離子導入法中寄生離子對紫外交聯效果的影響尚不清楚。本文采用核黃素乳酸鈉林格液（A 組）和核黃素生理鹽水（B 組）作為離子導入溶液，對離體豬眼鞏膜進行紫外交聯，計算了溶液中寄生離子濃度；檢測了核黃素導入后的平均熒光強度、滲透深度、滲透濃度以及交聯后鞏膜組織力學性能；推算了兩種溶液的擴散系數范圍。結果表明，A 組溶液含寄生離子種類較 B 組多；滲透 10 min 后，B 組核黃素平均熒光強度、滲透深度、滲透濃度及鞏膜彈性模量均明顯高于 A 組；B 組核黃素的擴散系數約是 A 組的 1.5 倍。本文研究結果提示，寄生離子種類對核黃素導入的滲透性影響較大，并且還會進一步影響交聯后鞏膜組織的力學性能。基于以上研究結果，期望本研究可為今后施行離子導入鞏膜交聯術時提高核黃素導入效率、優化核黃素配方提供參考。
引用本文： 王靖, 李曉娜, 高志鵬, 陳凌峰, 陳維毅, 吳婷婷. 寄生離子對離子導入鞏膜交聯術核黃素滲透性及交聯效果的影響. 生物醫學工程學雜志, 2021, 38(5): 869-876. doi: 10.7507/1001-5515.202104034 復制
版權信息： ?四川大學華西醫院華西期刊社《生物醫學工程學雜志》版權所有，未經授權不得轉載、改編
引言
高度近視是全球常見的眼疾之一，已成為視力損害和致盲的重要原因。高度近視，尤其是病理性近視，與鞏膜組織變薄和生物力學強度減弱導致的眼球軸向過度伸長有關[1]。近年研究發現，核黃素—紫外線 A 膠原交聯療法通過膠原之間的交聯作用，增強實驗動物鞏膜生物力學性能，提高鞏膜抗變形能力，有望成為控制近視發展的新方法[2-7]。離子導入核黃素因具有高效的給藥效率，可縮短手術時間，在角膜和鞏膜交聯術中開始逐漸得到關注[8-9]。
藥物離子導入法是一種非侵入性技術，原理是通過施加小電流來增強藥物在組織中的滲透[10]。影響藥物離子導入效率的因素有：電流強度及通電時間、離子的活潑性、藥物濃度、溶劑的性質和寄生離子等[11]。寄生離子是指在同一襯布墊極上，與需要導入組織的有效藥物離子極性相同的離子，兩者在導入機體時形成競爭關系，從而影響有效離子進入機體的量。在離子導入核黃素—紫外線 A 鞏膜膠原交聯術中，核黃素溶液常用溶劑是乳酸鈉林格液和生理鹽水溶液，溶液濃度和電流強度是相對固定值，但兩種核黃素溶液所含寄生離子種類對離子遞送核黃素效率的影響尚不清楚。
核黃素在組織中的滲透性可用滲透深度、滲透速率和滲透濃度表征[12]。擴散系數可用于評價物質的滲透性[13]。菲克第二定律可以定量描述核黃素溶液向基質一維擴散的行為[14]，其中擴散系數是沿擴散方向在單位時間每單位濃度梯度下，垂直通過單位面積所擴散某物質的質量或摩爾數。由于在實驗中直接檢測擴散系數存在一定難度，采用數值模擬手段與滲透實驗結合，可以很好地預測核黃素的滲透性[15]。
本文通過實驗和數值模擬研究了兩種核黃素溶液經離子導入后在鞏膜內的滲透性，通過實驗比較紫外線 A 照射前后鞏膜生物力學性能的改變，以此探索寄生離子對離子導入的影響，以期優化離子導入核黃素配方，為提高鞏膜交聯術離子導入核黃素試劑的效率提供參考。
1 實驗材料和方法
1.1 實驗對象及分組
實驗使用新鮮家豬眼球，取自太原屠宰場，置于 4℃ 保鮮盒中運輸至實驗室。清理眼球附著組織后浸沒于磷酸鹽緩沖鹽（phosphate buffered saline，PBS）溶液，暫存于 4℃ 冰箱，4 h 內完成實驗。實驗過程符合動物倫理要求。
將實驗分為三組：空白對照組、離子導入核黃素乳酸鈉林格液組（A 組）、離子導入核黃素生理鹽水組（B 組）。每組至少 5 個離體豬眼球，空白對照組不作任何處理。
1.2 離子導入核黃素實驗
將眼球置于人工前房，通過抽拉注射器使眼球眼壓穩定在正常生理范圍內。連接離子導入系統（SOOFT Italia Spa，意大利），對眼球后極部鞏膜進行 10 min 離子導入，導入區域直徑 9 mm，實驗所用核黃素濃度為 0.1%。
1.2.1 核黃素溶液離子成分的分析
核黃素用于離子導入時，帶有正電荷。溶液中含有相同極性的離子（陽離子）即為寄生離子。乳酸鈉林格注射液為復方制劑，每 1 000 mL 中含乳酸鈉 3.10 g、氯化鈉 6.00 g、氯化鉀 0.30 g、氯化鈣 0.20 g；0.9% 氯化鈉注射液（生理鹽水）每 500 mL 含氯化鈉 4.5 g。將 20 mg 注射用核黃素磷酸鈉分別溶入 20 mL 上述乳酸鈉林格注射液和 0.9% 氯化鈉注射液，配制成 A、B 兩組 0.1% 核黃素溶液。兩種核黃素溶液所含寄生離子濃度計算公式，如式（1）、式（2）所示：
 |
 '/> |
其中，m 為物質的質量，M 為物質的摩爾質量，n 為物質的量。根據各物質的化學式，計算出寄生離子物質的量，用 
表示 。 式（2）中，V 為溶液體積，c 為寄生離子物質的量濃度。
1.2.2 核黃素滲透性檢測
（1）冰凍切片及顯微鏡觀察：離子導入核黃素后，沿鞏膜厚度方向制作冰凍切片，置于熒光倒置顯微鏡下觀察拍照，使用圖像處理軟件 Image J 8.0（National Institutes of Health，美國）測量核黃素的平均熒光強度[16]。根據空白對照組灰度值變化，取其灰度值上限的平均，作為滲透深度測量的檢測閾值；滲透深度定義為 A 組和 B 組灰度值—鞏膜厚度曲線與檢測閾值相交第一點[17]，如圖 1 所示。滲透深度百分比定義為滲透深度占鞏膜厚度的比值，滲透速率定義為滲透深度與滲透時間的比值[17]。
圖1
鞏膜切片的灰度值—鞏膜厚度曲線與檢測閾值的交線示意圖
Figure1.
