與光感受器細胞的萎縮，進而引發外層視網膜退化[54]。目前GA的治療集中在C3補體蛋白療法和C5補體抑制上，盡管能延緩萎縮區擴張，但對視力改善有限[55-56]。研究發現，盡管GA患者的RPE與光感受器細胞顯著萎縮，但內層視網膜結構相對完整，為光遺傳學治療提供了可能性[55, 57]。
2.3 光遺傳學治療視神經損傷性疾病
青光眼作為全球高發且不可逆性的致盲眼病，影響著超過7 600萬患者，該病以RGC的退化為特征[58]。RGC是視覺信號傳遞至大腦的關鍵神經元，其保護和修復對青光眼的防治至關重要。研究表明，通過AAV將穩定階躍函數視蛋白導入青光眼小鼠上丘腦，精確調控上丘腦神經活動，促進神經生長因子釋放，間接保護RGC，為青光眼治療提供了新策略[59]。眼-腦-腎綜合征蛋白（OCRL）酶是一種磷脂酰肌醇5-磷酸酶，通過調節磷脂酰肌醇代謝，影響眼內液體流出和細胞骨架組織，對眼壓調節至關重要。Prosseda等[60]通過光敏蛋白系統激活OCRL酶，改善了眼-腦-腎綜合征小鼠的眼壓。其推測通過將OCRL酶招募至細胞膜或初級纖毛上，可調節多種細胞機制，提高房水流出效率，從而降低眼壓。Kowal等[61]運用光遺傳學技術，將小梁網細胞中的OCRL酶轉定位至細胞膜和初級纖毛上，增強房水流出，降低眼內壓，成功逆轉了由糖皮質激素引起的小梁網功能缺陷。這提示光遺傳學在眼壓調節中的應用潛力，為青光眼治療提供了新思路。
3 光遺傳學在視覺功能研究中的應用
3.1 視網膜功能的光遺傳學研究
視神經膠質瘤（OPG）是神經纖維瘤病1型（NF1）患者常見的并發癥，影響15%～20%的兒童患者。研究表明，通過光遺傳學調控NF1小鼠的視網膜神經活動，結果發現活躍的視神經活動促進OPG的生長，抑制神經連接蛋白3的釋放可能是減緩OPG進展的有效方法[62]。這一發現不僅加深了對神經活動與腫瘤發展關系的理解，也為NF1相關兒童OPG的治療提供了新思路。
無長突細胞（AC）在視網膜內核層中發揮關鍵作用，AC與RBC和RGC等相互作用，參與復雜視覺信息處理。這些細胞在調節視覺信息的亮度、對比度和運動視覺中起核心作用[63]。Khabou等[64]在AII型AC中表達光敏蛋白，在光感受器功能受損小鼠視網膜中成功重建了AC對光增強和光減弱的感知反應，改善了小鼠的視覺功能。AII型AC在接受光刺激后，能恢復更多復雜的視網膜反應和視覺處理功能，顯著提升視網膜對視覺場景的多樣化處理能力。
3.2 視皮質功能的光遺傳學研究
光遺傳學技術通過精確的基因導入和光刺激，為研究視覺皮層中神經元活動與視覺感知之間的聯系提供了一種創新方法。利用光遺傳學輔助電路映射技術，揭示了初級視覺皮層與丘腦皮質之間自上而下的輸入模式，以及這些模式對視覺信息處理的影響。不同皮層深度的輸入展現出獨特的匯聚與分離模式，為解析視覺信息處理的神經機制提供了新視角[65]。Ortiz-Rios等[66]在獼猴中使用光遺傳學技術刺激初級視覺皮層，并結合功能性磁共振成像技術，記錄到視覺關聯皮層區域功能性活動的增加。并誘發了“光幻視”感知，證明了光遺傳學在靈長類動物大腦皮層回路激活中的潛力，為受損視覺系統的恢復或視覺感知的增強提供了治療思路。
