引用本文： 李茂源, 鄭國爽, 楊佳慧, 陳小芳, 許劍鋒, 趙德偉. 骨/軟骨免疫調節水凝膠構建策略與應用研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2023, 37(11): 1423-1430. doi: 10.7507/1002-1892.202305081 復制
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骨/軟骨損傷的治療是目前骨科難題，常累及關節軟骨及軟骨下骨，關節軟骨結構特殊，一旦損傷很難修復，將導致嚴重關節功能障礙[1]。傳統治療方法，如自體/同種異體軟骨細胞移植等，均未取得滿意療效[2]。近年來，組織工程技術的出現為骨/軟骨缺損治療提供了新思路，采用該技術有望通過組裝和增強種子細胞、生長因子及支架材料生物學特性，提高骨/軟骨再生能力[3]。
研究表明，免疫系統在直接或間接實現骨/軟骨成功再生方面發揮著重要作用[4-5]。免疫細胞的穩態顯著影響骨/軟骨重塑和再生，其通過分泌各種細胞因子直接影響炎癥進展、干細胞募集和分化。巨噬細胞是免疫反應過程的調節中樞，在骨/軟骨缺損修復和再生過程中起到關鍵作用。巨噬細胞具有M1型和M2型兩種不同極化狀態，且這兩種極化狀態可逆。M1型巨噬細胞通過激活NF-κB途徑分泌TNF-α、IL-1、IL-6等促炎因子阻礙骨/軟骨缺損后的愈合過程；而M2型巨噬細胞則通過誘導IL-10、精氨酸酶 1、BMP-2和TGF-β等細胞因子高表達，加速組織修復與再生進程[6]。而巨噬細胞M1/M2比例失衡可以引起慢性炎癥反應，導致骨關節炎等多種疾病的發展[7]。所以，調控骨/軟骨損傷中的免疫反應是促進組織快速愈合的研究方向。但目前研究的骨/軟骨組織工程修復方法均忽略了恢復與改善被破壞的骨/軟骨組織免疫微環境，導致遠期治療效果欠佳。因此，通過免疫調節增強再生支架材料的骨/軟骨組織修復能力，是骨/軟骨組織工程未來研究方向。
水凝膠具有類似于骨/軟骨細胞外基質的三維網絡結構，能夠維持骨/軟骨細胞形態和促進相關蛋白表達，被認為是最有前景的骨/軟骨組織工程支架材料之一[8-9]。近年來，利用天然或人工材料構建的“免疫調節水凝膠”被引入骨/軟骨修復領域。通過調節該凝膠的物理、化學性質及負載的免疫相關制劑，可以激活機體的免疫系統進行免疫應答，誘導形成有利于骨/軟骨再生的免疫微環境，從而增強骨/軟骨細胞的再生修復能力，最終發揮促進骨/軟骨修復作用[10-12]（圖1）。
圖1
免疫調節水凝膠修復骨/軟骨缺損作用機制示意圖
Figure1.