Schematic diagram of intersection between gray value - scleral thickness curve of scleral slice and detection threshold
（2）鞏膜組織高效液相色譜分析：通過稱量質量、勻漿定容、輔助分離核黃素、去蛋白和兩次低溫高速離心，對核黃素給藥后的鞏膜組織進行處理，收取上清液作為測試溶液[18]。通過高效液相色譜儀（LC20A，島津株式會社，日本）獲取核黃素標準品色譜圖、核黃素標準品濃度和峰面積相關曲線（標準曲線）、空白對照組色譜圖、A 組和 B 組測試溶液色譜圖，定量分析鞏膜組織核黃素濃度。
1.3 鞏膜組織核黃素滲透模型建立
使用多物理場仿真軟件 COMSOL Multiphysics 5.3a（COMSOL Inc.，瑞典）建立簡化的旋轉對稱鞏膜組織模型，以去上皮角膜核黃素軸向擴散系數[14]為基準，模擬相同滲透時間（10 min）不同擴散系數下核黃素的滲透情況。模型直徑為 9 mm，厚度為 1.254 mm（數據來自于離子導入核黃素實驗的滲透性檢測部分）。邊界條件是沿旋轉軸的軸向對稱，初始條件是將 0.1% 的核黃素施加到鞏膜外表面，即模型的上邊界，鞏膜在 0 min 時沒有核黃素存在。
采用菲克第二定律計算核黃素的擴散行為[15]，如式（3）所示：
 |
式（3）中，c(x, y, z; t)為鞏膜模型中任意時刻核黃素的濃度；D 為特征擴散系數。標準擴散系數 D0 = 6.5 × 10-5 mm2/s[14]。模擬結果與 1.2.2 小節步驟（1）實驗數據對比，推算出與實驗結果最吻合的擴散系數范圍。
1.4 紫外線交聯實驗
離子導入核黃素后進行紫外線 A 照射。照射采用角膜交聯系統 VEGA（10 mW，CSO Srl.，意大利），照射時間為 9 min，照射強度為 10 mW/cm2，總照射能量密度為 5.4 J/cm2。
1.5 鞏膜條帶單軸拉伸實驗
豬眼鞏膜行交聯術后，將交聯部位沿矢狀面制備成條帶，采用力學試驗機 INSTRON-5544（C8024，Instron Co.Ltd.，美國）對鞏膜條帶進行單軸拉伸測試。首先進行 5 次加載速率為 1 mm/min 的預加載，正式加載速率與預加載相同，記錄載荷—位移關系。
1.6 數據分析
實驗數據均以“均值 ± 標準差”表示，用統計分析軟件 SPSS 24.0（IBM 公司，美國）進行獨立樣本 t 檢驗和單因素方差分析，P < 0.05 表示差異具有統計學意義。
2 結果
2.1 兩種核黃素溶液所含寄生離子成分及濃度
通過式（1）和式（2）計算得出兩種核黃素溶液寄生離子成分及濃度如表 1 所示，核黃素乳酸鈉林格液的金屬陽離子除 Na+外，還含有 K+和 Ga+，濃度分別為 132.27 mmol/L、4.03 mmol/L 和 1.36 mmol/L；核黃素生理鹽水只含有 Na+，濃度為 156.00 mmol/L，表明溶劑種類確實會產生寄生離子，兩者之間關系密切。
表1
不同核黃素溶液寄生離子成分及濃度
Table1.
