引用本文： 李奇薇, 李超婧, 王富軍, 胡思寒, 王璐. 多尺度纖維支架的結構調控與性能. 中國修復重建外科雜志, 2019, 33(4): 479-485. doi: 10.7507/1002-1892.201808128 復制
版權信息： ?四川大學華西醫院華西期刊社《中國修復重建外科雜志》版權所有，未經授權不得轉載、改編
設計和制造一種有利于引導細胞生長和組織再生的支架，是組織工程的關鍵內容之一。纖維型支架由于在幾何學、形態形貌學方面具有與天然細胞外基質類似的結構[1-2]，在組織工程領域得到廣泛研究。其中，靜電紡技術是一種常用制備方法，它可以調整直徑、密度、取向等方面，以使支架獲得優異的機械物理性能[3-4]。
在各種生物材料中，人工合成的可降解聚合物，如聚己內酯［poly（ε-caprolactone），PCL］等，具有可調控的力學性能和降解速率，在組織工程領域具有廣泛應用[5]。然而，靜電紡制備的聚合物纖維支架通常呈現疏水性且表面光滑，支架表面缺少細胞的結合位點，限制了細胞在支架上的黏附與生長[6]。有文獻表明，表面微納米尺度的拓撲結構可以起到調控細胞行為的作用[6-9]。因此，在靜電紡聚合物纖維支架中引入不同納米尺度表面形貌，可以模擬天然細胞組織的粗糙度，使其適當地促進細胞生長和增殖[10-12]。因而本研究選用 PCL 作為基材，通過與聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）共同靜電紡制備表面多孔纖維支架；另外采用溶液誘導結晶方式，在 PCL 纖維表面形成不同尺度的串晶結構（shish-kebab，SK）。對這兩種多尺度纖維支架的形貌和結構性能進行表征，比較不同尺度、不同纖維表面形態對細胞增殖行為以及對血液相容性的影響，旨在為更好地模擬天然細胞外基質結構以制備更具應用前景的組織工程支架奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、試劑、儀器
普通級雄性新西蘭大白兔，體質量約 2.5 kg，由上海金山動物實驗中心提供；實驗動物生產許可證批準號：SCXK（滬）2015 0005。
PCL（Sigma 公司，美國）；PVP（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；三氯甲烷、甲醇、冰醋酸、氯化鈣（上海凌峰化學試劑有限公司）；RPMI 培養基（GIBCO 公司，美國）；豬髂動脈內皮細胞（pig iliac artery endothelial cell，PIEC；中國科學院細胞庫）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；上海翊圣生物科技有限公司）。S-4800 場發射掃描電鏡（HITACHI 公司，日本）；DSC4000 差示掃描量熱儀（differential scanning calorimeter，DSC；PerkinElmer 公司，美國）；OCA15EC 接觸角測角儀（Dataphysics 公司，德國）；酶標儀（Thermo 公司，美國）。
1.2 多尺度纖維支架的制備與表征
1.2.1 PCL 表面多孔纖維支架的制備
將質量比分別為 8∶2 和 5∶5 的 PCL 及 PVP 溶于三氯甲烷和甲醇的混合溶劑（體積比為 3∶1）中，制備質量體積比為 12% 的紡絲液進行靜電紡。環境溫度 25℃，濕度 30%；紡絲參數：推注速度 1 mL/h，紡絲電壓 15 kV，針頭至接收裝置的距離為 20 cm。將獲得的 PCL/PVP 纖維支架放入 1 000 mL 去離子水中，24 h 后取出并用去離子水反復沖洗后放入真空干燥箱中干燥。將制得的 PCL 表面多孔纖維支架根據聚合物質量比分別標記為 PCL-P8、PCL-P5。
1.2.2 PCL-SK 纖維支架的制備
根據文獻［13］中的方法進行 SK 纖維支架的制備，主要采用溶液誘導結晶方法獲得 SK 結構。① 首先進行 PCL 靜電紡纖維支架的制備：配置質量體積比為 15% 的 PCL/三氯甲烷/甲醇紡絲液，紡絲電壓選擇 12 kV，其余紡絲參數參考 1.2.1 進行靜電紡。② PCL-SK 纖維支架的制備：首先在 60℃ 條件下將 PCL 溶解在體積比為 75% 的醋酸溶液中，制備質量體積比為 1% 的 PCL/醋酸/水混合溶液，冷卻至室溫后，將 PCL 靜電紡纖維支架浸沒于混合溶液中，分別于誘導結晶 1、5、30、60 min 后取出，并用體積比為 75% 醋酸溶液沖洗 3 次以去除殘余 PCL，結束后將支架置于真空干燥箱中干燥 24 h。將制得的 PCL-SK 纖維支架根據誘導結晶時間分別標記為 PCL-SK1、PCL-SK5、PCL-SK30、PCL-SK60。
1.3 多尺度纖維支架的表征
1.3.1 性能表征
① 掃描電鏡表征：使用場發射掃描電鏡觀察制備的兩種多尺度纖維支架的表面形態。根據圖 1 所示示意圖計算片晶尺寸和周期距離。② 接觸角測試：通過接觸角測角儀檢測 PCL 纖維支架（對照組）及兩種多尺度纖維支架的接觸角，評價支架的表面親水性。③ DSC 檢測：使用 DSC 檢測 PCL 纖維支架（對照組）及兩種多尺度纖維支架的熱學性能，如熔點（Tm）、熔融焓（ΔHm），繪制其熔融曲線，并根據以下公式計算結晶度 Xc：Xc=ΔHm/ΔHm0，其中 ΔHm 為 DSC 熱譜圖測得的熔融焓，ΔHm0 為完全結晶 PCL 的熔融焓（具體為 139.5 J/g）。速度為 10℃/min，溫度為 0～80℃。
圖1
SK 結構示意圖
Figure1.