Schematic diagram of mechanism of immunomodulating hydrogels in repairing bone/cartilage defects
但目前具有骨/軟骨免疫調控特性的免疫調節水凝膠研究尚處于初級階段。現對機體損傷后免疫細胞一般免疫應答及相關免疫機制，骨/軟骨缺損修復的免疫調節水凝膠構建策略，以及基于上述策略制備的免疫調節水凝膠在骨/軟骨組織工程中的應用研究進行深入總結，以期為骨/軟骨免疫調節水凝膠的開發研究提供參考。
1 免疫系統
免疫系統通過協調炎癥級聯反應對有害刺激物（包括受損細胞、病原體和無菌損傷等）侵襲進行防御，這種級聯反應涉及一系列連續過程，包括威脅檢測、危險清除和穩態恢復[13-14] 。免疫系統分為先天性和適應性兩種不同類型。先天性免疫系統是有害刺激物侵襲的第一反應者，其包括中性粒細胞、單核細胞和巨噬細胞。當這些先天性免疫細胞未能清除風險時，它們可以調動 B 細胞和 T 淋巴細胞的適應性免疫，從而特異性消除威脅[15]。在支架材料激起的炎癥過程中，免疫細胞除了清除凋亡細胞的碎片、細胞外基質片段和病原體外，還參與組織修復/再生過程。它們既可以減輕炎癥，增強干細胞/組織細胞增殖和分化，促進組織修復；也可增強炎癥反應，妨礙細胞增殖分化，最終導致瘢痕形成[16]。因此，為了實現所需的骨/軟骨組織再生，了解支架材料引起的不同免疫細胞的免疫應答機制非常重要。
1.1 中性粒細胞
中性粒細胞屬于多形核家族，起源于BMSCs，是先天性免疫細胞，被認為是響應損傷或外部入侵時向損傷部位遷移的第1個細胞[17]。中性粒細胞一旦到達損傷部位，立即參與消除感知到的威脅。它們既可以分泌殺菌物質和蛋白酶來破壞病原體，也可以產生中性粒細胞胞外陷阱來吞噬細菌[18]。另一方面，中性粒細胞還可以分泌VEGF [19]、生長因子[20]和基質金屬蛋白酶[21]，促進血管生成、刺激細胞增殖和細胞外基質重塑。通常，中性粒細胞的蓄積被認為對組織再生有害[22]。但有研究表明中性粒細胞可以參與巨噬細胞極化，有利于組織再生[23]。
1.2 巨噬細胞
組織固有巨噬細胞主要來自胚胎形成期間的卵黃囊，在組織發育過程中發揮關鍵作用，有助于維持組織穩態[24]。機體受到損傷后，大量單核細胞通過感知趨化因子和細胞因子信號被募集到損傷部位。這些單核細胞與固有巨噬細胞在參與炎癥和隨后的組織愈合過程時發生顯著的表型和功能變化，通過分泌IL-1、IL-8、單核細胞趨化蛋白 1和巨噬細胞炎癥蛋白1β，在植入部位募集更多的單核細胞，并促進巨噬細胞表型轉化[25]。這些單核及巨噬細胞通過釋放炎癥介質和組織重塑相關酶（例如基質金屬蛋白酶）、促進成纖維細胞遷移和分泌相關細胞因子、生長因子，參與炎癥發生、發展過程，在炎癥和組織再生中發揮重要作用[26]。巨噬細胞根據功能通常分為經典活化（M1型）和替代活化（M2型）兩類[27]。刺激NK細胞所產生的干擾素c、樹突狀細胞的輔助性 T 淋巴細胞 1（T helper cell-1，Th1）和 TNF-α可以誘導巨噬細胞M1型極化，引起炎癥因子分泌，促進炎癥并募集參與獲得性免疫的淋巴細胞[28]。另一方面，粒細胞和Th2細胞產生的 IL-4 以及單核細胞產生的 IL-10 觸發 M2 型極化。這些 M2型巨噬細胞通過細胞外基質沉積和細胞增殖啟動炎癥下調，促進切口愈合和組織修復[29]。然而，持續激活的M1、M2型巨噬細胞可分別觸發組織損傷或纖維化。并且，巨噬細胞還可通過吞噬異物影響免疫反應。如果異物持續存在，巨噬細胞進一步分化并最終融合成異物巨細胞，包括多達100個細胞核。這些細胞可在生物材料周圍形成纖維囊，將其與周圍組織隔離[30]。此外，巨噬細胞的極化狀態并不恒定，可受環境的調節[31]。由于其顯著的可塑性和功能性，巨噬細胞已成為免疫調節研究熱點。
