引用本文： 潘樞, 劉星辰, 史宏燦. 脫細胞氣管基質材料的免疫原性及生物相容性研究. 中國修復重建外科雜志, 2018, 32(4): 441-447. doi: 10.7507/1002-1892.201710007 復制
版權信息： ?四川大學華西醫院華西期刊社《中國修復重建外科雜志》版權所有，未經授權不得轉載、改編
氣管病變主要由先天狹窄、感染、創傷、腫瘤等引起，氣管切除并端端吻合是其治療“金標準”，但若病變切除范圍超過成人氣管總長度的 1/2 或兒童的 1/3，則需要替代物來重建氣道的連續性[1]。理想的氣管替代物應具有密封性、無免疫原性、利于細胞貼附生長等性能[2]。近年來，利用組織工程學原理和技術體外構建出具有生物活性及一定生理功能的仿生材料，作為移植物修復氣管缺損逐漸成為研究熱點[3]。脫細胞技術目前被廣泛應用于組織工程氣管基質材料的制備[4]。然而，傳統脫細胞方法由于去除了大部分氣管軟骨細胞，使其生物學性能發生改變，導致移植術后發生移植物塌陷而狹窄[5]。同時，有關研究表明軟骨細胞對維持氣管的三維管狀結構具有重要意義[6]。
高氯酸鹽離子是一種常用的活性氧化劑，常作為一個電解液介質，可用于 DNA 提取和分子生物學領域的雜交反應。高氯酸鈉（NaClO4）作為一種溫和的脫細胞方法，可以保留基質內的軟骨細胞[7-8]。本實驗通過評估經 NaClO4 制備的脫細胞氣管基質材料的生物相容性及其免疫原性，為組織工程同種異體氣管移植研究提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
2 月齡健康新西蘭兔 3 只，雌雄不限，體質量 200～300 g；6 月齡成年健康新西蘭兔 20 只，雌雄不限，體質量 2.0～2.5 kg；均由揚州大學實驗動物中心提供。
NaClO4（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；HE 染液、MTT 試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司）；戊巴比妥（Sigma 公司，美國）；低分子肝素鈉（深圳天道醫藥有限公司）；DMEM-F12、0.25% 胰蛋白酶-0.1%EDTA（HyClone 公司，美國）；FBS（北京全球康生物科技公司）；4% 多聚甲醛、Giemsa 染料（北京索萊寶科技有限公司）；青霉素、鏈霉素、兩性霉素 B（上海生工生物工程有限公司）；NaCl、KCl、K2HPO4、Na2HPO4（天津科密歐化學試劑公司）。
正置顯微鏡（Olympus 公司，日本）；Leica CM-1990 冷凍切片機（Leica 公司，德國）；正置免疫熒光顯微鏡、TS100 倒置顯微鏡（Nikon 公司，日本）；酶標儀（BioTAK 公司，美國）；S-4800 場發射掃描電鏡（Hitachi 公司，日本）；CO2 培養箱、臺式離心機（Hereaus 公司，德國）；恒溫震蕩培養箱（太倉市實驗設備廠）；CA-1480-2 垂直層流潔凈工作臺（上海上凈凈化設備有限公司）；MP200A 型電子天平（上海第二平衡器廠）；MILi-Qso 型純水器（MiliPore 公司，美國）；壓力蒸汽滅菌（嘉興中新醫療器械公司）。
1.2 BMSCs 分離、培養及傳代
取 2 月齡新西蘭兔，空氣栓塞法處死。用 18 號骨髓穿刺針于脛骨平臺處進行穿刺，用經肝素沖洗過的注射器抽取骨髓約 1 mL。按本研究小組既往的實驗方法[9]，采用全骨髓貼壁篩選法進行 BMSCs 的分離、培養及傳代。取生長狀態良好的第 4 代 BMSCs 用于后續實驗。
1.3 氣管支架制備及相關檢測
1.3.1 實驗分組及氣管支架制備
取 10 只 6 月齡成年新西蘭兔，空氣栓塞法處死，在外科標準無菌操作下獲取氣管。隨機分為 2 組，每組 5 只。對照組（A1 組）僅剝離氣管外表面疏松結締組織。實驗組（B1 組）在剝離氣管外表面疏松結締組織基礎上，參照本研究小組改良的 NaClO4 浸泡法[10]對氣管進行脫細胞處理：將氣管置于 4℃ 蒸餾水滲透溶解 48 h，然后以 5%NaClO4 浸泡 72 h，置于含 1% 雙抗的 PBS 緩沖液中 4℃ 保存待測。
1.3.2 浸提液細胞毒性實驗
