脫細胞基質（dECM）由于其高仿生性和優異的生物相容性，已被廣泛用作再生醫學的支架材料。水凝膠（hydrogel）作為一種高含水量、可控流動性的功能高分子材料，非常適合用于臨床中的部分微創手術。近年來，隨著水凝膠理論和技術的快速發展，dECM 水凝膠逐漸成為再生醫學領域的研究熱點。本文從 dECM 水凝膠的制備及其臨床前應用兩個方面對近年來的相關研究進行綜述，并展望其未來的臨床前景。
引用本文： 姜靖宇, 張遲, 張婷霞, 趙基源. 脫細胞基質水凝膠在再生醫學中的研究進展. 生物醫學工程學雜志, 2020, 37(1): 179-184. doi: 10.7507/1001-5515.201907027 復制
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引言
細胞外基質（extracellular matrix，ECM）是分布于細胞外空間的蛋白及多糖形成的網狀結構，主要成分包括膠原、彈性纖維、蛋白聚糖和糖蛋白等。ECM 獨特的網狀結構不僅賦予了組織和器官特定的機械性能，同時也為細胞生長提供了必要的生存場所，并調控細胞的增殖、分化、遷移等生命活動[1]。
雖然自體移植一直被認為是移植手術中的金標準，但供體來源不足及二次創傷等原因都限制了它的廣泛應用。研究不同組織 ECM 的組成和功能，以及模仿并構建具有高仿生性的生物支架已成為組織工程領域的研究熱點[2-5]。脫細胞后的天然 ECM 支架不僅保留了組織的微環境，而且表現出優異的生物學活性，已被廣泛用作再生醫學的支架材料。通過各種脫細胞技術獲得的支架形式主要包括二維（two-dimensional，2D）片狀支架、三維（three-dimensional，3D）海綿支架和水凝膠支架，其中水凝膠支架表現出更好的均一性和可操作性，在臨床上具有更廣闊的應用前景[4-6]。
2008 年 Badylak 等首次報道豬膀胱脫細胞基質（decellularized extracellular matrix，dECM）水凝膠的制備方法后，先后有研究將小腸黏膜下層（small intestinal submucosa，SIS）[7]、心臟[8-12]、肝臟[13-14]、腎臟[15]、半月板[16]、胰腺[17-18]、子宮[19]、神經[20-21]、脂肪[22-23]等組織制備成 dECM 水凝膠。凝膠化的 dECM 具有適合細胞生長的三維空間結構、良好的生物相容性以及優異的可控流動性和可注射性，非常適合作為微創手術的植入物，實現組織的修復再生[24-29]。下面將從 dECM 水凝膠的制備和臨床前應用兩個方面對近 3～5 年相關領域的研究進展進行綜述。
1 dECM 水凝膠的制備
1.1 脫細胞方法
組織脫細胞是制備 dECM 水凝膠的重要步驟，其主要目的是消除組織的免疫原性，并盡可能保留原有 ECM 組分。傳統脫細胞的原理是運用物理學、化學和酶學等方法，破壞細胞及胞內結構，再漂洗去除細胞碎片保留 ECM。其中物理法主要包括剪碎、刮除、凍融、攪拌等；化學和酶學方法主要通過破壞細胞的膜相結構來破碎細胞。目前，常用的脫細胞試劑主要有三類：① 離子型表面活性劑，如十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）和脫氧膽酸鈉（sodium deoxycholate，SDC）等；② 非離子型表面活性劑，如曲拉通 X-100 等；③ 生物酶，如胰蛋白酶、胃蛋白酶、DNA 酶、RNA 酶等[4]。
機械破碎結合脫細胞試劑已成為目前最常采用的脫細胞方法。Singelyn 等[10]將豬心臟組織剪碎，先后用 1% SDS 和 1% 曲拉通 X-100 對組織進行脫細胞處理，蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE）后發現脫細胞后的心臟組織呈多孔網狀結構，且未見細胞核殘留。Baghalishahi 等[9]將大鼠心臟組織剪碎后置于 1% SDS 和 1% 曲拉通 X-100 中進行機械攪拌，HE 染色、Hoechst 染色結果均證實該脫細胞方法可將細胞核徹底去除，但纖連蛋白、層粘連蛋白等重要基質組分丟失嚴重。Prest 等[21]在處理犬類神經組織的過程中，先使用胰蛋白酶對細胞進行消化，隨后用 3% 曲拉通 X-100 對細胞進行破壞，DAPI 染色結果顯示經脫細胞處理后的神經組織 ECM 僅有少量細胞核殘留，組織 DNA 含量由最初的（1 043.6 ± 291.2）ng/mg 降至（158.1 ± 34.5）ng/mg。Ahearne 等[30]將豬角膜反復凍融后，結合 DNA 酶和 RNA 酶對其進行脫細胞處理。Hoechst 染色未觀察到細胞核殘留，DNA 含量檢測結果顯示其殘存含量為 15%，且組織原有空間結構保留較為完整。因此，相比化學試劑法，酶學法更為溫和，對組織 ECM 的原有組分及空間結構破壞小，而機械破碎結合化學試劑法去除組織細胞成分的過程中，雖去除細胞成分的效果顯著，但對基質破壞相對嚴重。