Schematic of shish-kebab structure
1.3.2 血液相容性
采用溶血和凝血實驗表征 PCL 纖維支架（對照組）及兩種多尺度纖維支架的血液相容性。① 溶血實驗：收集新西蘭大白兔靜脈血，于離心半徑 10 cm、5 000 r/min 離心 5 min 并重復 5 次，取下層沉淀加入 34 mL PBS 液混合均勻后，得到兔紅細胞（rabbit red blood cell，RRBC）。將所有支架裁剪成 100 mm×100 mm 大小，加入 4 mL PBS 和 1 mL RRBC 中，于 37℃ 恒溫搖床中培養 2 h，以單純 1 mL RRBC+4 mL PBS 作為陰性對照，以 1 mL RRBC+4 mL 去離子水為陽性對照。培養結束后同上法離心后取上清液，使用酶標儀檢測 540 nm 波長下的吸光度（A）值，按以下公式計算溶血率：（實驗組 A 值－陰性對照組 A 值）/（陽性對照組 A 值－陰性對照組 A 值）×100%。根據美國材料與試驗協會（ASTM）F756-08 標準評價，溶血率<2% 即認為是非溶血材料。每組 3 個樣品，取均值。
② 凝血實驗：將裁剪后的支架依次加入 25 μL 兔靜脈全血和 20 μL 0.2 mol/L CaCl2 溶液中，于 37℃ 恒溫搖床中培養；分別于培養 5、10、30、60 min 后取出試樣，加入 2 mL 去離子水后繼續培養 5 min。并直接以 25 μL 全血加 2 mL 去離子水作為對照組。培養結束后，取上清液，用酶標儀測量 540 nm 波長下的 A 值，按以下公式計算凝血指數（blood clotting index，BCI）：實驗組 A 值/對照組 A 值×100%。BCI 越大代表材料凝血性能越差。每組 3 個樣品，取均值。
1.3.3 生物相容性
采用 CCK-8 法檢測 PIEC 在多尺度纖維支架上的增殖情況，評價支架的生物相容性。取 PIEC 采用完全培養基（含 10%FBS、1% 雙抗、1% 丙酮酸鈉的 RPMI 培養基）培養，以 2×104 個/mL 密度接種于滅菌的裁剪成直徑為 14 mm 的圓形支架上，于 37℃、5%CO2 培養箱中培養，每隔 2 d 換液 1 次。培養 1、7 d 時取出支架，加入含 10%CCK-8 工作液的培養基培養 3 h，用酶標儀于波長 450 nm 下檢測 A 值。
1.4 統計學方法
采用 SPSS22.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 多尺度纖維支架的性能表征
2.1.1 掃描電鏡表征
掃描電鏡觀察顯示成功制備出了表面多孔纖維支架和 SK 纖維支架，所有支架平均直徑保持在 700 nm 左右，保證了纖維直徑一致性。在 PCL-P8 和 PCL-P5 纖維表面出現了多孔形貌，隨著 PVP 含量的增加，PCL-P5 較 PCL-P8 的孔洞形狀更為細長，且粗糙度進一步增加。在 PCL-SK1 纖維表面僅出現少量點狀晶體，并且無明顯周期性，因而未能形成完整的 SK 結構，后續將不再進行測試；當結晶時間在 5 min 及以上時，形成了較為完整的片晶結構，且周期性地排布于纖維表面。見圖 2。進一步計算片晶尺寸與周期距離發現，隨著結晶時間的增加，片晶不斷生長，片晶尺寸與周期距離均逐漸增加，形成了類似膠原纖維的粗糙表面。見表 1。
表1
PCL-SK 纖維支架的片晶尺寸與周期距離（n=50，nm，
）
Table1.
