類風濕關節炎（rheumatoid arthritis, RA）是最常見的免疫介導性疾病之一，腸道微生物群與患者免疫系統之間的相互作用可能在 RA 的發生發展中起到一定作用。甲氨蝶呤（methotrexate, MTX）作為治療 RA 的一線藥物，腸道微生物及其酶產物可以通過直接和間接機制影響藥物的生物利用度、臨床療效和毒性。因此了解腸道微生物群影響 RA 的機制、腸道微生物群對 MTX 療效的影響至關重要。該文就腸道微生物群可能致 RA 發病的機制，以及腸道微生物群在 MTX 藥物代謝和治療反應中的作用機制及影響作一綜述。
引用本文： 張瑞, 張莉, 毛婧, 李文花, 張憲萌, 沈海麗. 基于腸道微生物群探討類風濕關節炎發病機制及甲氨蝶呤療效. 華西醫學, 2024, 39(8): 1302-1307. doi: 10.7507/1002-0179.202405209 復制
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類風濕關節炎（rheumatoid arthritis, RA）是一種發病機制復雜的全身性自身免疫性疾病，其特征是免疫耐受喪失和慢性炎癥[1]。雖然 RA 的確切發病機制尚不清楚，但目前認為 RA 的臨床表現與遺傳易感個體接觸環境因素誘發免疫系統靶向激活有關[2]。國內外研究證據表明，RA 的發病機制存在“黏膜起源假說”的特征，黏膜起源假說是指因慢性黏膜炎癥（腸道、口腔和肺部）而導致自身結構的免疫耐受性喪失[3-4]。黏膜微生物組、牙周炎、吸煙等環境因素也會通過促進或加重局部黏膜炎癥而參與發病機制。甲氨蝶呤（methotrexate, MTX）作為指南推薦的治療 RA 的錨定藥物，腸道微生物群中的微生物酶對藥物的直接作用可以提高或削弱其療效，藥物誘導的腸黏膜炎至少部分與患者的腸道微生物有關[5-6]。了解 MTX 影響腸道微生物群的機制、腸道菌群失調對療效的影響至關重要。本文就腸道微生物群可能導致 RA 的發病機制，以及腸道微生物群對 MTX 藥物代謝和療效的作用機制及影響進行綜述，以期為探索 RA 新的治療靶點開拓新的視角。
1 腸道微生物群在 RA 發病機制中的作用
Arumugam 等[7]首先提出人類腸道菌群由 3 種主要腸道型細菌組成，即擬桿菌屬、普雷沃菌屬和瘤胃球菌屬，這主要是由關鍵細菌屬的相對豐度決定的。RA 患者的微生物群以普雷沃菌屬為主，其次為革蘭陽性菌，而雙歧桿菌、革蘭陰性桿菌和厚壁菌較少[8]。RA 患者在出現臨床癥狀之前就存在普雷沃菌屬的富集，提示腸道普雷沃菌屬可能與 RA 的發病機制有關[9]。有學者強調了腸道微生物群在 RA 發病機制中的關鍵作用，其機制主要包括調節炎癥因子和免疫反應、損傷腸黏膜屏障和自身抗原的分子模擬[10]。
1.1 調節炎癥因子和免疫反應
胃腸道承載著體內大部分免疫細胞，與腸道微生物群的不斷相互作用塑造了它們的功能和表型。腸道微生物群介導與宿主免疫系統的持續雙向通信，在誘發感染和在人體共生之間維持平衡[11]。腸道相關淋巴組織中的先天免疫細胞是抵御胃腸道外源性物質的第一道防線。腸道菌群紊亂可觸發先天免疫細胞的異常激活，導致促炎細胞因子［包括白細胞介素（interleukin, IL）-12、IL-23 和Ⅰ型干擾素等］的上調，以及抗炎細胞因子（包括轉化生長因子β和 IL-10 等）的減少[12]。
適應性淋巴細胞是自身免疫的關鍵參與者，T 細胞和 B 細胞的異常激活會引起 RA。具備促炎能力的腸道病原體可以通過先天免疫過度激活來重塑免疫環境，然后是適應性免疫系統的異常激活[13]。腸道微生物群主要通過微生物群衍生的代謝物，在調節 T 細胞功能方面發揮作用，并可能通過異常抗原呈遞和調節適應性免疫來破壞腸道免疫穩態，特別是涉及初始 T 細胞與輔助性 T（helper T, Th）17 細胞的極化和自身反應性 B 細胞的產生[14-15]。腸黏膜含有許多 Th17 和調節性 T（regulatory T, Treg）細胞[16]，Th17 細胞通常以微生物群依賴性方式存在于腸道中，維持組織穩態并對抗細胞外細菌和真菌，而腸道 Treg 細胞保持對飲食抗原、腸道微生物群和自身抗原的耐受性，并抑制自身反應效應 T 細胞的激活和增殖[17]。