引用本文： 張維杰, 連芩, 李滌塵, 王坤正, 靳忠民, 邊衛國, 劉亞雄, 賀健康, 王玲. 基于3-D打印技術的軟骨修復及軟骨下骨重建. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(3): 318-324. doi: 10.7507/1002-1892.20140072 復制
版權信息： ?四川大學華西醫院華西期刊社《中國修復重建外科雜志》版權所有，未經授權不得轉載、改編
經既往幾十年努力，軟骨修復取得了長足進步，但仍與功能化修復有很大距離[1-3]。研究表明，軟骨和軟骨下骨是一整體，前者起負載作用，后者起力學支撐與吸收沖擊力作用，二者相互依賴、不可分割[4]。軟骨再生不應只限于軟骨修復，為達到功能化修復，需注意軟骨下骨對軟骨修復的影響，但其在軟骨修復中的作用尚不明確[5]。因此，本研究建立兔骨軟骨絕對尺寸缺損模型，植入仿生設計并采用3-D打印技術制造的骨軟骨復合支架，探討骨軟骨修復過程中軟骨下骨重建、微結構參數變化規律，以及與軟骨修復的關系，為軟骨的功能化修復奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6月齡雄性新西蘭白兔40只，體重2.5～3.5 kg，由西安交通大學實驗動物中心提供。所有動物實驗均獲西安交通大學實驗動物管理委員會同意，實驗實施遵循《實驗動物保護與應用指南》[6]。
聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）400（相對分子質量508；天津市天驕化工有限公司）；雙丙烯酸酯單體（上海寶曼生物科技有限公司）；引發劑2-羥基-甲基苯基丙烷-1-酮（I-1173；陜西化玻器械有限公司）；無水乙醇、戊二醛（天津科密歐化學試劑有限公司）；β-磷酸三鈣（β-tricalcium phosphate，β-TCP）陶瓷（上海貝奧路生物材料有限公司）。SPS150B 光固化快速成型機（陜西恒通智能機器有限公司）；Inveon Micro-CT（Siemens公司，德國）；Mimics13.0軟件（Materialize公司，比利時）。
1.2 骨軟骨復合支架制備
按既往研究方法[7-8]，應用3-D打印技術制備仿生雙相支架。操作步驟：采用凝膠注模和燒結方法制備外形匹配的β-TCP陶瓷支架，彈性模量達（12.6 ± 0.3） MPa；通過調整曝光時間與PEG濃度，以I-1173為引發劑，逐層打印，獲得與軟骨彈性模量相匹配的PEG水凝膠支架[9]，將PEG水凝膠直接成型于制備的β-TCP陶瓷支架上，形成外形匹配、力學性能仿生的雙相PEG/β-TCP骨軟骨復合支架（圖 1）。
圖1
雙相PEG/β-TCP骨軟骨復合支架外觀 ? ?1.3 骨軟骨缺損模型建立及支架植入
取40只新西蘭白兔，腹腔注射3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉后，無菌條件下，通過右側股內側切口，于右膝滑車部位建立直徑4.8 mm、深7.5 mm的骨軟骨絕對尺寸缺損模型（圖 2 a）；左側不制備缺損，僅行切開縫合手術處理，作為假手術組。將35個雙相PEG/β-TCP骨軟骨復合支架，分別植入35只實驗動物骨軟骨缺損內（實驗組），支架距離關節表面0.5 mm（圖 2 b）；余5只缺損不作處理，作為空白對照組；逐層關閉切口。實驗組和假手術組分別于1、2、4、8、16、24、52周，空白對照組于24周過量注射3%戊巴比妥鈉處死動物，各取5個標本進行以下觀測。
1.4 觀測指標
1.4.1 大體觀察
取實驗組和假手術組術后16、24、52周及空白對照組術后24周標本（n=5），對軟骨修復的中長期情況進行大體觀察。根據Wayne評分體系[10]，從新生軟骨缺損覆蓋范圍、顏色、缺損邊界及表面情況4個方面進行評分，總分16分。由3位專業技術人員雙盲條件下實施。
1.4.2 組織學觀察
取實驗組和假手術組術后16、24、52周及空白對照組術后24周標本（n=5），行組織學觀察。將標本置于10%甲醛固定48 h，于10%EDTA中脫鈣2～3個月，石蠟包埋、4 μm厚薄層切片，行番 紅 O/快綠染色。根據Wayne評分體系[10]，從新生軟骨基質、細胞分布、表面光滑度、番紅O著色情況及番紅O著色范圍5個方面進行評分，總分19分。由3位專業技術人員雙盲條件下實施。
1.4.3 Micro-CT掃描及三維重建
取3組各時間點樣本（n=5），用Inveon Micro-CT進行掃描，掃描條件：360°掃描，電壓30 kV，電流500 μA，曝光時間3 000 ms。新生軟骨下骨三維結構用Mimics13.0軟件進行重建，重建精度為41.76 μm。從重建的三維模型中，應用布爾運算選取感興趣區域的新生軟骨下骨部分（圖 3），得到新生軟骨下骨的微結構參數：骨體積分數（bone volume fraction，BV/TV）、骨表面積分數（bone surface area fraction，BSA/BV）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁數量（trabecular number，Tb.N） 及標識骨小梁之間平均距離的骨小梁分離度（trabecular spacing，Tb.Sp）。