無菌操作下將 A1 組和 B1 組氣管支架組織剪成 2 mm×2 mm 大小。按 10 mL/cm2 表面積加入含 10%FBS 的 DMEM/F12 培養液，37℃ 震蕩 24 h；混懸液以離心半徑 15 cm、500 r/min 離心 10 min，將上清液移至離心管中保存。同時以含 10%FBS 的 DMEM/F12 培養液為陰性對照組（C1 組），以含 50 g/L 苯酚、10%FBS 的 DMEM/F12 培養基為陽性對照組（D1 組）。取第 4 代 BMSCs，達 80% 融合時消化計數；然后將約含 5×103個細胞的細胞懸液（200 μL）接種至 96 孔板中，置于 37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱培養 24 h 后，更換為上述各組浸提液，之后每 48 小時換液。培養 1、3、5、7 d 后，每孔加 MTT 溶液（5 mg/mL，用 PBS 配制，pH7.4）10 μL，利用酶標儀測定各孔 490 nm 處吸光度（A）值，繪制細胞生長曲線。
1.3.3 免疫組織化學染色觀察主要組織相容性復合物（major histocompatibility complex，MHC）類抗原表達
將 A1 組和 B1 組氣管標本行 4 μm 厚冰凍切片，多聚甲醛固定后，正常山羊血清工作液封閉，加一抗（鼠抗兔 MHC-Ⅰ和Ⅱ抗體，稀釋濃度 1∶200）4℃ 過夜，滴加二抗（山羊抗鼠 IgG）后 DAB 顯色，蘇木素復染，二甲苯透明后封片，正置顯微鏡下觀察材料 MHC-Ⅰ和Ⅱ抗原的表達。
1.4 細胞-氣管支架復合物的制備及相關觀測
1.4.1 細胞-氣管支架復合物制備及細胞活性觀察
將 A1 組和 B1 組氣管支架在無菌環境中修剪成 0.5 cm×0.5 cm 大小的片狀組織，然后貼于 24 孔板底中央，氣管外壁朝上；吸走周圍 PBS 液，置于超凈臺中干燥 2 h，向組織片中滴加含 10%FBS 的 DMEM/F12 培養基直至覆蓋組織片，滴加過程避免組織片漂浮。將 24 孔培養板移至細胞培養箱，37℃、5%CO2、飽和濕度下孵育 24 h 后，吸去培養基。取生長狀態良好的第 4 代 BMSCs，達 80% 融合時消化計數，然后將含有 2.5×104個細胞的細胞懸液接種至兩組氣管組織片的外壁上，置于 37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱培養。48 h 后取出行 Giemsa 染色，倒置顯微鏡下觀察，根據細胞生長形態及狀況判斷材料毒性。
1.4.2 掃描電鏡觀察
兩組細胞-氣管支架復合物組織片培養 7、14 d 后取出，2.5% 戊二醛溶液固定 24 h；PBS 漂洗，梯度乙醇脫水，加入乙酸乙酯∶乙醇（1∶1）及純戊酯各 30 min，干燥后噴金，掃描電鏡觀察支架外表面的細胞狀態。
1.5 同種異體動物體內實驗
1.5.1 氣管支架手術埋植
取 6 月齡成年新西蘭兔 10 只，隨機分為 2 組，每組 5 只。以戊巴比妥鈉（3 mg/mL）耳緣靜脈注射麻醉，頸背部備皮切開，游離皮下淺筋膜，分離脊柱一側，形成皮囊。對照組（A2 組）植入新鮮氣管支架，實驗組（B2 組）植入脫細胞氣管支架，隨后常規縫合。術后觀察實驗動物炎性反應、排斥反應和一般健康狀態（包括飲食、體質量、活動等情況）。
1.5.2 血液免疫球蛋白動態分析
術后 5、10、15、20、25、30 d，于耳緣靜脈處采血留取標本，采用 ELISA 法評估受體血清免疫球蛋白 IgM 和 IgG 含量的動態變化。
1.5.3 HE 染色觀察
術后 30 d 空氣栓塞法處死兩組動物，獲取氣管支架材料。室溫下 10% 中性甲醛固定 24 h，梯度乙醇脫水，石蠟包埋切片，二甲苯脫蠟，行常規 HE 染色觀察。
1.6 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；多組間比較采用單因素方差分析；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 氣管支架相關觀測
2.1.1 浸提液細胞毒性實驗
各時間點 D1 組細胞均無成活。與 C1 組比較，雖然 A1 組和 B1 組細胞增殖稍低，但各時間點 3 組間 A 值比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 1。
2.1.2 免疫組織化學染色觀察 MHC 類抗原表達