來自人類腸道的細菌菌株可以調節 Th17 和 Treg 細胞的分化和活化[18]。在生理條件下，Th17 和 Treg 細胞的功能處于平衡狀態[19]。腸道菌群失調通過改變 Th17/Treg 細胞比例和濾泡輔助性 T（follicular helper T, Tfh）/濾泡調節性 T（follicular regulatory T, Tfr）細胞失衡導致炎癥[20]。微生物抗原還可以在 Tfh 細胞的幫助下誘導 B 淋巴細胞過度激活，分化為漿細胞并產生致病性自身抗體，可能會影響 RA 的發病機制[21]。因此，腸道菌群失調、炎癥因子和免疫反應是相互關聯的，共同影響 RA 的病情發展。
1.2 改變腸道屏障功能
腸道黏膜屏障由單層腸上皮細胞形成和維持，用于隔離腸腔中的有害物質，避免病原體入侵腸道、進入體循環和腸外組織并引發免疫反應[22]。黏液在這種屏障中起著至關重要的作用，它使得許多擴散分子可以進入宿主組織，同時限制微生物的進入和定植[23]。連蛋白（zonulin）是腸細胞在飲食和微生物刺激下分泌的一種腸毒素，它會刺激腸道黏膜將閉鎖小帶蛋白 1 和閉塞蛋白從緊密連接復合物中分離出來，從而導致腸道屏障損傷、通透性增加、血液中細菌產物易位和炎癥反應的啟動[22, 24]。同時 zonulin 誘導 T 細胞介導的黏膜炎癥，并可能控制免疫細胞從腸道遷移到關節[25]。
腸道屏障由腸道微生物群和宿主免疫系統之間的微調通信控制[26]。腸上皮細胞通過跨細胞途徑和樹突狀細胞進行管腔抗原取樣，調節腸腔和黏膜下層之間的分子運輸，導致對非自身的耐受性或免疫反應。黏膜屏障功能的喪失會影響細菌和抗原的運輸，并使微生物及其產物進入固有層和上皮下空間。Toll 樣受體和病原體相關分子模式對微生物的相互作用可能會激活免疫系統，導致促炎細胞因子的產生（IL-6、腫瘤壞死因子α或 IL-1β）以消除病原體[27]。
RA 患者的腸道完整性受損會導致微生物通過腸道屏障轉移到腸道組織甚至體循環中。腸道微生物群可促進局部組織中先天免疫和適應性免疫反應的過度激活，從而導致全身免疫失調[21]。腸道微生物群紊亂也會觸發自身反應性細胞通過循環遷移至關節，導致局部關節炎癥[28]。自身反應性細胞會激活巨噬細胞，導致炎性細胞因子的產生。此外，腫瘤壞死因子α、IL-6 和 IL-1 等細胞因子可誘導成纖維細胞產生基質金屬蛋白酶和核因子κB 配體的受體激活劑，介導骨和軟骨組織的破壞，從而導致 RA 的發生發展[29]。有研究在 RA 患者中發現過量的共生腸道細菌會降低人腸上皮細胞中緊密連接蛋白的表達，并通過破壞腸黏膜的完整性來增加疾病發生率[30]。相比之下，糞桿菌的豐度在 RA 患者中降低，證明其可維持腸道屏障功能，維持 Th17/Treg 平衡，并發揮顯著的抗炎作用[31]。這些發現表明，腸道微生物群多樣性的變化可能會損害腸黏膜通透性，從而促進 RA 的發生[32]。
1.3 自身抗原的分子模擬
分子模擬或交叉反應假說提出，外源性物質（即與自身抗原具有抗原相似性的微生物制劑）可能觸發針對自身抗原的免疫反應。腸道細菌可以通過分子模擬激活免疫系統并觸發針對自身抗原的 T 細胞反應[33]。普雷沃菌通過激活對關節炎相關自身抗原核糖體蛋白 L23a 具有特異性的自身反應性 T 細胞，促進小鼠關節炎的發展[34]。同樣，源自脆弱擬桿菌、白色念珠菌和血鏈球菌的肽與Ⅱ型膠原相似，并在膠原誘導性關節炎模型中誘導交叉反應[35]。
Pianta 等[36]使用蛋白質組學檢測滑膜或外周血單核細胞中人類白細胞 DR 抗原呈遞的肽，分別在 52%和 56%的 RA 患者中檢測出作為 T 細胞和 B 細胞反應靶標的 N-乙酰氨基葡萄糖-6-硫酸酯酶（N-acetylglucosamine-6-sulfatase, GNS）和細絲蛋白 A。GNS 和細絲蛋白 A 存在于滑液和發炎的滑膜組織中。人類白細胞 DR 抗原呈遞的 GNS 肽與普雷沃菌屬中的芳基硫酸酯酶蛋白和副擬桿菌屬中 GNS 表位具有明顯的同源性。微生物抗原可以通過樹突狀細胞和巨噬細胞呈遞給 CD4+ T 細胞，導致炎癥 T 細胞亞型的分化。因此，分子模擬可以部分解釋腸道黏膜屏障免疫耐受破壞與 RA 患者自身免疫發展之間的聯系。
2 腸道微生物群調節 MTX 的藥代動力學