1.5 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間及組內各時間點間比較采用單因素方差分析及Tukey post-hoc分析，兩兩比較采用t檢驗；采用Pearson相關分析軟骨下骨微結構參數與軟骨修復（大體評分與組織學評分）之間的相關性。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 軟骨修復
2.1.1 大體觀察
各時間點實驗組均未見明顯免疫排斥反應及感染等并發癥。16周時，實驗組大部分缺損區域由白色半透明組織覆蓋，新生組織表面與假手術組相比略粗糙，大部分缺損邊界清晰；24周時，整個缺損區域均軟骨樣組織覆蓋，新生軟骨組織表面較光滑但表面略高，尚有一半缺損邊界較明顯；52周時，新生軟骨組織具有透明軟骨特征，呈白色半透明樣，表面光滑，缺損邊界已不可見。空白對照組24周時缺損區由暗紅色纖維樣組織填充，表面粗糙，整個缺損區邊界明顯。見圖 4。
根據Wayne評分體系，24周時空白對照組評分為（7.000 0 ± 0.894 4）分，顯著低于各時間點實驗組及假手術組，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。實驗組組內24周及52周評分均顯著高于16周，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；24周及52周間比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）。各時間點實驗組評分均低于假手術組，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見表 1。
表1
實驗組和假手術組術后各時間點Wayne大體觀察評分（n=5，2.1.2 組織學觀察
假手術組各時間點觀察情況一致，具有正常透明軟骨特征，表層軟骨細胞呈平行排列，中層軟骨細胞呈柱狀排列，軟骨基質紅染，潮線結構清晰可見。16周時，實驗組修復軟骨組織尚不完全，修復組織以透明樣和纖維軟骨混合而成，細胞排列不規律，可見細胞呈柱狀與集簇排列，部分修復組織可見裂隙；24周時，新生軟骨組織質量較前明顯改善，細胞呈柱狀排列且更規律，軟骨表面與假手術組正常軟骨一樣光滑，但未見潮線結構出現；52周時，新生軟骨組織情況與24周相同，但潮線結構橫貫出現于缺損區域內，表明新生軟骨組織開始逐漸恢復軟骨正常結構。空白對照組24周時主要由纖維樣組織組成，染色著色甚少，未見明顯成軟骨細胞。見圖 5。
根據Wayne評分體系，24周時空白對照組評分為（3.666 7 ± 1.154 7）分，顯著低于各時間點實驗組及假手術組，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。實驗組組內24周及52周評分均顯著高于16周，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；24周及52周間比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）。各時間點實驗組評分均低于假手術組，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見表 2。
表2
實驗組和假手術組術后各時間點Wayne組織學評分（n=5，2.2 軟骨下骨重建
2.2.1 軟骨下骨重建及微結構參數變化規律
組織學染色示，術后實驗組新生的軟骨下骨逐漸從缺損周圍向中央遷移，24、52周時遷移的軟骨下骨逐漸相互接近，形成與正常軟骨下骨類似的骨板結構。實驗組修復過程中，新生軟骨下骨處于不斷改建重建中。BV/ TV、BSA/BV、Tb.N在2周時首次出現明顯增高，4～8 周逐漸恢復至正常軟骨下骨水平，16周時再次明顯升高，之后恢復至正常水平；2、16周與其余時間點比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05），2、16周間差異無統計學意義（P＞ 0.05）。Tb.Sp的變化規律與BV/ TV、BSA/BV、Tb.N相反，2、16周顯著低于其余各時間點，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；2、16周間差異無統計學意義（P＞ 0.05）。Tb.Th各時間點變化不明顯，僅24周時與16周時比較出現升高（P＜ 0.05），52周時逐漸恢復至正常水平。見表 3、圖 6。
表3
實驗組術后各時間點軟骨下骨微結構參數比較（n=5，
圖6
實驗組術后各時間點各軟骨下骨微結構參數變化規律
Figure6.