Kebab size and periodic distance of PCL-SK fibrous scaffolds (n=50, nm, 
)
圖2
場發射掃描電鏡觀察多尺度纖維支架形貌
a. PCL-P8（×15 k）；b. PCL-P5（×15 k）；c. PCL-SK1（×10 k）；d. PCL-SK5（×10 k）；e. PCL-SK30（×10 k）；f. PCL-SK60（×10 k）
Figure2. Field emission scanning electron microscope observation of fiber surfaces of hierarchically structured fibrous scaffoldsa. PCL-P8 (×15 k); b. PCL-P5 (×15 k); c. PCL-SK1 (×10 k); d. PCL-SK5 (×10 k); e. PCL-SK30 (×10 k); f. PCL-SK60 (×10 k)
2.1.2 接觸角測試
所有支架表面接觸角均在 130° 以上，呈現較高的疏水性。進一步分析發現，各 PCL-SK 纖維支架接觸角均顯著高于 PCL 纖維支架和 PCL 表面多孔纖維支架，差異有統計學意義（P<0.05），且隨片晶尺寸增加而增加；而 PCL-P5、PCL-P8 表面多孔纖維支架的接觸角與 PCL 纖維支架的接觸角比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 3。
圖3
多尺度纖維結構支架的接觸角測試
Figure3.
Water contact angles of hierarchically structured fibrous scaffolds
2.1.3 DSC 檢測
通過多尺度纖維結構支架的 DSC 熔融曲線分析發現，各 PCL-SK 纖維支架的 Tm 均高于 PCL 表面多孔纖維支架和 PCL 纖維支架，PCL 表面多孔纖維支架 Tm 高于 PCL 纖維支架，差異均有統計學意義（P<0.05）。各 PCL-SK 纖維支架和 PCL 表面多孔纖維支架的 Xc 均顯著高于 PCL 纖維支架，差異有統計學意義（P<0.05）。其中 PCL-P5 的的 Tm 和 Xc 小于 PCL-P8，差異有統計學意義（P<0.05）。隨著片晶尺寸的增加，PCL-SK 纖維支架的 Tm 和 Xc 均進一步增大，比較差異有統計學意義（P<0.05）。見表 2，圖 4。
表2
多尺度纖維結構支架 DSC 檢測結果（n=3，
）
Table2.
DSC tests of hierarchically structured fibrous scaffolds (n=3, 
)
圖4
多尺度纖維結構支架的 DSC 熔融曲線
Figure4.
DSC curve of hierarchically structured fibrous scaffolds
2.2 多尺度纖維支架的血液相容性
2.2.1 溶血實驗
PCL、PCL-P5、PCL-SK5、PCL-SK30、PCL-SK60 的溶血率分別為 0.06%±0.00%、0.95%±0.13%、0.98%±0.02%、1.04%±0.07%、0.64%±0.03%。SK 結構和表面多孔纖維支架的溶血率均高于 PCL 纖維支架。根據 ASTM F756-08 標準評價，所有支架溶血率均<2%，均為非溶血材料，因此制備的多尺度纖維結構支架可適用于血液接觸型材料。
2.2.2 凝血實驗
各支架的 BCI 隨時間增加逐漸減小，在 30 min 后基本維持不變；培養 5、10 min 時，SK 結構和表面多孔支架的 BCI 均高于 PCL 纖維支架，PCL-SK5 和 PCL-SK30 的 BCI 顯著高于其他支架，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 5。
圖5
多尺度纖維結構支架的 BCI 比較
Figure5.
Comparison of the BCI of hierarchically structured fib rous scaffolds
2.3 多尺度纖維結構支架的生物相容性
CCK-8 法檢測示，培養 1 d 時 PCL 表面多孔纖維支架的 A 值顯著高于 PCL 纖維支架和各 PCL-SK 纖維支架，而各 PCL-SK 纖維支架顯著低于 PCL 纖維支架，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。但 7 d 時除 PCL-SK60 外，其余 PCL-SK 纖維支架和 PCL 表面多孔纖維支架 A 值均顯著高于 PCL 纖維支架，差異有統計學意義（P<0.05）。SK 結構纖維支架中，隨結晶時間增加，A 值有下降趨勢，各支架間比較差異有統計學意義（P<0.05）；而表面多孔纖維支架中，PCL-P5 的 A 值高于 PCL-P8，差異有統計學意義（P<0.05）。 見表 3。
表3
CCK-8 法檢測各支架培養 1、7 d 時細胞增殖 A 值（n=3，
）
Table3.