1.3 T淋巴細胞
除了先天性免疫系統，適應性免疫系統也參與宿主對支架材料的反應。T 淋巴細胞屬于適應性免疫系統，在特異性免疫應答中發揮關鍵作用，是炎癥消退和組織再生的強效靶標，在組織修復中也發揮重要作用。它們可以分泌生長因子和細胞因子，如IGF-1、FGF-1α和IL-17A，促進組織細胞穩態和免疫細胞募集[32]。T 淋巴細胞主要附著在巨噬細胞上，促進巨噬細胞黏附和融合，調節巨噬細胞極化[33]。與巨噬細胞一樣，T 淋巴細胞存在由不同趨化因子和細胞因子觸發的細胞亞群（如輔助性T淋巴細胞、抑制性T淋巴細胞和細胞毒性T淋巴細胞），這些細胞亞群具有不同功能。此外，T 淋巴細胞和巨噬細胞可以共同釋放炎癥介質，募集炎癥效應細胞。并且，這些炎癥介質隨著時間推移而減少[34]。在小鼠模型中發現由Th1細胞分泌的 IFN-γ可抑制骨形成[35]。相反，Th2細胞通過調節抗炎性 M2 型巨噬細胞（由細胞因子如 IL-4 和 IL-10誘導）的生成來降低炎癥反應[36]。Treg細胞可以調節中性粒細胞向損傷部位遷移[37]；還有助于抑制單核細胞分泌炎癥因子，并促進巨噬細胞向 M2 型極化[38]。如上述，常規T淋巴細胞分泌細胞因子（如 INF-γ和TNF-α）以維持炎癥。相反，Treg細胞產生抗炎因子，以抑制這些常規 T 淋巴細胞的活性。除了對其他免疫細胞的調節外，還發現 Treg 細胞對組織細胞有直接影響[39]。
綜上述，免疫系統在應對組織損傷和隨后的組織再生中起著至關重要的作用。近年來，通過生物材料適當調控組織內免疫應答反應，以快速實現機體組織修復愈合過程，是組織修復領域研究熱點。
2 用于骨/軟骨修復的免疫調節水凝膠構建策略
水凝膠作為一種新興的生物材料，具有良好生物相容性，可以為細胞生長提供類似細胞外基質的微環境，還可以通過負載生物活性因子、藥物或細胞對免疫反應進行目的性調控，形成有利于組織再生的微環境，在組織修復方面展現出巨大潛力。此外，水凝膠的理化性質具有可調性。如通過調節交聯劑的種類和濃度，可以合成不同彈性模量（剛度）和孔徑（孔隙率）的水凝膠；利用特殊制備方法，可以在水凝膠表面構建微尺度或納米級形貌。水凝膠的化學性質同樣為其設計和優化提供了可能。例如，通過接枝一些相關高分子聚合物或者生物活性基團，可以改變水凝膠表面的親/疏水性；通過表面改性，也可以改變水凝膠表面所帶電荷；通過改變水凝膠表面不同生物活性基團和分子結構，可以進一步影響細胞行為[40-41]。因此，通過調控水凝膠特性影響宿主免疫細胞，進而調控免疫反應，對于免疫調節水凝膠的開發和研究至關重要。
免疫調節能力是免疫調節水凝膠在骨/軟骨組織工程應用的關鍵，直接決定了水凝膠修復受損骨/軟骨效果。近幾十年來，人們嘗試了多種控制免疫細胞極化和細胞行為的方法，以達到抗炎效果（促進組織再生和功能恢復）。一旦免疫調節水凝膠植入機體，免疫系統就會根據其物理、化學性質或生物信號作出響應，進而對免疫微環境進行目的性調控，最終形成利于骨/軟骨修復的免疫微環境。