RA 管理指南提出了早期治療、聯合治療的治療原則，其中推薦 MTX 單藥或與其他傳統改善病情抗風濕藥（disease-modifying antirheumatic drug, DMARD）作為 RA 治療的一線方案，劑量最大可用到每周 25～30 mg，我國常用劑量為≤每周 10 mg[37]。由于腸道吸收 MTX 的能力有限，因此口服 MTX 在體內的生物利用度亦有限，這可能與腸道微生物群相關[38]。口服 MTX 后，首先被近端空腸主動吸收，吸收藥物的程度和劑量與還原葉酸載體 1 相關，MTX 在口服給藥后 0.75～2 h 內血漿濃度將達到最大值，但藥物的半衰期相對較短（約為 1 h），18 h 后其在血清中的濃度幾乎為零且檢測不到[39]。MTX 從腸道進入循環，其中 35%～50%的藥物與白蛋白結合，大多數 MTX 通過還原葉酸載體 1 轉移到細胞中，主要是紅細胞、白細胞、滑膜細胞和肝細胞[40]。
MTX 有 3 種不同的代謝途徑[6, 40]：① 腸道代謝：腸道微生物產生的細菌酶即羧肽酶 G2，通過將 MTX 裂解成 2 種非細胞毒性代謝產物即2, 4-二氨基-N10-甲基蝶酸和谷氨酸來降低 MTX 濃度。假單胞菌屬可在體外通過羧肽酶 G2 作用于 MTX，催化谷氨酸的產生，這說明腸道細菌可以調節藥物活性代謝物的可用性并控制其作用機制。② 肝臟代謝途徑：肝臟負責將 MTX 生物轉化為7-羥基 MTX，7-羥基 MTX 可抑制二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase, DHFR）。DHFR 也存在于腸道微生物群中，表明它可能影響藥物的代謝，反之亦然，導致藥物和微生物代謝之間的相互作用。③ 細胞代謝：MTX 在細胞內轉化為聚谷氨酸。由于其涉及免疫調節的主要機制，因此該途徑優先于其他途徑。因此，MTX 的主要活性形式依賴于腸道穩態和腸道屏障完整性。
腸道菌群還可以通過保持腸道屏障的完整性來間接調節藥理代謝。微生物生態失調會影響微生物的多樣性，從而影響腸道中微生物的易位、免疫調節、代謝和酶降解[41]。高劑量 MTX 發揮一定的抗菌作用，導致宿主中擬桿菌門減少和厚壁菌門豐度增加[42]。對小鼠模型使用 MTX 后，脆弱擬桿菌的豐度降低，但乳酸桿菌的豐度未降低[43]。
3 腸道微生物群影響 MTX 療效的機制
3.1 藥物-腸道微生物群反饋回路
藥物治療效應與腸道微生物群之間存在反饋回路，DMARD 治療可能會影響和重塑腸道微生物群的結構和功能，直接影響腸道菌群的生長，以調節全身免疫。此外，腸道微生物群的改變也可能通過各種機制改善 DMARD 的療效[41]。有研究表明，厚壁菌門和擬桿菌門會由于 RA 的治療而增加，這是治療后出現的理想結果[42]。同時，也有研究表明，在對標準藥物治療無反應的 RA 患者隊列中觀察到腸道微生物群中產氣梭菌豐度增加，而對藥物治療反應良好的 RA 患者中產氣莢膜梭菌減少[44]。這些研究結果表明，微生物群可能會影響患者對 RA 治療的反應。對 RA 治療無反應可能與 MTX 消耗有關，目前可能歸因于梭狀芽胞桿菌豐度增加和擬桿菌豐度降低[45]。
3.2 細菌酶作用
DMARD 治療反應的差異性與催化其代謝的細菌酶有關。過度暴露于具有 DHFR 活性的蛋白質可恢復耐藥大腸桿菌菌株中對細胞內 MTX 的敏感性。MTX 可能與細菌 DHFR 具有相容性，如大腸桿菌和干酪乳桿菌[46]。此外，MTX 可以通過腸道菌群轉化為 MTX-聚谷氨酸[47]。一些患者出現對初始口服藥物的無反應表現可能是因為由腸道宏基因組（如擬桿菌）決定的四氫葉酸還原酶的產生途徑與宿主中的 DHFR 和 MTX 代謝競爭，從而干擾 MTX 的抗炎作用[48]。
3.3 其他可能的機制