在視覺皮層中，方向選擇性神經元對特定方向的視覺刺激高度敏感，其按照特定的組織模式排列，形成方向域，負責處理視覺系統中的運動和方向信息。初級視皮層中，神經細胞根據對左右眼視覺信息的偏好，以柱狀結構排列，形成眼優勢柱，對立體視覺建立至關重要。運用光遺傳學探索了非人靈長類動物視覺皮層中眼優勢柱與方向域的功能性組織，深化了對視覺系統處理和整合雙眼視覺信息的理解[67]。研究表明，在猴視網膜中表達光敏蛋白ChrimsonR，成功實現了長達20個月的持續功能表達，并有效地將信號傳遞至視覺皮層，驗證了光遺傳學技術在視覺恢復方面的長期有效性與安全性[68]。
4 光遺傳學在眼科疾病治療中的創新策略
4.1 光控干細胞技術
干細胞具有良好的可塑性，能夠代替損傷的視網膜細胞。研究者通過化學重編程技術，將成纖維細胞轉化為具有感光功能的細胞，并成功移植至小鼠模型中，部分恢復了小鼠視覺功能。然而，化學重編程效率有限，需要大量的起始材料才能獲得足夠數量的目標細胞，且化學化合物存在毒性和副作用，影響細胞安全性和質量[69]。
為克服這些限制，光控干細胞技術應運而生，該技術融合光遺傳學與干細胞技術，通過調控光敏蛋白精確控制干細胞遷移、分化和增殖。研究者利用近紅外光激活粘附肽，調節間充質干細胞（MSC）的粘附和多向分化，實現MSC向脂肪細胞或成骨細胞的定向分化，為再生醫學提供了非侵入性細胞控制方法[70]。研究表明，通過光敏蛋白Cryptochrome和CRISPR/dCas9基因編輯技術，精確調控如八聚體結合轉錄因子4等內源性轉錄因子，成功將小鼠胚胎成纖維細胞重編程為誘導多能干細胞，實現了對細胞內目標基因的精準定位并調控基因表達，為干細胞技術的精準應用提供了新思路[71]。
4.2 光控基因編輯技術
基因治療通過替換、沉默致病基因，使細胞表達正確的蛋白質，恢復細胞功能[72]。然而，傳統基因調控工具因缺乏時空特異性，在活體動物中進行精確基因操作的能力有限。為解決此問題，研究者結合光遺傳學與基因編輯技術，如光激活的逆四環素控制的轉錄激活因子（Li-rtTA）系統，成功實現了在活體動物中進行時空特異性的基因操作，Li-rtTA系統在體外和體內均展現出高效的基因激活能力[73]。
CRISPR-Cas9系統作為一種突破性的基因編輯技術，以其高效、靈活的基因編輯能力，成為生物學和醫學研究的關鍵工具。CRISPR-Cas9技術在眼科的研究廣泛且深入，包括遺傳性視網膜疾病、青光眼、AMD和角膜新生血管的治療研究[74-78]。但“脫靶效應”是其面臨的主要挑戰，即在非目標位點進行意外的基因編輯，可能導致基因突變。為解決這一問題，Pan等[79]開發了一種結合光敏蛋白，CRISPR-Cas9系統和上轉換納米顆粒的方案，利用近紅外光控制基因編輯。盡管光遺傳學與CRISPR-Cas9系統的結合不能直接消除“脫靶效應”，但是通過光敏CRISPR系統，Cas9酶的活性僅在特定波長的光照射下被激活，限制了Cas9酶在基因組中的非特異性游離時間，降低了脫靶切割的概率。
5 光遺傳學的挑戰與機遇
過去十年中光遺傳學技術在眼科領域取得了顯著進展，為視力恢復和視覺功能改善提供了新途徑。從視蛋白的優化到基因載體的選擇，再到臨床試驗的穩步推進，眼科光遺傳學正逐步成熟。然而，隨著研究的深入，光遺傳學也暴露出一些亟待解決的問題和挑戰。
