目前對于在體眼內房水流動的實驗研究較少，相關技術也不成熟。本研究旨在利用粒子圖像測速（PIV）技術，探索急性高眼壓下兔眼前房這種低速流場的在體測量實驗方法和關鍵技術。研究內容包括急性高眼壓兔眼造模、在體測試眼球準備和 PIV 系統搭建三個部分。重點探究用于兔眼 PIV 實驗的熒光粒子最佳注射方案，以及圖像折射和呼吸影響帶來的圖像采集誤差修正方案。研究結果顯示，采用 15 μL 熒光粒子溶液從虹膜下方緩慢注入兔眼前房后回籠等待 13 h，使粒子借助房水循環均勻分布在前房，即可進行在體 PIV 實驗測量；實驗時，需使用帶超聲耦合膠的方形水槽蓋在眼上進行攝像；對測量結果進行后處理計算前，可采用最大互信息算法對數據進行校正。最終研究結果表明，在用 PIV 技術對急性高眼壓兔眼進行在體前房房水流場測試時，選定合適的熒光粒子注射方案及圖像采集修正方案對于得到良好的實驗效果至關重要。
引用本文： 李琦, 王文佳, 龍曉雪, 楊宏宇, 宋紅芳. 基于粒子圖像測速技術的急性高眼壓兔眼在體實驗研究. 生物醫學工程學雜志, 2020, 37(5): 818-824. doi: 10.7507/1001-5515.201912056 復制
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引言
眼部疾病中，青光眼是第二大造成視力損傷的致盲病因，僅次于白內障；也是世界上第一大不可逆致盲眼病[1]。房水流出通道受阻導致眼壓升高是引發青光眼的一大重要原因[2]。房水是充滿眼球前房和后房，并從后房到前房持續循環的無色透明液體，在維持眼球正常生理功能方面起著重要的作用。房水流動受多種因素影響，任何病理改變都可能會干擾其正常的流動，繼而會出現眼壓升高、角膜內皮損傷、晶體前移和虹膜變性。因此，研究眼內房水流動對于了解并掌握高眼壓性青光眼的發病機制有著重要的作用[3]。
目前研究房水流動的方法多采用數值分析方法，既有通過理論推導得到理想情況下的簡化流體力學模型[4]，又有對真實眼球三維重建后的模擬計算模型[5]。但無論如何，數值計算仍然需要與真實流場進行對比。然而，房水流動的實驗測量較為困難，原因之一是房水流動空間狹小、流動緩慢，且流動易受測量條件等外界因素干擾[6]。
課題組人員前期已將粒子圖像測速（particle image velocimetry，PIV）技術用于眼球房水流動研究，但僅被應用在離體眼球或模型上，與真實的流動情況仍有很大差異，主要體現在除了所處的環境過于理想化之外，為了便于測量還使用了與真實房水的低速流場不同的高速快流流場等方面[7-8]。因此，要研究真實眼球房水流場，最好的方法是使用真實眼球進行在體實驗測量，但目前利用 PIV 技術進行眼球房水流動的在體實驗測量還鮮有報道。
基于以上因素，本課題組前期利用 PIV 技術對正常兔眼前房內房水流動狀態進行了測試，但測量方法有所不足，并且未關注急性高眼壓對兔眼房水流場的影響[9]。本文將使用 PIV 技術對急性高眼壓下兔眼前房流場進行在體實驗測量，主要探索 PIV 在小空間、多干擾、慢流速情況下的實驗方法和關鍵技術，為進一步認識真實房水流動提供一定的實驗測量方法，為控制高眼壓性青光眼患者的房水流動提供可靠的監測方法，有利于輔助青光眼的預防與治療。
1 方法
