乙型肝炎病毒（HBV）感染可導致慢性肝炎、肝纖維化甚至肝硬化或肝癌等嚴重后果，有效的抗病毒治療可以減緩疾病進展。乙肝病毒生物標志物在慢性乙型肝炎（CHB）患者全程動態化管理中具有重要作用，而經典乙肝病毒標志物（如乙肝兩對半、HBV DNA）尚不能完全滿足臨床需求。本文綜述了HBsAg定量、抗-HBc定量、HBV RNA和HBV核心相關抗原等HBV標志物的最新研究，總結了這些標志物在CHB患者抗病毒治療中的使用、療效預測和停藥后復發風險預測，以及疾病進展風險評估等方面的作用。
引用本文： 王馨, 唐小瓊, 韓寧, 唐紅. 乙型肝炎病毒生物標志物的研究進展及其臨床意義. 生物醫學工程學雜志, 2023, 40(6): 1242-1248. doi: 10.7507/1001-5515.202309041 復制
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0 引言
當前慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）及其導致的肝纖維化、肝硬化和肝細胞癌（hepatocelluar carcinoma，HCC）仍是影響人群健康的重大疾病負擔[1]。現有抗病毒藥物核苷（酸）類似物（nucleoside analogues，NAs）和干擾素可以延緩疾病進展和減少乙型肝炎相關終末期肝病的發生。其中，乙肝病毒標志物在CHB患者全程動態化管理中發揮著重要作用。
目前臨床上廣泛用于監測乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染的傳統標志物，包括HBV表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）及其抗體（抗-HBs）、HBV e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）及其抗體（抗-HBe）、HBV核心抗體（抗-HBc）和HBV DNA，這些傳統標志物可以在一定程度上反映HBV感染狀態和復制水平，但在反映共價閉合環狀DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）的轉錄活性和CHB患者抗病毒治療應答等方面存在一定局限性。對于抗病毒治療過程中出現HBsAg消失或HBV DNA檢測不到的CHB患者，其肝細胞內可能仍然存在cccDNA的轉錄復制，這部分患者停止抗病毒治療可能存在病毒學復發風險。
肝內cccDNA定量是充分了解HBV復制和轉錄活性的金標準。然而，其檢測存在如下局限性：① 松弛環狀的雙鏈DNA（relaxed circular DNA，rcDNA）與cccDNA具有序列同源性，導致區分cccDNA和病毒線性DNA或rcDNA是一大挑戰；② cccDNA檢測需要進行肝活檢，屬于有創性操作，存在出血、感染等風險，并且目前關于cccDNA的檢測沒有統一的標準化方案，因此cccDNA無法作為常規的HBV生物標志物用于治療效果和疾病進展監測。
隨著檢測手段的進步，包括乙肝表面抗原定量（quantification of hepatitis B surface antigen，qHBsAg）、乙肝核心抗體定量、HBV RNA和乙肝核心相關抗原（hepatitis B core-related antigen，HBcrAg）在內的HBV生物標志物在反映肝組織內cccDNA的水平、指導CHB抗病毒藥物選擇、監測治療效果、停藥后復發風險評估和肝癌風險分層等方面的研究正在不斷深入。本文對上述標志物的最新研究進行綜述，以期為CHB患者的臨床精確管理提供一定參考。
1 乙肝表面抗原定量
HBsAg的來源主要包括HBV cccDNA的轉錄翻譯和整合進人基因組的HBV DNA的轉錄翻譯。血清中檢測到的HBsAg大部分為亞病毒顆粒（subviral particle，SVP），其含量超過成熟病毒粒子的100～100 000倍。目前市售的檢測方法可以檢測各種形式的HBsAg（SVP或成熟病毒粒子）。近年來，qHBsAg檢測已在臨床中被廣泛應用，目前主要的檢測方法為化學發光法，最低檢測限一般為0.05 IU/mL。
慢性乙型肝炎臨床治愈（又稱功能性治愈），即完成有限療程治療后，血清HBsAg和HBV DNA持續檢測不到，是目前CHB治療中現實可行的治療目標。研究表明HBsAg的清除可以進一步減少HCC的發生和復發[2]。然而HBsAg的年清除率僅為0.2%～2%。因此，通過監測HBV生物標志物，優化CHB抗病毒治療方案，從而對能否實現HBsAg清除做出早期預測和提高HBsAg清除率有助于延緩CHB患者的疾病進展。
qHBsAg可以早期預測抗病毒治療應答和HBsAg清除。通過對接受聚乙二醇干擾素α（pegylated interferon alpha，PEG-IFNα）聯合或不聯合NAs治療的CHB患者研究發現，較低的治療前qHBsAg水平以及治療早期qHBsAg的明顯下降與更高的持續病毒學應答（sustained virological response，SVR）和HBsAg清除率有關[3-4]。有研究納入279名接受抗病毒治療的CHB患者，發現治療時血清HBV RNA下降且HBsAg下降>1 log的42名患者中有20人獲得持續應答（n = 20/42，47.6%）；而HBsAg下降 < 0.5 log的75名患者中只有12人獲得持續應答（n = 12/75，16.0%，P = 0.001）；治療過程中血清HBsAg水平沒有伴隨HBV RNA下降與治療反應率低和HBsAg清除率低有關[5]。鑒于此，基線的qHBsAg水平和治療過程中qHBsAg的下降情況可用于評估抗病毒治療是否獲得持久應答，以及能否停藥。
