引用本文： 李晶瑩, 朱斌, 張玉勤, 孟增東. 多孔氧化鋅/羥基磷灰石復合材料的體內生物安全性研究. 中國修復重建外科雜志, 2021, 35(7): 847-854. doi: 10.7507/1002-1892.202101123 復制
版權信息： ?四川大學華西醫院華西期刊社《中國修復重建外科雜志》版權所有，未經授權不得轉載、改編
由于創傷、感染、腫瘤等原因導致的骨缺損越來越多，目前主要采用自體骨、同種異體骨和異種骨移植修復。其中，自體骨骨源不足且存在供骨區并發癥，同種異體骨和異種骨存在免疫排斥反應以及傳播疾病風險[1-2]。因此，需要研發能促進受損骨組織修復或再生的人工骨修復材料。
羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）是天然骨組織主要無機成分，具有優良的生物相容性及骨傳導性，并且能直接與周圍硬組織化學鍵合，增加骨骼附著力，是人工骨修復材料的理想基體材料之一[3]。但是，HA 作為骨修復材料仍然存在以下問題[4-7]：① 孔隙結構、活性成分與天然骨相比存在差異；② 植入體內后降解緩慢；③ 機械強度低。上述問題導致 HA 在臨床應用中出現植骨延遲愈合或不愈合、降解與成骨速率不匹配、材料碎裂變形等現象，影響修復效果。采用新制備技術和添加具有促進成骨誘導的可降解活性元素是解決上述問題重要途徑之一。
鋅（Zn）作為天然骨中維持骨骼健康的重要元素之一，在促進骨形成和礦化方面起著重要作用。它通過促進成骨細胞和軟骨細胞分化，同時抑制破骨細胞分化和吸收，從而促進骨生長[8]。氧化鋅（ZnO）作為 Zn 的氧化物，不僅比 Zn 元素更穩定，而且具有良好的生物活性，少量 ZnO 即可促進細胞增殖和分化、組織再生、血管生成和骨整合[9]。本課題組在前期研究中將納米 ZnO 作為活性添加相、HA 作為基體相、碳酸氫銨（NH4HCO3）作為造孔劑，利用放電等離子燒結技術制備了多孔 ZnO/HA 復合材料，經檢測該復合材料以 HA 相和 ZnO 相為主，無其他雜質，抗壓強度>148 MPa，彈性模量約 6.5 GPa，并且體外浸泡實驗結果表明其具有良好的成骨礦化能力[10]。在此基礎上，本次研究采用急性全身毒性實驗和兔橈骨缺損模型，進一步觀察多孔 ZnO/HA 復合材料的體內生物安全性和骨修復能力。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
5 周齡清潔級雄性昆明種小鼠 15 只，體質量 18～22 g；成年雄性新西蘭大白兔 18 只，體質量約 3 kg；由昆明醫科大學動物房提供。
納米 HA，純度≥99.7%，平均粒徑≤100 nm；納米 ZnO，純度≥99.9%，粒徑為（50±10）nm；醫用級 NH4HCO3；均由上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供。多聚甲醛（天津市光復科技發展有限公司）；紅細胞裂解液（BD 公司，美國）。
電感耦合等離子體發射光譜儀（Perkin Elmer 公司，美國）；放電等離子燒結系統（SYNTEX 公司，日本）；萬能試驗機（濟南中正試驗機制造有限公司）；Quanta-200 型場發射掃描電鏡（FEI 公司，美國）；石蠟包埋機、石蠟切片機（Leica 公司，德國）；流式細胞儀（杭州艾森生物有限公司）；全自動生化分析儀（Roche 公司，德國）；X 線機（Simens 公司，德國）。
1.2 材料制備及觀測
1.2.1 材料制備
① 制備多孔 ZnO/HA 復合材料：按納米 ZnO 質量分數為 1.3wt%、納米 HA 質量分數為 98.7wt%，稱取粉末[11]；經球磨、烘干后得到 ZnO/HA 復合粉末；將復合粉末與造孔劑 NH4HCO3 按照質量比 2∶1 混合后，均勻裝入模具中，用萬能試驗機壓制，退模后即可得到長方體狀坯體；將坯體放入石墨模具中，在放電等離子燒結系統中進行快速燒結成型，抽真空至 2～10 Pa，不施加壓力，先加熱至 700℃（升溫速率 100℃/min），再升溫至 950℃（升溫速率 50℃/min），保溫 5 min 后隨爐冷卻至室溫，獲得多孔 ZnO/HA 復合材料。② 制備多孔 HA 材料：將納米 HA 粉末與造孔劑 NH4HCO3 按照質量比 2∶1 混合，制備方法與多孔 ZnO/HA 復合材料一致，獲得多孔 HA 材料。
1.2.2 材料表征
① 掃描電鏡觀察：將制備的兩種材料用導電膠固定于載物臺上，表面噴金，掃描電鏡觀察表面形貌和孔隙結構。
② 材料降解率測定：稱取兩種材料并記錄原始質量；置于 37℃ 模擬人工體液（stimulated body fluid，SBF），每隔 7 d 取出 1 次，取出后用去離子水沖洗，干燥后稱重，周期 49 d。按照以下公式計算各時間點材料降解率，降解率=（原始質量?各時間點質量）/原始質量×100%，根據各時間點降解率繪制材料降解曲線。實驗重復 3 次。