本文實驗技術包括急性高眼壓造模、在體測試眼球準備、PIV 系統搭建三個部分。本課題組前期發表的文獻[9-11]對兔眼急性高眼壓造模方法已有詳細描述，參照文獻[9-11]本文僅做簡要說明。而本文研究重點放在對在體急性高眼壓兔眼測試中的熒光粒子注射方法、折射成像變形矯正和呼吸位移抵消這三個方面進行詳細探究，內容包括：① 對于注射方法，將對比不同的注射劑量、不同等待時間下的注射效果，以選擇最優參數；② 對于折射成像的變形矯正，將針對是否使用填滿超聲耦合膠的方形玻璃槽的攝像效果進行對比；③ 對于呼吸位移的抵消，將采用最大互信息校準算法處理圖像數據；最終形成一套最佳實驗方案，并通過對急性高眼壓在體兔眼的前房流場進行測量以驗證本技術的可行性和優勢。
1.1 急性高眼壓兔眼造模
選用年齡在 3～8 月的健康雄性新西蘭大白兔 15 只（首都醫科大學實驗動物部提供，倫理編號：AEEI-2015-046，2.5 kg/只）作為研究對象，造模成功 5 只。本研究所有動物實驗均按照《首都醫科大學動物實驗及實驗動物管理規定》進行，并經首都醫科大學動物實驗及實驗動物福利委員會批準。
本研究中的急性高眼壓模型采用后房持續注射生理鹽水的方式獲得，為方便后續實驗需要使兔子保持麻醉狀態。使用 24 G 靜脈留置針（碧迪，美國，密閉式靜脈留置針 24 G，Y 型）于耳緣靜脈緩慢注射濃度為 0.3 mL/kg 的陸眠寧（ChemFaces，中國，158642-42-3）進行麻醉，首次麻醉依據兔子體重注射 5 mL/kg，每隔 0.5 h 補充注射 0.5 mL。麻醉效果以手觸碰眼球而不會引起眨眼為宜，據此標準調整注射用量和間隔時間。麻醉后將靜脈留置針扎入兔眼后房，扎入時要注意避免扎到眼部的血管，不要傷到晶體和虹膜。留置針后連接生理鹽水吊瓶維持急性高眼壓，方法是將吊瓶維持在一定高度（使滴注管液面維持在兔眼上方 50.0 cm 附近，即可使兔眼維持 37.59 mm Hg 左右的急性高眼壓），并通過回彈式眼壓計隨時測量眼壓升高情況。
1.2 在體眼球及實驗準備
待模型眼壓相對穩定后，使用渦旋振蕩器（汗諾儀器，中國，XH-D 渦旋混勻器）將濃度為 2.5%，粒徑為 3 μm 的熒光粒子溶液振蕩均勻，用哈密爾頓微量進樣器（Hamilton，瑞士，5 μL 進樣器）從角鞏膜緣下方扎進眼后房，緩慢將針尖移至瞳孔處，先抽出 15 μL 房水，再用同樣方法將不同配比的熒光粒子溶液從瞳孔處緩慢注入眼前房，輕輕晃動并按揉眼球，使熒光粒子與房水充分混合。注入完畢后，將兔放回籠中等待一定時長，使粒子借助房水循環均勻分布在前房，再進行在體 PIV 測量實驗（實驗方案的確定參見本文 1.4 節）。實驗時兔眼球被擠出后使用軟管系住防止縮回，眼周圍毛發應剪去或用膠布束縛以防止阻擋鏡頭，并用布包裹身體以保溫和避免反光。
1.3 PIV 系統搭建
使用由北京工業大學生命科學與生物工程學院提供的 PIV 測試系統進行測試，以 PIV 儀（TSI Inc.，美國）自帶的激光發射器發射出的激光線經過兔眼正中并與其攝像機平行，并使用吊瓶以留置針注入生理鹽水的方式進行急性高眼壓兔眼造模，如圖 1 所示。使用 PIV 系統自帶的 PIV 計算軟件 Insight4 軟件（TSI Inc.，美國）控制激光發生器與攝像機的同步拍攝、圖像處理，然后生成流場計算結果，最終使用數值模擬和計算流體力學結果可視化軟件 Telplot360 （Tecplot Inc.，美國）顯示計算得到的流場結果。
圖1
兔眼 PIV 測試系統示意圖
Figure1.
