隨著電氣設備的廣泛應用，長期處于50 Hz的電磁場（EMF）環境可能會使工作記憶（WM）等認知功能受到嚴重影響。然而，EMF影響WM的效應及其神經機制尚不明確。為此本文將15只大鼠隨機分為三組，分別暴露于50 Hz、2 mT的EMF環境0 d（對照組）、24 d（實驗Ⅰ組）和48 d（實驗Ⅱ組），通過T-迷宮任務評估其WM水平，并基于在體多通道電生理記錄系統獲取內側前額葉皮層（mPFC）的局部場電位（LFP），分析任務過程中θ和γ節律振蕩的功率譜密度（PSD）變化，以及θ-γ節律的相位幅值耦合（PAC）強度變化。結果顯示，實驗Ⅰ組和Ⅱ組大鼠的θ和γ節律PSD均有不同程度下降，θ和高頻γ（hγ）之間的PAC強度下降；實驗Ⅰ組和Ⅱ組大鼠達到WM任務標準所需時長均高于對照組。結果表明EMF長期暴露損害了WM功能，可能的原因是θ-hγ的PAC強度下降引起的mPFC不同節律振蕩之間的信息交流受損。本文從PAC強度變化的角度揭示了EMF對WM造成負面影響的潛在神經機制，為進一步探究EMF生物效應及其作用機制提供了重要支持。
引用本文： 王龍龍, 李雙燕, 李天翔, 鄭衛然, 李洋, 徐桂芝. 50 Hz電磁場對大鼠工作記憶的影響及其神經機制研究. 生物醫學工程學雜志, 2023, 40(6): 1135-1141. doi: 10.7507/1001-5515.202303032 復制
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0 引言
近年來，隨著電氣設備在工作和生活中的廣泛應用，人們所處的電磁場（electromagnetic field，EMF）環境日益復雜，EMF對生物體健康的影響也受到越來越多的關注。研究表明，暴露于50 Hz的EMF環境可能會對學習和記憶等認知功能造成影響[1-2]。流行病學調查研究表明50 Hz的EMF環境可能會引起神經退行性疾病的發病風險升高[3-4]，如阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease，AD）等認知功能障礙疾病[5]。此外，在嚙齒類動物的研究中也發現，長期暴露于EMF環境會引起大鼠空間記憶水平下降等認知行為障礙[6]。為保障人們的身心健康，國際非電離輻射防護委員會（International Commission on Non-Ionizing Radiation Protection，ICNIRP）導則規定職業工頻EMF暴露限值標準為1 mT[7]，然而面對EMF環境中暴露強度和暴露時長的日益增長，有必要研究EMF長期暴露對認知功能的影響及潛在的作用機制，為EMF的生物健康效應以及職業人員的健康保障提供支持。
EMF影響認知功能的生物機制是復雜且多層次的。大量研究表明，EMF暴露會影響細胞內的神經遞質水平[8]和相關酶的活性[9]，誘導神經元細胞內的鈣穩態失調[10]和自由基代謝紊亂[11]，以及造成長時程增強異常[12]，進而引發進行性記憶障礙。然而，認知活動需要大量的神經元協同配合，從細胞集群活動的角度解釋EMF生物效應機制的研究還不夠完善，因此需要更多的實驗進行深入探究。
植入式微電極記錄技術的發展使得人們能夠獲取相關腦區內的神經集群活動，即局部場電位（local field potential，LFP）[13]。LFP能夠反映神經元局部網絡的興奮性，并具有較好的空間分辨率以及良好的行為特異性[14]。前額葉皮層（prefrontal cortex，PFC）的神經活動異常通常被認為是AD患者認知功能受損的原因之一[15]，其中內側前額葉皮層（medial PFC，mPFC）在環境決策過程中對空間記憶的形成和提取具有重要作用[16]，尤其是對工作記憶（working memory，WM）[17]。WM[18]是指在短時間內維護和操縱信息的認知過程，是許多復雜的高級認知活動（如閱讀、理解、推理和學習）的核心基礎。研究表明，mPFC腦區θ節律（4～12 Hz）[19]和γ節律（30～150 Hz）[20]神經振蕩與WM的形成和維持密切相關。此外，θ和γ節律之間通過相位—幅值耦合（phase-amplitude coupling，PAC）的方式進行跨頻率信息交流，并在WM的編碼過程中發揮重要作用[21]。Zhang等[22]的研究表明，小鼠海馬腦區的θ和γ節律的活動強度以及PAC強度在受到EMF暴露后顯著下降，提示θ-γ節律的PAC模式可能是EMF影響WM的關鍵神經機制。因此，從mPFC神經振蕩PAC強度變化的角度探究EMF長期暴露對大鼠WM功能的影響，對揭示EMF生物效應的神經機制具有重要意義。
本文將成年大鼠分別暴露于磁感應強度為2 mT的EMF環境0 d、24 d和48 d（8 h/d）后，在其mPFC腦區植入微電極陣列，獲取LFP信號，并通過對比分析三組大鼠執行WM任務的行為學表現，WM任務過程中θ和γ節律神經振蕩的活動強度，以及θ節律相位和γ節律幅值耦合的強度變化，探究了EMF長期暴露對大鼠WM的影響及潛在機制，為EMF環境的生物健康效應及機制研究提供支持。