骨/軟骨組織工程所需的免疫調節水凝膠構建策略主要包括以下三方面：① 物理性質調節：包括對水凝膠基質的機械強度、結構及表面特性（即剛度、孔隙率和表面形貌）等進行調節；② 化學性質調節：通過改變水凝膠的化學成分，進而改變其濕潤度（親/疏水性）、電化學性質等進行調節；③ 生物活性分子遞送作用調節：利用水凝膠可控釋的特性，將其作為載體遞送細胞因子、基因等多種生物活性成分，應用于免疫微環境的調控，促進組織穩態和細胞再生。
2.1 通過調節物理性質構建免疫調節水凝膠
2.1.1 水凝膠基質剛度
生物材料的基質剛度是組織工程支架設計的關鍵參數。研究表明，中性粒細胞的遷移黏附受水凝膠基質剛度的影響[42]。水凝膠根據基質剛度可分為軟基質及硬基質兩類，一般而言軟基質水凝膠大部分誘導免疫細胞向免疫耐受或切口愈合表型轉變，而硬基質水凝膠更易引起免疫細胞朝著免疫激活表型轉變。Jannat等[43]研究了中性粒細胞在模擬體內環境中對不同基質剛度水凝膠的反應。結果證明，與基質剛度為2 kPa的軟基質水凝膠相比，在12 kPa硬基質水凝膠上生長的中性粒細胞更易進一步極化。此外，水凝膠的基質剛度也會影響巨噬細胞的行為。一般情況下，軟基質水凝膠可誘導巨噬細胞向抗炎性表型M2 型極化，導致IL-10、CD206和精氨酸酶1分泌增強；而在硬基質水凝膠上生長的巨噬細胞傾向于朝促炎性表型 M1型極化，表達高水平IL-1β、TNF-α、趨化因子配體11和趨化因子配體20等促炎因子[44-47]，且硬基質水凝膠顯著增強了細胞的擴散和遷移。同樣，T淋巴細胞的基因表達和代謝也受到水凝膠基質剛度的影響。研究顯示，硬基質水凝膠顯著提高了適應性免疫細胞中IL-12、IL-22和IFN-c等基因的表達[48-49]。
上述研究說明水凝膠的基質剛度可以影響巨噬細胞、中性粒細胞和淋巴細胞等多種免疫細胞，通過對這些免疫細胞的調控，可營造有利于骨/軟骨修復的微環境。
2.1.2 水凝膠孔隙率
在天然組織中，細胞外基質的多孔結構可以影響細胞之間的物質傳遞和胞間通訊[50]，因此水凝膠孔隙率在調控免疫細胞遷移和浸潤方面發揮著重要作用。Moshaverinia等[51]通過增加交聯劑濃度，開發了一種平均孔徑為600 nm且載有BMSCs的藻酸鹽水凝膠。結果顯示，該納米多孔水凝膠能夠抑制T淋巴細胞及促炎因子的分泌，從而減少 BMSCs 凋亡，促進小鼠體內骨再生。此外，孔隙率還會影響巨噬細胞表型極化[52]。然而，孔隙率影響免疫調節的作用機制尚無定論，還需要更多研究來系統證明。
2.1.3 水凝膠表面形貌
通過調節水凝膠的表面形貌引發理想的免疫應答是構建免疫調節水凝膠的另一種策略，其優點在于避免了體內復雜微環境的干擾。目前，通過軟光刻法制備的微槽圖案水凝膠已被用于調控巨噬細胞反應，它能通過調控骨軟骨受損過程中的炎癥反應來促進組織細胞修復；與無圖案水凝膠相比，該水凝膠上的巨噬細胞M2 標記物 IL-1RA分泌顯著增加[53]。Chen等[54]的研究表明粗糙度為68 nm的聚丙烯酸凝膠可以調控巨噬細胞炎癥因子的表達，進而調控免疫微環境，促進骨形成。然而，雖然水凝膠結構特性免疫調節作用很明顯，但目前對此研究有限，需要更多的實驗數據來明確其作用機制。另一方面，在水凝膠表面或內部實現精確的幾何圖案構建難度較大，仍需要研發對水凝膠結構進行精準構建的新技術。
2.2 通過調節化學性質構建免疫調節水凝膠