安全性是光遺傳學的核心問題，鑒于自然光的不穩定性和不易控性，治療過程中必須借助外部設備以精確調控光照的波長與強度，特別是對于藍光敏感的光敏蛋白，必須防止高強度光照引發的視網膜損傷[39, 43, 80]。提高光敏蛋白的反應速度和敏感度，減輕強光損害，對提高患者生活質量至關重要[22, 81]。
光遺傳學涉及對細胞基因的不可逆修改，雖然這一技術在實驗室和動物研究中已展現積極成果，但在臨床應用轉化時，卻要求必須進行嚴格的倫理審查和監管，以確保患者權益得到充分保護[82]。此外，患者需要對治療過程中的潛在風險有充分的了解，然而，光遺傳學技術的復雜性可能導致患者難以完全理解相關信息，尤其是兒童和認知障礙患者，從而影響知情同意的有效性。光遺傳學可能引起社會對基因修改和生物技術的廣泛討論，公眾對其接受度可能影響其推廣，因此，提升社會對光遺傳學的理解與接受度，成為我們的重要任務。
光遺傳學在實現精確的神經調控方面仍面臨挑戰，尤其是光熱效應可能引起的非特異性神經活動。為確保治療效果，光遺傳學操作必須精確調控光照的強度、波長及照射時間[83]。光遺傳學的調控精度提升至單個神經元級別，為光遺傳學的精準性提供了新的科學基礎[84]。
視網膜細胞通過高度特化的方式處理視覺信息，并將信號傳遞至大腦，這一過程稱為視覺編碼，涉及視網膜細胞間復雜的連接和信息傳遞模式。光遺傳學引入的新編碼機制涉及對神經元連接和信息傳遞模式的根本性改變。新的視網膜輸出并非自然形成，無法完全復制或重建視覺系統中的復雜編碼機制。若新的視覺信號與大腦中原有的視覺編碼不兼容，可能導致大腦無法正確解析和整合這些信號，從而影響視覺恢復的效果[85]。因此，解決“編碼”問題成為光遺傳學必須面對的挑戰。
光遺傳學當前主要聚焦于治療由光感受器退化引起的退行性視網膜疾病，隨著研究的深入，該技術未來有望擴展至非致盲性視網膜疾病，如色盲。色盲主要影響視錐細胞的顏色感知能力，不伴感光細胞退化。基因療法已在色盲治療中取得積極進展，通過AAV傳遞CNGA3基因至視錐細胞，激活信號通路，恢復其色覺感知功能[86]。光遺傳學在治療青光眼、降低眼壓方面也顯示出潛力，盡管目前仍處于動物實驗階段，但其轉化為實際臨床應用的前景令人期待。
光遺傳學技術通過跨學科融合，集成了多種技術優勢，為眼科疾病治療提供了創新策略。該技術與納米科技的結合，顯著提升了光遺傳學轉導效率，并減少了對健康視網膜細胞的非靶向效應[87]。此外，光遺傳學與再生醫學、干細胞技術、組織工程等其他生物醫學領域的交叉融合，正逐步實現視網膜細胞的再生與修復，為患者提供更徹底、更持久的視覺功能恢復方案[70-71, 88]。
6 小結與展望
光遺傳學技術在眼科領域的應用正迅速向個性化、精準化和智能化的方向邁進。當前，針對視網膜退行性疾病的光遺傳學治療研究已進入多個臨床試驗階段，初步的積極結果預示著該療法在未來眼科治療中具有巨大潛力。盡管光遺傳學技術目前仍面臨安全性和調控精度等挑戰，但隨著科技的進步和臨床實踐的深化，光遺傳學技術的跨學科整合將推動其實現重大突破，其應用前景將不僅限于視網膜和視神經退行性疾病，而是擴展至更廣泛的眼科疾病領域。