1 材料和方法
本研究所有實驗程序均按照《實驗動物護理和使用指南》[23]進行，所有實驗步驟環節均已通過河北工業大學生物醫學倫理委員審查（審查編號：HEBUTaCUC2022053）。實驗動物許可證號：SCXK（冀）2020-007。
1.1 實驗動物制備
本實驗以15只雄性成年sprague-dawley（SD）大鼠（體重為300～350 g）為研究對象，隨機分為3組（對照組、實驗Ⅰ組、實驗Ⅱ組），每組5只。選取磁感應強度為2 mT、頻率為50 Hz的EMF作為實驗組大鼠的暴露環境，實驗Ⅰ組暴露24 d，實驗Ⅱ組暴露48 d[24]，每天連續暴露8 h，對照組不接受EMF暴露。大鼠經過EMF暴露后，在其mPFC腦區植入微電極，并通過在體多通道電生理記錄系統獲取大鼠執行認知任務時的LFP進行分析。飼養期間給予充足的水和食物，執行行為學任務期間，限制大鼠飲食，使其體重保持在自由進食狀態下的85%，以保持食欲。
1.2 EMF暴露系統
本文的磁場暴露系統由一個交流電源和兩個銅線圈組成，在線圈之間放置一個塑料平臺，作為EMF暴露平臺。通過調整交流電源的輸入電流，在兩個線圈之間生成一個磁感應強度穩定EMF環境。應用COMSOL軟件對線圈間暴露平臺處的磁感應強度進行仿真，選取磁感應強度均勻的區域［（2 ± 0.05）mT］作為大鼠的EMF暴露環境。該EMF暴露系統在連續運行8 h后，線圈間暴露平臺處的溫度保持在（25 ± 3）℃。因此，可以排除環境溫度等干擾因素。
1.3 微電極陣列植入手術
通過外科手術將多通道微電極陣列植入大鼠的mPFC腦區。使用異氟烷氣體麻醉大鼠，并固定于立體定位儀進行外科手術，將16通道的鎳鉻合金微電極陣列（2×8 配置排列，直徑35 μm，電極間距300 μm）植入大鼠的mPFC（前囟前2.5～4.5 mm，旁開0.2～1.0 mm，深度為距離腦皮層表面2.5～3.0 mm）。在電極到達目標腦區后，使用瓊脂封閉顱腔來保護腦組織，然后使用牙科水泥進行包埋固定。術后單獨飼養，并給予大鼠5～7 d的恢復時間。
1.4 WM任務和神經電信號獲取
基于食物獎勵的T迷宮延遲交替任務是一種測試空間WM的行為學實驗范式[14]，已廣泛應用于腦認知活動的檢測。本文使用的“T迷宮”由一個起始臂（臂端為起始區域）和兩個具有食物獎勵的目標臂（臂端分別放置食槽，食槽內可放置食物作為獎勵）組成，如圖1所示。
圖1
T迷宮延遲交替任務示意圖
Figure1.
Diagram of the delayed-alternation task on T-maze
T迷宮任務包括訓練階段和測試階段。訓練階段，所有大鼠每天接受空間WM訓練（20次/天）。任務過程簡述如下：每次任務包括自由選擇和延遲交替選擇兩個過程。在自由選擇過程，大鼠從起始區域出發至選擇參考點（reference point，RP），然后選擇向左或向右移動進入任意一個目標臂以獲得食物獎勵。隨后大鼠回到起始區域等待5 s后開始延遲交替選擇過程。在此過程中，大鼠必須進入與自由選擇過程相反的目標臂，才能獲得食物獎勵，并記錄為行為學正確；反之，則不能獲取食物獎勵，并記錄為行為學錯誤。之后，大鼠自主回到起始點，本次任務結束。當大鼠行為學正確率連續兩天超過80%時，被認為達到“學會”的標準，完成訓練階段任務。此后，大鼠進行測試階段，過程與訓練階段相同，執行5 d（20次/天），并應用在體多通道電生理記錄系統OmniPlex（Plexon，美國）獲取大鼠在執行WM任務測試階段延遲交替選擇過程中mPFC的神經電信號，并通過放大（增益：5 000）和低通濾波（0.3～300 Hz）獲得16通道的LFP（采樣率：1 000 Hz）。
1.5 LFP數據分析
隨機選取每只大鼠WM任務測試階段20次行為學正確的數據進行分析，三組大鼠共300次任務的數據。首先對獲取的LFP數據進行預處理，通過小波變換去除LFP數據的基線漂移，再使用陷波濾波器消除50 Hz的工頻干擾，得到穩定信號。
本實驗使用多錐度法[25]對信號進行功率譜密度（power spectral density，PSD）估計，來分析信號的頻譜特性。應用短時傅立葉變換（short-time Fourier transform，STFT）[26]來估計LFP信號的頻率和時間分布。將LFP信號表示為x(t)，其STFT定義為：
 |
式中，g(t)是窗函數，選取窗口長度為500 ms，窗口移動步長為200 ms，計算LFP的動態時頻分布。
本研究使用調制指數（modulation index，MI）的方法[27]對θ相位和γ幅值之間的PAC模式進行了分析，過程簡述如下：首先使用一組窄帶濾波器分別檢測θ節律相位的上升和下降斜率，并使用寬帶濾波器找到波谷和波峰，以避免θ節律振蕩的相位因單調變化而形成偽耦合現象，并將相位信號命名為φ(t)。然后，將φ(t)的每個周期分為4個相位段，分別對應波峰至波谷的下降以及上升時期，將每個相位段再平均分成4個相位段，則一個相位周期被分為16個相位段。然后，對于γ節律振蕩，使用一個帶寬固定且頻率中心在γ節律范圍逐步平移的濾波器進行濾波，其帶寬至少是相位信號頻率的兩倍。本文選取的帶寬為24 Hz，符合兩倍的要求。然后利用希爾伯特變換計算γ振蕩的幅值包絡，記為A(t)。