生物體內的細胞不僅受到物理刺激影響，還受到化學信號的誘導。化學信號可以影響細胞的黏附、遷移、增殖和分化等。因此，通過調節水凝膠的化學性質也可以構建有利于骨/軟骨修復的免疫微環境。
2.2.1 親/疏水性
通過調節材料表面濕潤度來調控材料親/疏水性，能夠改變免疫細胞黏附性能。已有研究表明，巨噬細胞優先黏附在疏水性凝膠表面。但在親水性聚乙二醇水凝膠上生長的巨噬細胞中觀察到更高水平的炎癥因子表達，如 TNF-α和IL-1β。Xu等[55]通過將疏水性烷基分支連接到甲基丙烯酸酯化結冷膠（methacrylated gellan gum，MGG）上，制備出親水性不同的MGG水凝膠，而水凝膠硬度和組成沒有變化，發現在疏水性凝膠表面M1 型巨噬細胞相關細胞因子分泌顯著增加。此外，巨噬細胞的吞噬功能也可以通過改變凝膠親/疏水性來調控。例如，在親水性表面上的巨噬細胞吞噬作用較低，證明了親/疏水性在吞噬作用中的重要性[56]。
2.2.2 電化學性質
電信號幾乎參與活細胞和生物體的所有功能。研究表明，植入物的表面電荷密度可影響吸收蛋白質的量和構象，從而進一步影響免疫應答[57]。通過對水凝膠官能團的修飾，可以設計帶有不同表面電荷的水凝膠來調控機體細胞的免疫應答。通常帶正電荷的水凝膠可誘導巨噬細胞擴散，而帶負電荷的水凝膠可抑制其擴散。并且與帶負電荷的水凝膠相比，巨噬細胞與異物巨細胞的融合在帶正電荷的水凝膠上更明顯。這種細胞擴散和融合的增強歸因于帶正電荷的水凝膠表面和帶負電荷的細胞膜之間的靜電相互作用[58]。一項關于多結構域肽（multidomain peptide，MDP）水凝膠的研究顯示，對于帶正電荷的MDP K2（SL）6K2 和 R2（SL）6R2（氨基酸序列）可以引起小鼠體內組織明顯的異物反應，表現為多個免疫細胞浸潤和高度膠原沉積；相反，帶負電荷的 MDP E2（SL）6E2 和D2（SL）6D2的巨噬細胞低程度浸潤，未發現膠原沉積，表明異物反應水平較低[59]。
2.3 通過生物活性分子遞送釋放影響免疫應答
水凝膠因具有良好生物相容性、可調孔隙率和易于修飾等特性，成為負載外源性生物活性分子的理想支架。其可以通過緩控釋放免疫調節成分來調控免疫反應，從而影響免疫應答，加速骨/軟骨修復進程。
2.3.1 通過孔徑控制釋放影響免疫應答
水凝膠的孔徑不僅能直接影響細胞存活率，還可以調節生物活性分子的釋放，引起所需的免疫調節。例如，Li等[60]用水溶性羥丁基殼聚糖（hydroxybutyl chitosan，HBC）和氧化硫酸軟骨素（oxidized chondroitin sulfate，OCS）通過席夫堿反應制備共價水凝膠，經過材料成分優化工藝，研制出平均孔徑為 100 μm的均勻多孔結構可注射水凝膠。結果表明，人脂肪MSCs可在 HBC/OCS水凝膠中三維培養，保持良好活力。并且，該孔徑的水凝膠降解時間延長，有利于負載的活性分子釋放，降低巨噬細胞促炎因子表達水平，植入小鼠體內后可在7 d內抑制急性免疫反應。
2.3.2 通過靜電作用控制釋放影響免疫應答
由于核酸的電學特性，靜電作用可作用于免疫調節水凝膠上負載的生物活性分子。例如，Kim等[61]用陽離子聚電解質共聚物（MP-NH2）和陰離子BMP-2制備了一種可注射、靜電結合、原位形成的水凝膠。實驗表明，水凝膠注射到小鼠體內后，幾乎立即形成含有 BMP-2的靜電載水凝膠儲庫。BMP-2與MP-NH2的靜電引力作用可影響水凝膠內部BMP-2特征和穩定性，使其在體內停留時間顯著延長，更持久地發揮作用，從而促進人鼻甲MSCs成骨分化。