The A value of proliferation of PIEC on scaffolds after culturing for 1 day and 7 days determined by CCK-8 method (n=3, 
)
3 討論
靜電紡纖維支架具有高比表面積、高縱橫比和高微孔性，從而具有增強細胞黏附、生長和分化的潛能[2, 14-15]，通過引入不同表面結構使得支架更具有模擬細胞外基質中膠原的粗糙纖維結構[16]。因此，構建不同形貌的多尺度纖維支架不僅可以調控支架的表面物理化學性能，同時還將對細胞行為產生重要影響。
本研究利用共混物相分離的原理制備 PCL/PVP 雙組分纖維從而制備出 PCL 表面多孔纖維，以及采取 75% 醋酸溶液作為 PCL 的不良溶劑，使用溶液誘導結晶方式制備了不同尺度片晶的 SK 纖維。支架的物理性能測試結果表明，與表面光滑的 PCL 纖維支架相比，PCL-SK 和 PCL 表面多孔結構纖維支架的疏水性和結晶性能均有不同程度增加。PCL-SK 纖維支架由于在表面引入了二級納米結構使得表面粗糙度增加，能夠束縛更多空氣分子，因而使得接觸角比單純 PCL 纖維支架顯著增大；而 PCL 表面多孔纖維支架雖然粗糙度也有所增大，但其接觸角與 PCL 纖維支架無顯著性差異，這可能是由于增加的粗糙度不足以改變支架表面的疏水性。但已有文獻證明，通過非溶劑相分離原理制備的多孔左旋聚乳酸纖維由于粗糙度的增加，確實提高了纖維表面的疏水性[17]。此外，DSC 測試結果顯示 SK 結構的熔融峰形狀發生了變化，不僅變寬而且出現了雙峰現象，而熔融峰的形狀與材料的結晶度和晶型有關，較高的結晶度、更有序的晶型通常具有高而尖銳的熔融峰，因此我們推測 PCL-SK 纖維支架的雙峰現象可能是不同完整度的結晶區造成的結果。PCL 纖維在靜電紡過程中受到電場的牽伸力，形成高度延伸的 PCL 大分子鏈，這些高度延伸的大分子鏈便形成了完善程度更高的結晶，因而具有比 PCL 纖維表面附生的 PCL 片晶更高的 Tm；而隨著片晶尺寸的增大，片晶的完整性進一步增強，從而使得支架的 Tm 提高，Xc 也隨之增加，其他文獻[12]也得出了類似結果。而表面多孔纖維支架中 PCL-P5 的 Xc 小于 PCL-P8，這主要是由于共混體系中，PVP 相處于 PCL 相的非結晶區，當 PVP 去除后 Xc 相對有所增加；但隨著 PVP 含量的進一步增加，無定形的 PVP 大分子在 PCL 相中起到了空間位阻的作用，而影響 PCL 大分子鏈的緊密堆積，使得 PCL 晶體成型和生長減少，從而 Xc 有所下降。
支架的物理性能如粗糙度和疏水性的改變，會對支架的細胞和血液相容性產生影響。有研究表明，紅細胞的細胞膜由外部的糖萼以及磷脂雙分子層構成，糖萼不僅富含碳水化合物，還為表面提供負電荷，脂質雙分子層上含有許多跨膜蛋白且多呈現疏水性，因此靜電作用、親疏水性以及和膜蛋白的相互作用是影響聚合物和紅細胞相互作用的因素[18]。多尺度纖維結構支架的疏水性增加，聚合物可能接觸到細胞膜而破壞了脂質雙分子層的完整性，導致血紅蛋白的釋放及發生溶血，因此本研究得出其溶血率較 PCL 纖維支架增加。此外，短時間內支架和血液接觸時，更高的疏水性使得支架不能完全接觸血液，從而會使得凝血指數偏高。而表面粗糙度的增加，可以吸附更多蛋白質從而黏附更多細胞，進一步促進了細胞增殖[19-21]。Zamani 等[22]研究表明，表面具有多孔結構的聚乳酸-羥基乙酸共聚物［poly（lactide-co-glycolide），PLGA］纖維支架相比于表面光滑的 PLGA 支架，更能提高神經細胞的生長速率。本研究通過在支架上 PIEC 的培養發現，多尺度纖維支架相比于表面光滑的 PCL 纖維支架更有利于細胞的增殖，且細胞對不同表面、不同尺度具有不同的響應。第 1 天時由于細胞培養時間短且存在實驗誤差，PCL-SK 纖維支架的 A 值較低，且不同片晶尺寸支架間無明顯規律性；而表面多孔支架的 A 值顯著高于 PCL-SK 纖維支架和 PCL 纖維支架，說明短時間內表面多孔纖維支架有利于細胞生長；隨著時間增加，PCL-SK 纖維支架尤其是片晶尺寸為 100 nm 的 PCL-SK5 支架的 A 值高于其他支架。因此，PCL-SK5 支架相比于 PCL 表面多孔纖維支架更有利于 PIEC 的增殖。因而這兩種不同表面的多尺度纖維結構支架在組織工程領域具有良好的應用潛能。
設計和制造一種有利于引導細胞生長和組織再生的支架，是組織工程的關鍵內容之一。纖維型支架由于在幾何學、形態形貌學方面具有與天然細胞外基質類似的結構[1-2]，在組織工程領域得到廣泛研究。其中，靜電紡技術是一種常用制備方法，它可以調整直徑、密度、取向等方面，以使支架獲得優異的機械物理性能[3-4]。