接下來，計算每個相位段對應γ幅值包絡Ay的平均值。將各相位段所求的Ay除以各相位段均值的總和，從而將幅值信息轉化為分布概率的信息，如式（2）所示：
 |
式中，Ay(j)表示相位段j處的γ幅值包絡Ay的平均值，Pj為Ay(j)的分布概率，N為相位段的個數。當各個相位段所對應的幅值均值相同時，此分布為均勻分布。應用標準化熵度量H來表征調制指數，定義如式（3）所示：
 |
當Pj=1/N時，H達到最大值，記為Hmax。通過標準化，可以得到基于熵的MI。本研究使用MI來表示信號間的PAC強度，如式（4）所示：。
 |
當MI接近0時，表示θ節律相位和γ節律幅值的耦合強度較低；當MI值較大時，表示θ和γ節律之間存在較高強度的耦合關系。
1.6 統計分析
本文應用統計軟件GraphPad Prism 9.0（GraphPad Prism Software Inc.，美國）軟件的單因素方差分析（one-way ANOVA）對行為表現、PSD和PAC強度結果進行統計，并通過Bonferroni校正后分析組間差異，檢驗水準為0.05。文中數據均以均值±標準誤表示。
2 結果
2.1 EMF長期暴露對大鼠T-迷宮行為表現的影響
為研究EMF環境長期暴露對大鼠認知功能的影響，本研究通過T迷宮延遲交替任務來檢測各組大鼠的空間WM水平。在任務的訓練過程中，對每只大鼠每天的行為學正確率進行統計，當達到行為學標準時（至少連續兩天的正確率超過80％），認定該大鼠學會WM任務。圖2所示為各組大鼠每天的平均正確率。結果顯示，隨著學習時長的增加，正確率呈逐漸上升趨勢，且各組大鼠在經過訓練之后均達到行為學標準。
圖2
大鼠T迷宮任務行為表現
Figure2.
Behavior performance of rats in the T-maze task
圖3所示為各組大鼠達到行為學標準所需時長的統計結果，該指標反映了大鼠學習T迷宮任務規則的速率，是評價WM功能的重要指標。由圖3可知，各組大鼠達到行為學標準的平均天數分別為：對照組（5.8 ± 0.49）d、實驗Ⅰ組（10.8 ± 1.83）d、實驗Ⅱ組（12.6 ± 1.08）d。ANOVA結果顯示各組均值之間的差異具有統計學意義［F（2, 12）= 7.857，P= 0.006］，對照組達到WM任務標準所需平均時長低于實驗Ⅰ組（P = 0.047）和實驗Ⅱ組（P = 0.007）；而實驗Ⅰ組與實驗Ⅱ組之間的差異無統計學意義（P = 0.583）。結果提示，實驗Ⅰ組和實驗Ⅱ組的大鼠在經過EMF長期暴露后需要更多的時間才能學會WM任務，反映出其空間學習記憶能力受損。
圖3
大鼠達到T迷宮任務標準所需天數（*P < 0.05）
Figure3.
Days for rats to meet the T-maze task criterion (*P < 0.05)
2.2 EMF長期暴露對大鼠WM過程中神經活動的影響
為了從神經振蕩活動變化的角度探究EMF長期暴露對WM的影響，本文分析了大鼠mPFC中LFP信號θ和γ節律振蕩在WM任務期間的活動強度變化。以對照組為例，首先選取大鼠在RP前2 s和后1 s的LFP信號進行時頻分析，該時間段包含了大鼠從起始區域出發經過RP至獲得食物獎勵的過程。圖4所示為LFP信號的時頻分布結果，其中θ和γ節律振蕩的能量在RP前1 s內（–1～0 s）高于其他時間段，該時間段是大鼠離開起始區域并進行選擇的過程，可能是大鼠依據WM進行空間行為決策的關鍵時期。與之前的報道[26]一致，θ和γ節律的神經振蕩活動在該時間段增強。隨后，提取RP前1 s的LFP數據，分析各組大鼠θ和γ節律振蕩的PSD在該關鍵時期的差異。圖5所示為θ和γ節律振蕩PSD的統計結果。由圖5可知，ANOVA結果顯示三組θ節律PSD均值之間的差異具有統計學意義［F（2，297）= 31.20，P < 0.001］，經Bonferroni校正后實驗Ⅱ組的結果低于對照組（P < 0.001）和實驗Ⅰ組（P < 0.001），而對照組和實驗Ⅰ組之間的差異無統計學意義（P > 0.99）；ANOVA結果顯示三組γ節律PSD均值之間的差異具有統計學意義［F（2，297）= 114.0，P < 0.001］，經Bonferroni校正后實驗Ⅱ組的結果低于對照組（P < 0.001）和實驗Ⅰ組（P = 0.001），而實驗Ⅰ組也低于對照組（P < 0.001）。結果提示，經過EMF的長期暴露后，大鼠執行WM任務時θ和γ節律的神經振蕩活動都呈現不同程度的降低。
圖4
mPFC腦區的θ和γ節律振蕩在WM任務過程中的時頻分布
Figure4.