③ 復合材料溶出 Zn2+ 濃度測定：37℃ 恒溫下，將多孔 ZnO/HA 復合材料置于 50 mL SBF 浸泡 15 d，分別在 1、3、5、7、15 d 取 5 mL 浸泡液，利用電感耦合等離子體發射光譜儀測定浸泡液中 Zn2+ 濃度，根據各時間點 Zn2+ 濃度繪制多孔 ZnO/HA 復合材料的 Zn2+ 溶出曲線。每次取出浸泡液后均用新鮮 SBF 補充至 50 mL。實驗重復 3 次。
1.2.3 急性全身毒性實驗
① 材料浸提液制備：按照 GB/T16886.12-2017 中第 12 部分方法[12]，按照0.2 g/mL 浸提比例，將制備的兩種材料分別置于生理鹽水，于（37±1）℃ 條件下浸提 72 h，獲得浸提液。采用電感耦合等離子體發射光譜儀測量多孔 ZnO/HA 復合材料浸提液中 Zn2+ 及 Ca2+ 含量。
② 實驗分組及方法：按照 GB/T16886.11-2011 中第 11 部分方法[12]，將 15 只小鼠隨機分為 A、B、C 3 組（n=5），按照 50 mL/kg 劑量分別腹腔注射生理鹽水（陰性對照）、多孔 HA 材料浸提液、多孔 ZnO/HA 復合材料浸提液。
③ 觀測指標：記錄注射前和注射后 24、48、72 h 各組小鼠體質量變化以及呼吸、運動、排泄等一般情況。注射后 72 h 脫頸處死各組小鼠，取肝、腎組織，置于多聚甲醛固定、脫水、包埋并連續切片（片厚 5 μm），常規 HE 染色后光鏡下觀察。
1.3 動物體內植入實驗
1.3.1 實驗分組及方法
取成年雄性新西蘭大白兔 18 只，根據處理方法不同隨機分為 HA 組及 ZnO/HA 組，每組 9 只。
兩組兔以耳緣靜脈注射 3% 戊巴比妥溶液（1 mL/kg）麻醉后，雙側前肢剃毛、消毒，橈骨背側皮膚縱向切開，鈍性分離筋膜和肌肉后切開骨膜，將暴露的橈骨中段用線鋸切除 1 cm 長組織，然后于右前肢骨缺損區植入大小為 10 mm×5 mm×5 mm 的多孔 HA 材料或多孔 ZnO/HA 復合材料；逐層縫合骨膜、肌肉筋膜和皮膚，消毒后紗布包扎。兩組左側前肢僅制備骨缺損模型，作為空白對照。術后 7 d 內隔天肌肉注射青霉素預防感染。
1.3.2 觀測指標
① 觀察術后兩組動物飲食、活動以及切口愈合情況。
② 血常規檢查：術前 1 d 和術后 1 d、1 周、4 周、8 周兩組耳緣靜脈抽血。取 100 μL 血液至 2 mL 離心管，加入 2 mL 用蒸餾水稀釋的紅細胞裂解液（稀釋比例 1∶10），渦旋震蕩混勻；室溫避光孵育 10 min，以 400×g 離心 5 min，棄上清；加入 2 mL PBS，混勻后同上法離心 5 min，棄上清；加入 2 mL PBS 重懸細胞沉淀；最后在流式細胞儀上檢測中性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞含量。各時間點以中性粒細胞、單核細胞及淋巴細胞總含量作為炎癥細胞含量進行統計分析。
③ 血生化檢測：取上述相同時間點獲得的靜脈血，以 500×g 離心 20 min，取血清用全自動生化分析儀檢測肝功能指標丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）、總蛋白（total protein，TP），以及腎功能指標肌酐（creatinine，Cr）和血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）。
④ X 線片觀察：術后 4、8、12 周兩組兔同上法麻醉后，雙側橈骨攝 X 線片，觀察橈骨缺損修復情況。
1.4 統計學方法
采用 GraphPad Prism 8 軟件進行統計分析。數據以均數±標準差表示，組內各時間點間比較采用重復測量方差分析，兩兩比較采用 Tukey 法檢驗；組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 材料觀測
2.1.1 材料表征
掃描電鏡觀察示多孔 HA 材料與多孔 ZnO/HA 復合材料表面均存在不同形狀、大小的孔隙，具有相互連通的大、小孔結構，孔徑均在 50～500 μm 之間。見圖 1。
圖1
兩種材料掃描電鏡觀察（×200）
a. 多孔 HA 材料；b. 多孔 ZnO/HA 復合材料
Figure1. Scanning electron microscope observation of two materials (×200)a. Porous HA material; b. Porous ZnO/HA composite material
材料降解曲線示，多孔 HA 材料和多孔 ZnO/HA 復合材料在浸泡早期略增重，幾乎不發生降解。7 d 后材料降解開始加快，且多孔 ZnO/HA復合材料降解快于多孔 HA 材料。見圖 2。
圖2
兩種材料降解曲線
Figure2.