Diagram of PIV setup for rabbit eye measurement
1.4 兔眼注射熒光粒子方法探究
PIV 測試成功的關鍵在于熒光粒子成功注入眼前房，并能穩定地融合于房水中，故需探究向兔眼注射熒光粒子的最佳方法。探究內容包括注射熒光粒子的濃度、位置以及注射熒光粒子后的等待時間。注射成功的標準為：注射后不會使兔眼角膜膨脹而發生褶皺，粒子在前房中混合均勻，存留的粒子濃度能滿足 PIV 實驗要求，粒子不出現抱團、貼壁、沉淀等不均勻分布情況，眼壓恢復正常范圍（15～20 mm Hg）。
注射熒光粒子濃度的探究方案為：將粒徑為 3 μm 的熒光粒子分為 a、b、c 三組。a 組為 10 μL 熒光粒子與 10 μL 純水混合；b 組為不混合純水的 15 μL 熒光粒子；c 組為不混合純水的 25 μL 熒光粒子。
注射熒光粒子位置的探究方案為：用哈密爾頓微量進樣器從角鞏膜緣下方進入眼后房，再將針尖分別移動至瞳孔處以及虹膜下方注入熒光粒子。
注射熒光粒子后等待時間的探究方案為：注入熒光粒子后，分別間隔 7、8、9、10、11、12、13、48、81 h，用激光筆測試兔眼熒光粒子混合情況。
1.5 兔眼折射成像變形探究
由于眼球具有弧度且內部充滿房水，激光打在外表面通過 PIV 對其內部流場進行圖像采集，結果會不真實。故本研究采用直接測量和在眼球外加一個方形透明槽進行測量兩種方法，對比兩者的測量效果。此方形槽用透明的玻片粘接而成，槽內填滿超聲耦合膠，且方形槽內應保持透明無氣泡，角膜表面緊貼耦合劑，當將其置于眼球上時，期望可達到消除內部房水弧形面影響的目的。
1.6 圖像抵消呼吸位移探究
由于兔眼仍會隨著呼吸而上下起伏，在測試過程中會帶來圖像的虛假信息，故需對拍攝到的圖像進行校準以消除此位移的影響。本文采用最大互信息圖像校準算法進行處理[12]，每張圖與前一個時刻的圖像進行對準，依據角膜虹膜等高亮區的形狀和位置進行校準。
1.7 實驗效果檢驗
通過對上述實驗方法探明最適組合參數后，對進行急性高眼壓造模后的 5 只兔子雙眼進行 PIV 測試以檢驗方法效果，5 只兔子隨機標為：一、二、三、四、五號，每只眼睛用 1.4 小節確定的探究方案完成熒光粒子注射，實驗測量 90 s 內的流場變化圖像。
2 結果
2.1 最佳注射方法
對熒光粒子濃度的研究結果發現，三組不同濃度的熒光粒子分別注入兔眼后，a 組和 c 組的熒光粒子會黏附在一起形成絮狀物并吸附沉淀在前房各壁面上；與之相對應的是 b 組熒光粒子在注入兔眼后，不會出現抱團、貼壁、沉淀等不均勻分布情況。因此比較后可以發現，注入 15 μL 熒光粒子的效果更好。
對熒光粒子注射位置的研究發現，從瞳孔處注入熒光粒子會抱絮狀并吸附在虹膜上，而從虹膜下方注入則不會出現該現象。這可能是由于粒子從虹膜下方注入并順著房水循環進入前房，相較于直接從瞳孔處注入前房，有更充分的時間分散在房水中。
熒光粒子注射后等待時間的研究發現，雖然不同兔子存在個體差異，但 13 h 后，所有兔眼中的熒光粒子已完全均勻擴散在前房中，符合實驗需求的最佳測試狀態，因此確定 13 h 為最佳等待時間。
綜合考慮，最終的熒光粒子注射方案如下：用哈密爾頓微量進樣器從角鞏膜緣下方扎進眼后房，將針尖緩慢移至虹膜下方，先抽出 15 μL 房水，再用同樣方法將 15 μL 熒光粒子溶液從虹膜下方處緩慢注入眼前房，輕輕晃動并按揉眼球，使熒光粒子與房水混合充分。注入完畢后，將兔放回等待 13 h，使粒子借助房水循環充分分布在前房后，再進行在體 PIV 測量實驗，最終粒子在兔眼中的分布如圖 2 所示。
圖2
注射粒子 13 h 后兔眼中的粒子分布
Figure2.
Particle distribution in rabbit eye 13 h after injection
2.2 折射成像變形矯正
使用加蓋填滿超聲耦合膠的方形玻璃槽進行拍攝，效果與直接測試結果對比，并計算出渦量如圖 3 所示。可以看到，加蓋后的照片中前房的面積更大，形狀與真實形狀更為接近，并且粒子更加清晰。此外，通過圖 3 的渦量圖還可以看到加蓋后的測試結果中，流場被測量到的面積更大，缺失部分更少，更能反映真實流場情況。由于角膜具有親水性，加方形槽大約 10 min 后就會影響角膜透明度，因此測試應當在此時間內完成。
圖3
PIV 設備拍攝的照片及生成的渦量圖
Figure3.
