引用本文： 萬鈺茜, 諶強國, 顏廷亭. 二氧化硅/羥基磷灰石晶須多孔陶瓷支架的制備與性能研究. 中國修復重建外科雜志, 2023, 37(9): 1142-1148. doi: 10.7507/1002-1892.202304073 復制
版權信息： ?四川大學華西醫院華西期刊社《中國修復重建外科雜志》版權所有，未經授權不得轉載、改編
生物活性陶瓷支架是目前骨組織工程材料研究的重點，它不僅具有良好的生物相容性，多孔表面形貌和孔道結構，以促進新生組織長入，而且能夠長期在體內保持原有性質不變，植入后對患者全身和局部無明顯毒副作用，且生物力學強度能滿足人體骨等硬組織修復的需求。然而，當前的生物活性陶瓷支架存在骨誘導活性差、生物功能單一等缺陷，極大限制了其臨床治療效果和應用范圍[1-3]。
羥基磷灰石（hydroxyapatite，HAP）晶須是一種單晶微納米級短纖維材料，具有極高的長徑比。晶須一般高純度擇優生長，原子排列高度有序，強度與完整晶體的理論值接近。而高強度、高模量和高伸長率等特點，使得晶須制品的物理強度優于其他纖維質材料。因此，晶須常被當作復合材料的增強體，或制備高強度復合材料的原材料[4-7]。其中，采用傳統陶瓷燒結工藝制備的HAP晶須多孔陶瓷，植入體內后能與界面上的骨組織形成強力化學鍵合，其類骨成分、無毒及無免疫原性等特性對新骨生長有一定誘導作用，多用于人體組織或器官的修復、替代或增強其功能[8-10]。此外，晶須的高比表面積和表面活性能極大地促進生物大分子或藥物如蛋白質、多肽類物質及疫苗等的黏附、運輸與傳遞[8-12]。然而，由于HAP晶須降解時間較長，制備的多孔陶瓷支架生物降解性有待提升[10]。為滿足細胞植入、增殖、分化及新骨生成需求，支架材料的孔徑一般要求在100～600 μm[13-15]。以單一造孔法制備多孔陶瓷，其孔徑大小與分布很難達到支架材料的要求。隨著多孔陶瓷制備方法的多樣化，聯用幾種造孔方法則可以很好地實現各種方法間的互補，使得以鈣磷鹽為原材料的多孔陶瓷在生物醫用領域有了嶄新前景[16-17]。然而，對于多孔陶瓷支架而言，其孔隙率越高，材料抗壓強度越低，植入后難以起到很好的支撐作用[18]。
針對上述問題，研究者們發現將硅（Si）元素引入HAP中可提高材料生物活性和促進骨組織生長[19-20]；另一方面，對HAP進行表面Si改性，可以增加晶須表面的粗糙程度以及固位力，有效改善晶須在有機樹脂或多孔陶瓷支架中的拔出能力，極大提高材料的力學性能[21-22]。鑒于此，本研究擬結合Si對晶須的雙重作用，以二氧化硅（SiO2）微球對HAP晶須表面進行改性后制備多孔陶瓷材料，以期改善材料的生物活性以及機械性能，為臨床提供一種新的骨組織工程材料。
1 材料與方法
1.1 實驗試劑及儀器
239T細胞（轉染腺病毒EIA基因的人腎上皮細胞）來源于解放軍 聯勤保障部隊920醫院。
以水熱共沉淀法自制HAP晶須[23]。正硅酸乙酯（TEOS，98%，新亞化工有限公司）；氨水（27%，天津市致遠化學試劑有限公司）；月桂酸鉀（99.7%，廣州市化學試劑廠）；羧甲基纖維素（99.7%，上海三愛思試劑有限公司）；水溶性硅膠（30%，南京化學試劑股份有限公司）；無水乙醇（99.7%，天津市風船化學試劑科技有限公司）
78HW-1數顯恒溫磁力攪拌器（杭州儀表電機有限公司）；101A-1恒溫干燥箱（上海市儀器總廠）；SRJX-4-13箱式電阻爐（滬南實驗儀器廠）；Wp700（MS-2079TW）LG微波爐（天津樂金電子電器有限公司）；HL-3B恒流泵（上海瀘西分析儀器廠有限公司）；D/max-220 X射線衍射（X-ray diffrac-tion，XRD）儀（理學公司，日本）；XL-30ESEN-TMP掃描電鏡（Philips公司，荷蘭）；HY-0230萬能試驗機（上海橫翼精密儀器有限公司）；Poremas-ter-33壓汞儀（Quantachrome公司，美國）；YXG26高壓蒸汽滅菌器（寧波久興醫療器械有限公司）；酶標儀（上海邁瑞爾生化科技有限公司）。
1.2 材料制備方法
采用St?ber法調控HAP表面SiO2微球的生長。TEOS含量、攪拌時間、煅燒溫度以及保溫時間都是晶須改性的影響因素。采用不同因素進行晶須改性，制備3種SiO2/HAP晶須[23-24]。見表1。具體方法：將TEOS與無水乙醇溶液混合制成A液，將HAP晶須與濃氨水、無水乙醇混合制成B液；采用雙相滴定法，控制pH值；在乙醇溶液中以氨水為催化劑，TEOS發生水解及縮合反應，熱處理后形成粒徑均勻的SiO2顆粒，由于氨水與HAP晶須處于B液液滴中，SiO2顆粒將在HAP晶須上生成。泡沫預聚體的制備：以月桂酸鉀為發泡劑，羧甲基纖維素為泡沫穩定劑（二者比例為1∶2），水溶性硅膠為膠黏劑，以機械攪拌形式產生泡沫預聚體。多孔陶瓷制備：稱取7 g 自制HAP晶須或3種SiO2/HAP晶須少量多次加入泡沫預聚體中，攪拌0.5 h，過濾后再陳化0.5 h得到均勻的陶瓷泥漿。以自制模具對陳化后陶瓷泥漿進行擠壓成型，以微波加熱方式對坯體進行快速定型，然后置于室溫下干燥12 h。于650℃保溫6 h排除有機物，最終得到4種多孔陶瓷樣品。
表1
制備3種SiO2/HAP晶須的因素
Table1.