在各種生物材料中，人工合成的可降解聚合物，如聚己內酯［poly（ε-caprolactone），PCL］等，具有可調控的力學性能和降解速率，在組織工程領域具有廣泛應用[5]。然而，靜電紡制備的聚合物纖維支架通常呈現疏水性且表面光滑，支架表面缺少細胞的結合位點，限制了細胞在支架上的黏附與生長[6]。有文獻表明，表面微納米尺度的拓撲結構可以起到調控細胞行為的作用[6-9]。因此，在靜電紡聚合物纖維支架中引入不同納米尺度表面形貌，可以模擬天然細胞組織的粗糙度，使其適當地促進細胞生長和增殖[10-12]。因而本研究選用 PCL 作為基材，通過與聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）共同靜電紡制備表面多孔纖維支架；另外采用溶液誘導結晶方式，在 PCL 纖維表面形成不同尺度的串晶結構（shish-kebab，SK）。對這兩種多尺度纖維支架的形貌和結構性能進行表征，比較不同尺度、不同纖維表面形態對細胞增殖行為以及對血液相容性的影響，旨在為更好地模擬天然細胞外基質結構以制備更具應用前景的組織工程支架奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、試劑、儀器
普通級雄性新西蘭大白兔，體質量約 2.5 kg，由上海金山動物實驗中心提供；實驗動物生產許可證批準號：SCXK（滬）2015 0005。
PCL（Sigma 公司，美國）；PVP（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；三氯甲烷、甲醇、冰醋酸、氯化鈣（上海凌峰化學試劑有限公司）；RPMI 培養基（GIBCO 公司，美國）；豬髂動脈內皮細胞（pig iliac artery endothelial cell，PIEC；中國科學院細胞庫）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；上海翊圣生物科技有限公司）。S-4800 場發射掃描電鏡（HITACHI 公司，日本）；DSC4000 差示掃描量熱儀（differential scanning calorimeter，DSC；PerkinElmer 公司，美國）；OCA15EC 接觸角測角儀（Dataphysics 公司，德國）；酶標儀（Thermo 公司，美國）。
1.2 多尺度纖維支架的制備與表征
1.2.1 PCL 表面多孔纖維支架的制備
將質量比分別為 8∶2 和 5∶5 的 PCL 及 PVP 溶于三氯甲烷和甲醇的混合溶劑（體積比為 3∶1）中，制備質量體積比為 12% 的紡絲液進行靜電紡。環境溫度 25℃，濕度 30%；紡絲參數：推注速度 1 mL/h，紡絲電壓 15 kV，針頭至接收裝置的距離為 20 cm。將獲得的 PCL/PVP 纖維支架放入 1 000 mL 去離子水中，24 h 后取出并用去離子水反復沖洗后放入真空干燥箱中干燥。將制得的 PCL 表面多孔纖維支架根據聚合物質量比分別標記為 PCL-P8、PCL-P5。
1.2.2 PCL-SK 纖維支架的制備
根據文獻［13］中的方法進行 SK 纖維支架的制備，主要采用溶液誘導結晶方法獲得 SK 結構。① 首先進行 PCL 靜電紡纖維支架的制備：配置質量體積比為 15% 的 PCL/三氯甲烷/甲醇紡絲液，紡絲電壓選擇 12 kV，其余紡絲參數參考 1.2.1 進行靜電紡。② PCL-SK 纖維支架的制備：首先在 60℃ 條件下將 PCL 溶解在體積比為 75% 的醋酸溶液中，制備質量體積比為 1% 的 PCL/醋酸/水混合溶液，冷卻至室溫后，將 PCL 靜電紡纖維支架浸沒于混合溶液中，分別于誘導結晶 1、5、30、60 min 后取出，并用體積比為 75% 醋酸溶液沖洗 3 次以去除殘余 PCL，結束后將支架置于真空干燥箱中干燥 24 h。將制得的 PCL-SK 纖維支架根據誘導結晶時間分別標記為 PCL-SK1、PCL-SK5、PCL-SK30、PCL-SK60。
1.3 多尺度纖維支架的表征
1.3.1 性能表征
① 掃描電鏡表征：使用場發射掃描電鏡觀察制備的兩種多尺度纖維支架的表面形態。根據圖 1 所示示意圖計算片晶尺寸和周期距離。② 接觸角測試：通過接觸角測角儀檢測 PCL 纖維支架（對照組）及兩種多尺度纖維支架的接觸角，評價支架的表面親水性。③ DSC 檢測：使用 DSC 檢測 PCL 纖維支架（對照組）及兩種多尺度纖維支架的熱學性能，如熔點（Tm）、熔融焓（ΔHm），繪制其熔融曲線，并根據以下公式計算結晶度 Xc：Xc=ΔHm/ΔHm0，其中 ΔHm 為 DSC 熱譜圖測得的熔融焓，ΔHm0 為完全結晶 PCL 的熔融焓（具體為 139.5 J/g）。速度為 10℃/min，溫度為 0～80℃。
圖1
SK 結構示意圖
Figure1.