Changes of parameters of repaired subchondral bone at different time points after operation
空白對照組術后24周BV/TV、BSA/BV、Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp分別為10.070 9% ± 2.112 6%、（17.262 0 ± 1.221 0）/mm、（0.116 3 ± 0.008 6）mm、（87.780 6 ± 23.650 2）/mm和（0.012 1 ± 0.003 9） mm。假手術組各時間點測量結果一致，以24周為例，分別為1.818 7% ± 0.186 3%、（7.507 9 ± 1.194 0） / mm、（0.272 6 ± 0.043 2）mm、（6.858 4 ± 1.434 4） / mm和（0.159 3 ± 0.037 1）mm。各時間點實驗組及假手術組各指標與空白對照組比較，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。除實驗組2、16周BV/TV、BSA/BV、Tb.N顯著高于假手術組，Tb.Sp顯著低于假手術組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）外，其余各時間點及各指標兩組間比較差異均無統計學意義（P＞ 0.05）。
2.2.2 軟骨下骨重建與軟骨修復關系
對軟骨下骨微結構參數與軟骨修復大體及組織學Wayne評分行Pearson相關分析顯示：BV/TV、BSA/BV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp與軟骨修復大體及組織學評分間均存在相關關系，其中BSA/BV、Tb.Th、Tb.N與大體評分高度相關，以上全部參數與組織學評分均中度相關。見表 4。
表4
軟骨下骨微結構參數與軟骨修復評分相關性分析
Table4.
Pearson correlation analysis between subchondral bone microstructural parameters and cartilage repair
3 討論
軟骨缺損修復仍是矯形外科難題之一，臨床上雖已應用各種治療方法修復受損軟骨，但遠期修復效果仍不理想[1-2, 11]。為達到有效及功能化修復受損軟骨，探索軟骨修復的機制至關重要。近年來，骨軟骨作為一個功能單位受到持續關注[4, 12-13]，軟骨修復觀念從單純的軟骨修復轉變為更為綜合的骨軟骨一體化修復[12-13]。軟骨下骨在軟骨損傷的發生、退化中起重要作用[14]，有研究表明提高軟骨下骨完整度有助于防止軟骨損傷進展[15]，然而其在軟骨修復中的作用尚不清楚[5]。因此，本研究建立骨軟骨絕對尺寸缺損模型，植入仿生設計、3-D打印技術制造的骨軟骨復合支架，旨在探討骨軟骨修復過程中軟骨下骨重建、微結構參數變化規律，研究其與軟骨修復之間的關系，為軟骨的功能化再生提供指導。
3.1 軟骨修復
實驗組骨軟骨缺損經雙相PEG/β-TCP復合支架修復后，軟骨得到了明顯修復，修復的軟骨組織從早期纖維軟骨與透明樣軟骨混合狀態，逐漸轉變為52周時以透明軟骨為主，出現白色半透明外觀，與周圍正常邊界接近消失，番紅O染色強著色，細胞出現柱狀排列特點；并且52周時骨軟骨界面潮線結構開始出現，而潮線結構是介于透明軟骨與鈣化軟骨層之間的嗜堿性染色結構，是成熟軟骨的標志性結構[16]，提示新生軟骨組織已具有一定功能結構。提示外觀匹配的力學性能仿生雙相PEG/β-TCP復合支架可修復骨軟骨絕對尺寸缺損，修復的軟骨組織呈現透明軟骨及成熟軟骨的特征。
3.2 軟骨下骨重建及微結構參數變化規律
與軟骨修復共同發生的軟骨下骨再生，在雙相PEG/β-TCP復合支架作用下，逐漸從缺損周圍向中央遷移，24、52周時遷移的軟骨下骨逐漸相互接近，形成與生理情況類似的軟骨下骨板結構，對軟骨修復形成支持與保護作用。