此外，許多研究也探索了qHBsAg在預測停藥后持續病毒學應答及疾病進展中的作用。多數研究認為停用NAs治療時，血清低水平的qHBsAg（< 100 IU/mL）與持續的病毒學應答相關。有研究對110名停用NAs的HBeAg陰性的CHB患者進行96周隨訪，發現停藥時血清更低水平的qHBsAg（< 10 IU/mL）可以預測臨床治愈[6]。停用NAs時低水平的血清qHBsAg和HBcrAg實現臨床治愈的機會更高[7-8]。此外，有人通過研究NAs治療結束時HBsAg、HBcrAg與預后的關系，發現停藥時較低的HBsAg水平與較高的病毒學應答（OR = 0.812；P = 0.011）和HBsAg清除（OR = 0.380；P < 0.001）相關，同時谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）驟升發生率較低（OR = 1.833；P < 0.001）；較低的HBcrAg水平也有類似的結果[9]。因此，聯合qHBsAg和HBcrAg可以更好地預測停藥后的持續病毒學應答，而包括這兩個因素的風險評分可用于風險分層。另有研究提示，停用干擾素治療時較高的qHBsAg（OR = 1.586；95%CI：1.231～2.043）、HBV RNA（OR = 1.695；95%CI：1.371～2.094）和HBcrAg（OR = 1.518；95%CI：1.324～1.740）水平與較高的ALT驟升風險相關（P < 0.001）[10]。所以，聯合多個乙肝血清生物標志物評估可以較全面地指導治療和停藥隨訪的決策。另外，qHBsAg也可作為慢性肝炎進展為肝纖維化和肝癌的預測因子。在HBeAg陰性、ALT正常或輕度升高的CHB患者中，qHBsAg≥3 log10IU/mL的患者有更嚴重的肝臟炎癥或肝纖維化[11]。
綜上，較低的基線血清qHBsAg水平和治療過程中qHBsAg的下降情況可預測抗病毒療效和停藥時機；停藥時低水平的血清qHBsAg可評估停藥后復發風險和疾病進展，以及預測功能性治愈。
2 乙肝核心抗體定量
在慢性HBV感染的不同階段，抗-HBe一般在e抗原消失后產生，抗-HBs一般在感染清除后產生，而抗-HBc在各個時期均可被檢測到。同時在感染的不同階段，血清抗-HBc的水平存在差異。常用的抗-HBc檢測方法有酶聯免疫吸附法、化學發光法和電化學發光法，檢測原理主要是競爭法或間接法。近年來，已研發出雙抗原夾心法的商業化試劑盒，實現了抗-HBc的定量檢測，定量范圍可達102～105 IU/mL。
人體對HBV的體液免疫反應主要針對HBV核心抗原（hepatitis B core antigen，HBcAg），與感染階段密切相關。血清抗-HBc水平可反映肝臟炎癥程度。有研究納入了117名ALT正常、HBV DNA陽性、HBeAg陰性的CHB患者，其中50名患者（42.7%）的肝穿刺活檢結果有明顯的肝臟炎癥反應，發現血清抗-HBc水平與肝臟炎癥程度呈正相關（P < 0.001），是發生肝臟炎癥的獨立風險因子（OR = 1.562；95%CI：1.157～2.110；P = 0.004）[12]。無論HBeAg是陰性還是陽性，較高的抗-HBc水平與更嚴重的肝臟組織炎癥相關（P < 0.001）[13]。另有一項研究通過研究接受恩替卡韋治療的142例HBeAg陽性的CHB患者，發現肝臟中-重度炎癥（≥ G2）患者的抗-HBc水平明顯高于無或輕度肝炎患者，治療前抗-HBc定量、ALT水平與肝臟炎癥分級呈正相關，且抗-HBc的相關性優于血清ALT水平，而HBsAg與肝臟炎癥分級呈負相關，提示抗-HBc定量、ALT和HBsAg聯合使用更能預測明顯的肝臟炎癥（≥ G2）[14]。
有研究還討論了血清抗-HBc水平在預測抗病毒治療應答和停藥后復發風險方面的應用。侯金林教授團隊[15]開展的多中心隨機對照研究，在231名和560名接受PEG-IFNα或NAs治療的患者中，基線抗-HBc定量水平是HBeAg血清學轉換最佳的獨立預測因子（OR = 2.178；95%CI：1.577～3.009；P < 0.001）；基線抗-HBc定量水平越高，發生HBeAg血清學轉換的可能性越高。另有一項研究表明，對于接受干擾素治療的HBeAg陽性患者，基線抗-HBc水平越高（≥ 30 000 IU/mL），獲得免疫學和病毒學應答的概率也就越高[16]。其他針對接受各種抗病毒治療的HBeAg陽性的CHB患者的研究也得出一致的結論[13, 17-18]。而在原本NAs治療基礎上加用干擾素治療的CHB患者中，較高的抗-HBc與HBeAg血清學轉換、病毒持續應答也呈正相關，而與HBsAg清除呈負相關[13, 19]。與HBeAg陽性患者不同，抗-HBc定量在HBeAg陰性CHB患者中的預測意義還有待進一步探索。抗-HBc定量也可用于停藥后復發風險預測，CHB患者抗病毒治療停藥時，高水平抗-HBc定量與較低的臨床復發風險相關。一項前瞻性研究納入100例停藥的CHB患者，中位隨訪2.5年，發現NAs治療結束時抗-HBc水平越高（≥ 3 log10IU/mL），停藥后復發率越低，并且與停藥時qHBsAg水平（<2 log10IU/mL）聯合使用可提高預測能力[20]。