Degradation curves of two materials
Zn2+ 溶出曲線示隨著浸泡時間增加，多孔 ZnO/HA 復合材料中的 Zn2+ 不斷釋放，前 3 d Zn2+ 溶出較快，之后變緩慢，15 d 時仍有 Zn2+ 溶出。見圖 3。
圖3
多孔 ZnO/HA 復合材料 Zn2+ 溶出曲線
Figure3.
Zn2+ dissolution curve of porous ZnO/HA composite material
2.1.2 急性全身毒性實驗
電感耦合等離子體發射光譜儀測量多孔 ZnO/HA 復合材料浸提液中，Zn2+ 含量為 0.024 mg/L、Ca2+ 含量為 0.180 mg/L。
注射材料浸提液 72 h 內，所有小鼠活動、飲食等均正常，未發現任何異常表現。與注射前相比，注射后 3 組小鼠體質量均增加，且隨時間延長體質量差異亦有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。
圖4
給藥前后各時間點小鼠體質量
Figure4.
Body mass of mice at each time point before and after administration
注射后 72 h 所有小鼠處死后，大體觀察見臟器顏色鮮亮，未發現腹水、臟器損壞等情況。肝、腎組織 HE 染色觀察示組織細胞形態及結構均未見異常，各組細胞未見明顯水腫及空泡，腎組織可見完好腎小球結構，并且在組織間無顆粒物質沉積。見圖 5。
圖5
小鼠 HE 染色觀察（×40）
從左至右依次為 A、B、C 組 a. 肝組織；b. 腎組織
Figure5. HE staining observation of mice (×40)From left to right for groups A, B and C, respectively a. Liver tissue; b. Kidney tissue
2.2 動物體內植入實驗
2.2.1 一般情況
所有兔均存活至實驗完成。術后 1 d 飲食及活動恢復正常，無骨折或感染發生，2 周后皮膚切口均愈合。
2.2.2 血常規檢測
術后 1 d，兩組中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞均較術前 1 d 增多；術后 1 周，HA 組中性粒細胞、淋巴細胞較前減少，單核細胞增多，ZnO/HA 組中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞均減少；術后 4 周，HA 組中性粒細胞增多，單核細胞與術前 1 d 接近，淋巴細胞減少，ZnO/HA 組中性粒細胞增多，單核細胞和淋巴細胞與術前 1 d 接近；術后 8 周，兩組中性粒細胞減少，單核細胞和淋巴細胞與術前 1 d 接近。見圖 6。
圖6
流式細胞儀檢測各組各時間點中性粒細胞（E1）、單核細胞（E2）及淋巴細胞（E3）含量
從左至右依次是術前 1 d 及術后 1 d、1 周、4 周、8 周 a. HA 組；b. ZnO/HA 組
Figure6. The number of neutrophils (E1), monocytes (E2), and lymphocytes (E3) detected by flow cytometry in each group at each time pointFrom left to right for 1 day before operation and 1 day, 1 week, 4 weeks, and 8 weeks after operation, respectively a. HA group; b. ZnO/HA group
與術前 1 d 相比，HA 組術后 1 d及 1、4 周炎癥細胞含量差異均有統計學意義（P<0.05），8 周時差異無統計學意義（P>0.05）；ZnO/HA 組除術后 1 d 與術前 1 d 比較差異有統計學意義（P<0.05）外，其他時間點與術前 1 d 比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 7。
圖7
手術前后各時間點炎癥細胞含量變化
Figure7.
Changes in the content of inflammatory cells at each time point before and after operation
2.2.3 血生化檢測
術前 1 d 和術后 1 d、1 周、4 周和 8 周，兩組肝功能指標 ALT、AST、TBIL、TP 以及腎功能指標 Cr 和 BUN 均在正常參考范圍[13]波動，組間差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 8。
圖8
手術前后各時間點兩組肝、腎功能檢測指標（虛線部分表示正常參考范圍）
a. ALT；b. AST；c. TBIL；d. TP；e. Cr；f. BUN
Figure8. The liver and kidney function-related indicators of two groups at each time point before and after operation (the dotted line indicated the normal reference range)a. ALT; b. AST; c. TBIL; d. TP; e. Cr; f. BUN