除了療效與腸道菌群失調之間的密切關聯外，還有研究探討了其他可能的機制，包括免疫調節和代謝調節[42, 49-50]。Nayak 等[42]的研究指出，MTX 顯著改變了人類腸道微生物組；盡管菌株之間的藥物敏感性不同，但針對 DHFR 的作用機制在人和細菌細胞中似乎是保守的；將處理后樣本移植到暴露于炎癥觸發因素的無菌小鼠后，免疫激活受到抑制，從而可以檢測到與腸道和脾免疫細胞相關的 MTX 調節細菌分類群。Artacho 等[49]揭示了腸道細菌分類群的豐度和其基因（尤其是參與 MTX 和嘌呤代謝的直系同源物）與臨床反應之間存在顯著相關性，此外，他們還創建了一個基于微生物組的模型，可以預測不同患者的 MTX 反應程度。RA 患者的臨床反應與治療前的遠端腸道樣本離體孵育后剩余的 MTX 水平密切相關，這意味著腸道微生物群對 MTX 代謝和療效存在直接影響。Han 等[50]基于機器學習發現參與 MTX 代謝的基因組成在應答組和非應答組之間存在顯著差異，這些基因主要與厚壁菌門和擬桿菌門有關，此外，他們還證明了藥物在腸道微生物群中的分解代謝能力與 RA 患者對 MTX 的反應機制密切相關，并提出代謝能力是決定宿主對 MTX 反應的關鍵組成部分。
4 腸道微生物群對 MTX 療效的影響
4.1 腸道微生物群或其代謝物對 MTX 胃腸道毒性的影響
長期口服 MTX 可能引起許多不良反應，包括胃腸道毒性、心臟毒性、骨髓毒性、腎毒性和肺毒性，這極大地限制了 MTX 的臨床應用。其中，胃腸道毒性是最常見的副作用，其主要癥狀包括惡心、嘔吐、腹痛、腹脹和腹瀉，從而導致吸收不良、體重減輕，并最終可能導致停止治療[51-52]。腸道環境的穩態對整個胃腸道的完整性和功能是至關重要的。腸道微生物群在黏膜炎的發生和進展中起著重要作用，黏膜炎是腸道損傷的主要表現之一[53]。腸道微生物群的組成、結構和代謝物的變化可能會影響 MTX 的代謝，從而影響腸道黏膜的狀態。然而，這些復雜的動態過程仍需要進一步研究。
據報道，一些細菌和其代謝產物，如氨基酸、多酚或維生素，可能會影響 MTX 誘導的腸黏膜損傷[52]。其中一種可能的解釋是，長期暴露于 MTX 可能會誘導腸道中微生物群落和功能的變化，并誘導下游羧肽酶 G2 活性的破壞，這可能會延遲其對 MTX 的解毒，從而導致胃腸道毒性增加[54]。然而，單一菌株或代謝物對胃腸道毒性的影響范圍有限。因此，通過與候選細菌和代謝物建立聯合療法來降低 MTX 的胃腸道毒性是可行的。據報道，飲食的改變會導致腸道微生物群的微環境發生變化，高脂高蔗糖飲食中的蛋白質或脂質會改變腸道環境，最終加重 MTX 誘導的腸道炎癥[55]。
4.2 MTX 對 RA 患者腸道微生物群的影響
一項 16S 測序相關研究顯示，常規口服劑量的 MTX 不會導致腸道微生物生態的持續紊亂[49]。但之后的研究顯示，MTX 可以影響腸道微生物的群落結構，并改變腸道菌群的多樣性和功能[56]。MTX 抑制了 40 種代表性腸道細菌菌株中 30%的生長和 43 種細菌分離株中 84%的生長，覆蓋了 43%的人類腸道微生物群的相對豐度[57]。動物實驗顯示，MTX 能以劑量依賴性方式影響人源化小鼠的腸道微生物群組成[54]。低劑量的 MTX 增加了微生物群的物種豐富度和多樣性，包括厚壁菌門的相對豐度增加和擬桿菌門的相對豐度降低，這逆轉了通常與 RA 相關的微生物群的相對平衡。然而，高劑量的 MTX 卻顯著降低了腸道細菌多樣性[56]。
RA 患者在治療前的腸道宏基因組決定了他們是否對 MTX 有反應；而不同劑量的 MTX 改變了腸道細菌的物種豐富度和多樣性。換而言之，MTX 與腸道微生物群之間可能存在劑量依賴性的雙向相互作用。
5 小結與展望
本文重點介紹了腸道微生物群改變致 RA 發病的多種機制以及藥物-微生物群相互作用在 MTX 用于 RA 時藥物代謝和治療反應中的可能作用機制和影響。越來越多的證據揭示了腸道微生物群及其代謝物和參與 RA 發病機制的細胞（免疫和非免疫）之間聯系的機制。人類腸道微生物群及其酶產物也可以直接和/或間接影響藥物的生物利用度、臨床療效和毒性。而某些藥物和活性成分可以通過改變腸道微生物群組成來影響免疫系統，從而增強宿主的防御能力。此外，腸道微生物還與 MTX 耐藥性或反應不良有關。盡管特定微生物群落的顯著異常與 RA 疾病進展有關，但為了促進腸道微生物群靶向治療的進展，仍需解決以下幾個關鍵問題：首先，將來的研究仍需進一步闡明 RA 與微生物組成改變的相關性以及影響 RA 發展的機制通路；其次，還需進一步探索腸道微生物組是否可以直接代謝體內的 MTX，啟動免疫系統以增強反應，或兩者兼而有之；第三，有必要了解 MTX 對腸道菌群的相互作用，包括藥物對細菌代謝和繁殖的影響，以及細菌對藥物生物轉化的影響和機制，為優化或恢復 RA 患者微生物共生的治療策略鋪路。