The time-frequency distribution of θ and γ oscillations in mPFC brain regions during WM task
圖5
θ和γ節律的PSD對比圖（*P < 0.05）
Figure5.
Comparison of PSD of θ and γ rhythms oscillations in three groups (*P < 0.05)
2.3 EMF長期暴露對大鼠PAC模式的影響
為探究EMF長期暴露對大鼠在WM過程中不同節律神經振蕩信息交互的影響，對各組大鼠mPFC腦區的PAC模式進行分析。以對照組為例，圖6所示為大鼠空間決策關鍵時期（RP前1 s）θ相位和γ幅值的PAC結果，可見θ和γ節律之間存在明顯耦合現象。
圖6
θ-γ的PAC模式
Figure6.
PAC distribution of θ-γ oscillations
由圖6可知，在γ節律（30～150 Hz）之間發現不同的MI峰值，表明γ節律范圍內的PAC強度可能不同。如圖7所示為γ節律范圍內的PAC耦合情況。結果發現γ節律范圍的MI存在三個峰值，分別為低頻γ（lγ：30～60 Hz）、中頻γ（mγ：60～100 Hz）和高頻γ（hγ：100～150 Hz）。因此，對三個γ子節律與θ相位分別進行分析，以探究EMF長期暴露對不同γ子節律PAC強度的影響。如圖8所示為三個γ子節律與θ相位MI的統計結果。由圖8可知，θ-hγ的MI結果顯示三組之間差異具有統計學意義［F（2，297）= 7.816，P <0.001］，對照組的MI高于實驗Ⅰ組（P = 0.010）和實驗Ⅱ組（P <0.001），而實驗Ⅰ組和實驗Ⅱ組MI之間的差異無統計學意義（P = 0.408）；θ-lγ和θ-mγ的MI結果均顯示對照組與實驗Ⅰ組和實驗Ⅱ組的差異無統計學意義（P > 0.05）。結果提示，θ-hγ可能是EMF對mPFC腦區產生影響的主要作用靶點。
圖7
MI在γ節律范圍的動態分布
Figure7.
Dynamic distribution of MI in the γ rhythm range
圖8
θ-γ子節律間的MI對比（*P < 0.05）
Figure8.
Comparison of the MI between θ-γ sub-band (*P < 0.05)
3 討論與結論
本文通過將大鼠暴露于EMF環境0 d、24 d和48 d，對比分析了三組大鼠WM任務的行為表現，WM任務過程中θ和γ節律神經振蕩的活動強度，以及θ節律相位和γ節律幅值耦合的強度變化，以探究EMF長期暴露對大鼠WM的影響及其神經機制。
本研究中大鼠行為表現結果提示，經過EMF長期暴露后，大鼠需要更多的時間來學會相同的任務，即EMF使得大鼠的學習和工作記憶功能受損，與之前的報道[12]相一致。然而48 d的暴露時長并沒有使得大鼠的WM行為表現比暴露24 d組的表現下降，可能是由于代償機制發揮作用，大鼠逐漸適應了EMF環境。EMF的生物健康效應與被試對象和暴露參數等多種因素相關。因此，還需深入優化實驗條件，以保障長期處于EMF環境職業人員的身心健康。
LFP可以直接反映神經元集群的電生理活動，研究LFP特征對探究EMF影響神經系統認知功能的作用機制具有重要意義。本文發現在γ節律范圍內的PAC模式可能存在不同范圍的耦合峰值，高頻部分γ子節律的MI顯著高于低頻部分，表明θ相位與多個γ子節律幅值發生了耦合，并且更傾向于耦合高頻部分。其原因可能是不同的γ子節律范圍具有獨立的生理意義，發揮不同的作用[28]。θ與γ子節律耦合的結果表明，在經過EMF長期暴露后，θ-hγ的MI顯著下降，且暴露48 d的下降效果最為顯著。結果提示EMF長期暴露主要對高頻γ節律的PAC強度產生了影響，θ-hγ的耦合可能是EMF對mPFC腦區的主要作用靶點。同時，θ-hγ的PAC變化與行為結果一致，表明θ-hγ之間的PAC強度能夠反映WM水平，并且可能是EMF暴露影響WM功能的潛在神經機制。
此外，由于在大鼠mPFC腦區植入的微電極陣列為鎳鉻合金材質，可能會在EMF暴露時產生電磁感應效應影響實驗結果，因此本研究選擇在大鼠執行完EMF暴露后再進行微電極陣列植入手術，來避免電磁干擾。因此，本研究無法實現實時檢測EMF對大鼠的生物效應，希望后續的研究能夠對此深入探究。
綜上所述，本文的研究結果表明，EMF長期暴露造成大鼠mPFC腦區θ-hγ的耦合強度在WM任務過程中下降，使得不同節律神經振蕩之間的耦合作用減弱，導致大鼠的WM行為表現受損。本文的結果為以下假設提供了實驗證據，即EMF長期暴露會引起WM功能受損；同時本文從神經振蕩PAC強度變化的角度揭示了EMF暴露引起WM水平下降的潛在神經機制，為EMF環境引起認知功能受損的機制研究提供了理論和實驗依據。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：王龍龍參與了論文的選題、實驗設計、數據采集和分析、論文寫作；李雙燕參與了論文的選題、實驗設計、數據采集、論文內容審核和論文修改；徐桂芝參與了論文的選題、實驗設計、論文內容審核和論文修改；李天翔和鄭衛然參與了數據采集、分析和論文修改；李洋參與了動物實驗設計和手術過程。