Composition and concentration of parasitic ions in different riboflavin solutions
2.2 兩種核黃素溶液對離子導入后核黃素滲透性的影響
2.2.1 核黃素在鞏膜中的熒光強度和滲透深度
如圖 2 所示，與空白對照組比較，在鞏膜組織熒光圖片中，A 組和 B 組（樣本 1、樣本 2 和樣本 3）的核黃素都已滲透入鞏膜組織。在平均熒光強度圖中，A 組和 B 組鞏膜組織的平均熒光強度較空白對照組均明顯增加（P < 0.05），且 B 組高于 A 組（P < 0.05），差異具有統計學意義。采用圖像處理軟件 Image J 8.0（National Institutes of Health，美國）對冰凍切片的熒光圖片進行核黃素滲透深度測量，得到圖 2 滲透深度和滲透深度百分比箱線圖，發現在各組鞏膜厚度差異不具有統計學意義的情況下，A 組與 B 組核黃素的滲透深度及滲透深度百分比均值之間差異具有統計學意義（P < 0.05）；滲透時間保持不變，滲透速率變化趨勢與滲透深度的變化一致，圖 2 滲透速率圖中，B 組核黃素的滲透速率明顯高于 A 組（P < 0.05）。
圖2
寄生離子對核黃素滲透性的影響
*
*
2.2.2 核黃素在鞏膜中的滲透濃度
如圖 3 所示，通過高效液相色譜檢測發現，核黃素標準品色譜圖和核黃素標準曲線中，核黃素保留值為 17.50 min，標準品濃度與峰面積呈現良好的線性關系。而空白對照組色譜圖中，在 17.50 min 時信號強度較弱，含有其他雜峰，說明不含核黃素成分。A 組和 B 組色譜圖中均檢測到和核黃素標準品色譜圖保留時間一致的色譜峰，證實含有核黃素，兩組鞏膜組織核黃素含量分別為：A 組是（14.85 ± 2.70）μg/g、B 組是（24.91 ± 7.46）μg/g，A 組接近角膜交聯后組織內核黃素的有效含量 15 μg/g[19]，B 組大于該含量，兩組數據差異具有統計學意義，如圖 3 核黃素濃度圖所示（P < 0.05）。
圖3
兩種核黃素溶液離子導入豬眼鞏膜后的滲透濃度比較
*
*
2.3 不同擴散系數下核黃素滲透模擬結果
利用多物理場仿真軟件 COMSOL Multiphysics 5.3a（COMSOL Inc.，瑞典）建立標準擴散系數 D0[14]及其梯度值下核黃素溶液在鞏膜組織中的滲透模型，結果如圖 4 所示，核黃素滲透 10 min 后，其軸向擴散進程隨著擴散系數的減小而逐漸減緩。與實驗結果（如圖 2 鞏膜組織熒光圖所示）對比，發現擴散系數小于 D0 時，該擴散模型與實際情況更符合。
圖4
不同擴散系數下核黃素滲透分布圖
Figure4.
The distribution of riboflavin permeation under different diffusion coefficients
角膜交聯所需安全有效的核黃素濃度為 15 μg/g[19]，將該單位換算為物質的量濃度單位，其值為 0.011 29 mol/m3。定義該值為滲透進鞏膜組織的核黃素濃度閾值，高于該值則認為交聯有效。根據圖 5 獲取擴散系數梯度值下核黃素滲透深度有效值，如表 2 所示。參照實驗獲得的數據，A 組核黃素滲透深度為（394.91 ± 73.54）μm，B 組為（470.11 ± 135.67）μm，結合表 2 可知，A 組核黃素的擴散系數介于 D0/4～D0/3 之間，B 組介于 D0/3～D0/2 之間。B 組核黃素的擴散系數約是 A 組的 1.5 倍。
圖5
不同擴散系數核黃素濃度隨鞏膜厚度變化曲線
Figure5.
Variation curve of riboflavin concentration with scleral tissue thickness under different diffusion coefficients
表2
不同擴散系數下核黃素滲透深度和濃度比較
Table2.
Comparison of penetration depth and concentration of riboflavin under different diffusion coefficients
2.4 核黃素溶液離子輔助交聯對鞏膜生物力學性能的影響
將 A 組和 B 組核黃素溶液離子導入豬眼球鞏膜后極部 10 min 后進行紫外線交聯。單軸拉伸實驗結果如圖 6 所示，A 組和 B 組鞏膜的彈性模量均高于空白對照組，A 組（3.99 ± 1.37）MPa 和 B 組（6.30 ± 2.31）MPa 約為空白對照組（1.16 ± 0.48）MPa 的 3 倍和 5 倍（P < 0.05），且 B 組彈性模量明顯高于 A 組（P < 0.05）。
圖6
寄生離子對核黃素-紫外線 A 交聯術后鞏膜彈性模量的影響
*
*
3 討論