綜上，較高的血清抗-HBc水平可能提示患者較嚴重的肝臟炎癥，同時也能在一定程度上預測HBeAg血清學轉換和病毒持續應答。此外，停藥時較高水平的抗-HBc定量或聯合低水平的qHBsAg則可能提示停藥后復發風險較低。
3 HBV RNA
1996年，在HBV感染者血清中首次發現HBV RNA。此后，研究人員先后證實HBV RNA主要成分是未經轉錄或部分轉錄的、存在于核衣殼內的前基因組RNA（pregenomic RNA，pgRNA），主要來自于HBV cccDNA的直接轉錄，其形成與釋放不受NAs藥物直接抑制。目前定量檢測血清HBV RNA的主要方法包括間接定量法和直接定量法。間接定量法是通過實時熒光定量的檢測技術，其中商品化試劑檢測下限為300 copies/mL，定量范圍為103～108 copies/mL。直接定量法則是通過RNA捕獲探針法，其中實時恒溫擴增和檢測技術（simultaneous amplification and testing，SAT）已被成功用于血清HBV RNA的檢測，有助于進一步規避核酸提取產物中混雜的DNA對HBV RNA定量的干擾。SAT試劑檢測下限為50 copies/mL，定量范圍為102～108 copies/mL。
由于HBV RNA來自cccDNA直接轉錄的pgRNA，所以HBV RNA能夠較好地反映病毒cccDNA的存在水平和轉錄活性。唐紅教授團隊[21]的一項研究納入華西醫院2012年至2013年行肝穿刺活檢的110例CHB患者，發現在HBeAg陽性的CHB患者中，血清HBV RNA與肝內cccDNA水平具有正相關性。張文宏教授團隊[22]在隨訪接受NAs治療的CHB患者過程中也發現，部分患者在檢測不到HBV DNA時，血清中HBV RNA以及肝內cccDNA仍為陽性，提示血清HBV RNA水平與肝內cccDNA具有相關性。另有一項對接受48周干擾素治療的HBeAg陽性的CHB患者的隨機對照研究發現，治療前后的HBV RNA均與cccDNA有相關性（r = 0.728～0.781，P < 0.001）[23]。
血清HBV RNA水平可以監測和評估抗病毒療效。有研究指出在接受NAs治療的CHB患者中，HBV RNA和HBV DNA均呈下降趨勢；但部分患者出現HBV DNA很快低于檢測下限，而HBV RNA仍可檢出的現象[24]。在接受干擾素治療的HBeAg陽性和陰性的CHB患者中，早期血清HBV RNA水平的顯著下降與持續的治療應答和長期隨訪事件中的HBsAg清除有關[25-27]。HBV RNA還可預測HBeAg血清學轉換。有研究通過對50例接受NAs治療的HBeAg陽性CHB患者的觀察，發現在獲得HBeAg血清學轉換的患者中，HBV RNA水平下降顯著；而且治療第三個月和第六個月時HBV RNA水平較基線下降的程度可預測HBeAg血清學轉換的發生率，相較于HBV DNA、HBsAg、ALT等指標更為準確[28]。
血清HBV RNA水平還可評估停藥后的復發風險，從而指導停藥時機的選擇。一項研究納入114例服用恩替卡韋中位治療6.7年的非肝硬化CHB患者，符合HBsAg < 200 IU/mL且滿足國際停藥標準，停藥后隨訪48周發現，HBV DNA > 2 000 IU/mL的累計復發率為58.1%；根據停藥時HBV RNA水平，HBV RNA ≥ 44.6 U/mL的患者累計復發率為93.2%，HBV RNA < 44.6 U/mL的患者累計復發率為52.1%，而HBV RNA檢測不到的患者48周累計復發率為36.6%， HBV RNA檢測不到且qHBsAg < 10 IU/mL的患者48周累計復發率為9.1%[29]；因此，HBV RNA或聯合qHBsAg可作為評估恩替卡韋抗病毒治療停藥的關鍵指標。侯金林教授團隊[30]也基于HBV RNA在指導停藥方面展開了全國性的多中心臨床研究，發現治療結束時，無論在臨床復發、病毒學反彈或者HBeAg逆轉方面，HBV RNA和HBV DNA雙陰性的患者都較HBV RNA陽性或HBV DNA陽性的患者風險更低，提示聯合HBV RNA和HBV DNA檢測可指導接受NAs治療的非肝硬化CHB患者停藥時機的選擇。另有研究表明，停藥時血清HBV RNA檢測不到和HBsAg ≤ 100 IU/mL的患者比HBV RNA陽性和HBsAg > 100 IU/mL的患者發生病毒學復發的可能性更低；停藥時HBV RNA水平與HBV DNA有相關性，并與停藥后發生爆發性肝炎風險相關[31]。
血清HBV RNA除了監測與評估抗病毒治療效果外，還可用于疾病風險分層。有研究發現，相比于天冬氨酸轉氨酶和血小板比率指數（aspartate aminotransferase to platelet ratio index，APRI）評分和肝纖維化4因子指數（fibrosis 4 score，FIB-4），HBV RNA在預測HBeAg陽性或陰性患者的肝纖維化程度方面都更優越。血清HBV RNA水平是HBeAg陽性患者（OR = 0.514；P < 0.001）和HBeAg陰性患者（OR = 3.574；P < 0.001）肝纖維化的獨立預測因子[32]。在預測HCC發生風險上，HBV RNA和HBV DNA雙陽性患者比雙陰性患者的肝癌發生風險高4.02倍，單陽性患者比雙陰性患者的肝癌發生風險高1.57倍，其中HBV RNA陽性患者（4.1%）肝癌發生率也比陰性患者（1.8%）高[33]。還有研究認為，遠端非癌組織中HBV RNA含量越高，肝癌復發率越高，患者的生存率越低[34]。