近年來，基于組織原有脈管系統的灌注沖洗已逐漸成為肝、腎等實質器官脫細胞的重要方法。研究顯示此方法對組織的整體結構影響較小，在除去細胞成分的同時仍可保留組織的立體形態和血管結構。Wang 等[31]通過肝門靜脈插管，使用 1% SDS、0.1% 氨水先后對大鼠肝臟進行灌注，直至肝臟透明。對剩余組織進行檢測后發現，其 DNA 含量僅為原組織的 1.1%，且剩余組織中總蛋白、膠原蛋白、糖胺聚糖（glycosaminoglyca，GAG）等含量分別為原組織的 52%、71%、85%，均較大程度得到保留。除上述脫細胞方法外，Seo 等[8]還使用超臨界二氧化碳將大鼠心臟組織脫細胞。實驗人員將獲得的大鼠心臟組織冷凍干燥后剪碎，放于裝有二氧化碳液體的高壓容器內，350 bar 壓力下反應 6 h，然后用含有 DNA 酶的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗。結果顯示，超臨界二氧化碳組與化學試劑組的 DNA 殘留并無顯著差異，而前者膠原、GAG、胰島素樣生長因子結合蛋白-2、血管內皮生長因子等生長因子大部分得到保留，尤其是 GAG 含量在原組織［（7.0 ± 0.5）μg/mg］和實驗組［（6.1 ± 0.4）μg/mg］中十分接近，但化學試劑組中其剩余含量僅為原組織的 14%，進一步突顯了超臨界二氧化碳法相比于其他脫細胞方法的優勢。
1.2 dECM 凝膠化
dECM 水凝膠的形成是基于膠原自組裝的一個過程，同時也受糖胺聚糖、蛋白聚糖和多種蛋白的影響。具體過程包括兩個關鍵步驟：① 利用酶解、酸溶等方法溶解 dECM 制備成均相溶液；② 調整溶液溫度、鹽離子濃度及 pH，或加入交聯劑誘導交聯形成凝膠[4]。
1.2.1 dECM 的溶解
溶解 dECM 最常用的方法是通過胃蛋白酶的消化作用，使不溶性膠原蛋白聚合體在解螺旋后被切割成可溶的單體分子。Freytes 等[32]首次通過凍干、研磨、鹽酸-胃蛋白酶溶液消化以及磁力攪拌等步驟制備了豬膀胱 dECM 溶液。Saheli 等[13]嘗試用 0.5 mol/L 醋酸代替鹽酸對肝臟 dECM 進行溶解，以減少強酸對蛋白、生長因子等活性物質的破壞。除不同酸溶液外，胃蛋白酶的濃度及作用時間也會影響 dECM 的溶解。此外，也可利用尿素對組織 dECM 進行溶解。Uriel 等[33]利用尿素對 dECM 中非共價鍵進行破壞，促進了 dECM 中各類組分的溶解，然后離心去除殘留的非可溶性成分，得到均相的 dECM 溶液。
1.2.2 dECM 溶液成膠
通過改變 dECM 溶液的 pH、鹽離子濃度和外界溫度可促使其發生凝膠化。Freytes 等[32]用氫氧化鈉將豬膀胱 dECM 溶液調至中性（pH ≈ 7.4）后，改變溶液中鹽離子濃度以形成預凝膠，然后通過升溫至 37℃ 形成水凝膠。dECM 溶液預凝膠化是 dECM 水凝膠形成前的關鍵步驟，臨床人員可將該時期的 dECM 預凝膠注射至手術部位，在人體溫度（37℃）下，dECM 預凝膠可迅速形成 dECM 水凝膠。研究表明，dECM 溶液中膠原蛋白單體自組裝形成聚合體的過程中熵增加促使了水凝膠的生成，該成膠反應在較低鹽離子濃度（0.5 × PBS）下被促進，在較高鹽離子濃度（1.5 × PBS）以及溫度小于 22℃ 時被抑制。
1.2.3 dECM 水凝膠的評估
① 水凝膠的微觀結構：組織脫細胞以及 dECM 溶解過程中，原有纖維網狀結構已被破壞，隨著成膠反應的發生，dECM 溶液中膠原蛋白單體經自組裝又形成了新的三維多孔結構。影響 dECM 水凝膠結構的因素主要包括組織 dECM 的來源、凝膠化條件以及水凝膠中各類蛋白濃度等。不同組織來源的 dECM 水凝膠纖維直徑差異較小，凝膠化條件的改變以及各類蛋白濃度對孔徑影響較大。Ungerleider 等[24]使用掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察豬骨骼肌和心肌 dECM 水凝膠，發現重組后的纖維直徑分布在 30～250 nm，平均為 100 nm。Lin 等[20]通過 SEM 觀察戊二醛交聯后的神經 dECM 水凝膠，發現該水凝膠具有納米級多孔結構，重組后的纖維直徑在（55 ± 14）nm，纖維距離分布在 200～300 nm 之間。② 水凝膠的粘彈性：dECM 預凝膠的黏度和凝膠動力學等特性決定了可注射性以及能否保留在特定部位，是其能否成功用于微創手術的重要衡量標準。Sackett 等[17]通過比濁法對胰腺 dECM 水凝膠進行了動力學分析，結果發現胰腺 dECM 水凝膠顯示出類似于Ⅰ型膠原蛋白的“S”形動力學曲線，且兩者達到最大濃度吸光度值的一半時所需時間（T1 / 2）相似。但胰腺 dECM 水凝膠的滯后時間為 5～6 min，短于Ⅰ型膠原蛋白（10～15 min），表明在 37℃ 時，dECM 水凝膠較膠原能更快地發生凝膠化，最后凝膠化過程所需總時間相同。另外 Wu 等[16]還發現，不同濃度豬半月板 dECM 水凝膠的比濁凝膠動力學曲線顯示出類似的“S”形曲線，且水凝膠的滯后時間和凝膠化速率基本不受濃度改變的影響。