骨小梁是骨中最重要結構，由大量膠原按照一定方式排列，表面覆蓋大量礦物質，由桿狀和板狀骨小梁形成三維網狀結構[17]。骨的改變主要包括量變和質變，前者是指骨的數量或容積，后者指骨的微結構、骨膠原、骨基質礦化以及微骨折的發生和修復能力[18]。BV/ TV、BSA/BV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp這5個骨微結構參數可以定量描述骨組織微結構變化，間接反映骨強度。應用Micro-CT技術可無損、便捷地對骨軟骨絕對尺寸缺損修復過程進行觀察，本研究結果發現，在1～52周的骨軟骨缺損修復過程中，骨微結構參數均呈現規律性變化：BV/TV、BSA/BV、Tb.N、Tb.Sp均呈現出“雙峰”樣變化，峰值分別在2、16周出現，前三者呈增加變化，Tb.Sp則與前三者變化方向相反；而Tb.Th在整個修復過程中變化幅度較小，均與自然軟骨下骨無明顯差異。這與骨關節炎與骨質疏松等病理條件有明顯區別[19-20]，說明力學仿生的雙相PEG/β-TCP復合支架可為骨軟骨絕對尺寸缺損修復提供生理樣力學環境，保護并支持軟骨再生過程。
3.3 軟骨下骨重建與軟骨修復
目前軟骨下骨在軟骨修復中的作用尚不清楚，軟骨下骨與軟骨修復之間的關系也不明確。Orth等[14]的研究指出軟骨修復與軟骨下骨重建遵循不同節奏；Vasara等[21]也指出軟骨下骨反應與修復過程不相關。但該兩項研究都是在非絕對尺寸缺損模型下得出的結論，前者為缺損直徑3.2 mm兔膝關節缺損，而后者為缺損直徑6 mm山羊膝關節缺損，有研究表明此類缺損易被自主修復[22]。由此推測，在可自主修復的模型中，軟骨下骨重建可能與軟骨修復過程不相關。但在絕對尺寸缺損模型下，骨軟骨缺損不能被自主修復，這樣的缺損并不能在底部形成骨，也不能在缺損表面形成軟骨；相反，缺損骨壁會出現塌陷，形成大的空腔，缺損周圍的軟骨下骨和軟骨也會向缺損內塌陷[22-23]。有研究指出，在短期（1～56 d）骨髓刺激修復實驗中，高水平的骨重建活動是支持軟骨修復的重要因素[24-27]，但缺乏長期證據。
本研究應用3-D打印技術制備骨軟骨復合支架，修復直徑4.8 mm、深7.5 mm的絕對尺寸骨軟骨缺損，對軟骨下骨微結構參數和軟骨修復大體及組織學評分進行了相關分析，結果顯示，BV/TV、BSA/BV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp 5個軟骨下骨微結構參數均與軟骨修復大體及組織學評分之間存在相關關系，其中BSA/BV、Tb.Th、Tb.N與軟骨修復大體評分高度相關，而BV/TV、Tb.Sp與大體評分呈中度相關；BV/TV、BSA/BV、Tb.N、Tb.Sp與軟骨修復組織學評分均呈中度相關。由此可見，在絕對尺寸骨軟骨缺損修復模型中，軟骨下骨微結構參數與軟骨修復存在明確的相關關系；完整的軟骨下骨重建對軟骨修復具有重要意義；了解軟骨下骨重建規律，能為實時監控軟骨修復過程提供指導，為軟骨功能化再生奠定基礎。
綜上述，在絕對尺寸骨軟骨缺損修復模型中，軟骨下骨微結構參數與軟骨修復存在明確相關關系；完整的軟骨下骨修復需經歷“增殖-重建-再增殖-再重建”及“雙峰”樣過程，2、16周是骨增殖的2個關鍵時期；外形匹配力學仿生的雙相PEG/β-TCP復合支架可以修復骨軟骨絕對尺寸缺損，修復的軟骨組織呈現透明軟骨及成熟軟骨的特征。
經既往幾十年努力，軟骨修復取得了長足進步，但仍與功能化修復有很大距離[1-3]。研究表明，軟骨和軟骨下骨是一整體，前者起負載作用，后者起力學支撐與吸收沖擊力作用，二者相互依賴、不可分割[4]。軟骨再生不應只限于軟骨修復，為達到功能化修復，需注意軟骨下骨對軟骨修復的影響，但其在軟骨修復中的作用尚不明確[5]。因此，本研究建立兔骨軟骨絕對尺寸缺損模型，植入仿生設計并采用3-D打印技術制造的骨軟骨復合支架，探討骨軟骨修復過程中軟骨下骨重建、微結構參數變化規律，以及與軟骨修復的關系，為軟骨的功能化修復奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6月齡雄性新西蘭白兔40只，體重2.5～3.5 kg，由西安交通大學實驗動物中心提供。所有動物實驗均獲西安交通大學實驗動物管理委員會同意，實驗實施遵循《實驗動物保護與應用指南》[6]。
聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）400（相對分子質量508；天津市天驕化工有限公司）；雙丙烯酸酯單體（上海寶曼生物科技有限公司）；引發劑2-羥基-甲基苯基丙烷-1-酮（I-1173；陜西化玻器械有限公司）；無水乙醇、戊二醛（天津科密歐化學試劑有限公司）；β-磷酸三鈣（β-tricalcium phosphate，β-TCP）陶瓷（上海貝奧路生物材料有限公司）。SPS150B 光固化快速成型機（陜西恒通智能機器有限公司）；Inveon Micro-CT（Siemens公司，德國）；Mimics13.0軟件（Materialize公司，比利時）。
1.2 骨軟骨復合支架制備
按既往研究方法[7-8]，應用3-D打印技術制備仿生雙相支架。操作步驟：采用凝膠注模和燒結方法制備外形匹配的β-TCP陶瓷支架，彈性模量達（12.6 ± 0.3） MPa；通過調整曝光時間與PEG濃度，以I-1173為引發劑，逐層打印，獲得與軟骨彈性模量相匹配的PEG水凝膠支架[9]，將PEG水凝膠直接成型于制備的β-TCP陶瓷支架上，形成外形匹配、力學性能仿生的雙相PEG/β-TCP骨軟骨復合支架（圖 1）。
圖1
雙相PEG/β-TCP骨軟骨復合支架外觀 ? ?1.3 骨軟骨缺損模型建立及支架植入
取40只新西蘭白兔，腹腔注射3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉后，無菌條件下，通過右側股內側切口，于右膝滑車部位建立直徑4.8 mm、深7.5 mm的骨軟骨絕對尺寸缺損模型（圖 2 a）；左側不制備缺損，僅行切開縫合手術處理，作為假手術組。將35個雙相PEG/β-TCP骨軟骨復合支架，分別植入35只實驗動物骨軟骨缺損內（實驗組），支架距離關節表面0.5 mm（圖 2 b）；余5只缺損不作處理，作為空白對照組；逐層關閉切口。實驗組和假手術組分別于1、2、4、8、16、24、52周，空白對照組于24周過量注射3%戊巴比妥鈉處死動物，各取5個標本進行以下觀測。
1.4 觀測指標
1.4.1 大體觀察
取實驗組和假手術組術后16、24、52周及空白對照組術后24周標本（n=5），對軟骨修復的中長期情況進行大體觀察。根據Wayne評分體系[10]，從新生軟骨缺損覆蓋范圍、顏色、缺損邊界及表面情況4個方面進行評分，總分16分。由3位專業技術人員雙盲條件下實施。
1.4.2 組織學觀察
取實驗組和假手術組術后16、24、52周及空白對照組術后24周標本（n=5），行組織學觀察。將標本置于10%甲醛固定48 h，于10%EDTA中脫鈣2～3個月，石蠟包埋、4 μm厚薄層切片，行番 紅 O/快綠染色。根據Wayne評分體系[10]，從新生軟骨基質、細胞分布、表面光滑度、番紅O著色情況及番紅O著色范圍5個方面進行評分，總分19分。由3位專業技術人員雙盲條件下實施。
1.4.3 Micro-CT掃描及三維重建
取3組各時間點樣本（n=5），用Inveon Micro-CT進行掃描，掃描條件：360°掃描，電壓30 kV，電流500 μA，曝光時間3 000 ms。新生軟骨下骨三維結構用Mimics13.0軟件進行重建，重建精度為41.76 μm。從重建的三維模型中，應用布爾運算選取感興趣區域的新生軟骨下骨部分（圖 3），得到新生軟骨下骨的微結構參數：骨體積分數（bone volume fraction，BV/TV）、骨表面積分數（bone surface area fraction，BSA/BV）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁數量（trabecular number，Tb.N） 及標識骨小梁之間平均距離的骨小梁分離度（trabecular spacing，Tb.Sp）。
1.5 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間及組內各時間點間比較采用單因素方差分析及Tukey post-hoc分析，兩兩比較采用t檢驗；采用Pearson相關分析軟骨下骨微結構參數與軟骨修復（大體評分與組織學評分）之間的相關性。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 軟骨修復