Schematic of shish-kebab structure
1.3.2 血液相容性
采用溶血和凝血實驗表征 PCL 纖維支架（對照組）及兩種多尺度纖維支架的血液相容性。① 溶血實驗：收集新西蘭大白兔靜脈血，于離心半徑 10 cm、5 000 r/min 離心 5 min 并重復 5 次，取下層沉淀加入 34 mL PBS 液混合均勻后，得到兔紅細胞（rabbit red blood cell，RRBC）。將所有支架裁剪成 100 mm×100 mm 大小，加入 4 mL PBS 和 1 mL RRBC 中，于 37℃ 恒溫搖床中培養 2 h，以單純 1 mL RRBC+4 mL PBS 作為陰性對照，以 1 mL RRBC+4 mL 去離子水為陽性對照。培養結束后同上法離心后取上清液，使用酶標儀檢測 540 nm 波長下的吸光度（A）值，按以下公式計算溶血率：（實驗組 A 值－陰性對照組 A 值）/（陽性對照組 A 值－陰性對照組 A 值）×100%。根據美國材料與試驗協會（ASTM）F756-08 標準評價，溶血率<2% 即認為是非溶血材料。每組 3 個樣品，取均值。
② 凝血實驗：將裁剪后的支架依次加入 25 μL 兔靜脈全血和 20 μL 0.2 mol/L CaCl2 溶液中，于 37℃ 恒溫搖床中培養；分別于培養 5、10、30、60 min 后取出試樣，加入 2 mL 去離子水后繼續培養 5 min。并直接以 25 μL 全血加 2 mL 去離子水作為對照組。培養結束后，取上清液，用酶標儀測量 540 nm 波長下的 A 值，按以下公式計算凝血指數（blood clotting index，BCI）：實驗組 A 值/對照組 A 值×100%。BCI 越大代表材料凝血性能越差。每組 3 個樣品，取均值。
1.3.3 生物相容性
采用 CCK-8 法檢測 PIEC 在多尺度纖維支架上的增殖情況，評價支架的生物相容性。取 PIEC 采用完全培養基（含 10%FBS、1% 雙抗、1% 丙酮酸鈉的 RPMI 培養基）培養，以 2×104 個/mL 密度接種于滅菌的裁剪成直徑為 14 mm 的圓形支架上，于 37℃、5%CO2 培養箱中培養，每隔 2 d 換液 1 次。培養 1、7 d 時取出支架，加入含 10%CCK-8 工作液的培養基培養 3 h，用酶標儀于波長 450 nm 下檢測 A 值。
1.4 統計學方法
采用 SPSS22.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 多尺度纖維支架的性能表征
2.1.1 掃描電鏡表征
掃描電鏡觀察顯示成功制備出了表面多孔纖維支架和 SK 纖維支架，所有支架平均直徑保持在 700 nm 左右，保證了纖維直徑一致性。在 PCL-P8 和 PCL-P5 纖維表面出現了多孔形貌，隨著 PVP 含量的增加，PCL-P5 較 PCL-P8 的孔洞形狀更為細長，且粗糙度進一步增加。在 PCL-SK1 纖維表面僅出現少量點狀晶體，并且無明顯周期性，因而未能形成完整的 SK 結構，后續將不再進行測試；當結晶時間在 5 min 及以上時，形成了較為完整的片晶結構，且周期性地排布于纖維表面。見圖 2。進一步計算片晶尺寸與周期距離發現，隨著結晶時間的增加，片晶不斷生長，片晶尺寸與周期距離均逐漸增加，形成了類似膠原纖維的粗糙表面。見表 1。
表1
PCL-SK 纖維支架的片晶尺寸與周期距離（n=50，nm，）
Table1.