2 dECM 水凝膠的臨床前研究
dECM 水凝膠由于具有與自體組織類似的組成和結構，已被廣泛應用于組織工程和再生醫學領域的研究。目前已有科學家將 dECM 水凝膠作為基礎材料，通過加入某些活性成分以及改進其機械性能來模擬機體內部的微環境，從而實現個性化治療，為 dECM 水凝膠臨床應用奠定基礎[5-6, 11]。不同組織來源 dECM 水凝膠的制備工藝及應用效果見表 1。
表1
不同組織來源 dECM 水凝膠的制備工藝及應用效果
Table1.
The preparation process and application of dECM hydrogel from different tissue sources
2.1 心臟
組織損傷后血管的生成對心肌梗死等缺血性疾病的治療起到了至關重要的作用，dECM 水凝膠作為良好的生物支架材料，能夠有效地促進血管生成和加快組織修復[5]。Jang 等[11]分別在豬心臟 dECM 水凝膠及膠原兩種材料上種植人源心臟祖細胞（human c-kit cardiac progenitor cells，hCPCs），7 天后發現心臟 dECM 水凝膠能顯著增強 hCPCs 的黏附、增殖和成心肌分化。將通過 3D 打印技術構建的心臟 dECM 水凝膠仿生支架植入心肌梗死模型大鼠，發現混有間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）以及血管內皮生長因子的 dECM 水凝膠組中，大鼠左心室的厚度、組織中血管數目和直徑、射血分數和縮短分數均明顯增加，表明心臟 dECM 水凝膠不僅可作為載體材料對祖細胞心肌化、血管生成以及心臟組織的修復產生重要調節作用，而且可作為微創手術的植入材料，減少因手術治療造成的周圍組織損傷。Singelyn 等[10]對人冠狀動脈內皮細胞（human coronary artery endothelial cells，HCAECs）和大鼠主動脈平滑肌細胞（rat aortic smooth muscle cells，RASMCs）在豬心臟 dECM 水凝膠中的遷移情況進行評估，發現 dECM 水凝膠可明顯促進兩種細胞向其周圍遷移，RASMCs 在 dECM 水凝膠組中的遷移數目約為對照組的 2 倍。隨后將 dECM 預凝膠注射到 SD 大鼠左心室壁內，術后 4 h 即可觀察到新生小血管，11 天時在注射部位發現大量 HCAECs、RASMCs 以及直徑大于 10 μm 的新生血管，新生小血管數量顯著增加，證明 dECM 水凝膠具有良好的促血管生成的能力。
2.2 胰腺
盡管目前胰島素的使用已十分普及，但每年仍有數百萬人由于血糖控制不佳以及糖尿病相關并發癥而喪失生命。近年來也有學者提出將干細胞與胰腺 ECM 組分混合，以微創手術的形式，將水凝膠注射到體內從而對糖尿病進行治療。例如，Sackett 等[17]制備人源胰腺 dECM 水凝膠，將胰島素瘤細胞系和人臍靜脈內皮細胞種植于胰腺 dECM 水凝膠上，結果顯示 dECM 水凝膠可為細胞黏附生長提供良好的微環境，且細胞存活情況以及胰島素分泌指數與Ⅰ型膠原類似。動物實驗中，將胰腺 dECM 水凝膠和人胎兒胰腺組織植入裸鼠背部皮下，術后 4 周取出植入物，結果發現對照組中小鼠產生強烈的炎癥反應，而實驗組胰腺組織 dECM 水凝膠組并未發現有明顯的炎癥細胞浸潤，表明該水凝膠具有較低的免疫原性，有望成為臨床中輔助治療糖尿病的新型材料。Chaimov 等[18]開發了一種基于豬胰腺 dECM 水凝膠的新型細胞微膠囊化平臺（pancreas encapsulation platform），以用于糖尿病的治療。將包裹成人肝細胞（adult human liver cells，AHLC）和 MSC 的胰腺 dECM 水凝膠注射至 SCID Beige 糖尿病小鼠皮下，每隔 3 日檢測小鼠血糖含量。結果顯示未經處理的對照組小鼠血糖濃度一直維持在 350 mg/dL 左右，而包裹細胞的胰腺 dECM 水凝膠組中小鼠血糖濃度明顯下降，7 天內由 350 mg/dL 降至 210 mg/dL，隨后逐漸上升至 300 mg/dL 并趨于穩定，此結果證明包裹細胞的胰腺 dECM 水凝膠可明顯改善小鼠血糖濃度，有助于糖尿病的治療。