A1 組氣管支架中，MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ抗原在上皮層、黏膜層及黏膜下層細胞表達呈強陽性，在軟骨膜部表達呈陽性，而在軟骨細胞及細胞外基質結構均呈陰性；而 B1 組氣管支架中，MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ抗原在細胞外基質表達均呈陰性，僅在軟骨細胞核表達呈陽性。見圖 2。
2.2 細胞-氣管支架復合物相關觀測
2.2.1 細胞活性觀察
培養 48 h 后 Giemsa 染色示，A1 組材料周圍的細胞貼壁生長、增殖良好，未見懸浮細胞；B1 組材料周圍的細胞在形態和密度上與 A 組比較無明顯差別。見圖 3。
2.2.2 掃描電鏡觀察
培養 7、14 d，細胞在 A1 組氣管支架材料外壁上貼附良好，呈扁平的圓形、橢圓形，細胞排列緊密，成簇分布；細胞在 B1 組氣管支架材料外壁上呈單片狀生長，形態與 A1 組相似，生長趨勢較 A1 組好。見圖 4。
2.3 同種異體動物體內實驗
2.3.1 大體觀察
所有實驗動物術后 30 d 內表現健康，體質量有所增加；傷口均愈合良好。30 d 時 A2 組氣管支架周圍包繞炎性結締組織，并與受植床粘連，不易剝離；囊狀的新鮮氣管內有大量膿液積聚，破壞了正常氣管的解剖結構。而 B2 組氣管支架周圍包繞的結締組織較薄，無明顯排斥反應跡象；氣管支架表面有新生血管形成。見圖 5。
2.3.2 血液免疫球蛋白動態分析
術后兩組 IgM 及 IgG 表達均逐漸增加，分別于 15 d 和 20 d 達峰值，后逐漸下降，符合體液免疫應答抗體產生的規律。術后各時間點 A2 組 IgM 和 IgG 含量均顯著高于 B2 組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 6。
2.3.3 HE 染色觀察
術后 30 d A2 組支架材料外表面炎性細胞浸潤較多，腺體結構缺失，軟骨組織皆不同程度被破壞；B2 組未見炎性細胞深層滲透或破壞氣管結構，軟骨細胞形態無異常，未見鈣化、排斥等不良反應。見圖 7。
圖1
MTT 法檢測各時間點各組浸提液中細胞活性
Figure1.
The cell activity in the leach liquor in each group at diffe rent time points detected by MTT assay
圖2
免疫組織化學染色觀察兩組氣管支架材料 MHC 類抗原表達（正置顯微鏡×200）
a. A1 組 MHC-Ⅰ抗原表達；b. B1 組 MHC-Ⅰ抗原表達；c. A1 組 MHC-Ⅱ抗原表達；d. B1 組 MHC-Ⅱ抗原表達
Figure2. Expression of MHC antigen in tracheal matrixs in 2 groups by immunohistochemical staining observation (Upright microscope×200)a. Expression of MHC-Ⅰ antigen in group A1; b. Expression of MHC-Ⅰ antigen in group B1; c. Expression of MHC-Ⅱ antigen in group A1; d. Expression of MHC-Ⅱ antigen in group B1
圖3
兩組細胞-氣管支架復合物培養 48 h 后 Giemsa 染色觀察（倒置顯微鏡×100）
a. A1 組；b. B1 組
Figure3. Giemsa staining observation of cell-trachea scaffold complex in 2 groups after cultured for 48 hours (Inverted microscope×100)a. Group A1; b. Group B1
圖4
培養各時間點兩組細胞-氣管支架材料掃描電鏡觀察（×5 000）
a. A1 組培養 7 d；b. A1 組培養 14 d；c. B1 組培養 7 d；d. B1 組培養 14 d