Kebab size and periodic distance of PCL-SK fibrous scaffolds (n=50, nm, )
圖2
場發射掃描電鏡觀察多尺度纖維支架形貌
a. PCL-P8（×15 k）；b. PCL-P5（×15 k）；c. PCL-SK1（×10 k）；d. PCL-SK5（×10 k）；e. PCL-SK30（×10 k）；f. PCL-SK60（×10 k）
Figure2. Field emission scanning electron microscope observation of fiber surfaces of hierarchically structured fibrous scaffoldsa. PCL-P8 (×15 k); b. PCL-P5 (×15 k); c. PCL-SK1 (×10 k); d. PCL-SK5 (×10 k); e. PCL-SK30 (×10 k); f. PCL-SK60 (×10 k)
2.1.2 接觸角測試
所有支架表面接觸角均在 130° 以上，呈現較高的疏水性。進一步分析發現，各 PCL-SK 纖維支架接觸角均顯著高于 PCL 纖維支架和 PCL 表面多孔纖維支架，差異有統計學意義（P<0.05），且隨片晶尺寸增加而增加；而 PCL-P5、PCL-P8 表面多孔纖維支架的接觸角與 PCL 纖維支架的接觸角比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 3。
圖3
多尺度纖維結構支架的接觸角測試
Figure3.
Water contact angles of hierarchically structured fibrous scaffolds
2.1.3 DSC 檢測
通過多尺度纖維結構支架的 DSC 熔融曲線分析發現，各 PCL-SK 纖維支架的 Tm 均高于 PCL 表面多孔纖維支架和 PCL 纖維支架，PCL 表面多孔纖維支架 Tm 高于 PCL 纖維支架，差異均有統計學意義（P<0.05）。各 PCL-SK 纖維支架和 PCL 表面多孔纖維支架的 Xc 均顯著高于 PCL 纖維支架，差異有統計學意義（P<0.05）。其中 PCL-P5 的的 Tm 和 Xc 小于 PCL-P8，差異有統計學意義（P<0.05）。隨著片晶尺寸的增加，PCL-SK 纖維支架的 Tm 和 Xc 均進一步增大，比較差異有統計學意義（P<0.05）。見表 2，圖 4。
表2
多尺度纖維結構支架 DSC 檢測結果（n=3，）
Table2.
DSC tests of hierarchically structured fibrous scaffolds (n=3, )
圖4
多尺度纖維結構支架的 DSC 熔融曲線
Figure4.
DSC curve of hierarchically structured fibrous scaffolds
2.2 多尺度纖維支架的血液相容性
2.2.1 溶血實驗
PCL、PCL-P5、PCL-SK5、PCL-SK30、PCL-SK60 的溶血率分別為 0.06%±0.00%、0.95%±0.13%、0.98%±0.02%、1.04%±0.07%、0.64%±0.03%。SK 結構和表面多孔纖維支架的溶血率均高于 PCL 纖維支架。根據 ASTM F756-08 標準評價，所有支架溶血率均<2%，均為非溶血材料，因此制備的多尺度纖維結構支架可適用于血液接觸型材料。
2.2.2 凝血實驗
各支架的 BCI 隨時間增加逐漸減小，在 30 min 后基本維持不變；培養 5、10 min 時，SK 結構和表面多孔支架的 BCI 均高于 PCL 纖維支架，PCL-SK5 和 PCL-SK30 的 BCI 顯著高于其他支架，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 5。
圖5
多尺度纖維結構支架的 BCI 比較
Figure5.
Comparison of the BCI of hierarchically structured fib rous scaffolds
2.3 多尺度纖維結構支架的生物相容性
CCK-8 法檢測示，培養 1 d 時 PCL 表面多孔纖維支架的 A 值顯著高于 PCL 纖維支架和各 PCL-SK 纖維支架，而各 PCL-SK 纖維支架顯著低于 PCL 纖維支架，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。但 7 d 時除 PCL-SK60 外，其余 PCL-SK 纖維支架和 PCL 表面多孔纖維支架 A 值均顯著高于 PCL 纖維支架，差異有統計學意義（P<0.05）。SK 結構纖維支架中，隨結晶時間增加，A 值有下降趨勢，各支架間比較差異有統計學意義（P<0.05）；而表面多孔纖維支架中，PCL-P5 的 A 值高于 PCL-P8，差異有統計學意義（P<0.05）。 見表 3。
表3
CCK-8 法檢測各支架培養 1、7 d 時細胞增殖 A 值（n=3，）
Table3.