倫理聲明：本研究所有程序均已通過河北工業大學生物醫學倫理委員審查（審查編號：HEBUTaCUC2022053）。實驗動物許可證號：SCXK（冀）2020-007。
0 引言
近年來，隨著電氣設備在工作和生活中的廣泛應用，人們所處的電磁場（electromagnetic field，EMF）環境日益復雜，EMF對生物體健康的影響也受到越來越多的關注。研究表明，暴露于50 Hz的EMF環境可能會對學習和記憶等認知功能造成影響[1-2]。流行病學調查研究表明50 Hz的EMF環境可能會引起神經退行性疾病的發病風險升高[3-4]，如阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease，AD）等認知功能障礙疾病[5]。此外，在嚙齒類動物的研究中也發現，長期暴露于EMF環境會引起大鼠空間記憶水平下降等認知行為障礙[6]。為保障人們的身心健康，國際非電離輻射防護委員會（International Commission on Non-Ionizing Radiation Protection，ICNIRP）導則規定職業工頻EMF暴露限值標準為1 mT[7]，然而面對EMF環境中暴露強度和暴露時長的日益增長，有必要研究EMF長期暴露對認知功能的影響及潛在的作用機制，為EMF的生物健康效應以及職業人員的健康保障提供支持。
EMF影響認知功能的生物機制是復雜且多層次的。大量研究表明，EMF暴露會影響細胞內的神經遞質水平[8]和相關酶的活性[9]，誘導神經元細胞內的鈣穩態失調[10]和自由基代謝紊亂[11]，以及造成長時程增強異常[12]，進而引發進行性記憶障礙。然而，認知活動需要大量的神經元協同配合，從細胞集群活動的角度解釋EMF生物效應機制的研究還不夠完善，因此需要更多的實驗進行深入探究。
植入式微電極記錄技術的發展使得人們能夠獲取相關腦區內的神經集群活動，即局部場電位（local field potential，LFP）[13]。LFP能夠反映神經元局部網絡的興奮性，并具有較好的空間分辨率以及良好的行為特異性[14]。前額葉皮層（prefrontal cortex，PFC）的神經活動異常通常被認為是AD患者認知功能受損的原因之一[15]，其中內側前額葉皮層（medial PFC，mPFC）在環境決策過程中對空間記憶的形成和提取具有重要作用[16]，尤其是對工作記憶（working memory，WM）[17]。WM[18]是指在短時間內維護和操縱信息的認知過程，是許多復雜的高級認知活動（如閱讀、理解、推理和學習）的核心基礎。研究表明，mPFC腦區θ節律（4～12 Hz）[19]和γ節律（30～150 Hz）[20]神經振蕩與WM的形成和維持密切相關。此外，θ和γ節律之間通過相位—幅值耦合（phase-amplitude coupling，PAC）的方式進行跨頻率信息交流，并在WM的編碼過程中發揮重要作用[21]。Zhang等[22]的研究表明，小鼠海馬腦區的θ和γ節律的活動強度以及PAC強度在受到EMF暴露后顯著下降，提示θ-γ節律的PAC模式可能是EMF影響WM的關鍵神經機制。因此，從mPFC神經振蕩PAC強度變化的角度探究EMF長期暴露對大鼠WM功能的影響，對揭示EMF生物效應的神經機制具有重要意義。
本文將成年大鼠分別暴露于磁感應強度為2 mT的EMF環境0 d、24 d和48 d（8 h/d）后，在其mPFC腦區植入微電極陣列，獲取LFP信號，并通過對比分析三組大鼠執行WM任務的行為學表現，WM任務過程中θ和γ節律神經振蕩的活動強度，以及θ節律相位和γ節律幅值耦合的強度變化，探究了EMF長期暴露對大鼠WM的影響及潛在機制，為EMF環境的生物健康效應及機制研究提供支持。
1 材料和方法
本研究所有實驗程序均按照《實驗動物護理和使用指南》[23]進行，所有實驗步驟環節均已通過河北工業大學生物醫學倫理委員審查（審查編號：HEBUTaCUC2022053）。實驗動物許可證號：SCXK（冀）2020-007。
1.1 實驗動物制備
本實驗以15只雄性成年sprague-dawley（SD）大鼠（體重為300～350 g）為研究對象，隨機分為3組（對照組、實驗Ⅰ組、實驗Ⅱ組），每組5只。選取磁感應強度為2 mT、頻率為50 Hz的EMF作為實驗組大鼠的暴露環境，實驗Ⅰ組暴露24 d，實驗Ⅱ組暴露48 d[24]，每天連續暴露8 h，對照組不接受EMF暴露。大鼠經過EMF暴露后，在其mPFC腦區植入微電極，并通過在體多通道電生理記錄系統獲取大鼠執行認知任務時的LFP進行分析。飼養期間給予充足的水和食物，執行行為學任務期間，限制大鼠飲食，使其體重保持在自由進食狀態下的85%，以保持食欲。