2.2.4 X 線片觀察
術后 4 周，兩組材料仍在植入部位，無移位、斷裂等現象，缺損部位可見新骨形成；但 HA 組骨折線明顯，ZnO/HA 組骨折線模糊，開始發生骨整合。8 周時，空白對照骨缺損處有少量新骨形成；HA 組骨折線較 4 周時更模糊，但仍能觀察到 X 線可透間隙；ZnO/HA 組進一步與宿主骨發生骨整合。12 周時，空白對照骨缺損區域有豐富骨組織，但仍未完成骨重建；HA 組及 ZnO/HA 組材料與宿主骨均發生骨整合，且 ZnO/HA 組優于 HA 組。見圖 9。
圖9
術后 4、8、12 周各組 X 線片觀察
從左至右依次為 4、8、12 周 a. 空白對照；b. HA 組；c. ZnO/HA 組
Figure9. X-ray films of each group at 4, 8, and 12 weeks after operationFrom left to right for 4, 8, and 12 weeks, respectively a. Blank control group; b. HA group; c. ZnO/HA group
3 討論
理想的骨修復材料對生物相容性、孔隙率、降解率、促成骨能力等都有要求。本研究中，掃描電鏡示利用放電等離子燒結技術制備的多孔 ZnO/HA 復合材料和多孔 HA 材料均具有大小孔并存的孔隙結構，孔徑在 50～500 μm 之間，且前期研究顯示材料孔隙率>40%[10]。研究表明，骨修復材料其孔隙率需達 40% 以上并且大孔孔徑至少>150 μm、小孔孔徑>40 μm，才有利于新骨和血管向孔內生長，新長入的血管可以將氧氣和營養物質傳遞給骨缺損區域，從而促進新骨生長[14-15]。因此，本研究制備的多孔材料能為血管和骨組織長入提供足夠空間。材料降解曲線顯示，兩種多孔材料前 7 d 降解均較慢，隨著浸泡時間延長，降解開始加快。分析原因為前 7 d 材料在 SBF 溶解過程中會產生 PO43– 和 Ca2+，這些離子會順著濃度梯度方向不斷擴散。當 SBF 中上述離子濃度過飽和后，材料表面會出現類骨磷灰石沉積現象，從而出現增重情況；7 d 后材料迅速溶解出 PO43– 和 Ca2+，其溶解速率會逐漸大于類骨磷灰石形成速率，降解開始加快。多孔 ZnO/HA 復合材料降解快于多孔 HA 材料，說明 ZnO 的加入提高了材料降解率。Zn2+ 溶出曲線顯示多孔 ZnO/HA 復合材料呈一種可持續、緩慢的 Zn2+ 溶出特性，這可能是在制備復合材料過程中，納米 ZnO 被 HA 包裹，在 SBF 中會隨著 HA 的降解而釋放出來，然后再溶解釋放 Zn2+，這樣可以有效控制 Zn2+ 的釋放速度。
骨修復材料在植入體內后除了修復受損組織外，還應該保證其安全無毒，不會對機體產生負面影響，因此需評估材料體內生物安全性。多孔 ZnO/HA 復合材料作為可降解植入材料，當其降解成分被釋放進入體內后，有可能引起全身毒性反應，因此本研究首先進行急性全身毒性實驗。結果顯示小鼠注射兩種材料浸提液 72 h 時體質量仍增加，說明材料浸提液中的 Zn2+、Ca2+ 等成分在進入體內后會被正常代謝，不會使小鼠因中毒而導致體質量下降或者死亡，并且對肝、腎組織也無毒害作用，初步判斷多孔 ZnO/HA 復合材料安全。
為了進一步驗證多孔 ZnO/HA 復合材料體內安全性，本研究進行了動物體內植入實驗。理想的骨修復材料應具備良好生物相容性，植入體內后不會引起機體免疫排斥反應，不會產生嚴重炎癥反應。血液中的中性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞是與炎癥相關的 3 種細胞，其數量增減能反映機體是否發生炎癥[16]。血常規檢測結果顯示，術后 1 d 各組均出現炎癥反應，可能是機體對于手術創傷的應激反應，術后 1 周炎癥好轉，術后 8 周炎癥基本消失，說明多孔 ZnO/HA 復合材料植入體內后不會引起嚴重炎癥反應。血生化結果顯示兩組材料植入后兔肝、腎功能均正常，并且各項指標組間差異無統計學意義。上述檢測結果提示多孔 ZnO/HA 復合材料具有良好體內生物安全性。
最后，本研究利用 X 線片對多孔 ZnO/HA 復合材料的骨修復能力進行了初步評估。X 線片顯示，與 HA 組相比，ZnO/HA 組在 4 周就開始了骨整合，初步說明多孔 ZnO/HA 復合材料能更好地促進骨修復，其原因可能是：① 復合材料具有合適的孔徑與孔隙率以及摻入了 ZnO。在體外降解實驗和體內植入實驗中，多孔 ZnO/HA 復合材料降解較多孔 HA 材料快，隨著復合材料的降解，孔隙會更快地變大，為新的骨骼和血管向內生長提供更多空間，并且 HA 會釋放 PO43– 和 Ca2+ 等離子促進新骨礦化。② Zn2+ 的釋放。隨著多孔 ZnO/HA 復合材料的降解，Zn2+ 釋放到體內會使局部微環境呈堿性，增強成骨細胞活性，并且 Zn2+ 可以直接激活成骨細胞中的氨基酰 tRNA 合成酶，刺激細胞蛋白質合成，從而促進骨組織生長和礦化[17-19]。但是 X 線片提示 12 周時兩組材料仍比較完整，未發現材料大量降解情況，這可能與植入時間較短有關系。因此，在下一步研究中會延長材料植入時間，并且利用 micro-CT、組織學分析等方法對多孔 ZnO/HA 復合材料的骨修復能力進行深入評估。另外，感染是植骨失敗的原因之一，有研究表明 Zn2+ 能通過與細菌 DNA 結合和破壞細菌膜結構，使細菌死亡，從而起到殺菌作用[20-21]，提示多孔 ZnO/HA 復合材料可能具備良好抗菌性能，但有待后續研究證實。