綜上，血清HBV RNA可以較好地反映病毒cccDNA的轉錄活性；抗病毒治療早期血清HBV RNA水平的顯著下降可以預測HBeAg血清學轉換和HBsAg清除；停藥時較低甚至檢測不到的HBV RNA水平提示停藥后復發風險較低，聯合HBV RNA和HBV DNA可以更好地指導停藥時機的選擇。
4 乙肝核心相關抗原
HBcrAg是由前核心mRNA（3.5 kb）編碼形成的蛋白復合物，包括HBeAg、HBcAg和p22cr三種蛋白。這三種蛋白擁有相同的149個氨基酸序列，因此可以使用識別同源區域的單克隆抗體進行檢測。目前HBcrAg的主要檢測方法為化學發光酶免疫分析法，定量試劑的最低檢測下限一般為2.8 logU/mL。最近還研發出了一種全自動、新型高靈敏度的HBcrAg測定（iTACT-HBcrAg），靈敏度提高大約8倍。
與qHBsAg、HBV RNA等病毒學標志物相比，血清HBcrAg可以更好地反映肝組織內cccDNA水平，且不受HBeAg狀態的影響。唐紅教授團隊[35]的研究發現，在CHB自然史的不同時期，血清HBcrAg與肝內cccDNA均有良好的相關性；在抗病毒治療后，HBcrAg表達水平與cccDNA的下降幅度也具有相關性。進一步的一項多元回歸分析表明，在HBeAg陽性患者中，HBcrAg、HBsAg和HBV RNA均與肝內cccDNA水平相關；而在HBeAg陰性患者中，僅HBcrAg與肝內cccDNA水平具有相關性[21]。在抗病毒治療后HBV DNA檢測不到的患者中，血清HBcrAg與肝內cccDNA也具有較好的相關性。因此，血清HBcrAg是間接反映CHB患者肝組織內cccDNA的很好的指標。
血清HBcrAg水平可以進一步預測HBeAg血清學轉換。在接受NAs治療的HBeAg陽性患者中，較高的基線HBcrAg水平與發生HBeAg血清轉換獨立相關[36]。最新研究表明，基線時HBcrAg ≤ 6.5 log10 IU/mL，且抗病毒治療2年后HBcrAg水平 ≤ 5.3 log10IU/mL是HBeAg血清轉換的有利預測因素[37]。此外，唐紅教授團隊[38]的一項研究評估了接受干擾素治療12個月的HBeAg陽性的CHB患者，1月時HBcrAg水平及下降程度對治療6月后HBeAg發生血清學轉換的預測效果較好（ROC = 0.894；P = 0.043）。所以，通過監測干擾素或者NAs治療早期的HBcrAg下降水平，有助于預測患者能否獲得HBeAg血清學轉換。而且相較HBsAg而言，HBcrAg水平能更有效地預測接受NAs治療的患者能否獲得HBeAg血清學轉換。
血清HBcrAg或聯合其他血清標志物還可以進一步評估停藥后的復發風險。唐紅教授團隊[39]對接受NAs治療的CHB患者進行8年隨訪，發現在長期治療過程中，外周血HBcrAg水平呈逐漸降低趨勢。另有研究提示停藥時HBcrAg水平與HBsAg轉陰率呈負相關，其中HBcrAg水平 < 2 log10U/mL的患者HBsAg轉陰率最高[7]。此外，寧琴教授團隊[40]發現干擾素治療結束時患者的HBcrAg和抗-HBs定量水平與持久的功能性治愈密切相關，當HBcrAg < 4 log10 U/mL且抗-HBs > 2 log10 IU/L時，對患者獲得持久的功能性治愈的陽性預測值為100%（AUROC = 0.822；P = 0.001），因此HBcrAg和抗-HBs聯合預測接受干擾素治療患者的持續性應答效果最佳。停藥時較低水平的血清HBcrAg或低于檢測下限的血清HBV RNA以及兩者聯合可幫助評估停用NAs后有較低復發風險的患者[9, 29, 41-42]。同時也有研究認為在接受長期NAs治療的CHB患者中，早期治療4周時血清HBcrAg和HBV RNA的變化水平可以聯合預測HBsAg清除或HBsAg ≤ 100 IU/mL[43]。
血清HBcrAg水平也可以預測肝硬化與HCC發生風險。Liang等[44]通過對1 042名HBeAg陰性CHB患者的研究，發現血清HBcrAg水平越高，發生HCC的風險越大（HR = 2.20，> 2.9 vs. ≤ 2.9）。Kaneko等[45]進一步研究表示，在HBeAg陽性和陰性患者之間，不同的血清HBcrAg水平發展為肝癌的風險不同。多項研究均證明，基線和抗病毒治療期間的血清HBcrAg水平在預測肝癌的發展中起重要作用[46-47]。此外，臺灣的一項研究通過追蹤2 150名未接受過治療的CHB患者，發現外周血HBcrAg水平越高，發生HCC的風險越高；而且HBcrAg預測10年內發生HCC的能力優于HBV DNA和HBsAg（ROC = 0.75）[48]。
綜上，血清HBcrAg可以很好地反映病毒cccDNA的轉錄活性，治療早期血清HBcrAg水平的顯著下降以及治療前后低水平的HBcrAg是預測HBeAg血清學轉換的有利因素，同時停藥時較低的HBcrAg水平可評估停藥后較低復發風險的患者，并預測疾病進展風險。
5 結論