1.2 EMF暴露系統
本文的磁場暴露系統由一個交流電源和兩個銅線圈組成，在線圈之間放置一個塑料平臺，作為EMF暴露平臺。通過調整交流電源的輸入電流，在兩個線圈之間生成一個磁感應強度穩定EMF環境。應用COMSOL軟件對線圈間暴露平臺處的磁感應強度進行仿真，選取磁感應強度均勻的區域［（2 ± 0.05）mT］作為大鼠的EMF暴露環境。該EMF暴露系統在連續運行8 h后，線圈間暴露平臺處的溫度保持在（25 ± 3）℃。因此，可以排除環境溫度等干擾因素。
1.3 微電極陣列植入手術
通過外科手術將多通道微電極陣列植入大鼠的mPFC腦區。使用異氟烷氣體麻醉大鼠，并固定于立體定位儀進行外科手術，將16通道的鎳鉻合金微電極陣列（2×8 配置排列，直徑35 μm，電極間距300 μm）植入大鼠的mPFC（前囟前2.5～4.5 mm，旁開0.2～1.0 mm，深度為距離腦皮層表面2.5～3.0 mm）。在電極到達目標腦區后，使用瓊脂封閉顱腔來保護腦組織，然后使用牙科水泥進行包埋固定。術后單獨飼養，并給予大鼠5～7 d的恢復時間。
1.4 WM任務和神經電信號獲取
基于食物獎勵的T迷宮延遲交替任務是一種測試空間WM的行為學實驗范式[14]，已廣泛應用于腦認知活動的檢測。本文使用的“T迷宮”由一個起始臂（臂端為起始區域）和兩個具有食物獎勵的目標臂（臂端分別放置食槽，食槽內可放置食物作為獎勵）組成，如圖1所示。
圖1
T迷宮延遲交替任務示意圖
Figure1.
Diagram of the delayed-alternation task on T-maze
T迷宮任務包括訓練階段和測試階段。訓練階段，所有大鼠每天接受空間WM訓練（20次/天）。任務過程簡述如下：每次任務包括自由選擇和延遲交替選擇兩個過程。在自由選擇過程，大鼠從起始區域出發至選擇參考點（reference point，RP），然后選擇向左或向右移動進入任意一個目標臂以獲得食物獎勵。隨后大鼠回到起始區域等待5 s后開始延遲交替選擇過程。在此過程中，大鼠必須進入與自由選擇過程相反的目標臂，才能獲得食物獎勵，并記錄為行為學正確；反之，則不能獲取食物獎勵，并記錄為行為學錯誤。之后，大鼠自主回到起始點，本次任務結束。當大鼠行為學正確率連續兩天超過80%時，被認為達到“學會”的標準，完成訓練階段任務。此后，大鼠進行測試階段，過程與訓練階段相同，執行5 d（20次/天），并應用在體多通道電生理記錄系統OmniPlex（Plexon，美國）獲取大鼠在執行WM任務測試階段延遲交替選擇過程中mPFC的神經電信號，并通過放大（增益：5 000）和低通濾波（0.3～300 Hz）獲得16通道的LFP（采樣率：1 000 Hz）。
1.5 LFP數據分析
隨機選取每只大鼠WM任務測試階段20次行為學正確的數據進行分析，三組大鼠共300次任務的數據。首先對獲取的LFP數據進行預處理，通過小波變換去除LFP數據的基線漂移，再使用陷波濾波器消除50 Hz的工頻干擾，得到穩定信號。
本實驗使用多錐度法[25]對信號進行功率譜密度（power spectral density，PSD）估計，來分析信號的頻譜特性。應用短時傅立葉變換（short-time Fourier transform，STFT）[26]來估計LFP信號的頻率和時間分布。將LFP信號表示為x(t)，其STFT定義為：
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式中，g(t)是窗函數，選取窗口長度為500 ms，窗口移動步長為200 ms，計算LFP的動態時頻分布。
本研究使用調制指數（modulation index，MI）的方法[27]對θ相位和γ幅值之間的PAC模式進行了分析，過程簡述如下：首先使用一組窄帶濾波器分別檢測θ節律相位的上升和下降斜率，并使用寬帶濾波器找到波谷和波峰，以避免θ節律振蕩的相位因單調變化而形成偽耦合現象，并將相位信號命名為φ(t)。然后，將φ(t)的每個周期分為4個相位段，分別對應波峰至波谷的下降以及上升時期，將每個相位段再平均分成4個相位段，則一個相位周期被分為16個相位段。然后，對于γ節律振蕩，使用一個帶寬固定且頻率中心在γ節律范圍逐步平移的濾波器進行濾波，其帶寬至少是相位信號頻率的兩倍。本文選取的帶寬為24 Hz，符合兩倍的要求。然后利用希爾伯特變換計算γ振蕩的幅值包絡，記為A(t)。
接下來，計算每個相位段對應γ幅值包絡Ay的平均值。將各相位段所求的Ay除以各相位段均值的總和，從而將幅值信息轉化為分布概率的信息，如式（2）所示：