綜上所述，腸道微生物群在 MTX 治療 RA 中作用的研究仍是熱點領域，具有重要的臨床意義。MTX 作為一種用于治療腫瘤和免疫性疾病的“老藥”，仍需要進一步探索，以改善療效，降低毒性風險，同時還需要評估調節腸道微生物群以優化 MTX 治療策略的可能性，來改善 RA 的治療結局。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
類風濕關節炎（rheumatoid arthritis, RA）是一種發病機制復雜的全身性自身免疫性疾病，其特征是免疫耐受喪失和慢性炎癥[1]。雖然 RA 的確切發病機制尚不清楚，但目前認為 RA 的臨床表現與遺傳易感個體接觸環境因素誘發免疫系統靶向激活有關[2]。國內外研究證據表明，RA 的發病機制存在“黏膜起源假說”的特征，黏膜起源假說是指因慢性黏膜炎癥（腸道、口腔和肺部）而導致自身結構的免疫耐受性喪失[3-4]。黏膜微生物組、牙周炎、吸煙等環境因素也會通過促進或加重局部黏膜炎癥而參與發病機制。甲氨蝶呤（methotrexate, MTX）作為指南推薦的治療 RA 的錨定藥物，腸道微生物群中的微生物酶對藥物的直接作用可以提高或削弱其療效，藥物誘導的腸黏膜炎至少部分與患者的腸道微生物有關[5-6]。了解 MTX 影響腸道微生物群的機制、腸道菌群失調對療效的影響至關重要。本文就腸道微生物群可能導致 RA 的發病機制，以及腸道微生物群對 MTX 藥物代謝和療效的作用機制及影響進行綜述，以期為探索 RA 新的治療靶點開拓新的視角。
1 腸道微生物群在 RA 發病機制中的作用
Arumugam 等[7]首先提出人類腸道菌群由 3 種主要腸道型細菌組成，即擬桿菌屬、普雷沃菌屬和瘤胃球菌屬，這主要是由關鍵細菌屬的相對豐度決定的。RA 患者的微生物群以普雷沃菌屬為主，其次為革蘭陽性菌，而雙歧桿菌、革蘭陰性桿菌和厚壁菌較少[8]。RA 患者在出現臨床癥狀之前就存在普雷沃菌屬的富集，提示腸道普雷沃菌屬可能與 RA 的發病機制有關[9]。有學者強調了腸道微生物群在 RA 發病機制中的關鍵作用，其機制主要包括調節炎癥因子和免疫反應、損傷腸黏膜屏障和自身抗原的分子模擬[10]。
1.1 調節炎癥因子和免疫反應
胃腸道承載著體內大部分免疫細胞，與腸道微生物群的不斷相互作用塑造了它們的功能和表型。腸道微生物群介導與宿主免疫系統的持續雙向通信，在誘發感染和在人體共生之間維持平衡[11]。腸道相關淋巴組織中的先天免疫細胞是抵御胃腸道外源性物質的第一道防線。腸道菌群紊亂可觸發先天免疫細胞的異常激活，導致促炎細胞因子［包括白細胞介素（interleukin, IL）-12、IL-23 和Ⅰ型干擾素等］的上調，以及抗炎細胞因子（包括轉化生長因子β和 IL-10 等）的減少[12]。
適應性淋巴細胞是自身免疫的關鍵參與者，T 細胞和 B 細胞的異常激活會引起 RA。具備促炎能力的腸道病原體可以通過先天免疫過度激活來重塑免疫環境，然后是適應性免疫系統的異常激活[13]。腸道微生物群主要通過微生物群衍生的代謝物，在調節 T 細胞功能方面發揮作用，并可能通過異常抗原呈遞和調節適應性免疫來破壞腸道免疫穩態，特別是涉及初始 T 細胞與輔助性 T（helper T, Th）17 細胞的極化和自身反應性 B 細胞的產生[14-15]。腸黏膜含有許多 Th17 和調節性 T（regulatory T, Treg）細胞[16]，Th17 細胞通常以微生物群依賴性方式存在于腸道中，維持組織穩態并對抗細胞外細菌和真菌，而腸道 Treg 細胞保持對飲食抗原、腸道微生物群和自身抗原的耐受性，并抑制自身反應效應 T 細胞的激活和增殖[17]。來自人類腸道的細菌菌株可以調節 Th17 和 Treg 細胞的分化和活化[18]。在生理條件下，Th17 和 Treg 細胞的功能處于平衡狀態[19]。腸道菌群失調通過改變 Th17/Treg 細胞比例和濾泡輔助性 T（follicular helper T, Tfh）/濾泡調節性 T（follicular regulatory T, Tfr）細胞失衡導致炎癥[20]。微生物抗原還可以在 Tfh 細胞的幫助下誘導 B 淋巴細胞過度激活，分化為漿細胞并產生致病性自身抗體，可能會影響 RA 的發病機制[21]。因此，腸道菌群失調、炎癥因子和免疫反應是相互關聯的，共同影響 RA 的病情發展。