視網膜退行性疾病和視神經損害性疾病，如視網膜色素變性（RP）、年齡相關性黃斑變性（AMD）和青光眼，是導致全球不可逆性視力損害的主要原因[1]。目前，AMD的抗血管內皮生長因子（VEGF）治療和青光眼的降眼壓治療雖能緩解癥狀，無法逆轉疾病進程。RP的營養神經和抗炎療法治療效果有限，受損細胞的感光功能難以恢復。盡管基因治療在一些視網膜疾病中可改善視覺功能的潛力，但受限于特定基因型[2-3]。干細胞治療由于其潛在的定向分化能力和自我更新能力而備受關注，但存在腫瘤形成的風險[4]。因此，開發新型、高效且安全的治療策略已成為醫學研究的迫切需求。光遺傳學融合了光控技術與基因工程，能夠精準調控特定細胞的功能，為神經科學的研究提供了全新視角[5-6]。近年來，隨著光遺傳學的不斷創新與拓展，其在眼科疾病研究與治療方面的潛力逐漸顯露[5]。眼的自然透光特性為光遺傳學提供了理想的應用平臺，無需侵入性手術即可實現對視網膜細胞信號轉導的精準控制，為視力的恢復和改善開辟了新途徑。現就光遺傳學技術在眼科應用的研究進展作一綜述。
1 光遺傳學技術原理
光遺傳學將編碼特定光敏蛋白的基因片段精確導入非感光神經細胞中，使原本對光無反應的細胞表達出光敏通道蛋白，當特定波長的光照射時，觸發細胞內的電生理反應，激活或抑制細胞活動[7]。光遺傳學的時間分辨率達到毫秒級別，且能特異性作用于特定類型的細胞，為復雜生物系統的精確調控提供了可能性[8]。
1.1 光敏蛋白的發現和改良
光敏蛋白是光遺傳學技術的核心，最初在細菌和藻類中被發現，微生物利用光敏蛋白進行光合作用和光感應[9]。視紫紅質因其在視網膜中感知光線并觸發視覺信號傳遞的關鍵作用，成為研究的焦點[10]。Boyden等[11]將綠藻來源的通道視紫紅質（ChR）2引入哺乳動物神經元，實現了光控神經元活動，標志著光遺傳學的誕生。
光遺傳學通過激活型和抑制型光敏蛋白調控神經元活動。激活型光敏蛋白如ChR2及其突變體、衣藻和團藻來源的ChR1的嵌合突變體和嗜鹽菌來源的ChR等，本質上是陽離子通道蛋白，接收光信號后促使陽離子流入細胞內，引發去極化和動作電位[12-15]。抑制型光敏蛋白如第三代光驅動內向氯泵、嗜鹽菌來源的光驅動外向質子泵以及真菌來源的藍色激光激活的質子泵等，其激活導致陰離子流入或質子泵出，引起超極化，抑制動作電位[16-17]。光敏蛋白按照來源分為微生物視蛋白和動物視蛋白，它們功能上存在一定的差異[1]。微生物視蛋白通常不參與視覺過程，主要在光能的感應和利用中發揮作用，對微生物的能量代謝和生理活動至關重要[18-20]。動物視蛋白則在視覺成像中扮演重要角色，同時參與調節生物體晝夜節律的非視覺活動[21-23]。
光遺傳學的革新與進步促進了光敏蛋白的優化與改良，提升了光敏蛋白的性能并拓寬了其應用領域。最初的ChR2盡管功能強大，但在光敏度、選擇性及效率方面存在局限性[24]。新型光敏蛋白通過蛋白質工程改良后顯著優化了光譜特性，降低了暗電流，具有更高的光學靈敏度，同時保留了優異的時間精度[25-29]。在眼科應用中，微生物來源的光敏蛋白如ChR、光敏氯離子泵等，以及動物視蛋白如黑視蛋白、中波敏感視蛋白和視桿細胞來源的視紫紅質等，均在視覺恢復中展現出有效潛力[21-23, 30-31]。動物視蛋白具有低免疫原性和低光強度需求，為視覺恢復提供了更為安全、溫和的治療選擇[22]。
1.2 光遺傳學工具的基因傳遞策略
將光敏感蛋白精準導入目標細胞是光遺傳學技術應用的關鍵。基因載體的選擇直接關系到傳遞的效率與成功率。病毒載體因其高效性和穩定性，在光遺傳學中被廣泛采用。病毒載體具備卓越的轉染能力和基因攜帶能力，能夠有效地將光敏蛋白基因片段傳遞至目標細胞[32]。腺相關病毒（AAV）因其低免疫原性、高組織特異性和低致病性成為首選的病毒載體[33]。