Photograph taken by PIV and vorticity diagram generated by PIV
2.3 呼吸位移的抵消
采用最大互信息圖像校準算法校準效果如圖 4 所示，經此校準后其兩張圖片之間的整體位移變小，消除了很大一部分因呼吸帶來的位移影響，在分辨率為 2 048 × 2 048，像素為 72 dpi 的圖像中，此部分影響約為 10 個像素點，且多為斜向位移。
圖4
兔眼流場的校正效果對比
Figure4.
Comparison of correction effect for rabbit eye flow field
2.4 實驗效果檢驗
對 5 只急性高眼壓造模成功的兔子雙眼進行 PIV 測試。測試結束后，只有一號兔左眼、二號兔雙眼、三號兔右眼、四號兔右眼、五號兔右眼共計 6 只眼球可以得到 PIV 測試結果，其他 4 只眼球中都發生了粒子貼壁或者角膜模糊以至于無法得到 PIV 測試結果，方法成功率為 60%。
以五號兔為例，從 0～90 s 之間每 10 s 計算一次流場，計算結果如圖 5、圖 6 所示。
圖5
五號兔右眼 0 s 流場
Figure5.
Flow field in the right eye of rabbit No.5 at 0 s
圖6
五號兔右眼 90 s 內流場
Figure6.
Flow field in the right eye of rabbit No.5 during 90 s time window
最終結果測得流速數量級為 10-5 m/s，流場形狀雖然不規則，但大致方向與現有理論計算結果相似[13]，都從瞳孔進入，房角流出，其中都會產生渦旋，但大多只有一個渦旋，或左或右不定。但與現有理論計算結果不同的是，兔眼中的流場極不穩定，在 90 s 內不斷變化。
3 討論
本實驗基于急性高眼壓兔眼模型，將 PIV 技術運用于兔眼前房進行在體流場測量，探索出一種對于小空間、多干擾、低速流場的在體測量方案。從熒光粒子的注射、圖像信息的處理等方面著手，真實再現了前房房水的流態，為研究房水流動提供了一種可行的實驗測量方法。。
由于兔眼本身及所處環境的復雜性，本實驗成功率不夠理想僅有 60%，這也是在體測量的一個難點，但作為一種方法探索，仍有它的價值。由于等待熒光粒子混合均勻的時間過長，在此過程中不可控制的因素太多，影響最大的就是對熒光粒子溶液的處理。首先，熒光粒子本身的品質會對注射效果有很大影響；其次，熒光粒子溶液中含水量過多會增加粒子凝結成絮的可能性；最后，對熒光粒子振蕩不充分也會導致其沉淀。
在忽略掉角膜厚度不均勻帶來的屈光度誤差后，使用方形槽與超聲耦合膠能夠成功抵消由于空氣與房水折射率的不同引起的變形，這使得本文結果更具真實性。雖然超聲耦合膠與房水的折射率并不完全相同，但如果換為以水填充，會因為實驗條件下與方形槽結合不緊密而泄露，從而使實驗失敗。另一方面，這種方法的一大難點在于超聲耦合膠在注射入水槽中時會在內部產生大量氣泡，可使用注射器緩慢而細致地將較大氣泡全部抽走，僅殘留不影響實驗的微小氣泡，從而制備出可供實驗使用的方形槽。今后，可將實驗改進，設計更貼合兔眼的水槽或通過增加水槽的重力解決水從中泄露的問題，同時也期待未來能找到更好的去除超聲耦合膠氣泡的方法。
在體測得的流場相較于理論計算的結果[13]，變化非常劇烈，這種差別一方面有來自實驗的誤差，另一方面在于在體兔眼實驗本身的復雜性，如溫度、重力、呼吸心跳等帶來的位移，這些因素的共同作用導致兔眼流場形狀不規則且隨時間不斷變化，這或許就是真實的流場狀態。本文研究結果顯示，在體測得的流速數量級為 10?5 m/s，小于模型實驗測得的數量級 10?4 m/s[11]以及離體眼球實驗數量級 10?2 m/s [7]；相比之下，本文研究確實實現了低速的在體測量。此外還發現，流場最大速度的位置在左右之間不斷變化且位于角膜內皮和虹膜上皮附近，渦旋也在左右變化但都位于虹膜附近，這可能會對角膜內皮細胞與虹膜上皮細胞造成損傷[11]，從而導致其力學性質發生變化。研究中的另一個問題在于，測試結果只在前房中間效果較好，在瞳孔、虹膜、房角等邊界效果較差，這是由于這些部位處的粒子容易黏附以及部位本身的不透明所致。