1.2 改變腸道屏障功能
腸道黏膜屏障由單層腸上皮細胞形成和維持，用于隔離腸腔中的有害物質，避免病原體入侵腸道、進入體循環和腸外組織并引發免疫反應[22]。黏液在這種屏障中起著至關重要的作用，它使得許多擴散分子可以進入宿主組織，同時限制微生物的進入和定植[23]。連蛋白（zonulin）是腸細胞在飲食和微生物刺激下分泌的一種腸毒素，它會刺激腸道黏膜將閉鎖小帶蛋白 1 和閉塞蛋白從緊密連接復合物中分離出來，從而導致腸道屏障損傷、通透性增加、血液中細菌產物易位和炎癥反應的啟動[22, 24]。同時 zonulin 誘導 T 細胞介導的黏膜炎癥，并可能控制免疫細胞從腸道遷移到關節[25]。
腸道屏障由腸道微生物群和宿主免疫系統之間的微調通信控制[26]。腸上皮細胞通過跨細胞途徑和樹突狀細胞進行管腔抗原取樣，調節腸腔和黏膜下層之間的分子運輸，導致對非自身的耐受性或免疫反應。黏膜屏障功能的喪失會影響細菌和抗原的運輸，并使微生物及其產物進入固有層和上皮下空間。Toll 樣受體和病原體相關分子模式對微生物的相互作用可能會激活免疫系統，導致促炎細胞因子的產生（IL-6、腫瘤壞死因子α或 IL-1β）以消除病原體[27]。
RA 患者的腸道完整性受損會導致微生物通過腸道屏障轉移到腸道組織甚至體循環中。腸道微生物群可促進局部組織中先天免疫和適應性免疫反應的過度激活，從而導致全身免疫失調[21]。腸道微生物群紊亂也會觸發自身反應性細胞通過循環遷移至關節，導致局部關節炎癥[28]。自身反應性細胞會激活巨噬細胞，導致炎性細胞因子的產生。此外，腫瘤壞死因子α、IL-6 和 IL-1 等細胞因子可誘導成纖維細胞產生基質金屬蛋白酶和核因子κB 配體的受體激活劑，介導骨和軟骨組織的破壞，從而導致 RA 的發生發展[29]。有研究在 RA 患者中發現過量的共生腸道細菌會降低人腸上皮細胞中緊密連接蛋白的表達，并通過破壞腸黏膜的完整性來增加疾病發生率[30]。相比之下，糞桿菌的豐度在 RA 患者中降低，證明其可維持腸道屏障功能，維持 Th17/Treg 平衡，并發揮顯著的抗炎作用[31]。這些發現表明，腸道微生物群多樣性的變化可能會損害腸黏膜通透性，從而促進 RA 的發生[32]。
1.3 自身抗原的分子模擬
分子模擬或交叉反應假說提出，外源性物質（即與自身抗原具有抗原相似性的微生物制劑）可能觸發針對自身抗原的免疫反應。腸道細菌可以通過分子模擬激活免疫系統并觸發針對自身抗原的 T 細胞反應[33]。普雷沃菌通過激活對關節炎相關自身抗原核糖體蛋白 L23a 具有特異性的自身反應性 T 細胞，促進小鼠關節炎的發展[34]。同樣，源自脆弱擬桿菌、白色念珠菌和血鏈球菌的肽與Ⅱ型膠原相似，并在膠原誘導性關節炎模型中誘導交叉反應[35]。
Pianta 等[36]使用蛋白質組學檢測滑膜或外周血單核細胞中人類白細胞 DR 抗原呈遞的肽，分別在 52%和 56%的 RA 患者中檢測出作為 T 細胞和 B 細胞反應靶標的 N-乙酰氨基葡萄糖-6-硫酸酯酶（N-acetylglucosamine-6-sulfatase, GNS）和細絲蛋白 A。GNS 和細絲蛋白 A 存在于滑液和發炎的滑膜組織中。人類白細胞 DR 抗原呈遞的 GNS 肽與普雷沃菌屬中的芳基硫酸酯酶蛋白和副擬桿菌屬中 GNS 表位具有明顯的同源性。微生物抗原可以通過樹突狀細胞和巨噬細胞呈遞給 CD4+ T 細胞，導致炎癥 T 細胞亞型的分化。因此，分子模擬可以部分解釋腸道黏膜屏障免疫耐受破壞與 RA 患者自身免疫發展之間的聯系。
2 腸道微生物群調節 MTX 的藥代動力學
RA 管理指南提出了早期治療、聯合治療的治療原則，其中推薦 MTX 單藥或與其他傳統改善病情抗風濕藥（disease-modifying antirheumatic drug, DMARD）作為 RA 治療的一線方案，劑量最大可用到每周 25～30 mg，我國常用劑量為≤每周 10 mg[37]。由于腸道吸收 MTX 的能力有限，因此口服 MTX 在體內的生物利用度亦有限，這可能與腸道微生物群相關[38]。口服 MTX 后，首先被近端空腸主動吸收，吸收藥物的程度和劑量與還原葉酸載體 1 相關，MTX 在口服給藥后 0.75～2 h 內血漿濃度將達到最大值，但藥物的半衰期相對較短（約為 1 h），18 h 后其在血清中的濃度幾乎為零且檢測不到[39]。MTX 從腸道進入循環，其中 35%～50%的藥物與白蛋白結合，大多數 MTX 通過還原葉酸載體 1 轉移到細胞中，主要是紅細胞、白細胞、滑膜細胞和肝細胞[40]。