非病毒載體，如DNA納米復合體，脂質載體和陽離子聚合物載體等，通過親水或疏水的離子、多肽、脂質等物質聚合包裹DNA形成穩定的復合體，以提高基因的穩定性和細胞內遞送效率[34]。盡管非病毒載體具有較高的安全性及較大的基因載荷容量，但較低的傳遞效率限制了其在光遺傳學中的廣泛應用[35]。
基因編輯技術，如成簇的規律間隔的短回文重復序列（CRISPR）和CRISPR相關蛋白9（Cas9）系統和遠紅光激活的分裂Cas9系統，精準且高效，為光遺傳學提供新的研究思路[36-38]。這些技術不僅能使光敏感蛋白基因在目標細胞的基因組中精確整合，還能長期穩定表達[36]。Chen等[39]利用AAV-CRISPR-Cas9系統成功治療了由RPGR基因突變引起的視網膜退行性病變。
2 光遺傳學在視網膜和視神經疾病中的應用
2.1 光遺傳學治療遺傳性視網膜退行性疾病
遺傳性視網膜退行性疾病中，RP較為常見，其他包括Leber氏先天黑矇（LCA）和Stargardt黃斑營養不良（SD）等，這些疾病的共性特征是光感受器細胞的進行性損傷與死亡，導致患者視力損害和失明[40]。然而，盡管患者失去了大部分光感受器細胞，但視網膜內層結構如雙極細胞（RBC）和神經節細胞（RGC）仍長期保持相對完整[41-42]。光遺傳學賦予原本非感光的RBC或RGC光響應能力，為遺傳性視網膜退行性疾病提供了新治療路徑。
RP的全球平均患病率介于1/7 000～1/3 000，影響著數百萬人的視力健康[43]。研究表明，RP小鼠模型中表達光敏蛋白ChR2，可在視覺皮質區域觀察到光誘發電位的恢復[44]；Lin等[45]進一步利用哺乳動物的黑視蛋白恢復了RP小鼠的部分視覺功能，如瞳孔光反射和光回避行為。Gaub等[46]研究表明，與微生物視紫紅質通道蛋白相比，哺乳動物視紫紅質蛋白在提高光敏感性方面具有顯著優勢。Ameline等[47]研究報道，犬退化視網膜中長期表達光敏蛋白的安全性，為光遺傳學治療晚期視網膜退化提供了初步證據。Sahel等[48]通過光遺傳學結合特制激發眼鏡成功恢復了1例失明RP患者的部分視覺功能，為RP的治療提供了新的參考。
相較于傳統基因治療，光遺傳學的優勢在于其廣泛適用性，不受特定基因突變類型限制。光遺傳學不僅在RP治療中具有巨大潛力，同樣適用于SD和LCA等遺傳性視網膜疾病。SD通常在兒童或青少年時期發病，影響黃斑區域，導致中心視力下降[49]。多特征視蛋白（MCO）是光遺傳學療法MCO-010的核心成分。臨床試驗表明，玻璃體腔注射MCO至LCA患者視網膜細胞，結果發現MCO-010具有良好的耐受性，未引起嚴重不良事件，患者的視力得到改善，日常生活能力有所提升[50]。LCA患者的光感受器細胞經歷漸進性的退化和死亡，導致嚴重的視力減退或失明[51]。研究表明，在LCA小鼠模型中，MCO-010治療顯著減輕了視網膜細胞損失，提升了視力，且耐受性良好[52]。
2.2 光遺傳學治療年齡相關性視網膜退行性疾病