2.3.3 通過環境響應控制釋放影響免疫應答
細胞外基質是一種具有高度動態性的微環境。而免疫調節水凝膠具有時間和環境可控的特性，因此通過對細胞微環境的調控可以實現對免疫反應的調控。例如，Li等[62]在陽極氧化鈦表面引入了由羥丙基甲基纖維素、殼聚糖（chitosan，CS）、甘油組成的熱敏水凝膠。在正常體溫時水凝膠處于溶膠狀態，可以使巨噬細胞向 M2型極化，促進組織修復；而在細菌感染引起的高溫情況下，溶膠會轉為凝膠狀態，使巨噬細胞向 M1型極化，促進炎癥。實驗表明，這種水凝膠對生理環境的智能識別和調節，與溶膠和凝膠狀態下不同的羥丙基甲基纖維素、CS和甘油釋放量有關。
3 免疫調節水凝膠在骨/軟骨組織工程中的應用
3.1 生長因子和藥物遞送載體
免疫調節水凝膠作為生長因子和藥物的遞送載體，在體內指定部位進行控釋，是其在骨/軟骨組織工程中的主要應用方式。例如，Ji等[63]利用CS微球和羥丙基甲殼素（hydroxypropyl chitin，HPCH）構建了具有巨噬細胞調控特性的溫敏水凝膠藥物遞送系統，并將二甲氧基甘氨酸（dimethyloxalyl glycine，DMOG）負載于溫敏HPCH水凝膠（HD），將Kartogenin接枝于多孔CS微球（kartogenin conjugated CS-porous microspheres，CSK-PMS），共同組成HD/CSK-PMS復合支架，可有效調節缺損部位的再生微環境，募集自體干細胞并提供豐富的細胞黏著位點，實現局部巨噬細胞的M2型極化并促進骨軟骨再生。可快速降解的HD有利于透明軟骨再生，而高穩定性的CSK-PMS則支持軟骨內骨化和軟骨下骨的再生，為再生軟骨提供支撐。體外和體內實驗評價顯示，基于HD/CSK-PMS分層結構的可控藥物輸送組合可有效調控免疫微環境，并促進原位骨軟骨的再生。上述研究結果揭示了免疫微環境和軟骨下骨對高質量軟骨修復的重要性。
同樣，Li等[64]通過與抗破骨細胞藥物雙膦酸鹽（bisphosphonate，BP）的配位鍵組裝制備了仿生透明質酸納米復合水凝膠（hyaluronic acid-BP，HA-BP），HA-BP 在酸性環境下表現出負載 BP 的加速釋放。體外研究表明，HA-BP通過釋放的BP抑制RAW264.7細胞向成熟破骨細胞分化過程。此外，HA-BP可以支持原代巨噬細胞向前破骨細胞的初始分化，此分化過程被認為是骨再生過程中所必需的；體內評價也表明HA-BP可增強骨原位再生。
3.2 搭載細胞支架材料
水凝膠作為一種可模擬骨/軟骨細胞外基質的材料，可以直接用于細胞的三維封裝。例如，Yang等[65]利用巰基/硫酯功能化超支化聚氨基酸，通過原位交聯制備了一種新型聚賴氨酸水凝膠。將其負載外周血MSCs植入兔軟骨缺損模型后，表現出優異的修復效果。Micro-CT顯示與空白對照組相比，水凝膠組的軟骨下骨修復效果更佳。進一步研究發現，浸潤在聚賴氨酸水凝膠周圍的細胞主要為M2型巨噬細胞，顯示了免疫調節作用在軟骨組織修復方面的重要性，載干細胞的聚賴氨酸水凝膠在骨軟骨再生領域具有潛在的應用前景。
4 總結與展望