Factors for prepared 3 types of SiO2/HAP whiskers
1.3 觀測指標
1.3.1 SiO2/HAP晶須物相與形貌分析
取自制HAP晶須以及3種SiO2/HAP晶須進行XRD分析，測試范圍10°～90°，掃描速度4°/min；掃描電鏡觀察晶須表面形貌特征。
1.3.2 多孔陶瓷的軸向抗壓強度
取自制HAP晶須多孔陶瓷和3種SiO2/HAP晶須多孔陶瓷，依據GB/1041-92標準，采用萬能試驗機對樣品進行軸向抗壓強度測定。每種材料選取5個樣品進行測試，樣品為邊長約10 mm的立方塊體，壓縮速率為1 mm/min。
1.3.3 SiO2/HAP晶須多孔陶瓷的表征
根據力學測試結果篩選力學性能最佳的SiO2/HAP晶須多孔陶瓷，掃描電鏡觀察其孔隙結構，并依照GB/T1966-1996標準測定其顯氣孔率，采用壓汞儀表征其孔徑分布。
1.3.4 多孔陶瓷的生物降解性能
取自制HAP晶須多孔陶瓷和3種SiO2/HAP晶須多孔陶瓷，測量其濕重后，將樣品置于內含模擬體液（simulated body fluid，SBF）的密閉樣品管中 ［樣品質量與SBF體積比為（0.1～0.2）g∶1 mL］。將樣品管置于（37.0±0.5）℃培養箱，每天更換SBF1次，于不同時間點（1～8 d，12、14、17、20、27、41、47、52、57、63 d）測量浸泡樣品濕重，計算失重率，即各時間點樣品濕重占初始濕重的百分比，并繪制各多孔陶瓷的體外降解曲線。取失重率最大對應時間點的各材料進行掃描電鏡觀察。選擇在SBF中鈣磷沉積狀況良好的SiO2/HAP晶須多孔陶瓷，采用能譜儀測定其元素組成。
1.3.5 生物毒性實驗
選取抗壓強度以及在SBF中鈣磷沉積狀況良好的SiO2/HAP晶須多孔陶瓷，根據GB/T14233-2005標準，采用細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8）法對浸提液進行細胞毒性實驗。
具體步驟：① 浸提液制備：用含10%FBS的培養基制備濃度為0.05、0.1、0.2、0.4 mg/L的水溶液，置于37℃、5%CO2培養箱浸提各材料（24±2）h。② 接種細胞：培養293T細胞至4～6代，用含10%FBS的培養基配成單個細胞懸液，以每孔（1～10）×103個細胞接種至96孔板，置于37℃、5%CO2培養箱接種12 h，選取其中1孔作為空白對照組。③ 加浸提液：待觀測到細胞貼壁后，往培養板中每孔加入100 μL各樣品的浸提液作為實驗組，置于37℃、5%CO2培養箱繼續培養24 h。④ CCK-8檢測：每孔加入CCK-8溶液10 μL，繼續培養2 h后停止培養，于490 nm波長下測定各孔吸光度（A）值，按以下公式計算細胞相對增殖度（relative growth rate，RGR）：RGR=實驗組平均A值/空白對照組A值×100%。根據GB/T14233-2005標準對材料的細胞毒性進行分級：0級，RGR≥100%；1級，RGR為75%～99%；2級，RGR為50%～74%；3～5級，RGR≤49%。0～1級為無細胞毒性。
1.4 統計學方法
采用Office Excel軟件進行統計分析。計量資料行正態性檢驗，均符合正態分布，數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 SiO2/HAP晶須物相與形貌分析
XRD圖譜顯示，自制HAP晶須的衍射峰與PDF#74-0565標準卡片比對良好。其中，（211）、（300）、（112）為HAP晶須典型的特征晶面。相比于HAP晶須，1～3號SiO2/HAP晶須的（112）晶面衍射強度逐漸降低直至消失，而（211）、（300）晶面的衍射峰半峰寬卻逐漸增大，這是由于所有SiO2/HAP晶須在20°～25° 出現了非結晶態SiO2的特征峰群，（112）晶面的衍射峰與（300）晶面的衍射峰重疊[19]。見圖1。
圖1
自制HAP晶須及3種SiO2/HAP晶須的XRD圖譜
Figure1.