2.3 肝臟
梁成宵等[14]將肝細胞 BRL-3A 種于大鼠肝臟 dECM 水凝膠表面，以對其細胞毒性以及增殖、黏附等生物學活性進行檢測。與空白培養板相比，肝臟 dECM 水凝膠細胞毒性較低，利于細胞的存活；對細胞骨架染色后發現黏附于 dECM 水凝膠表面的細胞呈梭形，且每個視野下細胞黏附數量（84 ± 8）個明顯多于對照組（53 ± 7）個，證明 dECM 水凝膠具有良好的生物相容性，為后續水凝膠在肝臟疾病領域的應用提供了實驗依據。Wang 等[31]將大鼠肝臟 dECM 水凝膠均勻鋪于細胞培養板上，細胞毒性檢測結果顯示人源骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BM-MSC）在實驗組中生長良好，增殖較普通基質膠覆蓋的細胞培養板明顯增加；免疫熒光染色結果顯示 dECM 水凝膠組中 BM-MSC 分泌的尿素、白蛋白和甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）等因子數量更多，表明肝臟 dECM 水凝膠可作為一種理想的支架材料，具有較強的促 BM-MSC 朝肝細胞分化的能力。
2.4 神經
Prest 等[21]將狗外周神經 dECM 水凝膠填入硅膠神經導管內，隨后植入 SD 大鼠坐骨神經缺損模型。術后 3 周結果顯示 dECM 水凝膠能夠促使巨噬細胞和施旺細胞向其周圍遷移，并誘導 M2 型巨噬細胞比例顯著增加，M2 與 M1 型細胞之比接近 1.5∶1，而在對照組中兩者之比僅為 0.5∶1，組織修復速率明顯不及實驗組。Lin 等[20]利用豬源外周神經 dECM 水凝膠（pDNM-G）培養施旺細胞，發現 pDNM-G 具有促進細胞增殖以及維持細胞形態的作用。體內免疫反應評估結果顯示，dECM 水凝膠具有較低的免疫原性，可激活 M2 型巨噬細胞，促進組織損傷的修復。在小鼠坐骨神經 15 mm 缺損模型中，填充有 pDNM-G 的靜電紡絲導管組中軸突的再生長度可達 6 mm 左右，約為對照組的 2 倍；隨后對再生神經的功能進行評估，發現實驗組中運動神經傳導速率明顯快于對照組，達 20 m/s 以上。以上實驗結果表明 pDNM-G 可作為一種良好的生物支架，具有促進神經組織損傷修復的作用。
2.5 其他
Keane 等[7]將豬 SIS dECM 水凝膠植入葡聚糖硫酸誘導的大鼠潰瘍性結腸炎模型，發現 dECM 水凝膠可作為一種良好的粘合劑，附著于腸壁并與細胞緊密結合。同時 dECM 水凝膠能夠增加病變部位 E-鈣粘蛋白陽性細胞的數目，減少腫瘤壞死因子-α 等促炎因子的釋放，促進結腸炎大鼠上皮組織的修復。病變部位 7 天后已基本修復，與正常組織無顯著差異，證明 SIS dECM 水凝膠可快速促進潰瘍性結腸炎的愈合。Wu 等[16]將豬半月板 dECM 水凝膠涂抹于聚苯乙烯培養皿表面，培養牛軟骨細胞和小鼠成纖維細胞。相比于聚苯乙烯，半月板 dECM 水凝膠能顯著促進細胞的增殖，且在 7 天時細胞數目高于對照組約 30%，細胞存活率約為 90%。將 dECM 預凝膠注射至小鼠背部皮下，在材料植入初期可觀察到粒細胞快速遷移至注射部位，7 天時可觀察到巨噬細胞大量浸潤，但并未引起強烈的特異性免疫反應。上述實驗結果均表明半月板 dECM 水凝膠具有良好的生物學性能以及較低的免疫原性，可為后續臨床試驗提供依據。
3 展望
雖然 dECM 水凝膠對多種損傷組織的修復具有顯著促進作用，但不同組織來源 dECM 水凝膠的成分、力學性能、生物特性以及制備工藝的差異，使其在體內的治療效果還不穩定。如何選擇最合適的 dECM 水凝膠用于特定組織的修復依然有待進一步研究。此外 dECM 水凝膠機械性能往往較差，單純依靠調節溶液 pH、鹽離子濃度以及改變溫度的方法只能在一定程度上促使溶液進行交聯，并不能夠明顯提高力學性能。尋找安全有效的新交聯方法，改善水凝膠的機械性能，不僅能夠獲得更好的修復效果，還將擴大水凝膠應用的范圍。隨著科學家對 dECM 水凝膠研究的不斷深入，具有更優良力學和生物學性能的 dECM 水凝膠產品將不斷涌現，為臨床組織修復提供更多的選擇。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
引言
細胞外基質（extracellular matrix，ECM）是分布于細胞外空間的蛋白及多糖形成的網狀結構，主要成分包括膠原、彈性纖維、蛋白聚糖和糖蛋白等。ECM 獨特的網狀結構不僅賦予了組織和器官特定的機械性能，同時也為細胞生長提供了必要的生存場所，并調控細胞的增殖、分化、遷移等生命活動[1]。