總之，本文研究結果表明，在用 PIV 技術對急性高眼壓兔眼進行在體前房房水流場測試時，選定合適的熒光粒子注射方案及圖像采集修正方案對于得到良好的實驗效果至關重要。本文經過多方嘗試，考慮多種可能影響因素，實現了將 PIV 技術應用于眼內這種小空間、低流速流場的在體測量。探索出的實驗測量技術是一種全新的嘗試，是對現有在體實驗測量技術的一次很好的補充。但實驗方法在減小誤差以及提高實驗成功率方面仍有很大的改進空間，不斷變化的流場與現有理論計算結果的差異，也提示今后應當對房水動力學進行更進一步的研究。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
引言
眼部疾病中，青光眼是第二大造成視力損傷的致盲病因，僅次于白內障；也是世界上第一大不可逆致盲眼病[1]。房水流出通道受阻導致眼壓升高是引發青光眼的一大重要原因[2]。房水是充滿眼球前房和后房，并從后房到前房持續循環的無色透明液體，在維持眼球正常生理功能方面起著重要的作用。房水流動受多種因素影響，任何病理改變都可能會干擾其正常的流動，繼而會出現眼壓升高、角膜內皮損傷、晶體前移和虹膜變性。因此，研究眼內房水流動對于了解并掌握高眼壓性青光眼的發病機制有著重要的作用[3]。
目前研究房水流動的方法多采用數值分析方法，既有通過理論推導得到理想情況下的簡化流體力學模型[4]，又有對真實眼球三維重建后的模擬計算模型[5]。但無論如何，數值計算仍然需要與真實流場進行對比。然而，房水流動的實驗測量較為困難，原因之一是房水流動空間狹小、流動緩慢，且流動易受測量條件等外界因素干擾[6]。
課題組人員前期已將粒子圖像測速（particle image velocimetry，PIV）技術用于眼球房水流動研究，但僅被應用在離體眼球或模型上，與真實的流動情況仍有很大差異，主要體現在除了所處的環境過于理想化之外，為了便于測量還使用了與真實房水的低速流場不同的高速快流流場等方面[7-8]。因此，要研究真實眼球房水流場，最好的方法是使用真實眼球進行在體實驗測量，但目前利用 PIV 技術進行眼球房水流動的在體實驗測量還鮮有報道。
基于以上因素，本課題組前期利用 PIV 技術對正常兔眼前房內房水流動狀態進行了測試，但測量方法有所不足，并且未關注急性高眼壓對兔眼房水流場的影響[9]。本文將使用 PIV 技術對急性高眼壓下兔眼前房流場進行在體實驗測量，主要探索 PIV 在小空間、多干擾、慢流速情況下的實驗方法和關鍵技術，為進一步認識真實房水流動提供一定的實驗測量方法，為控制高眼壓性青光眼患者的房水流動提供可靠的監測方法，有利于輔助青光眼的預防與治療。
1 方法
本文實驗技術包括急性高眼壓造模、在體測試眼球準備、PIV 系統搭建三個部分。本課題組前期發表的文獻[9-11]對兔眼急性高眼壓造模方法已有詳細描述，參照文獻[9-11]本文僅做簡要說明。而本文研究重點放在對在體急性高眼壓兔眼測試中的熒光粒子注射方法、折射成像變形矯正和呼吸位移抵消這三個方面進行詳細探究，內容包括：① 對于注射方法，將對比不同的注射劑量、不同等待時間下的注射效果，以選擇最優參數；② 對于折射成像的變形矯正，將針對是否使用填滿超聲耦合膠的方形玻璃槽的攝像效果進行對比；③ 對于呼吸位移的抵消，將采用最大互信息校準算法處理圖像數據；最終形成一套最佳實驗方案，并通過對急性高眼壓在體兔眼的前房流場進行測量以驗證本技術的可行性和優勢。
1.1 急性高眼壓兔眼造模