2.1.1 大體觀察
各時間點實驗組均未見明顯免疫排斥反應及感染等并發癥。16周時，實驗組大部分缺損區域由白色半透明組織覆蓋，新生組織表面與假手術組相比略粗糙，大部分缺損邊界清晰；24周時，整個缺損區域均軟骨樣組織覆蓋，新生軟骨組織表面較光滑但表面略高，尚有一半缺損邊界較明顯；52周時，新生軟骨組織具有透明軟骨特征，呈白色半透明樣，表面光滑，缺損邊界已不可見。空白對照組24周時缺損區由暗紅色纖維樣組織填充，表面粗糙，整個缺損區邊界明顯。見圖 4。
根據Wayne評分體系，24周時空白對照組評分為（7.000 0 ± 0.894 4）分，顯著低于各時間點實驗組及假手術組，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。實驗組組內24周及52周評分均顯著高于16周，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；24周及52周間比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）。各時間點實驗組評分均低于假手術組，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見表 1。
表1
實驗組和假手術組術后各時間點Wayne大體觀察評分（n=5，2.1.2 組織學觀察
假手術組各時間點觀察情況一致，具有正常透明軟骨特征，表層軟骨細胞呈平行排列，中層軟骨細胞呈柱狀排列，軟骨基質紅染，潮線結構清晰可見。16周時，實驗組修復軟骨組織尚不完全，修復組織以透明樣和纖維軟骨混合而成，細胞排列不規律，可見細胞呈柱狀與集簇排列，部分修復組織可見裂隙；24周時，新生軟骨組織質量較前明顯改善，細胞呈柱狀排列且更規律，軟骨表面與假手術組正常軟骨一樣光滑，但未見潮線結構出現；52周時，新生軟骨組織情況與24周相同，但潮線結構橫貫出現于缺損區域內，表明新生軟骨組織開始逐漸恢復軟骨正常結構。空白對照組24周時主要由纖維樣組織組成，染色著色甚少，未見明顯成軟骨細胞。見圖 5。
根據Wayne評分體系，24周時空白對照組評分為（3.666 7 ± 1.154 7）分，顯著低于各時間點實驗組及假手術組，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。實驗組組內24周及52周評分均顯著高于16周，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；24周及52周間比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）。各時間點實驗組評分均低于假手術組，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見表 2。
表2
實驗組和假手術組術后各時間點Wayne組織學評分（n=5，2.2 軟骨下骨重建
2.2.1 軟骨下骨重建及微結構參數變化規律
組織學染色示，術后實驗組新生的軟骨下骨逐漸從缺損周圍向中央遷移，24、52周時遷移的軟骨下骨逐漸相互接近，形成與正常軟骨下骨類似的骨板結構。實驗組修復過程中，新生軟骨下骨處于不斷改建重建中。BV/ TV、BSA/BV、Tb.N在2周時首次出現明顯增高，4～8 周逐漸恢復至正常軟骨下骨水平，16周時再次明顯升高，之后恢復至正常水平；2、16周與其余時間點比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05），2、16周間差異無統計學意義（P＞ 0.05）。Tb.Sp的變化規律與BV/ TV、BSA/BV、Tb.N相反，2、16周顯著低于其余各時間點，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；2、16周間差異無統計學意義（P＞ 0.05）。Tb.Th各時間點變化不明顯，僅24周時與16周時比較出現升高（P＜ 0.05），52周時逐漸恢復至正常水平。見表 3、圖 6。
表3
實驗組術后各時間點軟骨下骨微結構參數比較（n=5，
圖6
實驗組術后各時間點各軟骨下骨微結構參數變化規律
Figure6.