年齡相關性視網膜退行性疾病的典型代表是AMD，該病是全球50歲以上老年人視力喪失的主要原因之一[4, 53]。AMD晚期分為新生血管性AMD（nAMD）與“地圖樣”萎縮（GA）。nAMD以脈絡膜新生血管（CNV）為特征，導致黃斑區視網膜損傷及中心視力急劇下降。抗VEGF療法可在一定程度上改善nAMD患者的視功能[53]。GA的核心表現為視網膜色素上皮（RPE）細胞與光感受器細胞的萎縮，進而引發外層視網膜退化[54]。目前GA的治療集中在C3補體蛋白療法和C5補體抑制上，盡管能延緩萎縮區擴張，但對視力改善有限[55-56]。研究發現，盡管GA患者的RPE與光感受器細胞顯著萎縮，但內層視網膜結構相對完整，為光遺傳學治療提供了可能性[55, 57]。
2.3 光遺傳學治療視神經損傷性疾病
青光眼作為全球高發且不可逆性的致盲眼病，影響著超過7 600萬患者，該病以RGC的退化為特征[58]。RGC是視覺信號傳遞至大腦的關鍵神經元，其保護和修復對青光眼的防治至關重要。研究表明，通過AAV將穩定階躍函數視蛋白導入青光眼小鼠上丘腦，精確調控上丘腦神經活動，促進神經生長因子釋放，間接保護RGC，為青光眼治療提供了新策略[59]。眼-腦-腎綜合征蛋白（OCRL）酶是一種磷脂酰肌醇5-磷酸酶，通過調節磷脂酰肌醇代謝，影響眼內液體流出和細胞骨架組織，對眼壓調節至關重要。Prosseda等[60]通過光敏蛋白系統激活OCRL酶，改善了眼-腦-腎綜合征小鼠的眼壓。其推測通過將OCRL酶招募至細胞膜或初級纖毛上，可調節多種細胞機制，提高房水流出效率，從而降低眼壓。Kowal等[61]運用光遺傳學技術，將小梁網細胞中的OCRL酶轉定位至細胞膜和初級纖毛上，增強房水流出，降低眼內壓，成功逆轉了由糖皮質激素引起的小梁網功能缺陷。這提示光遺傳學在眼壓調節中的應用潛力，為青光眼治療提供了新思路。
3 光遺傳學在視覺功能研究中的應用
3.1 視網膜功能的光遺傳學研究
視神經膠質瘤（OPG）是神經纖維瘤病1型（NF1）患者常見的并發癥，影響15%～20%的兒童患者。研究表明，通過光遺傳學調控NF1小鼠的視網膜神經活動，結果發現活躍的視神經活動促進OPG的生長，抑制神經連接蛋白3的釋放可能是減緩OPG進展的有效方法[62]。這一發現不僅加深了對神經活動與腫瘤發展關系的理解，也為NF1相關兒童OPG的治療提供了新思路。
無長突細胞（AC）在視網膜內核層中發揮關鍵作用，AC與RBC和RGC等相互作用，參與復雜視覺信息處理。這些細胞在調節視覺信息的亮度、對比度和運動視覺中起核心作用[63]。Khabou等[64]在AII型AC中表達光敏蛋白，在光感受器功能受損小鼠視網膜中成功重建了AC對光增強和光減弱的感知反應，改善了小鼠的視覺功能。AII型AC在接受光刺激后，能恢復更多復雜的視網膜反應和視覺處理功能，顯著提升視網膜對視覺場景的多樣化處理能力。
3.2 視皮質功能的光遺傳學研究
光遺傳學技術通過精確的基因導入和光刺激，為研究視覺皮層中神經元活動與視覺感知之間的聯系提供了一種創新方法。利用光遺傳學輔助電路映射技術，揭示了初級視覺皮層與丘腦皮質之間自上而下的輸入模式，以及這些模式對視覺信息處理的影響。不同皮層深度的輸入展現出獨特的匯聚與分離模式，為解析視覺信息處理的神經機制提供了新視角[65]。Ortiz-Rios等[66]在獼猴中使用光遺傳學技術刺激初級視覺皮層，并結合功能性磁共振成像技術，記錄到視覺關聯皮層區域功能性活動的增加。并誘發了“光幻視”感知，證明了光遺傳學在靈長類動物大腦皮層回路激活中的潛力，為受損視覺系統的恢復或視覺感知的增強提供了治療思路。