選用年齡在 3～8 月的健康雄性新西蘭大白兔 15 只（首都醫科大學實驗動物部提供，倫理編號：AEEI-2015-046，2.5 kg/只）作為研究對象，造模成功 5 只。本研究所有動物實驗均按照《首都醫科大學動物實驗及實驗動物管理規定》進行，并經首都醫科大學動物實驗及實驗動物福利委員會批準。
本研究中的急性高眼壓模型采用后房持續注射生理鹽水的方式獲得，為方便后續實驗需要使兔子保持麻醉狀態。使用 24 G 靜脈留置針（碧迪，美國，密閉式靜脈留置針 24 G，Y 型）于耳緣靜脈緩慢注射濃度為 0.3 mL/kg 的陸眠寧（ChemFaces，中國，158642-42-3）進行麻醉，首次麻醉依據兔子體重注射 5 mL/kg，每隔 0.5 h 補充注射 0.5 mL。麻醉效果以手觸碰眼球而不會引起眨眼為宜，據此標準調整注射用量和間隔時間。麻醉后將靜脈留置針扎入兔眼后房，扎入時要注意避免扎到眼部的血管，不要傷到晶體和虹膜。留置針后連接生理鹽水吊瓶維持急性高眼壓，方法是將吊瓶維持在一定高度（使滴注管液面維持在兔眼上方 50.0 cm 附近，即可使兔眼維持 37.59 mm Hg 左右的急性高眼壓），并通過回彈式眼壓計隨時測量眼壓升高情況。
1.2 在體眼球及實驗準備
待模型眼壓相對穩定后，使用渦旋振蕩器（汗諾儀器，中國，XH-D 渦旋混勻器）將濃度為 2.5%，粒徑為 3 μm 的熒光粒子溶液振蕩均勻，用哈密爾頓微量進樣器（Hamilton，瑞士，5 μL 進樣器）從角鞏膜緣下方扎進眼后房，緩慢將針尖移至瞳孔處，先抽出 15 μL 房水，再用同樣方法將不同配比的熒光粒子溶液從瞳孔處緩慢注入眼前房，輕輕晃動并按揉眼球，使熒光粒子與房水充分混合。注入完畢后，將兔放回籠中等待一定時長，使粒子借助房水循環均勻分布在前房，再進行在體 PIV 測量實驗（實驗方案的確定參見本文 1.4 節）。實驗時兔眼球被擠出后使用軟管系住防止縮回，眼周圍毛發應剪去或用膠布束縛以防止阻擋鏡頭，并用布包裹身體以保溫和避免反光。
1.3 PIV 系統搭建
使用由北京工業大學生命科學與生物工程學院提供的 PIV 測試系統進行測試，以 PIV 儀（TSI Inc.，美國）自帶的激光發射器發射出的激光線經過兔眼正中并與其攝像機平行，并使用吊瓶以留置針注入生理鹽水的方式進行急性高眼壓兔眼造模，如圖 1 所示。使用 PIV 系統自帶的 PIV 計算軟件 Insight4 軟件（TSI Inc.，美國）控制激光發生器與攝像機的同步拍攝、圖像處理，然后生成流場計算結果，最終使用數值模擬和計算流體力學結果可視化軟件 Telplot360 （Tecplot Inc.，美國）顯示計算得到的流場結果。
圖1
兔眼 PIV 測試系統示意圖
Figure1.
Diagram of PIV setup for rabbit eye measurement
1.4 兔眼注射熒光粒子方法探究
PIV 測試成功的關鍵在于熒光粒子成功注入眼前房，并能穩定地融合于房水中，故需探究向兔眼注射熒光粒子的最佳方法。探究內容包括注射熒光粒子的濃度、位置以及注射熒光粒子后的等待時間。注射成功的標準為：注射后不會使兔眼角膜膨脹而發生褶皺，粒子在前房中混合均勻，存留的粒子濃度能滿足 PIV 實驗要求，粒子不出現抱團、貼壁、沉淀等不均勻分布情況，眼壓恢復正常范圍（15～20 mm Hg）。
注射熒光粒子濃度的探究方案為：將粒徑為 3 μm 的熒光粒子分為 a、b、c 三組。a 組為 10 μL 熒光粒子與 10 μL 純水混合；b 組為不混合純水的 15 μL 熒光粒子；c 組為不混合純水的 25 μL 熒光粒子。
注射熒光粒子位置的探究方案為：用哈密爾頓微量進樣器從角鞏膜緣下方進入眼后房，再將針尖分別移動至瞳孔處以及虹膜下方注入熒光粒子。