Changes of parameters of repaired subchondral bone at different time points after operation
空白對照組術后24周BV/TV、BSA/BV、Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp分別為10.070 9% ± 2.112 6%、（17.262 0 ± 1.221 0）/mm、（0.116 3 ± 0.008 6）mm、（87.780 6 ± 23.650 2）/mm和（0.012 1 ± 0.003 9） mm。假手術組各時間點測量結果一致，以24周為例，分別為1.818 7% ± 0.186 3%、（7.507 9 ± 1.194 0） / mm、（0.272 6 ± 0.043 2）mm、（6.858 4 ± 1.434 4） / mm和（0.159 3 ± 0.037 1）mm。各時間點實驗組及假手術組各指標與空白對照組比較，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。除實驗組2、16周BV/TV、BSA/BV、Tb.N顯著高于假手術組，Tb.Sp顯著低于假手術組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）外，其余各時間點及各指標兩組間比較差異均無統計學意義（P＞ 0.05）。
2.2.2 軟骨下骨重建與軟骨修復關系
對軟骨下骨微結構參數與軟骨修復大體及組織學Wayne評分行Pearson相關分析顯示：BV/TV、BSA/BV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp與軟骨修復大體及組織學評分間均存在相關關系，其中BSA/BV、Tb.Th、Tb.N與大體評分高度相關，以上全部參數與組織學評分均中度相關。見表 4。
表4
軟骨下骨微結構參數與軟骨修復評分相關性分析
Table4.
Pearson correlation analysis between subchondral bone microstructural parameters and cartilage repair
3 討論
軟骨缺損修復仍是矯形外科難題之一，臨床上雖已應用各種治療方法修復受損軟骨，但遠期修復效果仍不理想[1-2, 11]。為達到有效及功能化修復受損軟骨，探索軟骨修復的機制至關重要。近年來，骨軟骨作為一個功能單位受到持續關注[4, 12-13]，軟骨修復觀念從單純的軟骨修復轉變為更為綜合的骨軟骨一體化修復[12-13]。軟骨下骨在軟骨損傷的發生、退化中起重要作用[14]，有研究表明提高軟骨下骨完整度有助于防止軟骨損傷進展[15]，然而其在軟骨修復中的作用尚不清楚[5]。因此，本研究建立骨軟骨絕對尺寸缺損模型，植入仿生設計、3-D打印技術制造的骨軟骨復合支架，旨在探討骨軟骨修復過程中軟骨下骨重建、微結構參數變化規律，研究其與軟骨修復之間的關系，為軟骨的功能化再生提供指導。
3.1 軟骨修復
實驗組骨軟骨缺損經雙相PEG/β-TCP復合支架修復后，軟骨得到了明顯修復，修復的軟骨組織從早期纖維軟骨與透明樣軟骨混合狀態，逐漸轉變為52周時以透明軟骨為主，出現白色半透明外觀，與周圍正常邊界接近消失，番紅O染色強著色，細胞出現柱狀排列特點；并且52周時骨軟骨界面潮線結構開始出現，而潮線結構是介于透明軟骨與鈣化軟骨層之間的嗜堿性染色結構，是成熟軟骨的標志性結構[16]，提示新生軟骨組織已具有一定功能結構。提示外觀匹配的力學性能仿生雙相PEG/β-TCP復合支架可修復骨軟骨絕對尺寸缺損，修復的軟骨組織呈現透明軟骨及成熟軟骨的特征。