雖然自體移植一直被認為是移植手術中的金標準，但供體來源不足及二次創傷等原因都限制了它的廣泛應用。研究不同組織 ECM 的組成和功能，以及模仿并構建具有高仿生性的生物支架已成為組織工程領域的研究熱點[2-5]。脫細胞后的天然 ECM 支架不僅保留了組織的微環境，而且表現出優異的生物學活性，已被廣泛用作再生醫學的支架材料。通過各種脫細胞技術獲得的支架形式主要包括二維（two-dimensional，2D）片狀支架、三維（three-dimensional，3D）海綿支架和水凝膠支架，其中水凝膠支架表現出更好的均一性和可操作性，在臨床上具有更廣闊的應用前景[4-6]。
2008 年 Badylak 等首次報道豬膀胱脫細胞基質（decellularized extracellular matrix，dECM）水凝膠的制備方法后，先后有研究將小腸黏膜下層（small intestinal submucosa，SIS）[7]、心臟[8-12]、肝臟[13-14]、腎臟[15]、半月板[16]、胰腺[17-18]、子宮[19]、神經[20-21]、脂肪[22-23]等組織制備成 dECM 水凝膠。凝膠化的 dECM 具有適合細胞生長的三維空間結構、良好的生物相容性以及優異的可控流動性和可注射性，非常適合作為微創手術的植入物，實現組織的修復再生[24-29]。下面將從 dECM 水凝膠的制備和臨床前應用兩個方面對近 3～5 年相關領域的研究進展進行綜述。
1 dECM 水凝膠的制備
1.1 脫細胞方法
組織脫細胞是制備 dECM 水凝膠的重要步驟，其主要目的是消除組織的免疫原性，并盡可能保留原有 ECM 組分。傳統脫細胞的原理是運用物理學、化學和酶學等方法，破壞細胞及胞內結構，再漂洗去除細胞碎片保留 ECM。其中物理法主要包括剪碎、刮除、凍融、攪拌等；化學和酶學方法主要通過破壞細胞的膜相結構來破碎細胞。目前，常用的脫細胞試劑主要有三類：① 離子型表面活性劑，如十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）和脫氧膽酸鈉（sodium deoxycholate，SDC）等；② 非離子型表面活性劑，如曲拉通 X-100 等；③ 生物酶，如胰蛋白酶、胃蛋白酶、DNA 酶、RNA 酶等[4]。
機械破碎結合脫細胞試劑已成為目前最常采用的脫細胞方法。Singelyn 等[10]將豬心臟組織剪碎，先后用 1% SDS 和 1% 曲拉通 X-100 對組織進行脫細胞處理，蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE）后發現脫細胞后的心臟組織呈多孔網狀結構，且未見細胞核殘留。Baghalishahi 等[9]將大鼠心臟組織剪碎后置于 1% SDS 和 1% 曲拉通 X-100 中進行機械攪拌，HE 染色、Hoechst 染色結果均證實該脫細胞方法可將細胞核徹底去除，但纖連蛋白、層粘連蛋白等重要基質組分丟失嚴重。Prest 等[21]在處理犬類神經組織的過程中，先使用胰蛋白酶對細胞進行消化，隨后用 3% 曲拉通 X-100 對細胞進行破壞，DAPI 染色結果顯示經脫細胞處理后的神經組織 ECM 僅有少量細胞核殘留，組織 DNA 含量由最初的（1 043.6 ± 291.2）ng/mg 降至（158.1 ± 34.5）ng/mg。Ahearne 等[30]將豬角膜反復凍融后，結合 DNA 酶和 RNA 酶對其進行脫細胞處理。Hoechst 染色未觀察到細胞核殘留，DNA 含量檢測結果顯示其殘存含量為 15%，且組織原有空間結構保留較為完整。因此，相比化學試劑法，酶學法更為溫和，對組織 ECM 的原有組分及空間結構破壞小，而機械破碎結合化學試劑法去除組織細胞成分的過程中，雖去除細胞成分的效果顯著，但對基質破壞相對嚴重。
近年來，基于組織原有脈管系統的灌注沖洗已逐漸成為肝、腎等實質器官脫細胞的重要方法。研究顯示此方法對組織的整體結構影響較小，在除去細胞成分的同時仍可保留組織的立體形態和血管結構。Wang 等[31]通過肝門靜脈插管，使用 1% SDS、0.1% 氨水先后對大鼠肝臟進行灌注，直至肝臟透明。對剩余組織進行檢測后發現，其 DNA 含量僅為原組織的 1.1%，且剩余組織中總蛋白、膠原蛋白、糖胺聚糖（glycosaminoglyca，GAG）等含量分別為原組織的 52%、71%、85%，均較大程度得到保留。除上述脫細胞方法外，Seo 等[8]還使用超臨界二氧化碳將大鼠心臟組織脫細胞。實驗人員將獲得的大鼠心臟組織冷凍干燥后剪碎，放于裝有二氧化碳液體的高壓容器內，350 bar 壓力下反應 6 h，然后用含有 DNA 酶的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗。結果顯示，超臨界二氧化碳組與化學試劑組的 DNA 殘留并無顯著差異，而前者膠原、GAG、胰島素樣生長因子結合蛋白-2、血管內皮生長因子等生長因子大部分得到保留，尤其是 GAG 含量在原組織［（7.0 ± 0.5）μg/mg］和實驗組［（6.1 ± 0.4）μg/mg］中十分接近，但化學試劑組中其剩余含量僅為原組織的 14%，進一步突顯了超臨界二氧化碳法相比于其他脫細胞方法的優勢。