注射熒光粒子后等待時間的探究方案為：注入熒光粒子后，分別間隔 7、8、9、10、11、12、13、48、81 h，用激光筆測試兔眼熒光粒子混合情況。
1.5 兔眼折射成像變形探究
由于眼球具有弧度且內部充滿房水，激光打在外表面通過 PIV 對其內部流場進行圖像采集，結果會不真實。故本研究采用直接測量和在眼球外加一個方形透明槽進行測量兩種方法，對比兩者的測量效果。此方形槽用透明的玻片粘接而成，槽內填滿超聲耦合膠，且方形槽內應保持透明無氣泡，角膜表面緊貼耦合劑，當將其置于眼球上時，期望可達到消除內部房水弧形面影響的目的。
1.6 圖像抵消呼吸位移探究
由于兔眼仍會隨著呼吸而上下起伏，在測試過程中會帶來圖像的虛假信息，故需對拍攝到的圖像進行校準以消除此位移的影響。本文采用最大互信息圖像校準算法進行處理[12]，每張圖與前一個時刻的圖像進行對準，依據角膜虹膜等高亮區的形狀和位置進行校準。
1.7 實驗效果檢驗
通過對上述實驗方法探明最適組合參數后，對進行急性高眼壓造模后的 5 只兔子雙眼進行 PIV 測試以檢驗方法效果，5 只兔子隨機標為：一、二、三、四、五號，每只眼睛用 1.4 小節確定的探究方案完成熒光粒子注射，實驗測量 90 s 內的流場變化圖像。
2 結果
2.1 最佳注射方法
對熒光粒子濃度的研究結果發現，三組不同濃度的熒光粒子分別注入兔眼后，a 組和 c 組的熒光粒子會黏附在一起形成絮狀物并吸附沉淀在前房各壁面上；與之相對應的是 b 組熒光粒子在注入兔眼后，不會出現抱團、貼壁、沉淀等不均勻分布情況。因此比較后可以發現，注入 15 μL 熒光粒子的效果更好。
對熒光粒子注射位置的研究發現，從瞳孔處注入熒光粒子會抱絮狀并吸附在虹膜上，而從虹膜下方注入則不會出現該現象。這可能是由于粒子從虹膜下方注入并順著房水循環進入前房，相較于直接從瞳孔處注入前房，有更充分的時間分散在房水中。
熒光粒子注射后等待時間的研究發現，雖然不同兔子存在個體差異，但 13 h 后，所有兔眼中的熒光粒子已完全均勻擴散在前房中，符合實驗需求的最佳測試狀態，因此確定 13 h 為最佳等待時間。
綜合考慮，最終的熒光粒子注射方案如下：用哈密爾頓微量進樣器從角鞏膜緣下方扎進眼后房，將針尖緩慢移至虹膜下方，先抽出 15 μL 房水，再用同樣方法將 15 μL 熒光粒子溶液從虹膜下方處緩慢注入眼前房，輕輕晃動并按揉眼球，使熒光粒子與房水混合充分。注入完畢后，將兔放回等待 13 h，使粒子借助房水循環充分分布在前房后，再進行在體 PIV 測量實驗，最終粒子在兔眼中的分布如圖 2 所示。
圖2
注射粒子 13 h 后兔眼中的粒子分布
Figure2.
Particle distribution in rabbit eye 13 h after injection
2.2 折射成像變形矯正
使用加蓋填滿超聲耦合膠的方形玻璃槽進行拍攝，效果與直接測試結果對比，并計算出渦量如圖 3 所示。可以看到，加蓋后的照片中前房的面積更大，形狀與真實形狀更為接近，并且粒子更加清晰。此外，通過圖 3 的渦量圖還可以看到加蓋后的測試結果中，流場被測量到的面積更大，缺失部分更少，更能反映真實流場情況。由于角膜具有親水性，加方形槽大約 10 min 后就會影響角膜透明度，因此測試應當在此時間內完成。
圖3
PIV 設備拍攝的照片及生成的渦量圖
Figure3.
Photograph taken by PIV and vorticity diagram generated by PIV
2.3 呼吸位移的抵消
采用最大互信息圖像校準算法校準效果如圖 4 所示，經此校準后其兩張圖片之間的整體位移變小，消除了很大一部分因呼吸帶來的位移影響，在分辨率為 2 048 × 2 048，像素為 72 dpi 的圖像中，此部分影響約為 10 個像素點，且多為斜向位移。
圖4
兔眼流場的校正效果對比
Figure4.