Figure4. Scanning electron microscope observation of cell-trachea scaffold complex in 2 groups after cultured for different time points (×5 000)a. Group A1 at 7 days; b. Group A1 at 14 days; c. Group B1 at 7 days; d. Group B1 at 14 days
圖5
術后 30 d 兩組氣管支架大體觀察
a. A2 組；b. B2 組
Figure5. Macroscopic observation of the tracheal scaffolds at 30 days after operationa. Group A2; b. Group B2
圖6
術后各時間點兩組血液免疫球蛋白動態分析
a. IgM；b. IgG
Figure6. Dynamic analysis of the blood immunoglobulin at each time point after operationa. IgM; b. IgG
圖7
術后 30 d 兩組 HE 染色觀察（×200）
a. A2 組；b. B2 組
Figure7. HE staining observation of 2 groups at 30 days after operation (×200)a. Group A2; b. Group B2
3 討論
細胞外基質是組織工程的重要組成部分，研究證實細胞外基質會影響細胞增殖、遷移、分化，最終促進組織再生和重塑[11-12]。脫細胞基質材料含有天然的細胞外基質成分，不會釋放有毒的可降解產物或引起炎性反應[13]。由于細胞外基質對于組織再生起著至關重要的作用，所以選擇合適的脫細胞方案尤為重要[14]。目前臨床應用的脫氧膽酸鈉聯合酶法對人、豬、鼠氣管分別需要 25、17、5 個循環，才能獲得低免疫原性的脫細胞基質[15]，該方法所需時間長，程序繁瑣，也增加了基質感染的風險[16]。
要成為可應用于臨床的組織工程氣管支架材料，必須能支持種子細胞生長、分化。本實驗將 BMSCs 接種至脫細胞氣管支架外壁上進行體外培養，并觀察細胞的黏附、生長情況。結果顯示，BMSCs 在脫細胞氣管支架外壁上貼附良好，細胞呈扁平的圓形、橢圓形，排列緊密，成簇分布。因此我們推斷 NaClO4 脫細胞基質能為 BMSCs 提供一個良好的黏附界面，同時也能支持細胞的生長。脫細胞使用的 NaClO4 作為一種化學試劑，如果其在支架材料中殘存濃度較高，對接種的細胞或宿主也會造成一定程度影響。本實驗發現脫細胞氣管支架浸提液中的細胞增殖情況與基礎培養液相比，差異無統計學意義，說明支架材料中沒有引起細胞活性降低的成分，提示此材料對細胞無明顯毒性。
眾所周知，同種異體移植后若不使用免疫抑制劑，往往發生排斥反應。同種異體移植排斥反應的細胞學基礎是移植物 MHC-Ⅰ和 MHC-Ⅱ抗原的表達，以激活宿主 CD4+T 細胞和 CTL 細胞。相關研究證明 MHC 類抗原的分布主要集中于黏膜表面的上皮、黏膜下腺和軟骨膜，而不是在軟骨細胞或軟骨基質，表明黏膜、黏膜下腺、軟骨膜是主要引起移植排斥反應的抗原結構[15, 17-19]。細胞外基質通過擴散來營養其中的軟骨細胞，而且由于軟骨細胞的新陳代謝需求低，可以在宿主體內存活[20]。同時，有研究提出軟骨作為一種“免疫豁免”組織，可逐漸被宿主自身的軟骨細胞替代[21]。Delaere 等[22]研究也發現位于軟骨陷窩內的軟骨細胞，由于缺乏直接血管，并且周圍基質中包裹有膠原-蛋白質-多糖的細胞外基質作為物理隔離，從而使軟骨細胞不被宿主的免疫系統識別。基于這些研究結果，我們提出了這種保留軟骨細胞的結構完整、低免疫原性的優化脫細胞方案。與傳統方法相比，該方法處理周期快，且較好地保留了細胞外基質成分，以滿足組織工程重建需求。
研究顯示，軟骨基質內的軟骨細胞在合成和分泌軟骨基質和膠原纖維中發揮重要作用，而且有活性的軟骨細胞對保持氣管基質材料的三維結構也是至關重要的[3, 17-19]。脫細胞的概念是為了減少免疫原性細胞的數量，而不是完全消除所有細胞。我們進行了同種異體埋植實驗，來驗證這種保留軟骨細胞基質材料的免疫原特性，并且術后未使用免疫抑制治療。結果表明本實驗的脫細胞方法制備的基質材料并未引起移植物的排斥反應。
綜上述，本研究中我們通過將細胞-脫細胞氣管支架進行體外培養，初步判斷采用改良 NaClO4 脫細胞法獲得的脫細胞氣管支架具有良好的生物相容性，能夠支持種子細胞的黏附和生長；并且在動物體內埋植實驗中驗證了軟骨細胞的“免疫豁免”特性。該方案簡化了脫細胞過程并節約了成本和時間，為同種異體氣管移植提供了一種新思路。今后需在提高脫細胞材料行體內原位移植的遠期效果方面做出更多改進。