X-ray diffraction patterns of self-made HAP whisker and 3 types of SiO2/HAP whiskers
掃描電鏡觀察示，自制HAP晶須表面光滑，無任何異物顆粒存在；與其相比，3種SiO2/HAP晶須表面附著了許多圓潤、均勻、附著性良好且呈分散狀態的微球，微球球徑約200 nm。見圖2。
圖2
自制HAP晶須及3種SiO2/HAP晶須掃描電鏡觀察（×10 k）
a. 自制HAP晶須；b～d. 分別為1～3號SiO2/HAP晶須
Figure2. Scanning electron microscopy images of the self-made HAP whisker and 3 types of SiO2/HAP whiskers (×10 k)a. Self-made HAP whisker; b-d. No.1 to No.3 SiO2/HAP whiskers, respectively
2.2 多孔陶瓷的軸向抗壓強度
自制HAP晶須多孔陶瓷和1、2、3號SiO2/HAP晶須多孔陶瓷軸向抗壓強度分別為（0.25±0.12）、（0.66±0.18）、（1.09±0.22）、（0.99±0.08）MPa。3種SiO2/HAP晶須多孔陶瓷的軸向抗壓強度均顯著大于自制HAP晶須多孔陶瓷，其中2號SiO2/HAP晶須多孔陶瓷的軸向抗壓強度最大，但差異均無統計學意義（P>0.05）。
2.3 SiO2/HAP晶須多孔陶瓷的表征
2號SiO2/HAP晶須多孔陶瓷掃描電鏡觀察示，其孔隙結構由排列整齊的縱向直通孔及大量微納米級貫通孔構成，顯氣孔率約78%。直通孔呈圓柱狀，直徑為（403.16±26.41）μm，直通孔間的間距約500 μm，直通孔大小主要由設計的成型模芯特性決定。直通孔斷面由大量蓬松的SiO2/HAP堆疊而成，側壁上可以觀察到很多孔徑10～80 μm的小孔，這些氣孔大部分由機械發泡產生，一部分為大量晶須無序堆疊產生。該多孔陶瓷的孔徑分布主要集中在5～50 μm和100～150 μm。見圖3、4。其中，在5～50 μm范圍內汞（Hg）的浸入量約1.4 mm3/g，遠高于在100～200 μm范圍內的Hg浸入量（約0.25 mm3/g），說明在多孔陶瓷中大部分微納米孔的孔徑在5～50 μm。結合掃描電鏡觀察結果可知，直徑>20 μm的微孔來源于發泡劑機械發泡，而直徑<20 μm的微孔則是晶須隨機堆積所致。此外，在100～200 μm范圍的微孔則可能是由不均勻發泡所產生的大氣泡造成的。
圖3
2號SiO2/HAP晶須多孔陶瓷掃描電鏡觀察
a. 直通孔整體觀察（×100）；b. 直通孔斷面（×80）；c. 斷面的內壁形貌（×500）；d. 發泡后殘留的氣孔（×10 k）
Figure3. Scanning electron microscopy images of the pore structure of the porous ceramics prepared by No.2 SiO2/HAP whiskersa. Straight-through holes (×100); b. Sections of the straight-through holes (×80); c. Inwall of the sections (×500); d. Residual pores after foaming (×10 k)
圖4
2號SiO2/HAP晶須多孔陶瓷孔徑分布
Figure4.
Pore size distributions of the porous ceramics prepared by No.2 SiO2/HAP whiskers
2.4 多孔陶瓷的生物降解性能
SBF浸泡63 d內，各種多孔陶瓷材料失重率均呈先增加后趨于平緩的變化趨勢。浸泡7 d后所有樣品的失重率急劇增加，最高可達25%。取該時間點的各種多孔陶瓷材料行掃描電鏡觀察示，1～3號SiO2/HAP晶須多孔陶瓷中晶須表面圓潤的SiO2微球形狀已嚴重畸變，甚至在2、3號SiO2/HAP晶須多孔陶瓷中已完全消失；孔隙內部SiO2微球上覆蓋了一定厚度的團聚物。對2號SiO2/HAP晶須多孔陶瓷中出現的團聚物進行能譜分析，發現其基本組成為Si、磷（P）、氧（O）、鈣（Ca）元素。其中，Ca/P原子比為1.43，提示這些沉積物為缺鈣型磷灰石結晶，材料具有良好生物活性。見圖5～7。
圖5
各種多孔陶瓷在SBF浸泡63 d內的體外降解曲線
Figure5.
In vitro degradation curves of various porous ceramics immersed in simulated body fluid within 63 days
圖6
SBF浸泡7 d各多孔陶瓷掃描電鏡觀察（×5 000）
a. 自制HAP晶須多孔陶瓷；b～d. 分別為1～3號SiO2/HAP晶須多孔陶瓷
Figure6. Scanning electron microscopy images of various porous ceramics immersed in simulated body fluid for 7 days (×5 000)a. Self-made HAP whisker; b-d. No.1 to No.3 SiO2/HAP whiskers, respectively
圖7
2號SiO2/HAP晶須多孔陶瓷的能譜分析
Figure7.