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式中，Ay(j)表示相位段j處的γ幅值包絡Ay的平均值，Pj為Ay(j)的分布概率，N為相位段的個數。當各個相位段所對應的幅值均值相同時，此分布為均勻分布。應用標準化熵度量H來表征調制指數，定義如式（3）所示：
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當Pj=1/N時，H達到最大值，記為Hmax。通過標準化，可以得到基于熵的MI。本研究使用MI來表示信號間的PAC強度，如式（4）所示：。
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當MI接近0時，表示θ節律相位和γ節律幅值的耦合強度較低；當MI值較大時，表示θ和γ節律之間存在較高強度的耦合關系。
1.6 統計分析
本文應用統計軟件GraphPad Prism 9.0（GraphPad Prism Software Inc.，美國）軟件的單因素方差分析（one-way ANOVA）對行為表現、PSD和PAC強度結果進行統計，并通過Bonferroni校正后分析組間差異，檢驗水準為0.05。文中數據均以均值±標準誤表示。
2 結果
2.1 EMF長期暴露對大鼠T-迷宮行為表現的影響
為研究EMF環境長期暴露對大鼠認知功能的影響，本研究通過T迷宮延遲交替任務來檢測各組大鼠的空間WM水平。在任務的訓練過程中，對每只大鼠每天的行為學正確率進行統計，當達到行為學標準時（至少連續兩天的正確率超過80％），認定該大鼠學會WM任務。圖2所示為各組大鼠每天的平均正確率。結果顯示，隨著學習時長的增加，正確率呈逐漸上升趨勢，且各組大鼠在經過訓練之后均達到行為學標準。
圖2
大鼠T迷宮任務行為表現
Figure2.
Behavior performance of rats in the T-maze task
圖3所示為各組大鼠達到行為學標準所需時長的統計結果，該指標反映了大鼠學習T迷宮任務規則的速率，是評價WM功能的重要指標。由圖3可知，各組大鼠達到行為學標準的平均天數分別為：對照組（5.8 ± 0.49）d、實驗Ⅰ組（10.8 ± 1.83）d、實驗Ⅱ組（12.6 ± 1.08）d。ANOVA結果顯示各組均值之間的差異具有統計學意義［F（2, 12）= 7.857，P= 0.006］，對照組達到WM任務標準所需平均時長低于實驗Ⅰ組（P = 0.047）和實驗Ⅱ組（P = 0.007）；而實驗Ⅰ組與實驗Ⅱ組之間的差異無統計學意義（P = 0.583）。結果提示，實驗Ⅰ組和實驗Ⅱ組的大鼠在經過EMF長期暴露后需要更多的時間才能學會WM任務，反映出其空間學習記憶能力受損。
圖3
大鼠達到T迷宮任務標準所需天數（*P < 0.05）
Figure3.
Days for rats to meet the T-maze task criterion (*P < 0.05)
2.2 EMF長期暴露對大鼠WM過程中神經活動的影響
為了從神經振蕩活動變化的角度探究EMF長期暴露對WM的影響，本文分析了大鼠mPFC中LFP信號θ和γ節律振蕩在WM任務期間的活動強度變化。以對照組為例，首先選取大鼠在RP前2 s和后1 s的LFP信號進行時頻分析，該時間段包含了大鼠從起始區域出發經過RP至獲得食物獎勵的過程。圖4所示為LFP信號的時頻分布結果，其中θ和γ節律振蕩的能量在RP前1 s內（–1～0 s）高于其他時間段，該時間段是大鼠離開起始區域并進行選擇的過程，可能是大鼠依據WM進行空間行為決策的關鍵時期。與之前的報道[26]一致，θ和γ節律的神經振蕩活動在該時間段增強。隨后，提取RP前1 s的LFP數據，分析各組大鼠θ和γ節律振蕩的PSD在該關鍵時期的差異。圖5所示為θ和γ節律振蕩PSD的統計結果。由圖5可知，ANOVA結果顯示三組θ節律PSD均值之間的差異具有統計學意義［F（2，297）= 31.20，P < 0.001］，經Bonferroni校正后實驗Ⅱ組的結果低于對照組（P < 0.001）和實驗Ⅰ組（P < 0.001），而對照組和實驗Ⅰ組之間的差異無統計學意義（P > 0.99）；ANOVA結果顯示三組γ節律PSD均值之間的差異具有統計學意義［F（2，297）= 114.0，P < 0.001］，經Bonferroni校正后實驗Ⅱ組的結果低于對照組（P < 0.001）和實驗Ⅰ組（P = 0.001），而實驗Ⅰ組也低于對照組（P < 0.001）。結果提示，經過EMF的長期暴露后，大鼠執行WM任務時θ和γ節律的神經振蕩活動都呈現不同程度的降低。
圖4
mPFC腦區的θ和γ節律振蕩在WM任務過程中的時頻分布
Figure4.
The time-frequency distribution of θ and γ oscillations in mPFC brain regions during WM task
圖5
θ和γ節律的PSD對比圖（*P < 0.05）
Figure5.