氣管病變主要由先天狹窄、感染、創傷、腫瘤等引起，氣管切除并端端吻合是其治療“金標準”，但若病變切除范圍超過成人氣管總長度的 1/2 或兒童的 1/3，則需要替代物來重建氣道的連續性[1]。理想的氣管替代物應具有密封性、無免疫原性、利于細胞貼附生長等性能[2]。近年來，利用組織工程學原理和技術體外構建出具有生物活性及一定生理功能的仿生材料，作為移植物修復氣管缺損逐漸成為研究熱點[3]。脫細胞技術目前被廣泛應用于組織工程氣管基質材料的制備[4]。然而，傳統脫細胞方法由于去除了大部分氣管軟骨細胞，使其生物學性能發生改變，導致移植術后發生移植物塌陷而狹窄[5]。同時，有關研究表明軟骨細胞對維持氣管的三維管狀結構具有重要意義[6]。
高氯酸鹽離子是一種常用的活性氧化劑，常作為一個電解液介質，可用于 DNA 提取和分子生物學領域的雜交反應。高氯酸鈉（NaClO4）作為一種溫和的脫細胞方法，可以保留基質內的軟骨細胞[7-8]。本實驗通過評估經 NaClO4 制備的脫細胞氣管基質材料的生物相容性及其免疫原性，為組織工程同種異體氣管移植研究提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
2 月齡健康新西蘭兔 3 只，雌雄不限，體質量 200～300 g；6 月齡成年健康新西蘭兔 20 只，雌雄不限，體質量 2.0～2.5 kg；均由揚州大學實驗動物中心提供。
NaClO4（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；HE 染液、MTT 試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司）；戊巴比妥（Sigma 公司，美國）；低分子肝素鈉（深圳天道醫藥有限公司）；DMEM-F12、0.25% 胰蛋白酶-0.1%EDTA（HyClone 公司，美國）；FBS（北京全球康生物科技公司）；4% 多聚甲醛、Giemsa 染料（北京索萊寶科技有限公司）；青霉素、鏈霉素、兩性霉素 B（上海生工生物工程有限公司）；NaCl、KCl、K2HPO4、Na2HPO4（天津科密歐化學試劑公司）。
正置顯微鏡（Olympus 公司，日本）；Leica CM-1990 冷凍切片機（Leica 公司，德國）；正置免疫熒光顯微鏡、TS100 倒置顯微鏡（Nikon 公司，日本）；酶標儀（BioTAK 公司，美國）；S-4800 場發射掃描電鏡（Hitachi 公司，日本）；CO2 培養箱、臺式離心機（Hereaus 公司，德國）；恒溫震蕩培養箱（太倉市實驗設備廠）；CA-1480-2 垂直層流潔凈工作臺（上海上凈凈化設備有限公司）；MP200A 型電子天平（上海第二平衡器廠）；MILi-Qso 型純水器（MiliPore 公司，美國）；壓力蒸汽滅菌（嘉興中新醫療器械公司）。
1.2 BMSCs 分離、培養及傳代
取 2 月齡新西蘭兔，空氣栓塞法處死。用 18 號骨髓穿刺針于脛骨平臺處進行穿刺，用經肝素沖洗過的注射器抽取骨髓約 1 mL。按本研究小組既往的實驗方法[9]，采用全骨髓貼壁篩選法進行 BMSCs 的分離、培養及傳代。取生長狀態良好的第 4 代 BMSCs 用于后續實驗。
1.3 氣管支架制備及相關檢測
1.3.1 實驗分組及氣管支架制備
取 10 只 6 月齡成年新西蘭兔，空氣栓塞法處死，在外科標準無菌操作下獲取氣管。隨機分為 2 組，每組 5 只。對照組（A1 組）僅剝離氣管外表面疏松結締組織。實驗組（B1 組）在剝離氣管外表面疏松結締組織基礎上，參照本研究小組改良的 NaClO4 浸泡法[10]對氣管進行脫細胞處理：將氣管置于 4℃ 蒸餾水滲透溶解 48 h，然后以 5%NaClO4 浸泡 72 h，置于含 1% 雙抗的 PBS 緩沖液中 4℃ 保存待測。
1.3.2 浸提液細胞毒性實驗