核黃素—紫外線 A 膠原交聯術在保證手術安全的前提下，可通過提高核黃素的滲透性及紫外線 A 的照射強度來縮短手術時間，優化交聯方案。在核黃素給藥方面，研究者引進了核黃素離子導入法[20]，用以減少手術時間。研究表明，人、豬和兔鞏膜在生理 pH 值下是一種帶凈負電荷的生物膜，對陽離子具有選擇性[21]。而核黃素離子導入時帶有正電荷，因此離子導入系統對于其在鞏膜組織中的運輸具有良好的輔助作用。本課題組前期首次采用該給藥方式對近視眼實驗動物進行了核黃素—紫外線 A 鞏膜交聯[9]。藥物溶液用于離子導入時，根據電離原理，一部分藥物會解離成離子，在直流電的作用下，陰離子或者陽離子進行定向移動，因此藥物溶液解離時容易產生寄生離子[22]。寄生離子的存在會使藥物導入量明顯減少，但關于寄生離子對該術式核黃素滲透性的影響尚未見報道。
本研究的寄生離子因核黃素溶劑的不同而不同，核黃素乳酸鈉林格液（A 組）所含寄生離子種類多于核黃素生理鹽水溶液（B 組）。通過對比分析兩種核黃素溶液在鞏膜組織內的平均熒光強度、滲透深度、滲透濃度和擴散系數等量化指標來評價兩種溶液的滲透性，以此探討寄生離子對離子導入遞送核黃素效率的影響，結合紫外線交聯后鞏膜組織生物力學性能的改變，進一步探討寄生離子對離子導入核黃素—紫外線 A 鞏膜交聯術交聯效果的影響。
本研究發現，離子導入核黃素乳酸鈉林格液組（A 組）和離子導入核黃素生理鹽水組（B 組）在鞏膜組織內的滲透濃度分別為（14.85 ± 2.70）μg/g 和（24.91 ± 7.46）μg/g，且 A 組核黃素接近理論上角膜交聯所需安全有效的核黃素濃度 15 μg/g[19]，而 B 組大于該值，表明這兩種溶液均能達到交聯術所需的核黃素基本量，但核黃素生理鹽水滲透進鞏膜組織的濃度、平均熒光強度均高于核黃素乳酸鈉林格液。核黃素是一種光敏劑，在藍光激發下顯示黃綠色熒光，其熒光強度與濃度成正比[16]。本研究實驗結果與理論結論一致，說明核黃素生理鹽水的離子導入效果優于核黃素乳酸鈉林格液。
核黃素在鞏膜內的滲透深度是衡量膠原交聯效果的重要指標之一，其代表含義類似角膜交聯分界線。Seiler 等[23]認為該分界線是角膜基質內交聯和未交聯膠原纖維的邊界線。分界線深度與交聯效果密切相關。賈洪真等[24]發現 0.1% 核黃素乳酸鈉林格液離子導入角膜后分界線深度為（268.25 ± 18.06）μm，而蒸餾水為（298.95 ± 51.97）μm，蒸餾水做溶劑，滲透效果更佳。分析原因可能有兩點：其一是蒸餾水中寄生離子含量少，核黃素遞送的競爭減少；其二是該溶液的低滲透壓可能破壞了角膜上皮的屏蔽作用[24]。本研究發現，離子導入核黃素乳酸鈉林格液組和離子導入核黃素生理鹽水組在鞏膜內的滲透深度分別為（394.91 ± 73.54）μm 和（470.11 ± 135.67）μm，差異具有統計學意義。兩組溶液所用溶劑都是等滲溶液，僅所含寄生離子種類不同，提示寄生離子是影響不同核黃素溶液離子導入效果的重要原因。由于角膜和鞏膜厚度不同，本文進一步分析了核黃素滲透深度百分比，探索了衡量核黃素在不同厚度組織中滲透性的量化指標。一般正常的角膜厚度約在 500～600 μm 之間，交聯后角膜力學性能增強的部分約在角膜的前 200～300 μm 的基質層內[18]。據此推測角膜交聯深度百分比介于 60%～70% 之間。本研究發現，核黃素乳酸鈉林格液和核黃素生理鹽水在鞏膜組織內的滲透深度百分比均小于角膜交聯深度百分比，分別為 31.31% 和 42.00%，這與鞏膜后極部組織比角膜厚有關。圖 2 中滲透深度和滲透深度百分比箱線圖表明，核黃素滲透深度數據比滲透深度百分比更為集中，提示滲透深度可能更適合衡量熒光滲透效果，后續實驗將增加樣本量進一步驗證此結論。
擴散系數是描述質量傳遞最重要的物性參數之一，可用來表示物質的擴散能力。本研究發現核黃素生理鹽水在離子導入時擴散性能優于核黃素乳酸鈉林格液，且與標準角膜膠原交聯術中的典型擴散系數 D0 相比，鞏膜離子導入核黃素擴散系數有所降低。這可能是因為 D0 是基于去上皮角膜交聯得出的，而角膜和鞏膜組織不管是在膠原纖維的構成還是排列上都存在差異，從而導致鞏膜交聯的核黃素擴散系數低于角膜交聯。
實驗和數值模擬結果均表明，核黃素生理鹽水應用于離子導入時，其在鞏膜組織中的滲透性優于核黃素乳酸鈉林格液。結合兩種溶液所含寄生離子種類的不同，說明寄生離子會阻礙核黃素的滲透。
鞏膜的生物力學改變是評價核黃素—紫外線 A 膠原交聯術的重要指標。本研究發現離子輔助交聯術后，A 組以乳酸鈉林格液作為溶劑和 B 組以生理鹽水作為溶劑，兩組鞏膜的彈性模量均高于空白對照組，且 B 組高于 A 組，約為 A 組的 1.6 倍，差異均具有統計學意義，該結果與 Wollensak 等[25]的研究結果一致。研究結果表明，在離子導入核黃素—紫外線 A 鞏膜交聯術中，B 組的術后力學效果優于 A 組。結合核黃素溶液離子導入滲透性分析結果，在鞏膜組織中，核黃素生理鹽水溶液比核黃素乳酸鈉林格液滲透更深，濃度更高。核黃素生理鹽水溶液的滲透深度約為核黃素乳酸鈉林格液的 1.2 倍，濃度約為其 1.6 倍，表明核黃素生理鹽水溶液的膠原交聯作用更強，在改善鞏膜生物力學方面更具優勢，證明鞏膜內核黃素的含量能夠直接影響膠原交聯的效果，與張學敏等[26]的研究一致，進一步提示寄生離子能夠通過影響核黃素遞送到鞏膜組織的深度和含量而間接影響交聯效果。