The A value of proliferation of PIEC on scaffolds after culturing for 1 day and 7 days determined by CCK-8 method (n=3, )
3 討論
靜電紡纖維支架具有高比表面積、高縱橫比和高微孔性，從而具有增強細胞黏附、生長和分化的潛能[2, 14-15]，通過引入不同表面結構使得支架更具有模擬細胞外基質中膠原的粗糙纖維結構[16]。因此，構建不同形貌的多尺度纖維支架不僅可以調控支架的表面物理化學性能，同時還將對細胞行為產生重要影響。
本研究利用共混物相分離的原理制備 PCL/PVP 雙組分纖維從而制備出 PCL 表面多孔纖維，以及采取 75% 醋酸溶液作為 PCL 的不良溶劑，使用溶液誘導結晶方式制備了不同尺度片晶的 SK 纖維。支架的物理性能測試結果表明，與表面光滑的 PCL 纖維支架相比，PCL-SK 和 PCL 表面多孔結構纖維支架的疏水性和結晶性能均有不同程度增加。PCL-SK 纖維支架由于在表面引入了二級納米結構使得表面粗糙度增加，能夠束縛更多空氣分子，因而使得接觸角比單純 PCL 纖維支架顯著增大；而 PCL 表面多孔纖維支架雖然粗糙度也有所增大，但其接觸角與 PCL 纖維支架無顯著性差異，這可能是由于增加的粗糙度不足以改變支架表面的疏水性。但已有文獻證明，通過非溶劑相分離原理制備的多孔左旋聚乳酸纖維由于粗糙度的增加，確實提高了纖維表面的疏水性[17]。此外，DSC 測試結果顯示 SK 結構的熔融峰形狀發生了變化，不僅變寬而且出現了雙峰現象，而熔融峰的形狀與材料的結晶度和晶型有關，較高的結晶度、更有序的晶型通常具有高而尖銳的熔融峰，因此我們推測 PCL-SK 纖維支架的雙峰現象可能是不同完整度的結晶區造成的結果。PCL 纖維在靜電紡過程中受到電場的牽伸力，形成高度延伸的 PCL 大分子鏈，這些高度延伸的大分子鏈便形成了完善程度更高的結晶，因而具有比 PCL 纖維表面附生的 PCL 片晶更高的 Tm；而隨著片晶尺寸的增大，片晶的完整性進一步增強，從而使得支架的 Tm 提高，Xc 也隨之增加，其他文獻[12]也得出了類似結果。而表面多孔纖維支架中 PCL-P5 的 Xc 小于 PCL-P8，這主要是由于共混體系中，PVP 相處于 PCL 相的非結晶區，當 PVP 去除后 Xc 相對有所增加；但隨著 PVP 含量的進一步增加，無定形的 PVP 大分子在 PCL 相中起到了空間位阻的作用，而影響 PCL 大分子鏈的緊密堆積，使得 PCL 晶體成型和生長減少，從而 Xc 有所下降。
支架的物理性能如粗糙度和疏水性的改變，會對支架的細胞和血液相容性產生影響。有研究表明，紅細胞的細胞膜由外部的糖萼以及磷脂雙分子層構成，糖萼不僅富含碳水化合物，還為表面提供負電荷，脂質雙分子層上含有許多跨膜蛋白且多呈現疏水性，因此靜電作用、親疏水性以及和膜蛋白的相互作用是影響聚合物和紅細胞相互作用的因素[18]。多尺度纖維結構支架的疏水性增加，聚合物可能接觸到細胞膜而破壞了脂質雙分子層的完整性，導致血紅蛋白的釋放及發生溶血，因此本研究得出其溶血率較 PCL 纖維支架增加。此外，短時間內支架和血液接觸時，更高的疏水性使得支架不能完全接觸血液，從而會使得凝血指數偏高。而表面粗糙度的增加，可以吸附更多蛋白質從而黏附更多細胞，進一步促進了細胞增殖[19-21]。Zamani 等[22]研究表明，表面具有多孔結構的聚乳酸-羥基乙酸共聚物［poly（lactide-co-glycolide），PLGA］纖維支架相比于表面光滑的 PLGA 支架，更能提高神經細胞的生長速率。本研究通過在支架上 PIEC 的培養發現，多尺度纖維支架相比于表面光滑的 PCL 纖維支架更有利于細胞的增殖，且細胞對不同表面、不同尺度具有不同的響應。第 1 天時由于細胞培養時間短且存在實驗誤差，PCL-SK 纖維支架的 A 值較低，且不同片晶尺寸支架間無明顯規律性；而表面多孔支架的 A 值顯著高于 PCL-SK 纖維支架和 PCL 纖維支架，說明短時間內表面多孔纖維支架有利于細胞生長；隨著時間增加，PCL-SK 纖維支架尤其是片晶尺寸為 100 nm 的 PCL-SK5 支架的 A 值高于其他支架。因此，PCL-SK5 支架相比于 PCL 表面多孔纖維支架更有利于 PIEC 的增殖。因而這兩種不同表面的多尺度纖維結構支架在組織工程領域具有良好的應用潛能。