在CHB臨床管理中，評估病毒生物標志物的作用是不可或缺的。在目前以強效低耐藥的NAs為主要治療手段的時代，絕大部分患者經NAs治療后HBV DNA都檢測不到，這就需要新的HBV轉錄和翻譯標記物，以進一步評估和優化治療效果。不斷增加的證據表明，qHBsAg、抗-HBc定量、HBV RNA和HBcrAg等HBV生物標志物，在幫助制訂治療決策、預測臨床治療效果和指導安全停藥、肝臟疾病進展風險分層和預測等方面都發揮著重要的作用，值得在臨床應用。需要注意的是，如何更好地應用這些生物標志物以發揮其最大的臨床價值仍有待進一步探索。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：王馨主要負責論文撰寫與修改，唐小瓊和韓寧主要負責論文修訂，唐紅主要負責論文審閱修訂并提供基金支持。
0 引言
當前慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）及其導致的肝纖維化、肝硬化和肝細胞癌（hepatocelluar carcinoma，HCC）仍是影響人群健康的重大疾病負擔[1]。現有抗病毒藥物核苷（酸）類似物（nucleoside analogues，NAs）和干擾素可以延緩疾病進展和減少乙型肝炎相關終末期肝病的發生。其中，乙肝病毒標志物在CHB患者全程動態化管理中發揮著重要作用。
目前臨床上廣泛用于監測乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染的傳統標志物，包括HBV表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）及其抗體（抗-HBs）、HBV e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）及其抗體（抗-HBe）、HBV核心抗體（抗-HBc）和HBV DNA，這些傳統標志物可以在一定程度上反映HBV感染狀態和復制水平，但在反映共價閉合環狀DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）的轉錄活性和CHB患者抗病毒治療應答等方面存在一定局限性。對于抗病毒治療過程中出現HBsAg消失或HBV DNA檢測不到的CHB患者，其肝細胞內可能仍然存在cccDNA的轉錄復制，這部分患者停止抗病毒治療可能存在病毒學復發風險。
肝內cccDNA定量是充分了解HBV復制和轉錄活性的金標準。然而，其檢測存在如下局限性：① 松弛環狀的雙鏈DNA（relaxed circular DNA，rcDNA）與cccDNA具有序列同源性，導致區分cccDNA和病毒線性DNA或rcDNA是一大挑戰；② cccDNA檢測需要進行肝活檢，屬于有創性操作，存在出血、感染等風險，并且目前關于cccDNA的檢測沒有統一的標準化方案，因此cccDNA無法作為常規的HBV生物標志物用于治療效果和疾病進展監測。
隨著檢測手段的進步，包括乙肝表面抗原定量（quantification of hepatitis B surface antigen，qHBsAg）、乙肝核心抗體定量、HBV RNA和乙肝核心相關抗原（hepatitis B core-related antigen，HBcrAg）在內的HBV生物標志物在反映肝組織內cccDNA的水平、指導CHB抗病毒藥物選擇、監測治療效果、停藥后復發風險評估和肝癌風險分層等方面的研究正在不斷深入。本文對上述標志物的最新研究進行綜述，以期為CHB患者的臨床精確管理提供一定參考。
1 乙肝表面抗原定量
HBsAg的來源主要包括HBV cccDNA的轉錄翻譯和整合進人基因組的HBV DNA的轉錄翻譯。血清中檢測到的HBsAg大部分為亞病毒顆粒（subviral particle，SVP），其含量超過成熟病毒粒子的100～100 000倍。目前市售的檢測方法可以檢測各種形式的HBsAg（SVP或成熟病毒粒子）。近年來，qHBsAg檢測已在臨床中被廣泛應用，目前主要的檢測方法為化學發光法，最低檢測限一般為0.05 IU/mL。
慢性乙型肝炎臨床治愈（又稱功能性治愈），即完成有限療程治療后，血清HBsAg和HBV DNA持續檢測不到，是目前CHB治療中現實可行的治療目標。研究表明HBsAg的清除可以進一步減少HCC的發生和復發[2]。然而HBsAg的年清除率僅為0.2%～2%。因此，通過監測HBV生物標志物，優化CHB抗病毒治療方案，從而對能否實現HBsAg清除做出早期預測和提高HBsAg清除率有助于延緩CHB患者的疾病進展。
qHBsAg可以早期預測抗病毒治療應答和HBsAg清除。通過對接受聚乙二醇干擾素α（pegylated interferon alpha，PEG-IFNα）聯合或不聯合NAs治療的CHB患者研究發現，較低的治療前qHBsAg水平以及治療早期qHBsAg的明顯下降與更高的持續病毒學應答（sustained virological response，SVR）和HBsAg清除率有關[3-4]。有研究納入279名接受抗病毒治療的CHB患者，發現治療時血清HBV RNA下降且HBsAg下降>1 log的42名患者中有20人獲得持續應答（n = 20/42，47.6%）；而HBsAg下降 < 0.5 log的75名患者中只有12人獲得持續應答（n = 12/75，16.0%，P = 0.001）；治療過程中血清HBsAg水平沒有伴隨HBV RNA下降與治療反應率低和HBsAg清除率低有關[5]。鑒于此，基線的qHBsAg水平和治療過程中qHBsAg的下降情況可用于評估抗病毒治療是否獲得持久應答，以及能否停藥。