4 結論
本文初步獲得了寄生離子導入參數與核黃素滲透性及紫外線交聯后鞏膜生物力學性能變化之間的關系：核黃素生理鹽水溶液所含寄生離子種類減少可增加藥物導入量，提高核黃素在鞏膜組織中的滲透性，提高交聯后鞏膜組織力學性能。提示可通過減少核黃素溶液中寄生離子種類來提高核黃素導入效率，增強鞏膜交聯術交聯效果，進而提高手術中患者依從性。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
引言
高度近視是全球常見的眼疾之一，已成為視力損害和致盲的重要原因。高度近視，尤其是病理性近視，與鞏膜組織變薄和生物力學強度減弱導致的眼球軸向過度伸長有關[1]。近年研究發現，核黃素—紫外線 A 膠原交聯療法通過膠原之間的交聯作用，增強實驗動物鞏膜生物力學性能，提高鞏膜抗變形能力，有望成為控制近視發展的新方法[2-7]。離子導入核黃素因具有高效的給藥效率，可縮短手術時間，在角膜和鞏膜交聯術中開始逐漸得到關注[8-9]。
藥物離子導入法是一種非侵入性技術，原理是通過施加小電流來增強藥物在組織中的滲透[10]。影響藥物離子導入效率的因素有：電流強度及通電時間、離子的活潑性、藥物濃度、溶劑的性質和寄生離子等[11]。寄生離子是指在同一襯布墊極上，與需要導入組織的有效藥物離子極性相同的離子，兩者在導入機體時形成競爭關系，從而影響有效離子進入機體的量。在離子導入核黃素—紫外線 A 鞏膜膠原交聯術中，核黃素溶液常用溶劑是乳酸鈉林格液和生理鹽水溶液，溶液濃度和電流強度是相對固定值，但兩種核黃素溶液所含寄生離子種類對離子遞送核黃素效率的影響尚不清楚。
核黃素在組織中的滲透性可用滲透深度、滲透速率和滲透濃度表征[12]。擴散系數可用于評價物質的滲透性[13]。菲克第二定律可以定量描述核黃素溶液向基質一維擴散的行為[14]，其中擴散系數是沿擴散方向在單位時間每單位濃度梯度下，垂直通過單位面積所擴散某物質的質量或摩爾數。由于在實驗中直接檢測擴散系數存在一定難度，采用數值模擬手段與滲透實驗結合，可以很好地預測核黃素的滲透性[15]。
本文通過實驗和數值模擬研究了兩種核黃素溶液經離子導入后在鞏膜內的滲透性，通過實驗比較紫外線 A 照射前后鞏膜生物力學性能的改變，以此探索寄生離子對離子導入的影響，以期優化離子導入核黃素配方，為提高鞏膜交聯術離子導入核黃素試劑的效率提供參考。
1 實驗材料和方法
1.1 實驗對象及分組
實驗使用新鮮家豬眼球，取自太原屠宰場，置于 4℃ 保鮮盒中運輸至實驗室。清理眼球附著組織后浸沒于磷酸鹽緩沖鹽（phosphate buffered saline，PBS）溶液，暫存于 4℃ 冰箱，4 h 內完成實驗。實驗過程符合動物倫理要求。
將實驗分為三組：空白對照組、離子導入核黃素乳酸鈉林格液組（A 組）、離子導入核黃素生理鹽水組（B 組）。每組至少 5 個離體豬眼球，空白對照組不作任何處理。
1.2 離子導入核黃素實驗
將眼球置于人工前房，通過抽拉注射器使眼球眼壓穩定在正常生理范圍內。連接離子導入系統（SOOFT Italia Spa，意大利），對眼球后極部鞏膜進行 10 min 離子導入，導入區域直徑 9 mm，實驗所用核黃素濃度為 0.1%。
1.2.1 核黃素溶液離子成分的分析
核黃素用于離子導入時，帶有正電荷。溶液中含有相同極性的離子（陽離子）即為寄生離子。乳酸鈉林格注射液為復方制劑，每 1 000 mL 中含乳酸鈉 3.10 g、氯化鈉 6.00 g、氯化鉀 0.30 g、氯化鈣 0.20 g；0.9% 氯化鈉注射液（生理鹽水）每 500 mL 含氯化鈉 4.5 g。將 20 mg 注射用核黃素磷酸鈉分別溶入 20 mL 上述乳酸鈉林格注射液和 0.9% 氯化鈉注射液，配制成 A、B 兩組 0.1% 核黃素溶液。兩種核黃素溶液所含寄生離子濃度計算公式，如式（1）、式（2）所示：
|
| '/> |
其中，m 為物質的質量，M 為物質的摩爾質量，n 為物質的量。根據各物質的化學式，計算出寄生離子物質的量，用 表示 。 式（2）中，V 為溶液體積，c 為寄生離子物質的量濃度。
1.2.2 核黃素滲透性檢測
（1）冰凍切片及顯微鏡觀察：離子導入核黃素后，沿鞏膜厚度方向制作冰凍切片，置于熒光倒置顯微鏡下觀察拍照，使用圖像處理軟件 Image J 8.0（National Institutes of Health，美國）測量核黃素的平均熒光強度[16]。根據空白對照組灰度值變化，取其灰度值上限的平均，作為滲透深度測量的檢測閾值；滲透深度定義為 A 組和 B 組灰度值—鞏膜厚度曲線與檢測閾值相交第一點[17]，如圖 1 所示。滲透深度百分比定義為滲透深度占鞏膜厚度的比值，滲透速率定義為滲透深度與滲透時間的比值[17]。
圖1
鞏膜切片的灰度值—鞏膜厚度曲線與檢測閾值的交線示意圖
Figure1.