3.2 軟骨下骨重建及微結構參數變化規律
與軟骨修復共同發生的軟骨下骨再生，在雙相PEG/β-TCP復合支架作用下，逐漸從缺損周圍向中央遷移，24、52周時遷移的軟骨下骨逐漸相互接近，形成與生理情況類似的軟骨下骨板結構，對軟骨修復形成支持與保護作用。
骨小梁是骨中最重要結構，由大量膠原按照一定方式排列，表面覆蓋大量礦物質，由桿狀和板狀骨小梁形成三維網狀結構[17]。骨的改變主要包括量變和質變，前者是指骨的數量或容積，后者指骨的微結構、骨膠原、骨基質礦化以及微骨折的發生和修復能力[18]。BV/ TV、BSA/BV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp這5個骨微結構參數可以定量描述骨組織微結構變化，間接反映骨強度。應用Micro-CT技術可無損、便捷地對骨軟骨絕對尺寸缺損修復過程進行觀察，本研究結果發現，在1～52周的骨軟骨缺損修復過程中，骨微結構參數均呈現規律性變化：BV/TV、BSA/BV、Tb.N、Tb.Sp均呈現出“雙峰”樣變化，峰值分別在2、16周出現，前三者呈增加變化，Tb.Sp則與前三者變化方向相反；而Tb.Th在整個修復過程中變化幅度較小，均與自然軟骨下骨無明顯差異。這與骨關節炎與骨質疏松等病理條件有明顯區別[19-20]，說明力學仿生的雙相PEG/β-TCP復合支架可為骨軟骨絕對尺寸缺損修復提供生理樣力學環境，保護并支持軟骨再生過程。
3.3 軟骨下骨重建與軟骨修復
目前軟骨下骨在軟骨修復中的作用尚不清楚，軟骨下骨與軟骨修復之間的關系也不明確。Orth等[14]的研究指出軟骨修復與軟骨下骨重建遵循不同節奏；Vasara等[21]也指出軟骨下骨反應與修復過程不相關。但該兩項研究都是在非絕對尺寸缺損模型下得出的結論，前者為缺損直徑3.2 mm兔膝關節缺損，而后者為缺損直徑6 mm山羊膝關節缺損，有研究表明此類缺損易被自主修復[22]。由此推測，在可自主修復的模型中，軟骨下骨重建可能與軟骨修復過程不相關。但在絕對尺寸缺損模型下，骨軟骨缺損不能被自主修復，這樣的缺損并不能在底部形成骨，也不能在缺損表面形成軟骨；相反，缺損骨壁會出現塌陷，形成大的空腔，缺損周圍的軟骨下骨和軟骨也會向缺損內塌陷[22-23]。有研究指出，在短期（1～56 d）骨髓刺激修復實驗中，高水平的骨重建活動是支持軟骨修復的重要因素[24-27]，但缺乏長期證據。
本研究應用3-D打印技術制備骨軟骨復合支架，修復直徑4.8 mm、深7.5 mm的絕對尺寸骨軟骨缺損，對軟骨下骨微結構參數和軟骨修復大體及組織學評分進行了相關分析，結果顯示，BV/TV、BSA/BV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp 5個軟骨下骨微結構參數均與軟骨修復大體及組織學評分之間存在相關關系，其中BSA/BV、Tb.Th、Tb.N與軟骨修復大體評分高度相關，而BV/TV、Tb.Sp與大體評分呈中度相關；BV/TV、BSA/BV、Tb.N、Tb.Sp與軟骨修復組織學評分均呈中度相關。由此可見，在絕對尺寸骨軟骨缺損修復模型中，軟骨下骨微結構參數與軟骨修復存在明確的相關關系；完整的軟骨下骨重建對軟骨修復具有重要意義；了解軟骨下骨重建規律，能為實時監控軟骨修復過程提供指導，為軟骨功能化再生奠定基礎。
綜上述，在絕對尺寸骨軟骨缺損修復模型中，軟骨下骨微結構參數與軟骨修復存在明確相關關系；完整的軟骨下骨修復需經歷“增殖-重建-再增殖-再重建”及“雙峰”樣過程，2、16周是骨增殖的2個關鍵時期；外形匹配力學仿生的雙相PEG/β-TCP復合支架可以修復骨軟骨絕對尺寸缺損，修復的軟骨組織呈現透明軟骨及成熟軟骨的特征。