MTX 有 3 種不同的代謝途徑[6, 40]：① 腸道代謝：腸道微生物產生的細菌酶即羧肽酶 G2，通過將 MTX 裂解成 2 種非細胞毒性代謝產物即2, 4-二氨基-N10-甲基蝶酸和谷氨酸來降低 MTX 濃度。假單胞菌屬可在體外通過羧肽酶 G2 作用于 MTX，催化谷氨酸的產生，這說明腸道細菌可以調節藥物活性代謝物的可用性并控制其作用機制。② 肝臟代謝途徑：肝臟負責將 MTX 生物轉化為7-羥基 MTX，7-羥基 MTX 可抑制二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase, DHFR）。DHFR 也存在于腸道微生物群中，表明它可能影響藥物的代謝，反之亦然，導致藥物和微生物代謝之間的相互作用。③ 細胞代謝：MTX 在細胞內轉化為聚谷氨酸。由于其涉及免疫調節的主要機制，因此該途徑優先于其他途徑。因此，MTX 的主要活性形式依賴于腸道穩態和腸道屏障完整性。
腸道菌群還可以通過保持腸道屏障的完整性來間接調節藥理代謝。微生物生態失調會影響微生物的多樣性，從而影響腸道中微生物的易位、免疫調節、代謝和酶降解[41]。高劑量 MTX 發揮一定的抗菌作用，導致宿主中擬桿菌門減少和厚壁菌門豐度增加[42]。對小鼠模型使用 MTX 后，脆弱擬桿菌的豐度降低，但乳酸桿菌的豐度未降低[43]。
3 腸道微生物群影響 MTX 療效的機制
3.1 藥物-腸道微生物群反饋回路
藥物治療效應與腸道微生物群之間存在反饋回路，DMARD 治療可能會影響和重塑腸道微生物群的結構和功能，直接影響腸道菌群的生長，以調節全身免疫。此外，腸道微生物群的改變也可能通過各種機制改善 DMARD 的療效[41]。有研究表明，厚壁菌門和擬桿菌門會由于 RA 的治療而增加，這是治療后出現的理想結果[42]。同時，也有研究表明，在對標準藥物治療無反應的 RA 患者隊列中觀察到腸道微生物群中產氣梭菌豐度增加，而對藥物治療反應良好的 RA 患者中產氣莢膜梭菌減少[44]。這些研究結果表明，微生物群可能會影響患者對 RA 治療的反應。對 RA 治療無反應可能與 MTX 消耗有關，目前可能歸因于梭狀芽胞桿菌豐度增加和擬桿菌豐度降低[45]。
3.2 細菌酶作用
DMARD 治療反應的差異性與催化其代謝的細菌酶有關。過度暴露于具有 DHFR 活性的蛋白質可恢復耐藥大腸桿菌菌株中對細胞內 MTX 的敏感性。MTX 可能與細菌 DHFR 具有相容性，如大腸桿菌和干酪乳桿菌[46]。此外，MTX 可以通過腸道菌群轉化為 MTX-聚谷氨酸[47]。一些患者出現對初始口服藥物的無反應表現可能是因為由腸道宏基因組（如擬桿菌）決定的四氫葉酸還原酶的產生途徑與宿主中的 DHFR 和 MTX 代謝競爭，從而干擾 MTX 的抗炎作用[48]。
3.3 其他可能的機制
除了療效與腸道菌群失調之間的密切關聯外，還有研究探討了其他可能的機制，包括免疫調節和代謝調節[42, 49-50]。Nayak 等[42]的研究指出，MTX 顯著改變了人類腸道微生物組；盡管菌株之間的藥物敏感性不同，但針對 DHFR 的作用機制在人和細菌細胞中似乎是保守的；將處理后樣本移植到暴露于炎癥觸發因素的無菌小鼠后，免疫激活受到抑制，從而可以檢測到與腸道和脾免疫細胞相關的 MTX 調節細菌分類群。Artacho 等[49]揭示了腸道細菌分類群的豐度和其基因（尤其是參與 MTX 和嘌呤代謝的直系同源物）與臨床反應之間存在顯著相關性，此外，他們還創建了一個基于微生物組的模型，可以預測不同患者的 MTX 反應程度。RA 患者的臨床反應與治療前的遠端腸道樣本離體孵育后剩余的 MTX 水平密切相關，這意味著腸道微生物群對 MTX 代謝和療效存在直接影響。Han 等[50]基于機器學習發現參與 MTX 代謝的基因組成在應答組和非應答組之間存在顯著差異，這些基因主要與厚壁菌門和擬桿菌門有關，此外，他們還證明了藥物在腸道微生物群中的分解代謝能力與 RA 患者對 MTX 的反應機制密切相關，并提出代謝能力是決定宿主對 MTX 反應的關鍵組成部分。