Schematic diagram of intersection between gray value - scleral thickness curve of scleral slice and detection threshold
（2）鞏膜組織高效液相色譜分析：通過稱量質量、勻漿定容、輔助分離核黃素、去蛋白和兩次低溫高速離心，對核黃素給藥后的鞏膜組織進行處理，收取上清液作為測試溶液[18]。通過高效液相色譜儀（LC20A，島津株式會社，日本）獲取核黃素標準品色譜圖、核黃素標準品濃度和峰面積相關曲線（標準曲線）、空白對照組色譜圖、A 組和 B 組測試溶液色譜圖，定量分析鞏膜組織核黃素濃度。
1.3 鞏膜組織核黃素滲透模型建立
使用多物理場仿真軟件 COMSOL Multiphysics 5.3a（COMSOL Inc.，瑞典）建立簡化的旋轉對稱鞏膜組織模型，以去上皮角膜核黃素軸向擴散系數[14]為基準，模擬相同滲透時間（10 min）不同擴散系數下核黃素的滲透情況。模型直徑為 9 mm，厚度為 1.254 mm（數據來自于離子導入核黃素實驗的滲透性檢測部分）。邊界條件是沿旋轉軸的軸向對稱，初始條件是將 0.1% 的核黃素施加到鞏膜外表面，即模型的上邊界，鞏膜在 0 min 時沒有核黃素存在。
采用菲克第二定律計算核黃素的擴散行為[15]，如式（3）所示：
|
式（3）中，c(x, y, z; t)為鞏膜模型中任意時刻核黃素的濃度；D 為特征擴散系數。標準擴散系數 D0 = 6.5 × 10-5 mm2/s[14]。模擬結果與 1.2.2 小節步驟（1）實驗數據對比，推算出與實驗結果最吻合的擴散系數范圍。
1.4 紫外線交聯實驗
離子導入核黃素后進行紫外線 A 照射。照射采用角膜交聯系統 VEGA（10 mW，CSO Srl.，意大利），照射時間為 9 min，照射強度為 10 mW/cm2，總照射能量密度為 5.4 J/cm2。
1.5 鞏膜條帶單軸拉伸實驗
豬眼鞏膜行交聯術后，將交聯部位沿矢狀面制備成條帶，采用力學試驗機 INSTRON-5544（C8024，Instron Co.Ltd.，美國）對鞏膜條帶進行單軸拉伸測試。首先進行 5 次加載速率為 1 mm/min 的預加載，正式加載速率與預加載相同，記錄載荷—位移關系。
1.6 數據分析
實驗數據均以“均值 ± 標準差”表示，用統計分析軟件 SPSS 24.0（IBM 公司，美國）進行獨立樣本 t 檢驗和單因素方差分析，P < 0.05 表示差異具有統計學意義。
2 結果
2.1 兩種核黃素溶液所含寄生離子成分及濃度
通過式（1）和式（2）計算得出兩種核黃素溶液寄生離子成分及濃度如表 1 所示，核黃素乳酸鈉林格液的金屬陽離子除 Na+外，還含有 K+和 Ga+，濃度分別為 132.27 mmol/L、4.03 mmol/L 和 1.36 mmol/L；核黃素生理鹽水只含有 Na+，濃度為 156.00 mmol/L，表明溶劑種類確實會產生寄生離子，兩者之間關系密切。
表1
不同核黃素溶液寄生離子成分及濃度
Table1.