此外，許多研究也探索了qHBsAg在預測停藥后持續病毒學應答及疾病進展中的作用。多數研究認為停用NAs治療時，血清低水平的qHBsAg（< 100 IU/mL）與持續的病毒學應答相關。有研究對110名停用NAs的HBeAg陰性的CHB患者進行96周隨訪，發現停藥時血清更低水平的qHBsAg（< 10 IU/mL）可以預測臨床治愈[6]。停用NAs時低水平的血清qHBsAg和HBcrAg實現臨床治愈的機會更高[7-8]。此外，有人通過研究NAs治療結束時HBsAg、HBcrAg與預后的關系，發現停藥時較低的HBsAg水平與較高的病毒學應答（OR = 0.812；P = 0.011）和HBsAg清除（OR = 0.380；P < 0.001）相關，同時谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）驟升發生率較低（OR = 1.833；P < 0.001）；較低的HBcrAg水平也有類似的結果[9]。因此，聯合qHBsAg和HBcrAg可以更好地預測停藥后的持續病毒學應答，而包括這兩個因素的風險評分可用于風險分層。另有研究提示，停用干擾素治療時較高的qHBsAg（OR = 1.586；95%CI：1.231～2.043）、HBV RNA（OR = 1.695；95%CI：1.371～2.094）和HBcrAg（OR = 1.518；95%CI：1.324～1.740）水平與較高的ALT驟升風險相關（P < 0.001）[10]。所以，聯合多個乙肝血清生物標志物評估可以較全面地指導治療和停藥隨訪的決策。另外，qHBsAg也可作為慢性肝炎進展為肝纖維化和肝癌的預測因子。在HBeAg陰性、ALT正常或輕度升高的CHB患者中，qHBsAg≥3 log10IU/mL的患者有更嚴重的肝臟炎癥或肝纖維化[11]。
綜上，較低的基線血清qHBsAg水平和治療過程中qHBsAg的下降情況可預測抗病毒療效和停藥時機；停藥時低水平的血清qHBsAg可評估停藥后復發風險和疾病進展，以及預測功能性治愈。
2 乙肝核心抗體定量
在慢性HBV感染的不同階段，抗-HBe一般在e抗原消失后產生，抗-HBs一般在感染清除后產生，而抗-HBc在各個時期均可被檢測到。同時在感染的不同階段，血清抗-HBc的水平存在差異。常用的抗-HBc檢測方法有酶聯免疫吸附法、化學發光法和電化學發光法，檢測原理主要是競爭法或間接法。近年來，已研發出雙抗原夾心法的商業化試劑盒，實現了抗-HBc的定量檢測，定量范圍可達102～105 IU/mL。
人體對HBV的體液免疫反應主要針對HBV核心抗原（hepatitis B core antigen，HBcAg），與感染階段密切相關。血清抗-HBc水平可反映肝臟炎癥程度。有研究納入了117名ALT正常、HBV DNA陽性、HBeAg陰性的CHB患者，其中50名患者（42.7%）的肝穿刺活檢結果有明顯的肝臟炎癥反應，發現血清抗-HBc水平與肝臟炎癥程度呈正相關（P < 0.001），是發生肝臟炎癥的獨立風險因子（OR = 1.562；95%CI：1.157～2.110；P = 0.004）[12]。無論HBeAg是陰性還是陽性，較高的抗-HBc水平與更嚴重的肝臟組織炎癥相關（P < 0.001）[13]。另有一項研究通過研究接受恩替卡韋治療的142例HBeAg陽性的CHB患者，發現肝臟中-重度炎癥（≥ G2）患者的抗-HBc水平明顯高于無或輕度肝炎患者，治療前抗-HBc定量、ALT水平與肝臟炎癥分級呈正相關，且抗-HBc的相關性優于血清ALT水平，而HBsAg與肝臟炎癥分級呈負相關，提示抗-HBc定量、ALT和HBsAg聯合使用更能預測明顯的肝臟炎癥（≥ G2）[14]。
有研究還討論了血清抗-HBc水平在預測抗病毒治療應答和停藥后復發風險方面的應用。侯金林教授團隊[15]開展的多中心隨機對照研究，在231名和560名接受PEG-IFNα或NAs治療的患者中，基線抗-HBc定量水平是HBeAg血清學轉換最佳的獨立預測因子（OR = 2.178；95%CI：1.577～3.009；P < 0.001）；基線抗-HBc定量水平越高，發生HBeAg血清學轉換的可能性越高。另有一項研究表明，對于接受干擾素治療的HBeAg陽性患者，基線抗-HBc水平越高（≥ 30 000 IU/mL），獲得免疫學和病毒學應答的概率也就越高[16]。其他針對接受各種抗病毒治療的HBeAg陽性的CHB患者的研究也得出一致的結論[13, 17-18]。而在原本NAs治療基礎上加用干擾素治療的CHB患者中，較高的抗-HBc與HBeAg血清學轉換、病毒持續應答也呈正相關，而與HBsAg清除呈負相關[13, 19]。與HBeAg陽性患者不同，抗-HBc定量在HBeAg陰性CHB患者中的預測意義還有待進一步探索。抗-HBc定量也可用于停藥后復發風險預測，CHB患者抗病毒治療停藥時，高水平抗-HBc定量與較低的臨床復發風險相關。一項前瞻性研究納入100例停藥的CHB患者，中位隨訪2.5年，發現NAs治療結束時抗-HBc水平越高（≥ 3 log10IU/mL），停藥后復發率越低，并且與停藥時qHBsAg水平（<2 log10IU/mL）聯合使用可提高預測能力[20]。
綜上，較高的血清抗-HBc水平可能提示患者較嚴重的肝臟炎癥，同時也能在一定程度上預測HBeAg血清學轉換和病毒持續應答。此外，停藥時較高水平的抗-HBc定量或聯合低水平的qHBsAg則可能提示停藥后復發風險較低。
3 HBV RNA