Energy spectrum analysis of the No.2 SiO2/HAP whisker porous ceramics
2.5 生物毒性實驗
浸提液濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.4 g/mL時，2號SiO2/HAP晶須的RGR分別為95.75%±0.03%、99.92%±0.02%、101.64%±0.04%、105.24%±0.07%，2號SiO2/HAP晶須多孔陶瓷的RGR分別為112.39%±0.01%、126.16%±0.01%、123.83%±0.02%、102.95%±0.06%。上述細胞毒性均為0～1級，提示無細胞毒性。
3 討論
在骨組織工程研究中，支架材料是最重要的部分，是種子細胞附著及代謝的場所。因此，支架材料的形態和功能直接影響工程化組織的形態和功能。理想的支架材料需滿足以下條件[25]：① 良好的生物相容性。② 適宜的孔隙結構和孔徑，有利于體液循環與骨組織生長。通常最佳孔徑為150～500 μm，整體孔隙率>80%。③ 一定機械強度，為骨重建提供過渡性力學支撐。④ 良好的生物降解性能。目前，生物活性多孔陶瓷是骨組織工程支架材料研究的重點。HAP是人體骨和動物骨骼的主要無機成分，具有良好生物活性。然而，其在人體內降解速度極慢，無法與骨損傷部位的生產周期相匹配。此外，多孔陶瓷孔隙率越高，其機械性能越差。因此，本研究采用SiO2微球改性HAP晶須，以改善材料的生物降解性能；并以此為原料制備多孔陶瓷材料，以擠壓法制備微米級直通孔，方便大分子細胞的植入與生長；發泡法制備微納米級貫通孔，以達到載藥目的。
本研究通過調整TEOS含量、攪拌時間、煅燒溫度及保溫時間等因素，對HAP晶須表面進行了SiO2微球改性。隨著改性條件的改變，非結晶態SiO2微球的數量逐漸增多，直至完全覆蓋晶須表面，說明針對HAP晶須表面的SiO2微球改性具有可控性。基于制備的改性晶須，本研究利用機械發泡結合模具擠壓成型方法成功制備了顯氣孔率約為78%的SiO2/HAP晶須多孔陶瓷支架材料。我們對該多孔陶瓷的孔隙結構進一步觀察，發現排列整齊的縱向直通孔大小由設計的模具模芯大小控制，而產生的微納米級孔洞是由大量蓬松的SiO2/HAP晶須堆疊而成，其大小同時受到機械發泡的影響。此外，晶須表面附著的納米SiO2微球清晰可見，并未隨著制備工藝而產生破壞，說明晶須與SiO2微球之間并不是簡單附著，而是存在著很強的化學鍵合作用。由此可見，該材料是一種具有高孔隙率、三維復合孔隙結構的多孔陶瓷，這種獨特的孔隙結構能夠為干細胞的生長、增殖以及物質傳遞和交換提供良好通道。
軸向抗壓強度測試表明SiO2/HAP晶須多孔陶瓷的軸向抗壓強度可達1.0 MPa以上，相比于自制HAP晶須多孔陶瓷，其強度可提高近4倍。SiO2微球附著使得多孔陶瓷的軸向抗壓強度得到明顯提高，這是因為一方面，晶須表面的SiO2微球增大了晶須的粗糙程度，晶須之間受到壓力使得拔出、移動更為困難，對于外部壓力的抵抗也越強；另一方面，微球的存在使得晶須之間存在固位點，能有效釘扎在水溶性硅膠形成的硅氧三維網絡上，材料軸向抗壓強度明顯改善。此外，隨著SiO2微球附著量逐漸增大，多孔陶瓷的軸向抗壓強度呈現先上升后減小的趨勢。這是因為SiO2微球附著量過大，晶須完全被微球所包覆，微球的釘扎效應慢慢減弱，材料強度反而會下降。因此，本研究制備的SiO2/HAP晶須多孔陶瓷的強度可滿足臨床骨缺損修復需求[26]。
在SBF浸泡的63 d內，SiO2/HAP晶須多孔陶瓷的失重率均呈先增加后趨于平緩的變化趨勢，這是因為材料的降解行為主要表現為晶須表面磷灰石的沉積與降解。沉積是由于SBF是Ca的過飽和溶液，沉積大于溶解，因此樣品在浸泡之后質量均會增加。對比改性與未改性晶須制備的多孔陶瓷材料，可以發現SiO2修飾后的晶須磷灰石沉積速率大于未改性晶須，微球數目越多，磷灰石沉積速率越快。相比于未改性晶須，磷灰石首先沉積于SiO2微球附近，導致圓潤的微球畸變，甚至消失。因此推斷修飾的SiO2可為磷灰石提供沉積與降解位點，這對于延長晶須降解時間有一定幫助。此外，SiO2/HAP晶須及其多孔陶瓷材料的細胞毒性等級為0～1級，是一種合格的生物醫用材料。
綜上述，本研究制備的SiO2/HAP晶須及其多孔陶瓷生物活性良好，具有高孔隙率及三維復合孔隙結構，其軸向抗壓強度在1.0 MPa以上，無細胞毒性，有望成為一種新的骨組織工程支架材料。同時，材料在體內的性能仍有待進一步研究。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
作者貢獻聲明 萬鈺茜、顏廷亭：研究設計；萬鈺茜、諶強國：數據收集整理及統計分析，文章撰寫；陳慶華、顏廷亭：經費支持