4 腸道微生物群對 MTX 療效的影響
4.1 腸道微生物群或其代謝物對 MTX 胃腸道毒性的影響
長期口服 MTX 可能引起許多不良反應，包括胃腸道毒性、心臟毒性、骨髓毒性、腎毒性和肺毒性，這極大地限制了 MTX 的臨床應用。其中，胃腸道毒性是最常見的副作用，其主要癥狀包括惡心、嘔吐、腹痛、腹脹和腹瀉，從而導致吸收不良、體重減輕，并最終可能導致停止治療[51-52]。腸道環境的穩態對整個胃腸道的完整性和功能是至關重要的。腸道微生物群在黏膜炎的發生和進展中起著重要作用，黏膜炎是腸道損傷的主要表現之一[53]。腸道微生物群的組成、結構和代謝物的變化可能會影響 MTX 的代謝，從而影響腸道黏膜的狀態。然而，這些復雜的動態過程仍需要進一步研究。
據報道，一些細菌和其代謝產物，如氨基酸、多酚或維生素，可能會影響 MTX 誘導的腸黏膜損傷[52]。其中一種可能的解釋是，長期暴露于 MTX 可能會誘導腸道中微生物群落和功能的變化，并誘導下游羧肽酶 G2 活性的破壞，這可能會延遲其對 MTX 的解毒，從而導致胃腸道毒性增加[54]。然而，單一菌株或代謝物對胃腸道毒性的影響范圍有限。因此，通過與候選細菌和代謝物建立聯合療法來降低 MTX 的胃腸道毒性是可行的。據報道，飲食的改變會導致腸道微生物群的微環境發生變化，高脂高蔗糖飲食中的蛋白質或脂質會改變腸道環境，最終加重 MTX 誘導的腸道炎癥[55]。
4.2 MTX 對 RA 患者腸道微生物群的影響
一項 16S 測序相關研究顯示，常規口服劑量的 MTX 不會導致腸道微生物生態的持續紊亂[49]。但之后的研究顯示，MTX 可以影響腸道微生物的群落結構，并改變腸道菌群的多樣性和功能[56]。MTX 抑制了 40 種代表性腸道細菌菌株中 30%的生長和 43 種細菌分離株中 84%的生長，覆蓋了 43%的人類腸道微生物群的相對豐度[57]。動物實驗顯示，MTX 能以劑量依賴性方式影響人源化小鼠的腸道微生物群組成[54]。低劑量的 MTX 增加了微生物群的物種豐富度和多樣性，包括厚壁菌門的相對豐度增加和擬桿菌門的相對豐度降低，這逆轉了通常與 RA 相關的微生物群的相對平衡。然而，高劑量的 MTX 卻顯著降低了腸道細菌多樣性[56]。
RA 患者在治療前的腸道宏基因組決定了他們是否對 MTX 有反應；而不同劑量的 MTX 改變了腸道細菌的物種豐富度和多樣性。換而言之，MTX 與腸道微生物群之間可能存在劑量依賴性的雙向相互作用。
5 小結與展望
本文重點介紹了腸道微生物群改變致 RA 發病的多種機制以及藥物-微生物群相互作用在 MTX 用于 RA 時藥物代謝和治療反應中的可能作用機制和影響。越來越多的證據揭示了腸道微生物群及其代謝物和參與 RA 發病機制的細胞（免疫和非免疫）之間聯系的機制。人類腸道微生物群及其酶產物也可以直接和/或間接影響藥物的生物利用度、臨床療效和毒性。而某些藥物和活性成分可以通過改變腸道微生物群組成來影響免疫系統，從而增強宿主的防御能力。此外，腸道微生物還與 MTX 耐藥性或反應不良有關。盡管特定微生物群落的顯著異常與 RA 疾病進展有關，但為了促進腸道微生物群靶向治療的進展，仍需解決以下幾個關鍵問題：首先，將來的研究仍需進一步闡明 RA 與微生物組成改變的相關性以及影響 RA 發展的機制通路；其次，還需進一步探索腸道微生物組是否可以直接代謝體內的 MTX，啟動免疫系統以增強反應，或兩者兼而有之；第三，有必要了解 MTX 對腸道菌群的相互作用，包括藥物對細菌代謝和繁殖的影響，以及細菌對藥物生物轉化的影響和機制，為優化或恢復 RA 患者微生物共生的治療策略鋪路。
綜上所述，腸道微生物群在 MTX 治療 RA 中作用的研究仍是熱點領域，具有重要的臨床意義。MTX 作為一種用于治療腫瘤和免疫性疾病的“老藥”，仍需要進一步探索，以改善療效，降低毒性風險，同時還需要評估調節腸道微生物群以優化 MTX 治療策略的可能性，來改善 RA 的治療結局。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。