無菌操作下將 A1 組和 B1 組氣管支架組織剪成 2 mm×2 mm 大小。按 10 mL/cm2 表面積加入含 10%FBS 的 DMEM/F12 培養液，37℃ 震蕩 24 h；混懸液以離心半徑 15 cm、500 r/min 離心 10 min，將上清液移至離心管中保存。同時以含 10%FBS 的 DMEM/F12 培養液為陰性對照組（C1 組），以含 50 g/L 苯酚、10%FBS 的 DMEM/F12 培養基為陽性對照組（D1 組）。取第 4 代 BMSCs，達 80% 融合時消化計數；然后將約含 5×103個細胞的細胞懸液（200 μL）接種至 96 孔板中，置于 37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱培養 24 h 后，更換為上述各組浸提液，之后每 48 小時換液。培養 1、3、5、7 d 后，每孔加 MTT 溶液（5 mg/mL，用 PBS 配制，pH7.4）10 μL，利用酶標儀測定各孔 490 nm 處吸光度（A）值，繪制細胞生長曲線。
1.3.3 免疫組織化學染色觀察主要組織相容性復合物（major histocompatibility complex，MHC）類抗原表達
將 A1 組和 B1 組氣管標本行 4 μm 厚冰凍切片，多聚甲醛固定后，正常山羊血清工作液封閉，加一抗（鼠抗兔 MHC-Ⅰ和Ⅱ抗體，稀釋濃度 1∶200）4℃ 過夜，滴加二抗（山羊抗鼠 IgG）后 DAB 顯色，蘇木素復染，二甲苯透明后封片，正置顯微鏡下觀察材料 MHC-Ⅰ和Ⅱ抗原的表達。
1.4 細胞-氣管支架復合物的制備及相關觀測
1.4.1 細胞-氣管支架復合物制備及細胞活性觀察
將 A1 組和 B1 組氣管支架在無菌環境中修剪成 0.5 cm×0.5 cm 大小的片狀組織，然后貼于 24 孔板底中央，氣管外壁朝上；吸走周圍 PBS 液，置于超凈臺中干燥 2 h，向組織片中滴加含 10%FBS 的 DMEM/F12 培養基直至覆蓋組織片，滴加過程避免組織片漂浮。將 24 孔培養板移至細胞培養箱，37℃、5%CO2、飽和濕度下孵育 24 h 后，吸去培養基。取生長狀態良好的第 4 代 BMSCs，達 80% 融合時消化計數，然后將含有 2.5×104個細胞的細胞懸液接種至兩組氣管組織片的外壁上，置于 37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱培養。48 h 后取出行 Giemsa 染色，倒置顯微鏡下觀察，根據細胞生長形態及狀況判斷材料毒性。
1.4.2 掃描電鏡觀察
兩組細胞-氣管支架復合物組織片培養 7、14 d 后取出，2.5% 戊二醛溶液固定 24 h；PBS 漂洗，梯度乙醇脫水，加入乙酸乙酯∶乙醇（1∶1）及純戊酯各 30 min，干燥后噴金，掃描電鏡觀察支架外表面的細胞狀態。
1.5 同種異體動物體內實驗
1.5.1 氣管支架手術埋植
取 6 月齡成年新西蘭兔 10 只，隨機分為 2 組，每組 5 只。以戊巴比妥鈉（3 mg/mL）耳緣靜脈注射麻醉，頸背部備皮切開，游離皮下淺筋膜，分離脊柱一側，形成皮囊。對照組（A2 組）植入新鮮氣管支架，實驗組（B2 組）植入脫細胞氣管支架，隨后常規縫合。術后觀察實驗動物炎性反應、排斥反應和一般健康狀態（包括飲食、體質量、活動等情況）。
1.5.2 血液免疫球蛋白動態分析
術后 5、10、15、20、25、30 d，于耳緣靜脈處采血留取標本，采用 ELISA 法評估受體血清免疫球蛋白 IgM 和 IgG 含量的動態變化。
1.5.3 HE 染色觀察
術后 30 d 空氣栓塞法處死兩組動物，獲取氣管支架材料。室溫下 10% 中性甲醛固定 24 h，梯度乙醇脫水，石蠟包埋切片，二甲苯脫蠟，行常規 HE 染色觀察。
1.6 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；多組間比較采用單因素方差分析；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 氣管支架相關觀測
2.1.1 浸提液細胞毒性實驗
各時間點 D1 組細胞均無成活。與 C1 組比較，雖然 A1 組和 B1 組細胞增殖稍低，但各時間點 3 組間 A 值比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 1。
2.1.2 免疫組織化學染色觀察 MHC 類抗原表達
A1 組氣管支架中，MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ抗原在上皮層、黏膜層及黏膜下層細胞表達呈強陽性，在軟骨膜部表達呈陽性，而在軟骨細胞及細胞外基質結構均呈陰性；而 B1 組氣管支架中，MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ抗原在細胞外基質表達均呈陰性，僅在軟骨細胞核表達呈陽性。見圖 2。