1996年，在HBV感染者血清中首次發現HBV RNA。此后，研究人員先后證實HBV RNA主要成分是未經轉錄或部分轉錄的、存在于核衣殼內的前基因組RNA（pregenomic RNA，pgRNA），主要來自于HBV cccDNA的直接轉錄，其形成與釋放不受NAs藥物直接抑制。目前定量檢測血清HBV RNA的主要方法包括間接定量法和直接定量法。間接定量法是通過實時熒光定量的檢測技術，其中商品化試劑檢測下限為300 copies/mL，定量范圍為103～108 copies/mL。直接定量法則是通過RNA捕獲探針法，其中實時恒溫擴增和檢測技術（simultaneous amplification and testing，SAT）已被成功用于血清HBV RNA的檢測，有助于進一步規避核酸提取產物中混雜的DNA對HBV RNA定量的干擾。SAT試劑檢測下限為50 copies/mL，定量范圍為102～108 copies/mL。
由于HBV RNA來自cccDNA直接轉錄的pgRNA，所以HBV RNA能夠較好地反映病毒cccDNA的存在水平和轉錄活性。唐紅教授團隊[21]的一項研究納入華西醫院2012年至2013年行肝穿刺活檢的110例CHB患者，發現在HBeAg陽性的CHB患者中，血清HBV RNA與肝內cccDNA水平具有正相關性。張文宏教授團隊[22]在隨訪接受NAs治療的CHB患者過程中也發現，部分患者在檢測不到HBV DNA時，血清中HBV RNA以及肝內cccDNA仍為陽性，提示血清HBV RNA水平與肝內cccDNA具有相關性。另有一項對接受48周干擾素治療的HBeAg陽性的CHB患者的隨機對照研究發現，治療前后的HBV RNA均與cccDNA有相關性（r = 0.728～0.781，P < 0.001）[23]。
血清HBV RNA水平可以監測和評估抗病毒療效。有研究指出在接受NAs治療的CHB患者中，HBV RNA和HBV DNA均呈下降趨勢；但部分患者出現HBV DNA很快低于檢測下限，而HBV RNA仍可檢出的現象[24]。在接受干擾素治療的HBeAg陽性和陰性的CHB患者中，早期血清HBV RNA水平的顯著下降與持續的治療應答和長期隨訪事件中的HBsAg清除有關[25-27]。HBV RNA還可預測HBeAg血清學轉換。有研究通過對50例接受NAs治療的HBeAg陽性CHB患者的觀察，發現在獲得HBeAg血清學轉換的患者中，HBV RNA水平下降顯著；而且治療第三個月和第六個月時HBV RNA水平較基線下降的程度可預測HBeAg血清學轉換的發生率，相較于HBV DNA、HBsAg、ALT等指標更為準確[28]。
血清HBV RNA水平還可評估停藥后的復發風險，從而指導停藥時機的選擇。一項研究納入114例服用恩替卡韋中位治療6.7年的非肝硬化CHB患者，符合HBsAg < 200 IU/mL且滿足國際停藥標準，停藥后隨訪48周發現，HBV DNA > 2 000 IU/mL的累計復發率為58.1%；根據停藥時HBV RNA水平，HBV RNA ≥ 44.6 U/mL的患者累計復發率為93.2%，HBV RNA < 44.6 U/mL的患者累計復發率為52.1%，而HBV RNA檢測不到的患者48周累計復發率為36.6%， HBV RNA檢測不到且qHBsAg < 10 IU/mL的患者48周累計復發率為9.1%[29]；因此，HBV RNA或聯合qHBsAg可作為評估恩替卡韋抗病毒治療停藥的關鍵指標。侯金林教授團隊[30]也基于HBV RNA在指導停藥方面展開了全國性的多中心臨床研究，發現治療結束時，無論在臨床復發、病毒學反彈或者HBeAg逆轉方面，HBV RNA和HBV DNA雙陰性的患者都較HBV RNA陽性或HBV DNA陽性的患者風險更低，提示聯合HBV RNA和HBV DNA檢測可指導接受NAs治療的非肝硬化CHB患者停藥時機的選擇。另有研究表明，停藥時血清HBV RNA檢測不到和HBsAg ≤ 100 IU/mL的患者比HBV RNA陽性和HBsAg > 100 IU/mL的患者發生病毒學復發的可能性更低；停藥時HBV RNA水平與HBV DNA有相關性，并與停藥后發生爆發性肝炎風險相關[31]。
血清HBV RNA除了監測與評估抗病毒治療效果外，還可用于疾病風險分層。有研究發現，相比于天冬氨酸轉氨酶和血小板比率指數（aspartate aminotransferase to platelet ratio index，APRI）評分和肝纖維化4因子指數（fibrosis 4 score，FIB-4），HBV RNA在預測HBeAg陽性或陰性患者的肝纖維化程度方面都更優越。血清HBV RNA水平是HBeAg陽性患者（OR = 0.514；P < 0.001）和HBeAg陰性患者（OR = 3.574；P < 0.001）肝纖維化的獨立預測因子[32]。在預測HCC發生風險上，HBV RNA和HBV DNA雙陽性患者比雙陰性患者的肝癌發生風險高4.02倍，單陽性患者比雙陰性患者的肝癌發生風險高1.57倍，其中HBV RNA陽性患者（4.1%）肝癌發生率也比陰性患者（1.8%）高[33]。還有研究認為，遠端非癌組織中HBV RNA含量越高，肝癌復發率越高，患者的生存率越低[34]。
綜上，血清HBV RNA可以較好地反映病毒cccDNA的轉錄活性；抗病毒治療早期血清HBV RNA水平的顯著下降可以預測HBeAg血清學轉換和HBsAg清除；停藥時較低甚至檢測不到的HBV RNA水平提示停藥后復發風險較低，聯合HBV RNA和HBV DNA可以更好地指導停藥時機的選擇。