綜上述，多孔 ZnO/HA 復合材料具有良好體內生物安全性，并初步表現良好的骨修復能力，是一種潛在骨修復材料。
作者貢獻：李晶瑩負責實驗實施、數據收集整理及統計分析、文章撰寫；朱斌修改文章；張玉勤提出修改意見；孟增東負責實驗設計和經費支持。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經云南省第一人民醫院醫學倫理委員會批準（2018GJ077）。實驗動物生產許可證號：SCXK（滇）K2020-0004，實驗動物使用許可證號：SYXK（滇）K2020-0006。
由于創傷、感染、腫瘤等原因導致的骨缺損越來越多，目前主要采用自體骨、同種異體骨和異種骨移植修復。其中，自體骨骨源不足且存在供骨區并發癥，同種異體骨和異種骨存在免疫排斥反應以及傳播疾病風險[1-2]。因此，需要研發能促進受損骨組織修復或再生的人工骨修復材料。
羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）是天然骨組織主要無機成分，具有優良的生物相容性及骨傳導性，并且能直接與周圍硬組織化學鍵合，增加骨骼附著力，是人工骨修復材料的理想基體材料之一[3]。但是，HA 作為骨修復材料仍然存在以下問題[4-7]：① 孔隙結構、活性成分與天然骨相比存在差異；② 植入體內后降解緩慢；③ 機械強度低。上述問題導致 HA 在臨床應用中出現植骨延遲愈合或不愈合、降解與成骨速率不匹配、材料碎裂變形等現象，影響修復效果。采用新制備技術和添加具有促進成骨誘導的可降解活性元素是解決上述問題重要途徑之一。
鋅（Zn）作為天然骨中維持骨骼健康的重要元素之一，在促進骨形成和礦化方面起著重要作用。它通過促進成骨細胞和軟骨細胞分化，同時抑制破骨細胞分化和吸收，從而促進骨生長[8]。氧化鋅（ZnO）作為 Zn 的氧化物，不僅比 Zn 元素更穩定，而且具有良好的生物活性，少量 ZnO 即可促進細胞增殖和分化、組織再生、血管生成和骨整合[9]。本課題組在前期研究中將納米 ZnO 作為活性添加相、HA 作為基體相、碳酸氫銨（NH4HCO3）作為造孔劑，利用放電等離子燒結技術制備了多孔 ZnO/HA 復合材料，經檢測該復合材料以 HA 相和 ZnO 相為主，無其他雜質，抗壓強度>148 MPa，彈性模量約 6.5 GPa，并且體外浸泡實驗結果表明其具有良好的成骨礦化能力[10]。在此基礎上，本次研究采用急性全身毒性實驗和兔橈骨缺損模型，進一步觀察多孔 ZnO/HA 復合材料的體內生物安全性和骨修復能力。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
5 周齡清潔級雄性昆明種小鼠 15 只，體質量 18～22 g；成年雄性新西蘭大白兔 18 只，體質量約 3 kg；由昆明醫科大學動物房提供。
納米 HA，純度≥99.7%，平均粒徑≤100 nm；納米 ZnO，純度≥99.9%，粒徑為（50±10）nm；醫用級 NH4HCO3；均由上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供。多聚甲醛（天津市光復科技發展有限公司）；紅細胞裂解液（BD 公司，美國）。
電感耦合等離子體發射光譜儀（Perkin Elmer 公司，美國）；放電等離子燒結系統（SYNTEX 公司，日本）；萬能試驗機（濟南中正試驗機制造有限公司）；Quanta-200 型場發射掃描電鏡（FEI 公司，美國）；石蠟包埋機、石蠟切片機（Leica 公司，德國）；流式細胞儀（杭州艾森生物有限公司）；全自動生化分析儀（Roche 公司，德國）；X 線機（Simens 公司，德國）。
1.2 材料制備及觀測
1.2.1 材料制備
① 制備多孔 ZnO/HA 復合材料：按納米 ZnO 質量分數為 1.3wt%、納米 HA 質量分數為 98.7wt%，稱取粉末[11]；經球磨、烘干后得到 ZnO/HA 復合粉末；將復合粉末與造孔劑 NH4HCO3 按照質量比 2∶1 混合后，均勻裝入模具中，用萬能試驗機壓制，退模后即可得到長方體狀坯體；將坯體放入石墨模具中，在放電等離子燒結系統中進行快速燒結成型，抽真空至 2～10 Pa，不施加壓力，先加熱至 700℃（升溫速率 100℃/min），再升溫至 950℃（升溫速率 50℃/min），保溫 5 min 后隨爐冷卻至室溫，獲得多孔 ZnO/HA 復合材料。② 制備多孔 HA 材料：將納米 HA 粉末與造孔劑 NH4HCO3 按照質量比 2∶1 混合，制備方法與多孔 ZnO/HA 復合材料一致，獲得多孔 HA 材料。
1.2.2 材料表征
① 掃描電鏡觀察：將制備的兩種材料用導電膠固定于載物臺上，表面噴金，掃描電鏡觀察表面形貌和孔隙結構。
② 材料降解率測定：稱取兩種材料并記錄原始質量；置于 37℃ 模擬人工體液（stimulated body fluid，SBF），每隔 7 d 取出 1 次，取出后用去離子水沖洗，干燥后稱重，周期 49 d。按照以下公式計算各時間點材料降解率，降解率=（原始質量?各時間點質量）/原始質量×100%，根據各時間點降解率繪制材料降解曲線。實驗重復 3 次。