生物活性陶瓷支架是目前骨組織工程材料研究的重點，它不僅具有良好的生物相容性，多孔表面形貌和孔道結構，以促進新生組織長入，而且能夠長期在體內保持原有性質不變，植入后對患者全身和局部無明顯毒副作用，且生物力學強度能滿足人體骨等硬組織修復的需求。然而，當前的生物活性陶瓷支架存在骨誘導活性差、生物功能單一等缺陷，極大限制了其臨床治療效果和應用范圍[1-3]。
羥基磷灰石（hydroxyapatite，HAP）晶須是一種單晶微納米級短纖維材料，具有極高的長徑比。晶須一般高純度擇優生長，原子排列高度有序，強度與完整晶體的理論值接近。而高強度、高模量和高伸長率等特點，使得晶須制品的物理強度優于其他纖維質材料。因此，晶須常被當作復合材料的增強體，或制備高強度復合材料的原材料[4-7]。其中，采用傳統陶瓷燒結工藝制備的HAP晶須多孔陶瓷，植入體內后能與界面上的骨組織形成強力化學鍵合，其類骨成分、無毒及無免疫原性等特性對新骨生長有一定誘導作用，多用于人體組織或器官的修復、替代或增強其功能[8-10]。此外，晶須的高比表面積和表面活性能極大地促進生物大分子或藥物如蛋白質、多肽類物質及疫苗等的黏附、運輸與傳遞[8-12]。然而，由于HAP晶須降解時間較長，制備的多孔陶瓷支架生物降解性有待提升[10]。為滿足細胞植入、增殖、分化及新骨生成需求，支架材料的孔徑一般要求在100～600 μm[13-15]。以單一造孔法制備多孔陶瓷，其孔徑大小與分布很難達到支架材料的要求。隨著多孔陶瓷制備方法的多樣化，聯用幾種造孔方法則可以很好地實現各種方法間的互補，使得以鈣磷鹽為原材料的多孔陶瓷在生物醫用領域有了嶄新前景[16-17]。然而，對于多孔陶瓷支架而言，其孔隙率越高，材料抗壓強度越低，植入后難以起到很好的支撐作用[18]。
針對上述問題，研究者們發現將硅（Si）元素引入HAP中可提高材料生物活性和促進骨組織生長[19-20]；另一方面，對HAP進行表面Si改性，可以增加晶須表面的粗糙程度以及固位力，有效改善晶須在有機樹脂或多孔陶瓷支架中的拔出能力，極大提高材料的力學性能[21-22]。鑒于此，本研究擬結合Si對晶須的雙重作用，以二氧化硅（SiO2）微球對HAP晶須表面進行改性后制備多孔陶瓷材料，以期改善材料的生物活性以及機械性能，為臨床提供一種新的骨組織工程材料。
1 材料與方法
1.1 實驗試劑及儀器
239T細胞（轉染腺病毒EIA基因的人腎上皮細胞）來源于解放軍 聯勤保障部隊920醫院。
以水熱共沉淀法自制HAP晶須[23]。正硅酸乙酯（TEOS，98%，新亞化工有限公司）；氨水（27%，天津市致遠化學試劑有限公司）；月桂酸鉀（99.7%，廣州市化學試劑廠）；羧甲基纖維素（99.7%，上海三愛思試劑有限公司）；水溶性硅膠（30%，南京化學試劑股份有限公司）；無水乙醇（99.7%，天津市風船化學試劑科技有限公司）
78HW-1數顯恒溫磁力攪拌器（杭州儀表電機有限公司）；101A-1恒溫干燥箱（上海市儀器總廠）；SRJX-4-13箱式電阻爐（滬南實驗儀器廠）；Wp700（MS-2079TW）LG微波爐（天津樂金電子電器有限公司）；HL-3B恒流泵（上海瀘西分析儀器廠有限公司）；D/max-220 X射線衍射（X-ray diffrac-tion，XRD）儀（理學公司，日本）；XL-30ESEN-TMP掃描電鏡（Philips公司，荷蘭）；HY-0230萬能試驗機（上海橫翼精密儀器有限公司）；Poremas-ter-33壓汞儀（Quantachrome公司，美國）；YXG26高壓蒸汽滅菌器（寧波久興醫療器械有限公司）；酶標儀（上海邁瑞爾生化科技有限公司）。
1.2 材料制備方法
采用St?ber法調控HAP表面SiO2微球的生長。TEOS含量、攪拌時間、煅燒溫度以及保溫時間都是晶須改性的影響因素。采用不同因素進行晶須改性，制備3種SiO2/HAP晶須[23-24]。見表1。具體方法：將TEOS與無水乙醇溶液混合制成A液，將HAP晶須與濃氨水、無水乙醇混合制成B液；采用雙相滴定法，控制pH值；在乙醇溶液中以氨水為催化劑，TEOS發生水解及縮合反應，熱處理后形成粒徑均勻的SiO2顆粒，由于氨水與HAP晶須處于B液液滴中，SiO2顆粒將在HAP晶須上生成。泡沫預聚體的制備：以月桂酸鉀為發泡劑，羧甲基纖維素為泡沫穩定劑（二者比例為1∶2），水溶性硅膠為膠黏劑，以機械攪拌形式產生泡沫預聚體。多孔陶瓷制備：稱取7 g 自制HAP晶須或3種SiO2/HAP晶須少量多次加入泡沫預聚體中，攪拌0.5 h，過濾后再陳化0.5 h得到均勻的陶瓷泥漿。以自制模具對陳化后陶瓷泥漿進行擠壓成型，以微波加熱方式對坯體進行快速定型，然后置于室溫下干燥12 h。于650℃保溫6 h排除有機物，最終得到4種多孔陶瓷樣品。
表1
制備3種SiO2/HAP晶須的因素
Table1.