1.2 dECM 凝膠化
dECM 水凝膠的形成是基于膠原自組裝的一個過程，同時也受糖胺聚糖、蛋白聚糖和多種蛋白的影響。具體過程包括兩個關鍵步驟：① 利用酶解、酸溶等方法溶解 dECM 制備成均相溶液；② 調整溶液溫度、鹽離子濃度及 pH，或加入交聯劑誘導交聯形成凝膠[4]。
1.2.1 dECM 的溶解
溶解 dECM 最常用的方法是通過胃蛋白酶的消化作用，使不溶性膠原蛋白聚合體在解螺旋后被切割成可溶的單體分子。Freytes 等[32]首次通過凍干、研磨、鹽酸-胃蛋白酶溶液消化以及磁力攪拌等步驟制備了豬膀胱 dECM 溶液。Saheli 等[13]嘗試用 0.5 mol/L 醋酸代替鹽酸對肝臟 dECM 進行溶解，以減少強酸對蛋白、生長因子等活性物質的破壞。除不同酸溶液外，胃蛋白酶的濃度及作用時間也會影響 dECM 的溶解。此外，也可利用尿素對組織 dECM 進行溶解。Uriel 等[33]利用尿素對 dECM 中非共價鍵進行破壞，促進了 dECM 中各類組分的溶解，然后離心去除殘留的非可溶性成分，得到均相的 dECM 溶液。
1.2.2 dECM 溶液成膠
通過改變 dECM 溶液的 pH、鹽離子濃度和外界溫度可促使其發生凝膠化。Freytes 等[32]用氫氧化鈉將豬膀胱 dECM 溶液調至中性（pH ≈ 7.4）后，改變溶液中鹽離子濃度以形成預凝膠，然后通過升溫至 37℃ 形成水凝膠。dECM 溶液預凝膠化是 dECM 水凝膠形成前的關鍵步驟，臨床人員可將該時期的 dECM 預凝膠注射至手術部位，在人體溫度（37℃）下，dECM 預凝膠可迅速形成 dECM 水凝膠。研究表明，dECM 溶液中膠原蛋白單體自組裝形成聚合體的過程中熵增加促使了水凝膠的生成，該成膠反應在較低鹽離子濃度（0.5 × PBS）下被促進，在較高鹽離子濃度（1.5 × PBS）以及溫度小于 22℃ 時被抑制。
1.2.3 dECM 水凝膠的評估
① 水凝膠的微觀結構：組織脫細胞以及 dECM 溶解過程中，原有纖維網狀結構已被破壞，隨著成膠反應的發生，dECM 溶液中膠原蛋白單體經自組裝又形成了新的三維多孔結構。影響 dECM 水凝膠結構的因素主要包括組織 dECM 的來源、凝膠化條件以及水凝膠中各類蛋白濃度等。不同組織來源的 dECM 水凝膠纖維直徑差異較小，凝膠化條件的改變以及各類蛋白濃度對孔徑影響較大。Ungerleider 等[24]使用掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察豬骨骼肌和心肌 dECM 水凝膠，發現重組后的纖維直徑分布在 30～250 nm，平均為 100 nm。Lin 等[20]通過 SEM 觀察戊二醛交聯后的神經 dECM 水凝膠，發現該水凝膠具有納米級多孔結構，重組后的纖維直徑在（55 ± 14）nm，纖維距離分布在 200～300 nm 之間。② 水凝膠的粘彈性：dECM 預凝膠的黏度和凝膠動力學等特性決定了可注射性以及能否保留在特定部位，是其能否成功用于微創手術的重要衡量標準。Sackett 等[17]通過比濁法對胰腺 dECM 水凝膠進行了動力學分析，結果發現胰腺 dECM 水凝膠顯示出類似于Ⅰ型膠原蛋白的“S”形動力學曲線，且兩者達到最大濃度吸光度值的一半時所需時間（T1 / 2）相似。但胰腺 dECM 水凝膠的滯后時間為 5～6 min，短于Ⅰ型膠原蛋白（10～15 min），表明在 37℃ 時，dECM 水凝膠較膠原能更快地發生凝膠化，最后凝膠化過程所需總時間相同。另外 Wu 等[16]還發現，不同濃度豬半月板 dECM 水凝膠的比濁凝膠動力學曲線顯示出類似的“S”形曲線，且水凝膠的滯后時間和凝膠化速率基本不受濃度改變的影響。
2 dECM 水凝膠的臨床前研究
dECM 水凝膠由于具有與自體組織類似的組成和結構，已被廣泛應用于組織工程和再生醫學領域的研究。目前已有科學家將 dECM 水凝膠作為基礎材料，通過加入某些活性成分以及改進其機械性能來模擬機體內部的微環境，從而實現個性化治療，為 dECM 水凝膠臨床應用奠定基礎[5-6, 11]。不同組織來源 dECM 水凝膠的制備工藝及應用效果見表 1。
表1
不同組織來源 dECM 水凝膠的制備工藝及應用效果
Table1.