③ 復合材料溶出 Zn2+ 濃度測定：37℃ 恒溫下，將多孔 ZnO/HA 復合材料置于 50 mL SBF 浸泡 15 d，分別在 1、3、5、7、15 d 取 5 mL 浸泡液，利用電感耦合等離子體發射光譜儀測定浸泡液中 Zn2+ 濃度，根據各時間點 Zn2+ 濃度繪制多孔 ZnO/HA 復合材料的 Zn2+ 溶出曲線。每次取出浸泡液后均用新鮮 SBF 補充至 50 mL。實驗重復 3 次。
1.2.3 急性全身毒性實驗
① 材料浸提液制備：按照 GB/T16886.12-2017 中第 12 部分方法[12]，按照0.2 g/mL 浸提比例，將制備的兩種材料分別置于生理鹽水，于（37±1）℃ 條件下浸提 72 h，獲得浸提液。采用電感耦合等離子體發射光譜儀測量多孔 ZnO/HA 復合材料浸提液中 Zn2+ 及 Ca2+ 含量。
② 實驗分組及方法：按照 GB/T16886.11-2011 中第 11 部分方法[12]，將 15 只小鼠隨機分為 A、B、C 3 組（n=5），按照 50 mL/kg 劑量分別腹腔注射生理鹽水（陰性對照）、多孔 HA 材料浸提液、多孔 ZnO/HA 復合材料浸提液。
③ 觀測指標：記錄注射前和注射后 24、48、72 h 各組小鼠體質量變化以及呼吸、運動、排泄等一般情況。注射后 72 h 脫頸處死各組小鼠，取肝、腎組織，置于多聚甲醛固定、脫水、包埋并連續切片（片厚 5 μm），常規 HE 染色后光鏡下觀察。
1.3 動物體內植入實驗
1.3.1 實驗分組及方法
取成年雄性新西蘭大白兔 18 只，根據處理方法不同隨機分為 HA 組及 ZnO/HA 組，每組 9 只。
兩組兔以耳緣靜脈注射 3% 戊巴比妥溶液（1 mL/kg）麻醉后，雙側前肢剃毛、消毒，橈骨背側皮膚縱向切開，鈍性分離筋膜和肌肉后切開骨膜，將暴露的橈骨中段用線鋸切除 1 cm 長組織，然后于右前肢骨缺損區植入大小為 10 mm×5 mm×5 mm 的多孔 HA 材料或多孔 ZnO/HA 復合材料；逐層縫合骨膜、肌肉筋膜和皮膚，消毒后紗布包扎。兩組左側前肢僅制備骨缺損模型，作為空白對照。術后 7 d 內隔天肌肉注射青霉素預防感染。
1.3.2 觀測指標
① 觀察術后兩組動物飲食、活動以及切口愈合情況。
② 血常規檢查：術前 1 d 和術后 1 d、1 周、4 周、8 周兩組耳緣靜脈抽血。取 100 μL 血液至 2 mL 離心管，加入 2 mL 用蒸餾水稀釋的紅細胞裂解液（稀釋比例 1∶10），渦旋震蕩混勻；室溫避光孵育 10 min，以 400×g 離心 5 min，棄上清；加入 2 mL PBS，混勻后同上法離心 5 min，棄上清；加入 2 mL PBS 重懸細胞沉淀；最后在流式細胞儀上檢測中性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞含量。各時間點以中性粒細胞、單核細胞及淋巴細胞總含量作為炎癥細胞含量進行統計分析。
③ 血生化檢測：取上述相同時間點獲得的靜脈血，以 500×g 離心 20 min，取血清用全自動生化分析儀檢測肝功能指標丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）、總蛋白（total protein，TP），以及腎功能指標肌酐（creatinine，Cr）和血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）。
④ X 線片觀察：術后 4、8、12 周兩組兔同上法麻醉后，雙側橈骨攝 X 線片，觀察橈骨缺損修復情況。
1.4 統計學方法
采用 GraphPad Prism 8 軟件進行統計分析。數據以均數±標準差表示，組內各時間點間比較采用重復測量方差分析，兩兩比較采用 Tukey 法檢驗；組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 材料觀測
2.1.1 材料表征
掃描電鏡觀察示多孔 HA 材料與多孔 ZnO/HA 復合材料表面均存在不同形狀、大小的孔隙，具有相互連通的大、小孔結構，孔徑均在 50～500 μm 之間。見圖 1。
圖1
兩種材料掃描電鏡觀察（×200）
a. 多孔 HA 材料；b. 多孔 ZnO/HA 復合材料
Figure1. Scanning electron microscope observation of two materials (×200)a. Porous HA material; b. Porous ZnO/HA composite material
材料降解曲線示，多孔 HA 材料和多孔 ZnO/HA 復合材料在浸泡早期略增重，幾乎不發生降解。7 d 后材料降解開始加快，且多孔 ZnO/HA復合材料降解快于多孔 HA 材料。見圖 2。
圖2
兩種材料降解曲線
Figure2.
Degradation curves of two materials
Zn2+ 溶出曲線示隨著浸泡時間增加，多孔 ZnO/HA 復合材料中的 Zn2+ 不斷釋放，前 3 d Zn2+ 溶出較快，之后變緩慢，15 d 時仍有 Zn2+ 溶出。見圖 3。
圖3
多孔 ZnO/HA 復合材料 Zn2+ 溶出曲線
Figure3.