Factors for prepared 3 types of SiO2/HAP whiskers
1.3 觀測指標
1.3.1 SiO2/HAP晶須物相與形貌分析
取自制HAP晶須以及3種SiO2/HAP晶須進行XRD分析，測試范圍10°～90°，掃描速度4°/min；掃描電鏡觀察晶須表面形貌特征。
1.3.2 多孔陶瓷的軸向抗壓強度
取自制HAP晶須多孔陶瓷和3種SiO2/HAP晶須多孔陶瓷，依據GB/1041-92標準，采用萬能試驗機對樣品進行軸向抗壓強度測定。每種材料選取5個樣品進行測試，樣品為邊長約10 mm的立方塊體，壓縮速率為1 mm/min。
1.3.3 SiO2/HAP晶須多孔陶瓷的表征
根據力學測試結果篩選力學性能最佳的SiO2/HAP晶須多孔陶瓷，掃描電鏡觀察其孔隙結構，并依照GB/T1966-1996標準測定其顯氣孔率，采用壓汞儀表征其孔徑分布。
1.3.4 多孔陶瓷的生物降解性能
取自制HAP晶須多孔陶瓷和3種SiO2/HAP晶須多孔陶瓷，測量其濕重后，將樣品置于內含模擬體液（simulated body fluid，SBF）的密閉樣品管中 ［樣品質量與SBF體積比為（0.1～0.2）g∶1 mL］。將樣品管置于（37.0±0.5）℃培養箱，每天更換SBF1次，于不同時間點（1～8 d，12、14、17、20、27、41、47、52、57、63 d）測量浸泡樣品濕重，計算失重率，即各時間點樣品濕重占初始濕重的百分比，并繪制各多孔陶瓷的體外降解曲線。取失重率最大對應時間點的各材料進行掃描電鏡觀察。選擇在SBF中鈣磷沉積狀況良好的SiO2/HAP晶須多孔陶瓷，采用能譜儀測定其元素組成。
1.3.5 生物毒性實驗
選取抗壓強度以及在SBF中鈣磷沉積狀況良好的SiO2/HAP晶須多孔陶瓷，根據GB/T14233-2005標準，采用細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8）法對浸提液進行細胞毒性實驗。
具體步驟：① 浸提液制備：用含10%FBS的培養基制備濃度為0.05、0.1、0.2、0.4 mg/L的水溶液，置于37℃、5%CO2培養箱浸提各材料（24±2）h。② 接種細胞：培養293T細胞至4～6代，用含10%FBS的培養基配成單個細胞懸液，以每孔（1～10）×103個細胞接種至96孔板，置于37℃、5%CO2培養箱接種12 h，選取其中1孔作為空白對照組。③ 加浸提液：待觀測到細胞貼壁后，往培養板中每孔加入100 μL各樣品的浸提液作為實驗組，置于37℃、5%CO2培養箱繼續培養24 h。④ CCK-8檢測：每孔加入CCK-8溶液10 μL，繼續培養2 h后停止培養，于490 nm波長下測定各孔吸光度（A）值，按以下公式計算細胞相對增殖度（relative growth rate，RGR）：RGR=實驗組平均A值/空白對照組A值×100%。根據GB/T14233-2005標準對材料的細胞毒性進行分級：0級，RGR≥100%；1級，RGR為75%～99%；2級，RGR為50%～74%；3～5級，RGR≤49%。0～1級為無細胞毒性。
1.4 統計學方法
采用Office Excel軟件進行統計分析。計量資料行正態性檢驗，均符合正態分布，數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 SiO2/HAP晶須物相與形貌分析
XRD圖譜顯示，自制HAP晶須的衍射峰與PDF#74-0565標準卡片比對良好。其中，（211）、（300）、（112）為HAP晶須典型的特征晶面。相比于HAP晶須，1～3號SiO2/HAP晶須的（112）晶面衍射強度逐漸降低直至消失，而（211）、（300）晶面的衍射峰半峰寬卻逐漸增大，這是由于所有SiO2/HAP晶須在20°～25° 出現了非結晶態SiO2的特征峰群，（112）晶面的衍射峰與（300）晶面的衍射峰重疊[19]。見圖1。
圖1
自制HAP晶須及3種SiO2/HAP晶須的XRD圖譜
Figure1.