2.2 細胞-氣管支架復合物相關觀測
2.2.1 細胞活性觀察
培養 48 h 后 Giemsa 染色示，A1 組材料周圍的細胞貼壁生長、增殖良好，未見懸浮細胞；B1 組材料周圍的細胞在形態和密度上與 A 組比較無明顯差別。見圖 3。
2.2.2 掃描電鏡觀察
培養 7、14 d，細胞在 A1 組氣管支架材料外壁上貼附良好，呈扁平的圓形、橢圓形，細胞排列緊密，成簇分布；細胞在 B1 組氣管支架材料外壁上呈單片狀生長，形態與 A1 組相似，生長趨勢較 A1 組好。見圖 4。
2.3 同種異體動物體內實驗
2.3.1 大體觀察
所有實驗動物術后 30 d 內表現健康，體質量有所增加；傷口均愈合良好。30 d 時 A2 組氣管支架周圍包繞炎性結締組織，并與受植床粘連，不易剝離；囊狀的新鮮氣管內有大量膿液積聚，破壞了正常氣管的解剖結構。而 B2 組氣管支架周圍包繞的結締組織較薄，無明顯排斥反應跡象；氣管支架表面有新生血管形成。見圖 5。
2.3.2 血液免疫球蛋白動態分析
術后兩組 IgM 及 IgG 表達均逐漸增加，分別于 15 d 和 20 d 達峰值，后逐漸下降，符合體液免疫應答抗體產生的規律。術后各時間點 A2 組 IgM 和 IgG 含量均顯著高于 B2 組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 6。
2.3.3 HE 染色觀察
術后 30 d A2 組支架材料外表面炎性細胞浸潤較多，腺體結構缺失，軟骨組織皆不同程度被破壞；B2 組未見炎性細胞深層滲透或破壞氣管結構，軟骨細胞形態無異常，未見鈣化、排斥等不良反應。見圖 7。
圖1
MTT 法檢測各時間點各組浸提液中細胞活性
Figure1.
The cell activity in the leach liquor in each group at diffe rent time points detected by MTT assay
圖2
免疫組織化學染色觀察兩組氣管支架材料 MHC 類抗原表達（正置顯微鏡×200）
a. A1 組 MHC-Ⅰ抗原表達；b. B1 組 MHC-Ⅰ抗原表達；c. A1 組 MHC-Ⅱ抗原表達；d. B1 組 MHC-Ⅱ抗原表達
Figure2. Expression of MHC antigen in tracheal matrixs in 2 groups by immunohistochemical staining observation (Upright microscope×200)a. Expression of MHC-Ⅰ antigen in group A1; b. Expression of MHC-Ⅰ antigen in group B1; c. Expression of MHC-Ⅱ antigen in group A1; d. Expression of MHC-Ⅱ antigen in group B1
圖3
兩組細胞-氣管支架復合物培養 48 h 后 Giemsa 染色觀察（倒置顯微鏡×100）
a. A1 組；b. B1 組
Figure3. Giemsa staining observation of cell-trachea scaffold complex in 2 groups after cultured for 48 hours (Inverted microscope×100)a. Group A1; b. Group B1
圖4
培養各時間點兩組細胞-氣管支架材料掃描電鏡觀察（×5 000）
a. A1 組培養 7 d；b. A1 組培養 14 d；c. B1 組培養 7 d；d. B1 組培養 14 d
Figure4. Scanning electron microscope observation of cell-trachea scaffold complex in 2 groups after cultured for different time points (×5 000)a. Group A1 at 7 days; b. Group A1 at 14 days; c. Group B1 at 7 days; d. Group B1 at 14 days