Zn2+ dissolution curve of porous ZnO/HA composite material
2.1.2 急性全身毒性實驗
電感耦合等離子體發射光譜儀測量多孔 ZnO/HA 復合材料浸提液中，Zn2+ 含量為 0.024 mg/L、Ca2+ 含量為 0.180 mg/L。
注射材料浸提液 72 h 內，所有小鼠活動、飲食等均正常，未發現任何異常表現。與注射前相比，注射后 3 組小鼠體質量均增加，且隨時間延長體質量差異亦有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。
圖4
給藥前后各時間點小鼠體質量
Figure4.
Body mass of mice at each time point before and after administration
注射后 72 h 所有小鼠處死后，大體觀察見臟器顏色鮮亮，未發現腹水、臟器損壞等情況。肝、腎組織 HE 染色觀察示組織細胞形態及結構均未見異常，各組細胞未見明顯水腫及空泡，腎組織可見完好腎小球結構，并且在組織間無顆粒物質沉積。見圖 5。
圖5
小鼠 HE 染色觀察（×40）
從左至右依次為 A、B、C 組 a. 肝組織；b. 腎組織
Figure5. HE staining observation of mice (×40)From left to right for groups A, B and C, respectively a. Liver tissue; b. Kidney tissue
2.2 動物體內植入實驗
2.2.1 一般情況
所有兔均存活至實驗完成。術后 1 d 飲食及活動恢復正常，無骨折或感染發生，2 周后皮膚切口均愈合。
2.2.2 血常規檢測
術后 1 d，兩組中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞均較術前 1 d 增多；術后 1 周，HA 組中性粒細胞、淋巴細胞較前減少，單核細胞增多，ZnO/HA 組中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞均減少；術后 4 周，HA 組中性粒細胞增多，單核細胞與術前 1 d 接近，淋巴細胞減少，ZnO/HA 組中性粒細胞增多，單核細胞和淋巴細胞與術前 1 d 接近；術后 8 周，兩組中性粒細胞減少，單核細胞和淋巴細胞與術前 1 d 接近。見圖 6。
圖6
流式細胞儀檢測各組各時間點中性粒細胞（E1）、單核細胞（E2）及淋巴細胞（E3）含量
從左至右依次是術前 1 d 及術后 1 d、1 周、4 周、8 周 a. HA 組；b. ZnO/HA 組
Figure6. The number of neutrophils (E1), monocytes (E2), and lymphocytes (E3) detected by flow cytometry in each group at each time pointFrom left to right for 1 day before operation and 1 day, 1 week, 4 weeks, and 8 weeks after operation, respectively a. HA group; b. ZnO/HA group
與術前 1 d 相比，HA 組術后 1 d及 1、4 周炎癥細胞含量差異均有統計學意義（P<0.05），8 周時差異無統計學意義（P>0.05）；ZnO/HA 組除術后 1 d 與術前 1 d 比較差異有統計學意義（P<0.05）外，其他時間點與術前 1 d 比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 7。
圖7
手術前后各時間點炎癥細胞含量變化
Figure7.
Changes in the content of inflammatory cells at each time point before and after operation
2.2.3 血生化檢測
術前 1 d 和術后 1 d、1 周、4 周和 8 周，兩組肝功能指標 ALT、AST、TBIL、TP 以及腎功能指標 Cr 和 BUN 均在正常參考范圍[13]波動，組間差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 8。
圖8
手術前后各時間點兩組肝、腎功能檢測指標（虛線部分表示正常參考范圍）
a. ALT；b. AST；c. TBIL；d. TP；e. Cr；f. BUN
Figure8. The liver and kidney function-related indicators of two groups at each time point before and after operation (the dotted line indicated the normal reference range)a. ALT; b. AST; c. TBIL; d. TP; e. Cr; f. BUN
2.2.4 X 線片觀察
術后 4 周，兩組材料仍在植入部位，無移位、斷裂等現象，缺損部位可見新骨形成；但 HA 組骨折線明顯，ZnO/HA 組骨折線模糊，開始發生骨整合。8 周時，空白對照骨缺損處有少量新骨形成；HA 組骨折線較 4 周時更模糊，但仍能觀察到 X 線可透間隙；ZnO/HA 組進一步與宿主骨發生骨整合。12 周時，空白對照骨缺損區域有豐富骨組織，但仍未完成骨重建；HA 組及 ZnO/HA 組材料與宿主骨均發生骨整合，且 ZnO/HA 組優于 HA 組。見圖 9。