Comparison of PSD of θ and γ rhythms oscillations in three groups (*P < 0.05)
2.3 EMF長期暴露對大鼠PAC模式的影響
為探究EMF長期暴露對大鼠在WM過程中不同節律神經振蕩信息交互的影響，對各組大鼠mPFC腦區的PAC模式進行分析。以對照組為例，圖6所示為大鼠空間決策關鍵時期（RP前1 s）θ相位和γ幅值的PAC結果，可見θ和γ節律之間存在明顯耦合現象。
圖6
θ-γ的PAC模式
Figure6.
PAC distribution of θ-γ oscillations
由圖6可知，在γ節律（30～150 Hz）之間發現不同的MI峰值，表明γ節律范圍內的PAC強度可能不同。如圖7所示為γ節律范圍內的PAC耦合情況。結果發現γ節律范圍的MI存在三個峰值，分別為低頻γ（lγ：30～60 Hz）、中頻γ（mγ：60～100 Hz）和高頻γ（hγ：100～150 Hz）。因此，對三個γ子節律與θ相位分別進行分析，以探究EMF長期暴露對不同γ子節律PAC強度的影響。如圖8所示為三個γ子節律與θ相位MI的統計結果。由圖8可知，θ-hγ的MI結果顯示三組之間差異具有統計學意義［F（2，297）= 7.816，P <0.001］，對照組的MI高于實驗Ⅰ組（P = 0.010）和實驗Ⅱ組（P <0.001），而實驗Ⅰ組和實驗Ⅱ組MI之間的差異無統計學意義（P = 0.408）；θ-lγ和θ-mγ的MI結果均顯示對照組與實驗Ⅰ組和實驗Ⅱ組的差異無統計學意義（P > 0.05）。結果提示，θ-hγ可能是EMF對mPFC腦區產生影響的主要作用靶點。
圖7
MI在γ節律范圍的動態分布
Figure7.
Dynamic distribution of MI in the γ rhythm range
圖8
θ-γ子節律間的MI對比（*P < 0.05）
Figure8.
Comparison of the MI between θ-γ sub-band (*P < 0.05)
3 討論與結論
本文通過將大鼠暴露于EMF環境0 d、24 d和48 d，對比分析了三組大鼠WM任務的行為表現，WM任務過程中θ和γ節律神經振蕩的活動強度，以及θ節律相位和γ節律幅值耦合的強度變化，以探究EMF長期暴露對大鼠WM的影響及其神經機制。
本研究中大鼠行為表現結果提示，經過EMF長期暴露后，大鼠需要更多的時間來學會相同的任務，即EMF使得大鼠的學習和工作記憶功能受損，與之前的報道[12]相一致。然而48 d的暴露時長并沒有使得大鼠的WM行為表現比暴露24 d組的表現下降，可能是由于代償機制發揮作用，大鼠逐漸適應了EMF環境。EMF的生物健康效應與被試對象和暴露參數等多種因素相關。因此，還需深入優化實驗條件，以保障長期處于EMF環境職業人員的身心健康。
LFP可以直接反映神經元集群的電生理活動，研究LFP特征對探究EMF影響神經系統認知功能的作用機制具有重要意義。本文發現在γ節律范圍內的PAC模式可能存在不同范圍的耦合峰值，高頻部分γ子節律的MI顯著高于低頻部分，表明θ相位與多個γ子節律幅值發生了耦合，并且更傾向于耦合高頻部分。其原因可能是不同的γ子節律范圍具有獨立的生理意義，發揮不同的作用[28]。θ與γ子節律耦合的結果表明，在經過EMF長期暴露后，θ-hγ的MI顯著下降，且暴露48 d的下降效果最為顯著。結果提示EMF長期暴露主要對高頻γ節律的PAC強度產生了影響，θ-hγ的耦合可能是EMF對mPFC腦區的主要作用靶點。同時，θ-hγ的PAC變化與行為結果一致，表明θ-hγ之間的PAC強度能夠反映WM水平，并且可能是EMF暴露影響WM功能的潛在神經機制。
此外，由于在大鼠mPFC腦區植入的微電極陣列為鎳鉻合金材質，可能會在EMF暴露時產生電磁感應效應影響實驗結果，因此本研究選擇在大鼠執行完EMF暴露后再進行微電極陣列植入手術，來避免電磁干擾。因此，本研究無法實現實時檢測EMF對大鼠的生物效應，希望后續的研究能夠對此深入探究。
綜上所述，本文的研究結果表明，EMF長期暴露造成大鼠mPFC腦區θ-hγ的耦合強度在WM任務過程中下降，使得不同節律神經振蕩之間的耦合作用減弱，導致大鼠的WM行為表現受損。本文的結果為以下假設提供了實驗證據，即EMF長期暴露會引起WM功能受損；同時本文從神經振蕩PAC強度變化的角度揭示了EMF暴露引起WM水平下降的潛在神經機制，為EMF環境引起認知功能受損的機制研究提供了理論和實驗依據。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：王龍龍參與了論文的選題、實驗設計、數據采集和分析、論文寫作；李雙燕參與了論文的選題、實驗設計、數據采集、論文內容審核和論文修改；徐桂芝參與了論文的選題、實驗設計、論文內容審核和論文修改；李天翔和鄭衛然參與了數據采集、分析和論文修改；李洋參與了動物實驗設計和手術過程。
倫理聲明：本研究所有程序均已通過河北工業大學生物醫學倫理委員審查（審查編號：HEBUTaCUC2022053）。實驗動物許可證號：SCXK（冀）2020-007。