X-ray diffraction patterns of self-made HAP whisker and 3 types of SiO2/HAP whiskers
掃描電鏡觀察示，自制HAP晶須表面光滑，無任何異物顆粒存在；與其相比，3種SiO2/HAP晶須表面附著了許多圓潤、均勻、附著性良好且呈分散狀態的微球，微球球徑約200 nm。見圖2。
圖2
自制HAP晶須及3種SiO2/HAP晶須掃描電鏡觀察（×10 k）
a. 自制HAP晶須；b～d. 分別為1～3號SiO2/HAP晶須
Figure2. Scanning electron microscopy images of the self-made HAP whisker and 3 types of SiO2/HAP whiskers (×10 k)a. Self-made HAP whisker; b-d. No.1 to No.3 SiO2/HAP whiskers, respectively
2.2 多孔陶瓷的軸向抗壓強度
自制HAP晶須多孔陶瓷和1、2、3號SiO2/HAP晶須多孔陶瓷軸向抗壓強度分別為（0.25±0.12）、（0.66±0.18）、（1.09±0.22）、（0.99±0.08）MPa。3種SiO2/HAP晶須多孔陶瓷的軸向抗壓強度均顯著大于自制HAP晶須多孔陶瓷，其中2號SiO2/HAP晶須多孔陶瓷的軸向抗壓強度最大，但差異均無統計學意義（P>0.05）。
2.3 SiO2/HAP晶須多孔陶瓷的表征
2號SiO2/HAP晶須多孔陶瓷掃描電鏡觀察示，其孔隙結構由排列整齊的縱向直通孔及大量微納米級貫通孔構成，顯氣孔率約78%。直通孔呈圓柱狀，直徑為（403.16±26.41）μm，直通孔間的間距約500 μm，直通孔大小主要由設計的成型模芯特性決定。直通孔斷面由大量蓬松的SiO2/HAP堆疊而成，側壁上可以觀察到很多孔徑10～80 μm的小孔，這些氣孔大部分由機械發泡產生，一部分為大量晶須無序堆疊產生。該多孔陶瓷的孔徑分布主要集中在5～50 μm和100～150 μm。見圖3、4。其中，在5～50 μm范圍內汞（Hg）的浸入量約1.4 mm3/g，遠高于在100～200 μm范圍內的Hg浸入量（約0.25 mm3/g），說明在多孔陶瓷中大部分微納米孔的孔徑在5～50 μm。結合掃描電鏡觀察結果可知，直徑>20 μm的微孔來源于發泡劑機械發泡，而直徑<20 μm的微孔則是晶須隨機堆積所致。此外，在100～200 μm范圍的微孔則可能是由不均勻發泡所產生的大氣泡造成的。
圖3
2號SiO2/HAP晶須多孔陶瓷掃描電鏡觀察
a. 直通孔整體觀察（×100）；b. 直通孔斷面（×80）；c. 斷面的內壁形貌（×500）；d. 發泡后殘留的氣孔（×10 k）
Figure3. Scanning electron microscopy images of the pore structure of the porous ceramics prepared by No.2 SiO2/HAP whiskersa. Straight-through holes (×100); b. Sections of the straight-through holes (×80); c. Inwall of the sections (×500); d. Residual pores after foaming (×10 k)
圖4
2號SiO2/HAP晶須多孔陶瓷孔徑分布
Figure4.
Pore size distributions of the porous ceramics prepared by No.2 SiO2/HAP whiskers
2.4 多孔陶瓷的生物降解性能
SBF浸泡63 d內，各種多孔陶瓷材料失重率均呈先增加后趨于平緩的變化趨勢。浸泡7 d后所有樣品的失重率急劇增加，最高可達25%。取該時間點的各種多孔陶瓷材料行掃描電鏡觀察示，1～3號SiO2/HAP晶須多孔陶瓷中晶須表面圓潤的SiO2微球形狀已嚴重畸變，甚至在2、3號SiO2/HAP晶須多孔陶瓷中已完全消失；孔隙內部SiO2微球上覆蓋了一定厚度的團聚物。對2號SiO2/HAP晶須多孔陶瓷中出現的團聚物進行能譜分析，發現其基本組成為Si、磷（P）、氧（O）、鈣（Ca）元素。其中，Ca/P原子比為1.43，提示這些沉積物為缺鈣型磷灰石結晶，材料具有良好生物活性。見圖5～7。
圖5
各種多孔陶瓷在SBF浸泡63 d內的體外降解曲線
Figure5.
In vitro degradation curves of various porous ceramics immersed in simulated body fluid within 63 days
圖6
SBF浸泡7 d各多孔陶瓷掃描電鏡觀察（×5 000）
a. 自制HAP晶須多孔陶瓷；b～d. 分別為1～3號SiO2/HAP晶須多孔陶瓷
Figure6. Scanning electron microscopy images of various porous ceramics immersed in simulated body fluid for 7 days (×5 000)a. Self-made HAP whisker; b-d. No.1 to No.3 SiO2/HAP whiskers, respectively
圖7
2號SiO2/HAP晶須多孔陶瓷的能譜分析
Figure7.