圖9
術后 4、8、12 周各組 X 線片觀察
從左至右依次為 4、8、12 周 a. 空白對照；b. HA 組；c. ZnO/HA 組
Figure9. X-ray films of each group at 4, 8, and 12 weeks after operationFrom left to right for 4, 8, and 12 weeks, respectively a. Blank control group; b. HA group; c. ZnO/HA group
3 討論
理想的骨修復材料對生物相容性、孔隙率、降解率、促成骨能力等都有要求。本研究中，掃描電鏡示利用放電等離子燒結技術制備的多孔 ZnO/HA 復合材料和多孔 HA 材料均具有大小孔并存的孔隙結構，孔徑在 50～500 μm 之間，且前期研究顯示材料孔隙率>40%[10]。研究表明，骨修復材料其孔隙率需達 40% 以上并且大孔孔徑至少>150 μm、小孔孔徑>40 μm，才有利于新骨和血管向孔內生長，新長入的血管可以將氧氣和營養物質傳遞給骨缺損區域，從而促進新骨生長[14-15]。因此，本研究制備的多孔材料能為血管和骨組織長入提供足夠空間。材料降解曲線顯示，兩種多孔材料前 7 d 降解均較慢，隨著浸泡時間延長，降解開始加快。分析原因為前 7 d 材料在 SBF 溶解過程中會產生 PO43– 和 Ca2+，這些離子會順著濃度梯度方向不斷擴散。當 SBF 中上述離子濃度過飽和后，材料表面會出現類骨磷灰石沉積現象，從而出現增重情況；7 d 后材料迅速溶解出 PO43– 和 Ca2+，其溶解速率會逐漸大于類骨磷灰石形成速率，降解開始加快。多孔 ZnO/HA 復合材料降解快于多孔 HA 材料，說明 ZnO 的加入提高了材料降解率。Zn2+ 溶出曲線顯示多孔 ZnO/HA 復合材料呈一種可持續、緩慢的 Zn2+ 溶出特性，這可能是在制備復合材料過程中，納米 ZnO 被 HA 包裹，在 SBF 中會隨著 HA 的降解而釋放出來，然后再溶解釋放 Zn2+，這樣可以有效控制 Zn2+ 的釋放速度。
骨修復材料在植入體內后除了修復受損組織外，還應該保證其安全無毒，不會對機體產生負面影響，因此需評估材料體內生物安全性。多孔 ZnO/HA 復合材料作為可降解植入材料，當其降解成分被釋放進入體內后，有可能引起全身毒性反應，因此本研究首先進行急性全身毒性實驗。結果顯示小鼠注射兩種材料浸提液 72 h 時體質量仍增加，說明材料浸提液中的 Zn2+、Ca2+ 等成分在進入體內后會被正常代謝，不會使小鼠因中毒而導致體質量下降或者死亡，并且對肝、腎組織也無毒害作用，初步判斷多孔 ZnO/HA 復合材料安全。
為了進一步驗證多孔 ZnO/HA 復合材料體內安全性，本研究進行了動物體內植入實驗。理想的骨修復材料應具備良好生物相容性，植入體內后不會引起機體免疫排斥反應，不會產生嚴重炎癥反應。血液中的中性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞是與炎癥相關的 3 種細胞，其數量增減能反映機體是否發生炎癥[16]。血常規檢測結果顯示，術后 1 d 各組均出現炎癥反應，可能是機體對于手術創傷的應激反應，術后 1 周炎癥好轉，術后 8 周炎癥基本消失，說明多孔 ZnO/HA 復合材料植入體內后不會引起嚴重炎癥反應。血生化結果顯示兩組材料植入后兔肝、腎功能均正常，并且各項指標組間差異無統計學意義。上述檢測結果提示多孔 ZnO/HA 復合材料具有良好體內生物安全性。
最后，本研究利用 X 線片對多孔 ZnO/HA 復合材料的骨修復能力進行了初步評估。X 線片顯示，與 HA 組相比，ZnO/HA 組在 4 周就開始了骨整合，初步說明多孔 ZnO/HA 復合材料能更好地促進骨修復，其原因可能是：① 復合材料具有合適的孔徑與孔隙率以及摻入了 ZnO。在體外降解實驗和體內植入實驗中，多孔 ZnO/HA 復合材料降解較多孔 HA 材料快，隨著復合材料的降解，孔隙會更快地變大，為新的骨骼和血管向內生長提供更多空間，并且 HA 會釋放 PO43– 和 Ca2+ 等離子促進新骨礦化。② Zn2+ 的釋放。隨著多孔 ZnO/HA 復合材料的降解，Zn2+ 釋放到體內會使局部微環境呈堿性，增強成骨細胞活性，并且 Zn2+ 可以直接激活成骨細胞中的氨基酰 tRNA 合成酶，刺激細胞蛋白質合成，從而促進骨組織生長和礦化[17-19]。但是 X 線片提示 12 周時兩組材料仍比較完整，未發現材料大量降解情況，這可能與植入時間較短有關系。因此，在下一步研究中會延長材料植入時間，并且利用 micro-CT、組織學分析等方法對多孔 ZnO/HA 復合材料的骨修復能力進行深入評估。另外，感染是植骨失敗的原因之一，有研究表明 Zn2+ 能通過與細菌 DNA 結合和破壞細菌膜結構，使細菌死亡，從而起到殺菌作用[20-21]，提示多孔 ZnO/HA 復合材料可能具備良好抗菌性能，但有待后續研究證實。
綜上述，多孔 ZnO/HA 復合材料具有良好體內生物安全性，并初步表現良好的骨修復能力，是一種潛在骨修復材料。
作者貢獻：李晶瑩負責實驗實施、數據收集整理及統計分析、文章撰寫；朱斌修改文章；張玉勤提出修改意見；孟增東負責實驗設計和經費支持。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經云南省第一人民醫院醫學倫理委員會批準（2018GJ077）。實驗動物生產許可證號：SCXK（滇）K2020-0004，實驗動物使用許可證號：SYXK（滇）K2020-0006。