圖5
術后 30 d 兩組氣管支架大體觀察
a. A2 組；b. B2 組
Figure5. Macroscopic observation of the tracheal scaffolds at 30 days after operationa. Group A2; b. Group B2
圖6
術后各時間點兩組血液免疫球蛋白動態分析
a. IgM；b. IgG
Figure6. Dynamic analysis of the blood immunoglobulin at each time point after operationa. IgM; b. IgG
圖7
術后 30 d 兩組 HE 染色觀察（×200）
a. A2 組；b. B2 組
Figure7. HE staining observation of 2 groups at 30 days after operation (×200)a. Group A2; b. Group B2
3 討論
細胞外基質是組織工程的重要組成部分，研究證實細胞外基質會影響細胞增殖、遷移、分化，最終促進組織再生和重塑[11-12]。脫細胞基質材料含有天然的細胞外基質成分，不會釋放有毒的可降解產物或引起炎性反應[13]。由于細胞外基質對于組織再生起著至關重要的作用，所以選擇合適的脫細胞方案尤為重要[14]。目前臨床應用的脫氧膽酸鈉聯合酶法對人、豬、鼠氣管分別需要 25、17、5 個循環，才能獲得低免疫原性的脫細胞基質[15]，該方法所需時間長，程序繁瑣，也增加了基質感染的風險[16]。
要成為可應用于臨床的組織工程氣管支架材料，必須能支持種子細胞生長、分化。本實驗將 BMSCs 接種至脫細胞氣管支架外壁上進行體外培養，并觀察細胞的黏附、生長情況。結果顯示，BMSCs 在脫細胞氣管支架外壁上貼附良好，細胞呈扁平的圓形、橢圓形，排列緊密，成簇分布。因此我們推斷 NaClO4 脫細胞基質能為 BMSCs 提供一個良好的黏附界面，同時也能支持細胞的生長。脫細胞使用的 NaClO4 作為一種化學試劑，如果其在支架材料中殘存濃度較高，對接種的細胞或宿主也會造成一定程度影響。本實驗發現脫細胞氣管支架浸提液中的細胞增殖情況與基礎培養液相比，差異無統計學意義，說明支架材料中沒有引起細胞活性降低的成分，提示此材料對細胞無明顯毒性。
眾所周知，同種異體移植后若不使用免疫抑制劑，往往發生排斥反應。同種異體移植排斥反應的細胞學基礎是移植物 MHC-Ⅰ和 MHC-Ⅱ抗原的表達，以激活宿主 CD4+T 細胞和 CTL 細胞。相關研究證明 MHC 類抗原的分布主要集中于黏膜表面的上皮、黏膜下腺和軟骨膜，而不是在軟骨細胞或軟骨基質，表明黏膜、黏膜下腺、軟骨膜是主要引起移植排斥反應的抗原結構[15, 17-19]。細胞外基質通過擴散來營養其中的軟骨細胞，而且由于軟骨細胞的新陳代謝需求低，可以在宿主體內存活[20]。同時，有研究提出軟骨作為一種“免疫豁免”組織，可逐漸被宿主自身的軟骨細胞替代[21]。Delaere 等[22]研究也發現位于軟骨陷窩內的軟骨細胞，由于缺乏直接血管，并且周圍基質中包裹有膠原-蛋白質-多糖的細胞外基質作為物理隔離，從而使軟骨細胞不被宿主的免疫系統識別。基于這些研究結果，我們提出了這種保留軟骨細胞的結構完整、低免疫原性的優化脫細胞方案。與傳統方法相比，該方法處理周期快，且較好地保留了細胞外基質成分，以滿足組織工程重建需求。
研究顯示，軟骨基質內的軟骨細胞在合成和分泌軟骨基質和膠原纖維中發揮重要作用，而且有活性的軟骨細胞對保持氣管基質材料的三維結構也是至關重要的[3, 17-19]。脫細胞的概念是為了減少免疫原性細胞的數量，而不是完全消除所有細胞。我們進行了同種異體埋植實驗，來驗證這種保留軟骨細胞基質材料的免疫原特性，并且術后未使用免疫抑制治療。結果表明本實驗的脫細胞方法制備的基質材料并未引起移植物的排斥反應。
綜上述，本研究中我們通過將細胞-脫細胞氣管支架進行體外培養，初步判斷采用改良 NaClO4 脫細胞法獲得的脫細胞氣管支架具有良好的生物相容性，能夠支持種子細胞的黏附和生長；并且在動物體內埋植實驗中驗證了軟骨細胞的“免疫豁免”特性。該方案簡化了脫細胞過程并節約了成本和時間，為同種異體氣管移植提供了一種新思路。今后需在提高脫細胞材料行體內原位移植的遠期效果方面做出更多改進。