Composition and concentration of parasitic ions in different riboflavin solutions
2.2 兩種核黃素溶液對離子導入后核黃素滲透性的影響
2.2.1 核黃素在鞏膜中的熒光強度和滲透深度
如圖 2 所示，與空白對照組比較，在鞏膜組織熒光圖片中，A 組和 B 組（樣本 1、樣本 2 和樣本 3）的核黃素都已滲透入鞏膜組織。在平均熒光強度圖中，A 組和 B 組鞏膜組織的平均熒光強度較空白對照組均明顯增加（P < 0.05），且 B 組高于 A 組（P < 0.05），差異具有統計學意義。采用圖像處理軟件 Image J 8.0（National Institutes of Health，美國）對冰凍切片的熒光圖片進行核黃素滲透深度測量，得到圖 2 滲透深度和滲透深度百分比箱線圖，發現在各組鞏膜厚度差異不具有統計學意義的情況下，A 組與 B 組核黃素的滲透深度及滲透深度百分比均值之間差異具有統計學意義（P < 0.05）；滲透時間保持不變，滲透速率變化趨勢與滲透深度的變化一致，圖 2 滲透速率圖中，B 組核黃素的滲透速率明顯高于 A 組（P < 0.05）。
圖2
寄生離子對核黃素滲透性的影響
*
*
2.2.2 核黃素在鞏膜中的滲透濃度
如圖 3 所示，通過高效液相色譜檢測發現，核黃素標準品色譜圖和核黃素標準曲線中，核黃素保留值為 17.50 min，標準品濃度與峰面積呈現良好的線性關系。而空白對照組色譜圖中，在 17.50 min 時信號強度較弱，含有其他雜峰，說明不含核黃素成分。A 組和 B 組色譜圖中均檢測到和核黃素標準品色譜圖保留時間一致的色譜峰，證實含有核黃素，兩組鞏膜組織核黃素含量分別為：A 組是（14.85 ± 2.70）μg/g、B 組是（24.91 ± 7.46）μg/g，A 組接近角膜交聯后組織內核黃素的有效含量 15 μg/g[19]，B 組大于該含量，兩組數據差異具有統計學意義，如圖 3 核黃素濃度圖所示（P < 0.05）。
圖3
兩種核黃素溶液離子導入豬眼鞏膜后的滲透濃度比較
*
*
2.3 不同擴散系數下核黃素滲透模擬結果
利用多物理場仿真軟件 COMSOL Multiphysics 5.3a（COMSOL Inc.，瑞典）建立標準擴散系數 D0[14]及其梯度值下核黃素溶液在鞏膜組織中的滲透模型，結果如圖 4 所示，核黃素滲透 10 min 后，其軸向擴散進程隨著擴散系數的減小而逐漸減緩。與實驗結果（如圖 2 鞏膜組織熒光圖所示）對比，發現擴散系數小于 D0 時，該擴散模型與實際情況更符合。
圖4
不同擴散系數下核黃素滲透分布圖
Figure4.
The distribution of riboflavin permeation under different diffusion coefficients
角膜交聯所需安全有效的核黃素濃度為 15 μg/g[19]，將該單位換算為物質的量濃度單位，其值為 0.011 29 mol/m3。定義該值為滲透進鞏膜組織的核黃素濃度閾值，高于該值則認為交聯有效。根據圖 5 獲取擴散系數梯度值下核黃素滲透深度有效值，如表 2 所示。參照實驗獲得的數據，A 組核黃素滲透深度為（394.91 ± 73.54）μm，B 組為（470.11 ± 135.67）μm，結合表 2 可知，A 組核黃素的擴散系數介于 D0/4～D0/3 之間，B 組介于 D0/3～D0/2 之間。B 組核黃素的擴散系數約是 A 組的 1.5 倍。
圖5
不同擴散系數核黃素濃度隨鞏膜厚度變化曲線
Figure5.
Variation curve of riboflavin concentration with scleral tissue thickness under different diffusion coefficients
表2
不同擴散系數下核黃素滲透深度和濃度比較
Table2.
Comparison of penetration depth and concentration of riboflavin under different diffusion coefficients
2.4 核黃素溶液離子輔助交聯對鞏膜生物力學性能的影響
將 A 組和 B 組核黃素溶液離子導入豬眼球鞏膜后極部 10 min 后進行紫外線交聯。單軸拉伸實驗結果如圖 6 所示，A 組和 B 組鞏膜的彈性模量均高于空白對照組，A 組（3.99 ± 1.37）MPa 和 B 組（6.30 ± 2.31）MPa 約為空白對照組（1.16 ± 0.48）MPa 的 3 倍和 5 倍（P < 0.05），且 B 組彈性模量明顯高于 A 組（P < 0.05）。
圖6
寄生離子對核黃素-紫外線 A 交聯術后鞏膜彈性模量的影響
*
*
3 討論
核黃素—紫外線 A 膠原交聯術在保證手術安全的前提下，可通過提高核黃素的滲透性及紫外線 A 的照射強度來縮短手術時間，優化交聯方案。在核黃素給藥方面，研究者引進了核黃素離子導入法[20]，用以減少手術時間。研究表明，人、豬和兔鞏膜在生理 pH 值下是一種帶凈負電荷的生物膜，對陽離子具有選擇性[21]。而核黃素離子導入時帶有正電荷，因此離子導入系統對于其在鞏膜組織中的運輸具有良好的輔助作用。本課題組前期首次采用該給藥方式對近視眼實驗動物進行了核黃素—紫外線 A 鞏膜交聯[9]。藥物溶液用于離子導入時，根據電離原理，一部分藥物會解離成離子，在直流電的作用下，陰離子或者陽離子進行定向移動，因此藥物溶液解離時容易產生寄生離子[22]。寄生離子的存在會使藥物導入量明顯減少，但關于寄生離子對該術式核黃素滲透性的影響尚未見報道。