在視覺皮層中，方向選擇性神經元對特定方向的視覺刺激高度敏感，其按照特定的組織模式排列，形成方向域，負責處理視覺系統中的運動和方向信息。初級視皮層中，神經細胞根據對左右眼視覺信息的偏好，以柱狀結構排列，形成眼優勢柱，對立體視覺建立至關重要。運用光遺傳學探索了非人靈長類動物視覺皮層中眼優勢柱與方向域的功能性組織，深化了對視覺系統處理和整合雙眼視覺信息的理解[67]。研究表明，在猴視網膜中表達光敏蛋白ChrimsonR，成功實現了長達20個月的持續功能表達，并有效地將信號傳遞至視覺皮層，驗證了光遺傳學技術在視覺恢復方面的長期有效性與安全性[68]。
4 光遺傳學在眼科疾病治療中的創新策略
4.1 光控干細胞技術
干細胞具有良好的可塑性，能夠代替損傷的視網膜細胞。研究者通過化學重編程技術，將成纖維細胞轉化為具有感光功能的細胞，并成功移植至小鼠模型中，部分恢復了小鼠視覺功能。然而，化學重編程效率有限，需要大量的起始材料才能獲得足夠數量的目標細胞，且化學化合物存在毒性和副作用，影響細胞安全性和質量[69]。
為克服這些限制，光控干細胞技術應運而生，該技術融合光遺傳學與干細胞技術，通過調控光敏蛋白精確控制干細胞遷移、分化和增殖。研究者利用近紅外光激活粘附肽，調節間充質干細胞（MSC）的粘附和多向分化，實現MSC向脂肪細胞或成骨細胞的定向分化，為再生醫學提供了非侵入性細胞控制方法[70]。研究表明，通過光敏蛋白Cryptochrome和CRISPR/dCas9基因編輯技術，精確調控如八聚體結合轉錄因子4等內源性轉錄因子，成功將小鼠胚胎成纖維細胞重編程為誘導多能干細胞，實現了對細胞內目標基因的精準定位并調控基因表達，為干細胞技術的精準應用提供了新思路[71]。
4.2 光控基因編輯技術
基因治療通過替換、沉默致病基因，使細胞表達正確的蛋白質，恢復細胞功能[72]。然而，傳統基因調控工具因缺乏時空特異性，在活體動物中進行精確基因操作的能力有限。為解決此問題，研究者結合光遺傳學與基因編輯技術，如光激活的逆四環素控制的轉錄激活因子（Li-rtTA）系統，成功實現了在活體動物中進行時空特異性的基因操作，Li-rtTA系統在體外和體內均展現出高效的基因激活能力[73]。
CRISPR-Cas9系統作為一種突破性的基因編輯技術，以其高效、靈活的基因編輯能力，成為生物學和醫學研究的關鍵工具。CRISPR-Cas9技術在眼科的研究廣泛且深入，包括遺傳性視網膜疾病、青光眼、AMD和角膜新生血管的治療研究[74-78]。但“脫靶效應”是其面臨的主要挑戰，即在非目標位點進行意外的基因編輯，可能導致基因突變。為解決這一問題，Pan等[79]開發了一種結合光敏蛋白，CRISPR-Cas9系統和上轉換納米顆粒的方案，利用近紅外光控制基因編輯。盡管光遺傳學與CRISPR-Cas9系統的結合不能直接消除“脫靶效應”，但是通過光敏CRISPR系統，Cas9酶的活性僅在特定波長的光照射下被激活，限制了Cas9酶在基因組中的非特異性游離時間，降低了脫靶切割的概率。
5 光遺傳學的挑戰與機遇