Energy spectrum analysis of the No.2 SiO2/HAP whisker porous ceramics
2.5 生物毒性實驗
浸提液濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.4 g/mL時，2號SiO2/HAP晶須的RGR分別為95.75%±0.03%、99.92%±0.02%、101.64%±0.04%、105.24%±0.07%，2號SiO2/HAP晶須多孔陶瓷的RGR分別為112.39%±0.01%、126.16%±0.01%、123.83%±0.02%、102.95%±0.06%。上述細胞毒性均為0～1級，提示無細胞毒性。
3 討論
在骨組織工程研究中，支架材料是最重要的部分，是種子細胞附著及代謝的場所。因此，支架材料的形態和功能直接影響工程化組織的形態和功能。理想的支架材料需滿足以下條件[25]：① 良好的生物相容性。② 適宜的孔隙結構和孔徑，有利于體液循環與骨組織生長。通常最佳孔徑為150～500 μm，整體孔隙率>80%。③ 一定機械強度，為骨重建提供過渡性力學支撐。④ 良好的生物降解性能。目前，生物活性多孔陶瓷是骨組織工程支架材料研究的重點。HAP是人體骨和動物骨骼的主要無機成分，具有良好生物活性。然而，其在人體內降解速度極慢，無法與骨損傷部位的生產周期相匹配。此外，多孔陶瓷孔隙率越高，其機械性能越差。因此，本研究采用SiO2微球改性HAP晶須，以改善材料的生物降解性能；并以此為原料制備多孔陶瓷材料，以擠壓法制備微米級直通孔，方便大分子細胞的植入與生長；發泡法制備微納米級貫通孔，以達到載藥目的。
本研究通過調整TEOS含量、攪拌時間、煅燒溫度及保溫時間等因素，對HAP晶須表面進行了SiO2微球改性。隨著改性條件的改變，非結晶態SiO2微球的數量逐漸增多，直至完全覆蓋晶須表面，說明針對HAP晶須表面的SiO2微球改性具有可控性。基于制備的改性晶須，本研究利用機械發泡結合模具擠壓成型方法成功制備了顯氣孔率約為78%的SiO2/HAP晶須多孔陶瓷支架材料。我們對該多孔陶瓷的孔隙結構進一步觀察，發現排列整齊的縱向直通孔大小由設計的模具模芯大小控制，而產生的微納米級孔洞是由大量蓬松的SiO2/HAP晶須堆疊而成，其大小同時受到機械發泡的影響。此外，晶須表面附著的納米SiO2微球清晰可見，并未隨著制備工藝而產生破壞，說明晶須與SiO2微球之間并不是簡單附著，而是存在著很強的化學鍵合作用。由此可見，該材料是一種具有高孔隙率、三維復合孔隙結構的多孔陶瓷，這種獨特的孔隙結構能夠為干細胞的生長、增殖以及物質傳遞和交換提供良好通道。
軸向抗壓強度測試表明SiO2/HAP晶須多孔陶瓷的軸向抗壓強度可達1.0 MPa以上，相比于自制HAP晶須多孔陶瓷，其強度可提高近4倍。SiO2微球附著使得多孔陶瓷的軸向抗壓強度得到明顯提高，這是因為一方面，晶須表面的SiO2微球增大了晶須的粗糙程度，晶須之間受到壓力使得拔出、移動更為困難，對于外部壓力的抵抗也越強；另一方面，微球的存在使得晶須之間存在固位點，能有效釘扎在水溶性硅膠形成的硅氧三維網絡上，材料軸向抗壓強度明顯改善。此外，隨著SiO2微球附著量逐漸增大，多孔陶瓷的軸向抗壓強度呈現先上升后減小的趨勢。這是因為SiO2微球附著量過大，晶須完全被微球所包覆，微球的釘扎效應慢慢減弱，材料強度反而會下降。因此，本研究制備的SiO2/HAP晶須多孔陶瓷的強度可滿足臨床骨缺損修復需求[26]。
在SBF浸泡的63 d內，SiO2/HAP晶須多孔陶瓷的失重率均呈先增加后趨于平緩的變化趨勢，這是因為材料的降解行為主要表現為晶須表面磷灰石的沉積與降解。沉積是由于SBF是Ca的過飽和溶液，沉積大于溶解，因此樣品在浸泡之后質量均會增加。對比改性與未改性晶須制備的多孔陶瓷材料，可以發現SiO2修飾后的晶須磷灰石沉積速率大于未改性晶須，微球數目越多，磷灰石沉積速率越快。相比于未改性晶須，磷灰石首先沉積于SiO2微球附近，導致圓潤的微球畸變，甚至消失。因此推斷修飾的SiO2可為磷灰石提供沉積與降解位點，這對于延長晶須降解時間有一定幫助。此外，SiO2/HAP晶須及其多孔陶瓷材料的細胞毒性等級為0～1級，是一種合格的生物醫用材料。
綜上述，本研究制備的SiO2/HAP晶須及其多孔陶瓷生物活性良好，具有高孔隙率及三維復合孔隙結構，其軸向抗壓強度在1.0 MPa以上，無細胞毒性，有望成為一種新的骨組織工程支架材料。同時，材料在體內的性能仍有待進一步研究。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
作者貢獻聲明 萬鈺茜、顏廷亭：研究設計；萬鈺茜、諶強國：數據收集整理及統計分析，文章撰寫；陳慶華、顏廷亭：經費支持