本研究的寄生離子因核黃素溶劑的不同而不同，核黃素乳酸鈉林格液（A 組）所含寄生離子種類多于核黃素生理鹽水溶液（B 組）。通過對比分析兩種核黃素溶液在鞏膜組織內的平均熒光強度、滲透深度、滲透濃度和擴散系數等量化指標來評價兩種溶液的滲透性，以此探討寄生離子對離子導入遞送核黃素效率的影響，結合紫外線交聯后鞏膜組織生物力學性能的改變，進一步探討寄生離子對離子導入核黃素—紫外線 A 鞏膜交聯術交聯效果的影響。
本研究發現，離子導入核黃素乳酸鈉林格液組（A 組）和離子導入核黃素生理鹽水組（B 組）在鞏膜組織內的滲透濃度分別為（14.85 ± 2.70）μg/g 和（24.91 ± 7.46）μg/g，且 A 組核黃素接近理論上角膜交聯所需安全有效的核黃素濃度 15 μg/g[19]，而 B 組大于該值，表明這兩種溶液均能達到交聯術所需的核黃素基本量，但核黃素生理鹽水滲透進鞏膜組織的濃度、平均熒光強度均高于核黃素乳酸鈉林格液。核黃素是一種光敏劑，在藍光激發下顯示黃綠色熒光，其熒光強度與濃度成正比[16]。本研究實驗結果與理論結論一致，說明核黃素生理鹽水的離子導入效果優于核黃素乳酸鈉林格液。
核黃素在鞏膜內的滲透深度是衡量膠原交聯效果的重要指標之一，其代表含義類似角膜交聯分界線。Seiler 等[23]認為該分界線是角膜基質內交聯和未交聯膠原纖維的邊界線。分界線深度與交聯效果密切相關。賈洪真等[24]發現 0.1% 核黃素乳酸鈉林格液離子導入角膜后分界線深度為（268.25 ± 18.06）μm，而蒸餾水為（298.95 ± 51.97）μm，蒸餾水做溶劑，滲透效果更佳。分析原因可能有兩點：其一是蒸餾水中寄生離子含量少，核黃素遞送的競爭減少；其二是該溶液的低滲透壓可能破壞了角膜上皮的屏蔽作用[24]。本研究發現，離子導入核黃素乳酸鈉林格液組和離子導入核黃素生理鹽水組在鞏膜內的滲透深度分別為（394.91 ± 73.54）μm 和（470.11 ± 135.67）μm，差異具有統計學意義。兩組溶液所用溶劑都是等滲溶液，僅所含寄生離子種類不同，提示寄生離子是影響不同核黃素溶液離子導入效果的重要原因。由于角膜和鞏膜厚度不同，本文進一步分析了核黃素滲透深度百分比，探索了衡量核黃素在不同厚度組織中滲透性的量化指標。一般正常的角膜厚度約在 500～600 μm 之間，交聯后角膜力學性能增強的部分約在角膜的前 200～300 μm 的基質層內[18]。據此推測角膜交聯深度百分比介于 60%～70% 之間。本研究發現，核黃素乳酸鈉林格液和核黃素生理鹽水在鞏膜組織內的滲透深度百分比均小于角膜交聯深度百分比，分別為 31.31% 和 42.00%，這與鞏膜后極部組織比角膜厚有關。圖 2 中滲透深度和滲透深度百分比箱線圖表明，核黃素滲透深度數據比滲透深度百分比更為集中，提示滲透深度可能更適合衡量熒光滲透效果，后續實驗將增加樣本量進一步驗證此結論。
擴散系數是描述質量傳遞最重要的物性參數之一，可用來表示物質的擴散能力。本研究發現核黃素生理鹽水在離子導入時擴散性能優于核黃素乳酸鈉林格液，且與標準角膜膠原交聯術中的典型擴散系數 D0 相比，鞏膜離子導入核黃素擴散系數有所降低。這可能是因為 D0 是基于去上皮角膜交聯得出的，而角膜和鞏膜組織不管是在膠原纖維的構成還是排列上都存在差異，從而導致鞏膜交聯的核黃素擴散系數低于角膜交聯。
實驗和數值模擬結果均表明，核黃素生理鹽水應用于離子導入時，其在鞏膜組織中的滲透性優于核黃素乳酸鈉林格液。結合兩種溶液所含寄生離子種類的不同，說明寄生離子會阻礙核黃素的滲透。
鞏膜的生物力學改變是評價核黃素—紫外線 A 膠原交聯術的重要指標。本研究發現離子輔助交聯術后，A 組以乳酸鈉林格液作為溶劑和 B 組以生理鹽水作為溶劑，兩組鞏膜的彈性模量均高于空白對照組，且 B 組高于 A 組，約為 A 組的 1.6 倍，差異均具有統計學意義，該結果與 Wollensak 等[25]的研究結果一致。研究結果表明，在離子導入核黃素—紫外線 A 鞏膜交聯術中，B 組的術后力學效果優于 A 組。結合核黃素溶液離子導入滲透性分析結果，在鞏膜組織中，核黃素生理鹽水溶液比核黃素乳酸鈉林格液滲透更深，濃度更高。核黃素生理鹽水溶液的滲透深度約為核黃素乳酸鈉林格液的 1.2 倍，濃度約為其 1.6 倍，表明核黃素生理鹽水溶液的膠原交聯作用更強，在改善鞏膜生物力學方面更具優勢，證明鞏膜內核黃素的含量能夠直接影響膠原交聯的效果，與張學敏等[26]的研究一致，進一步提示寄生離子能夠通過影響核黃素遞送到鞏膜組織的深度和含量而間接影響交聯效果。
4 結論
本文初步獲得了寄生離子導入參數與核黃素滲透性及紫外線交聯后鞏膜生物力學性能變化之間的關系：核黃素生理鹽水溶液所含寄生離子種類減少可增加藥物導入量，提高核黃素在鞏膜組織中的滲透性，提高交聯后鞏膜組織力學性能。提示可通過減少核黃素溶液中寄生離子種類來提高核黃素導入效率，增強鞏膜交聯術交聯效果，進而提高手術中患者依從性。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