過去十年中光遺傳學技術在眼科領域取得了顯著進展，為視力恢復和視覺功能改善提供了新途徑。從視蛋白的優化到基因載體的選擇，再到臨床試驗的穩步推進，眼科光遺傳學正逐步成熟。然而，隨著研究的深入，光遺傳學也暴露出一些亟待解決的問題和挑戰。
安全性是光遺傳學的核心問題，鑒于自然光的不穩定性和不易控性，治療過程中必須借助外部設備以精確調控光照的波長與強度，特別是對于藍光敏感的光敏蛋白，必須防止高強度光照引發的視網膜損傷[39, 43, 80]。提高光敏蛋白的反應速度和敏感度，減輕強光損害，對提高患者生活質量至關重要[22, 81]。
光遺傳學涉及對細胞基因的不可逆修改，雖然這一技術在實驗室和動物研究中已展現積極成果，但在臨床應用轉化時，卻要求必須進行嚴格的倫理審查和監管，以確保患者權益得到充分保護[82]。此外，患者需要對治療過程中的潛在風險有充分的了解，然而，光遺傳學技術的復雜性可能導致患者難以完全理解相關信息，尤其是兒童和認知障礙患者，從而影響知情同意的有效性。光遺傳學可能引起社會對基因修改和生物技術的廣泛討論，公眾對其接受度可能影響其推廣，因此，提升社會對光遺傳學的理解與接受度，成為我們的重要任務。
光遺傳學在實現精確的神經調控方面仍面臨挑戰，尤其是光熱效應可能引起的非特異性神經活動。為確保治療效果，光遺傳學操作必須精確調控光照的強度、波長及照射時間[83]。光遺傳學的調控精度提升至單個神經元級別，為光遺傳學的精準性提供了新的科學基礎[84]。
視網膜細胞通過高度特化的方式處理視覺信息，并將信號傳遞至大腦，這一過程稱為視覺編碼，涉及視網膜細胞間復雜的連接和信息傳遞模式。光遺傳學引入的新編碼機制涉及對神經元連接和信息傳遞模式的根本性改變。新的視網膜輸出并非自然形成，無法完全復制或重建視覺系統中的復雜編碼機制。若新的視覺信號與大腦中原有的視覺編碼不兼容，可能導致大腦無法正確解析和整合這些信號，從而影響視覺恢復的效果[85]。因此，解決“編碼”問題成為光遺傳學必須面對的挑戰。
光遺傳學當前主要聚焦于治療由光感受器退化引起的退行性視網膜疾病，隨著研究的深入，該技術未來有望擴展至非致盲性視網膜疾病，如色盲。色盲主要影響視錐細胞的顏色感知能力，不伴感光細胞退化。基因療法已在色盲治療中取得積極進展，通過AAV傳遞CNGA3基因至視錐細胞，激活信號通路，恢復其色覺感知功能[86]。光遺傳學在治療青光眼、降低眼壓方面也顯示出潛力，盡管目前仍處于動物實驗階段，但其轉化為實際臨床應用的前景令人期待。
光遺傳學技術通過跨學科融合，集成了多種技術優勢，為眼科疾病治療提供了創新策略。該技術與納米科技的結合，顯著提升了光遺傳學轉導效率，并減少了對健康視網膜細胞的非靶向效應[87]。此外，光遺傳學與再生醫學、干細胞技術、組織工程等其他生物醫學領域的交叉融合，正逐步實現視網膜細胞的再生與修復，為患者提供更徹底、更持久的視覺功能恢復方案[70-71, 88]。
6 小結與展望
光遺傳學技術在眼科領域的應用正迅速向個性化、精準化和智能化的方向邁進。當前，針對視網膜退行性疾病的光遺傳學治療研究已進入多個臨床試驗階段，初步的積極結果預示著該療法在未來眼科治療中具有巨大潛力。盡管光遺傳學技術目前仍面臨安全性和調控精度等挑戰，但隨著科技的進步和臨床實踐的深化，光遺傳學技術的跨學科整合將推動其實現重大突破，其應用前景將不僅限于視網膜和視神經退行性疾病，而是擴展至更廣泛的眼科疾病領域。