The preparation process and application of dECM hydrogel from different tissue sources
2.1 心臟
組織損傷后血管的生成對心肌梗死等缺血性疾病的治療起到了至關重要的作用，dECM 水凝膠作為良好的生物支架材料，能夠有效地促進血管生成和加快組織修復[5]。Jang 等[11]分別在豬心臟 dECM 水凝膠及膠原兩種材料上種植人源心臟祖細胞（human c-kit cardiac progenitor cells，hCPCs），7 天后發現心臟 dECM 水凝膠能顯著增強 hCPCs 的黏附、增殖和成心肌分化。將通過 3D 打印技術構建的心臟 dECM 水凝膠仿生支架植入心肌梗死模型大鼠，發現混有間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）以及血管內皮生長因子的 dECM 水凝膠組中，大鼠左心室的厚度、組織中血管數目和直徑、射血分數和縮短分數均明顯增加，表明心臟 dECM 水凝膠不僅可作為載體材料對祖細胞心肌化、血管生成以及心臟組織的修復產生重要調節作用，而且可作為微創手術的植入材料，減少因手術治療造成的周圍組織損傷。Singelyn 等[10]對人冠狀動脈內皮細胞（human coronary artery endothelial cells，HCAECs）和大鼠主動脈平滑肌細胞（rat aortic smooth muscle cells，RASMCs）在豬心臟 dECM 水凝膠中的遷移情況進行評估，發現 dECM 水凝膠可明顯促進兩種細胞向其周圍遷移，RASMCs 在 dECM 水凝膠組中的遷移數目約為對照組的 2 倍。隨后將 dECM 預凝膠注射到 SD 大鼠左心室壁內，術后 4 h 即可觀察到新生小血管，11 天時在注射部位發現大量 HCAECs、RASMCs 以及直徑大于 10 μm 的新生血管，新生小血管數量顯著增加，證明 dECM 水凝膠具有良好的促血管生成的能力。
2.2 胰腺
盡管目前胰島素的使用已十分普及，但每年仍有數百萬人由于血糖控制不佳以及糖尿病相關并發癥而喪失生命。近年來也有學者提出將干細胞與胰腺 ECM 組分混合，以微創手術的形式，將水凝膠注射到體內從而對糖尿病進行治療。例如，Sackett 等[17]制備人源胰腺 dECM 水凝膠，將胰島素瘤細胞系和人臍靜脈內皮細胞種植于胰腺 dECM 水凝膠上，結果顯示 dECM 水凝膠可為細胞黏附生長提供良好的微環境，且細胞存活情況以及胰島素分泌指數與Ⅰ型膠原類似。動物實驗中，將胰腺 dECM 水凝膠和人胎兒胰腺組織植入裸鼠背部皮下，術后 4 周取出植入物，結果發現對照組中小鼠產生強烈的炎癥反應，而實驗組胰腺組織 dECM 水凝膠組并未發現有明顯的炎癥細胞浸潤，表明該水凝膠具有較低的免疫原性，有望成為臨床中輔助治療糖尿病的新型材料。Chaimov 等[18]開發了一種基于豬胰腺 dECM 水凝膠的新型細胞微膠囊化平臺（pancreas encapsulation platform），以用于糖尿病的治療。將包裹成人肝細胞（adult human liver cells，AHLC）和 MSC 的胰腺 dECM 水凝膠注射至 SCID Beige 糖尿病小鼠皮下，每隔 3 日檢測小鼠血糖含量。結果顯示未經處理的對照組小鼠血糖濃度一直維持在 350 mg/dL 左右，而包裹細胞的胰腺 dECM 水凝膠組中小鼠血糖濃度明顯下降，7 天內由 350 mg/dL 降至 210 mg/dL，隨后逐漸上升至 300 mg/dL 并趨于穩定，此結果證明包裹細胞的胰腺 dECM 水凝膠可明顯改善小鼠血糖濃度，有助于糖尿病的治療。
2.3 肝臟