4 乙肝核心相關抗原
HBcrAg是由前核心mRNA（3.5 kb）編碼形成的蛋白復合物，包括HBeAg、HBcAg和p22cr三種蛋白。這三種蛋白擁有相同的149個氨基酸序列，因此可以使用識別同源區域的單克隆抗體進行檢測。目前HBcrAg的主要檢測方法為化學發光酶免疫分析法，定量試劑的最低檢測下限一般為2.8 logU/mL。最近還研發出了一種全自動、新型高靈敏度的HBcrAg測定（iTACT-HBcrAg），靈敏度提高大約8倍。
與qHBsAg、HBV RNA等病毒學標志物相比，血清HBcrAg可以更好地反映肝組織內cccDNA水平，且不受HBeAg狀態的影響。唐紅教授團隊[35]的研究發現，在CHB自然史的不同時期，血清HBcrAg與肝內cccDNA均有良好的相關性；在抗病毒治療后，HBcrAg表達水平與cccDNA的下降幅度也具有相關性。進一步的一項多元回歸分析表明，在HBeAg陽性患者中，HBcrAg、HBsAg和HBV RNA均與肝內cccDNA水平相關；而在HBeAg陰性患者中，僅HBcrAg與肝內cccDNA水平具有相關性[21]。在抗病毒治療后HBV DNA檢測不到的患者中，血清HBcrAg與肝內cccDNA也具有較好的相關性。因此，血清HBcrAg是間接反映CHB患者肝組織內cccDNA的很好的指標。
血清HBcrAg水平可以進一步預測HBeAg血清學轉換。在接受NAs治療的HBeAg陽性患者中，較高的基線HBcrAg水平與發生HBeAg血清轉換獨立相關[36]。最新研究表明，基線時HBcrAg ≤ 6.5 log10 IU/mL，且抗病毒治療2年后HBcrAg水平 ≤ 5.3 log10IU/mL是HBeAg血清轉換的有利預測因素[37]。此外，唐紅教授團隊[38]的一項研究評估了接受干擾素治療12個月的HBeAg陽性的CHB患者，1月時HBcrAg水平及下降程度對治療6月后HBeAg發生血清學轉換的預測效果較好（ROC = 0.894；P = 0.043）。所以，通過監測干擾素或者NAs治療早期的HBcrAg下降水平，有助于預測患者能否獲得HBeAg血清學轉換。而且相較HBsAg而言，HBcrAg水平能更有效地預測接受NAs治療的患者能否獲得HBeAg血清學轉換。
血清HBcrAg或聯合其他血清標志物還可以進一步評估停藥后的復發風險。唐紅教授團隊[39]對接受NAs治療的CHB患者進行8年隨訪，發現在長期治療過程中，外周血HBcrAg水平呈逐漸降低趨勢。另有研究提示停藥時HBcrAg水平與HBsAg轉陰率呈負相關，其中HBcrAg水平 < 2 log10U/mL的患者HBsAg轉陰率最高[7]。此外，寧琴教授團隊[40]發現干擾素治療結束時患者的HBcrAg和抗-HBs定量水平與持久的功能性治愈密切相關，當HBcrAg < 4 log10 U/mL且抗-HBs > 2 log10 IU/L時，對患者獲得持久的功能性治愈的陽性預測值為100%（AUROC = 0.822；P = 0.001），因此HBcrAg和抗-HBs聯合預測接受干擾素治療患者的持續性應答效果最佳。停藥時較低水平的血清HBcrAg或低于檢測下限的血清HBV RNA以及兩者聯合可幫助評估停用NAs后有較低復發風險的患者[9, 29, 41-42]。同時也有研究認為在接受長期NAs治療的CHB患者中，早期治療4周時血清HBcrAg和HBV RNA的變化水平可以聯合預測HBsAg清除或HBsAg ≤ 100 IU/mL[43]。
血清HBcrAg水平也可以預測肝硬化與HCC發生風險。Liang等[44]通過對1 042名HBeAg陰性CHB患者的研究，發現血清HBcrAg水平越高，發生HCC的風險越大（HR = 2.20，> 2.9 vs. ≤ 2.9）。Kaneko等[45]進一步研究表示，在HBeAg陽性和陰性患者之間，不同的血清HBcrAg水平發展為肝癌的風險不同。多項研究均證明，基線和抗病毒治療期間的血清HBcrAg水平在預測肝癌的發展中起重要作用[46-47]。此外，臺灣的一項研究通過追蹤2 150名未接受過治療的CHB患者，發現外周血HBcrAg水平越高，發生HCC的風險越高；而且HBcrAg預測10年內發生HCC的能力優于HBV DNA和HBsAg（ROC = 0.75）[48]。
綜上，血清HBcrAg可以很好地反映病毒cccDNA的轉錄活性，治療早期血清HBcrAg水平的顯著下降以及治療前后低水平的HBcrAg是預測HBeAg血清學轉換的有利因素，同時停藥時較低的HBcrAg水平可評估停藥后較低復發風險的患者，并預測疾病進展風險。
5 結論
在CHB臨床管理中，評估病毒生物標志物的作用是不可或缺的。在目前以強效低耐藥的NAs為主要治療手段的時代，絕大部分患者經NAs治療后HBV DNA都檢測不到，這就需要新的HBV轉錄和翻譯標記物，以進一步評估和優化治療效果。不斷增加的證據表明，qHBsAg、抗-HBc定量、HBV RNA和HBcrAg等HBV生物標志物，在幫助制訂治療決策、預測臨床治療效果和指導安全停藥、肝臟疾病進展風險分層和預測等方面都發揮著重要的作用，值得在臨床應用。需要注意的是，如何更好地應用這些生物標志物以發揮其最大的臨床價值仍有待進一步探索。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：王馨主要負責論文撰寫與修改，唐小瓊和韓寧主要負責論文修訂，唐紅主要負責論文審閱修訂并提供基金支持。