Comparison of correction effect for rabbit eye flow field
2.4 實驗效果檢驗
對 5 只急性高眼壓造模成功的兔子雙眼進行 PIV 測試。測試結束后，只有一號兔左眼、二號兔雙眼、三號兔右眼、四號兔右眼、五號兔右眼共計 6 只眼球可以得到 PIV 測試結果，其他 4 只眼球中都發生了粒子貼壁或者角膜模糊以至于無法得到 PIV 測試結果，方法成功率為 60%。
以五號兔為例，從 0～90 s 之間每 10 s 計算一次流場，計算結果如圖 5、圖 6 所示。
圖5
五號兔右眼 0 s 流場
Figure5.
Flow field in the right eye of rabbit No.5 at 0 s
圖6
五號兔右眼 90 s 內流場
Figure6.
Flow field in the right eye of rabbit No.5 during 90 s time window
最終結果測得流速數量級為 10-5 m/s，流場形狀雖然不規則，但大致方向與現有理論計算結果相似[13]，都從瞳孔進入，房角流出，其中都會產生渦旋，但大多只有一個渦旋，或左或右不定。但與現有理論計算結果不同的是，兔眼中的流場極不穩定，在 90 s 內不斷變化。
3 討論
本實驗基于急性高眼壓兔眼模型，將 PIV 技術運用于兔眼前房進行在體流場測量，探索出一種對于小空間、多干擾、低速流場的在體測量方案。從熒光粒子的注射、圖像信息的處理等方面著手，真實再現了前房房水的流態，為研究房水流動提供了一種可行的實驗測量方法。。
由于兔眼本身及所處環境的復雜性，本實驗成功率不夠理想僅有 60%，這也是在體測量的一個難點，但作為一種方法探索，仍有它的價值。由于等待熒光粒子混合均勻的時間過長，在此過程中不可控制的因素太多，影響最大的就是對熒光粒子溶液的處理。首先，熒光粒子本身的品質會對注射效果有很大影響；其次，熒光粒子溶液中含水量過多會增加粒子凝結成絮的可能性；最后，對熒光粒子振蕩不充分也會導致其沉淀。
在忽略掉角膜厚度不均勻帶來的屈光度誤差后，使用方形槽與超聲耦合膠能夠成功抵消由于空氣與房水折射率的不同引起的變形，這使得本文結果更具真實性。雖然超聲耦合膠與房水的折射率并不完全相同，但如果換為以水填充，會因為實驗條件下與方形槽結合不緊密而泄露，從而使實驗失敗。另一方面，這種方法的一大難點在于超聲耦合膠在注射入水槽中時會在內部產生大量氣泡，可使用注射器緩慢而細致地將較大氣泡全部抽走，僅殘留不影響實驗的微小氣泡，從而制備出可供實驗使用的方形槽。今后，可將實驗改進，設計更貼合兔眼的水槽或通過增加水槽的重力解決水從中泄露的問題，同時也期待未來能找到更好的去除超聲耦合膠氣泡的方法。
在體測得的流場相較于理論計算的結果[13]，變化非常劇烈，這種差別一方面有來自實驗的誤差，另一方面在于在體兔眼實驗本身的復雜性，如溫度、重力、呼吸心跳等帶來的位移，這些因素的共同作用導致兔眼流場形狀不規則且隨時間不斷變化，這或許就是真實的流場狀態。本文研究結果顯示，在體測得的流速數量級為 10?5 m/s，小于模型實驗測得的數量級 10?4 m/s[11]以及離體眼球實驗數量級 10?2 m/s [7]；相比之下，本文研究確實實現了低速的在體測量。此外還發現，流場最大速度的位置在左右之間不斷變化且位于角膜內皮和虹膜上皮附近，渦旋也在左右變化但都位于虹膜附近，這可能會對角膜內皮細胞與虹膜上皮細胞造成損傷[11]，從而導致其力學性質發生變化。研究中的另一個問題在于，測試結果只在前房中間效果較好，在瞳孔、虹膜、房角等邊界效果較差，這是由于這些部位處的粒子容易黏附以及部位本身的不透明所致。
總之，本文研究結果表明，在用 PIV 技術對急性高眼壓兔眼進行在體前房房水流場測試時，選定合適的熒光粒子注射方案及圖像采集修正方案對于得到良好的實驗效果至關重要。本文經過多方嘗試，考慮多種可能影響因素，實現了將 PIV 技術應用于眼內這種小空間、低流速流場的在體測量。探索出的實驗測量技術是一種全新的嘗試，是對現有在體實驗測量技術的一次很好的補充。但實驗方法在減小誤差以及提高實驗成功率方面仍有很大的改進空間，不斷變化的流場與現有理論計算結果的差異，也提示今后應當對房水動力學進行更進一步的研究。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