梁成宵等[14]將肝細胞 BRL-3A 種于大鼠肝臟 dECM 水凝膠表面，以對其細胞毒性以及增殖、黏附等生物學活性進行檢測。與空白培養板相比，肝臟 dECM 水凝膠細胞毒性較低，利于細胞的存活；對細胞骨架染色后發現黏附于 dECM 水凝膠表面的細胞呈梭形，且每個視野下細胞黏附數量（84 ± 8）個明顯多于對照組（53 ± 7）個，證明 dECM 水凝膠具有良好的生物相容性，為后續水凝膠在肝臟疾病領域的應用提供了實驗依據。Wang 等[31]將大鼠肝臟 dECM 水凝膠均勻鋪于細胞培養板上，細胞毒性檢測結果顯示人源骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BM-MSC）在實驗組中生長良好，增殖較普通基質膠覆蓋的細胞培養板明顯增加；免疫熒光染色結果顯示 dECM 水凝膠組中 BM-MSC 分泌的尿素、白蛋白和甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）等因子數量更多，表明肝臟 dECM 水凝膠可作為一種理想的支架材料，具有較強的促 BM-MSC 朝肝細胞分化的能力。
2.4 神經
Prest 等[21]將狗外周神經 dECM 水凝膠填入硅膠神經導管內，隨后植入 SD 大鼠坐骨神經缺損模型。術后 3 周結果顯示 dECM 水凝膠能夠促使巨噬細胞和施旺細胞向其周圍遷移，并誘導 M2 型巨噬細胞比例顯著增加，M2 與 M1 型細胞之比接近 1.5∶1，而在對照組中兩者之比僅為 0.5∶1，組織修復速率明顯不及實驗組。Lin 等[20]利用豬源外周神經 dECM 水凝膠（pDNM-G）培養施旺細胞，發現 pDNM-G 具有促進細胞增殖以及維持細胞形態的作用。體內免疫反應評估結果顯示，dECM 水凝膠具有較低的免疫原性，可激活 M2 型巨噬細胞，促進組織損傷的修復。在小鼠坐骨神經 15 mm 缺損模型中，填充有 pDNM-G 的靜電紡絲導管組中軸突的再生長度可達 6 mm 左右，約為對照組的 2 倍；隨后對再生神經的功能進行評估，發現實驗組中運動神經傳導速率明顯快于對照組，達 20 m/s 以上。以上實驗結果表明 pDNM-G 可作為一種良好的生物支架，具有促進神經組織損傷修復的作用。
2.5 其他
Keane 等[7]將豬 SIS dECM 水凝膠植入葡聚糖硫酸誘導的大鼠潰瘍性結腸炎模型，發現 dECM 水凝膠可作為一種良好的粘合劑，附著于腸壁并與細胞緊密結合。同時 dECM 水凝膠能夠增加病變部位 E-鈣粘蛋白陽性細胞的數目，減少腫瘤壞死因子-α 等促炎因子的釋放，促進結腸炎大鼠上皮組織的修復。病變部位 7 天后已基本修復，與正常組織無顯著差異，證明 SIS dECM 水凝膠可快速促進潰瘍性結腸炎的愈合。Wu 等[16]將豬半月板 dECM 水凝膠涂抹于聚苯乙烯培養皿表面，培養牛軟骨細胞和小鼠成纖維細胞。相比于聚苯乙烯，半月板 dECM 水凝膠能顯著促進細胞的增殖，且在 7 天時細胞數目高于對照組約 30%，細胞存活率約為 90%。將 dECM 預凝膠注射至小鼠背部皮下，在材料植入初期可觀察到粒細胞快速遷移至注射部位，7 天時可觀察到巨噬細胞大量浸潤，但并未引起強烈的特異性免疫反應。上述實驗結果均表明半月板 dECM 水凝膠具有良好的生物學性能以及較低的免疫原性，可為后續臨床試驗提供依據。
3 展望
雖然 dECM 水凝膠對多種損傷組織的修復具有顯著促進作用，但不同組織來源 dECM 水凝膠的成分、力學性能、生物特性以及制備工藝的差異，使其在體內的治療效果還不穩定。如何選擇最合適的 dECM 水凝膠用于特定組織的修復依然有待進一步研究。此外 dECM 水凝膠機械性能往往較差，單純依靠調節溶液 pH、鹽離子濃度以及改變溫度的方法只能在一定程度上促使溶液進行交聯，并不能夠明顯提高力學性能。尋找安全有效的新交聯方法，改善水凝膠的機械性能，不僅能夠獲得更好的修復效果，還將擴大水凝膠應用的范圍。隨著科學家對 dECM 水凝膠研究的不斷深入，具有更優良力學和生物學性能的 dECM 水凝膠產品將不斷涌現，為臨床組織修復提供更多的選擇。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