免疫調節水凝膠具有良好生物相容性、易于修飾和可控特性等優點，其構建策略包括調節水凝膠的物理、化學性質以及遞送活性因子控制免疫應答。該水凝膠被廣泛應用于骨/軟骨組織工程，主要包括作為藥物和生長因子的遞送載體和搭載細胞的支架材料，且在骨/軟骨修復方面的療效得到了驗證，為今后治療關節軟骨損傷提供了新思路。
然而，目前具有骨/軟骨免疫調控特性的免疫調節水凝膠研究尚處于初級階段，在實現骨/軟骨缺損理想修復方面仍有許多問題亟待探索和解決：① 需要進一步使用先進的制造方法來提高免疫調節水凝膠在生物響應、物質傳遞、力學性能等多方面的功能性，如使用生物打印、芯片技術等方法。② 水凝膠的免疫調節作用不是單一因素結果，而是多種理化性質共同作用的結果，有必要通過高通量篩選技術篩選水凝膠性質的理想組合效應。③ 免疫調節水凝膠植入體內后與局部微環境的結合程度，對骨/軟骨再生有很大的影響，因此需進一步開展更多的動物實驗以及體內實驗。④ 負載生物活性分子的免疫調節水凝膠在骨/軟骨修復過程中發揮著重要作用，伴隨著免疫調節水凝膠的降解以及負載治療藥物的完全釋放，是否會導致局部藥物濃度激增從而引發全身副反應，值得進一步思考與探索。此外，藥物釋放后水凝膠結構的長期保留是否誘發機體潛在疾病（如異物反應），仍是一個值得關注的問題。⑤ 雖然通過調節水凝膠的理化性質已經可以獲得部分理想的免疫反應，但是水凝膠的理化性質對免疫調節影響的機制還需要深入探索，這有助于個性化定制特異性免疫調節水凝膠。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；項目經費支持沒有影響文章觀點及其報道
作者貢獻聲明 李茂源：文獻檢索、收集以及總結；鄭國爽、楊佳慧：綜述框架設計；陳小芳、許劍鋒：文獻整理、歸類；趙德偉：項目指導、框架引導及文章寫作校對與修改
骨/軟骨損傷的治療是目前骨科難題，常累及關節軟骨及軟骨下骨，關節軟骨結構特殊，一旦損傷很難修復，將導致嚴重關節功能障礙[1]。傳統治療方法，如自體/同種異體軟骨細胞移植等，均未取得滿意療效[2]。近年來，組織工程技術的出現為骨/軟骨缺損治療提供了新思路，采用該技術有望通過組裝和增強種子細胞、生長因子及支架材料生物學特性，提高骨/軟骨再生能力[3]。
研究表明，免疫系統在直接或間接實現骨/軟骨成功再生方面發揮著重要作用[4-5]。免疫細胞的穩態顯著影響骨/軟骨重塑和再生，其通過分泌各種細胞因子直接影響炎癥進展、干細胞募集和分化。巨噬細胞是免疫反應過程的調節中樞，在骨/軟骨缺損修復和再生過程中起到關鍵作用。巨噬細胞具有M1型和M2型兩種不同極化狀態，且這兩種極化狀態可逆。M1型巨噬細胞通過激活NF-κB途徑分泌TNF-α、IL-1、IL-6等促炎因子阻礙骨/軟骨缺損后的愈合過程；而M2型巨噬細胞則通過誘導IL-10、精氨酸酶 1、BMP-2和TGF-β等細胞因子高表達，加速組織修復與再生進程[6]。而巨噬細胞M1/M2比例失衡可以引起慢性炎癥反應，導致骨關節炎等多種疾病的發展[7]。所以，調控骨/軟骨損傷中的免疫反應是促進組織快速愈合的研究方向。但目前研究的骨/軟骨組織工程修復方法均忽略了恢復與改善被破壞的骨/軟骨組織免疫微環境，導致遠期治療效果欠佳。因此，通過免疫調節增強再生支架材料的骨/軟骨組織修復能力，是骨/軟骨組織工程未來研究方向。
水凝膠具有類似于骨/軟骨細胞外基質的三維網絡結構，能夠維持骨/軟骨細胞形態和促進相關蛋白表達，被認為是最有前景的骨/軟骨組織工程支架材料之一[8-9]。近年來，利用天然或人工材料構建的“免疫調節水凝膠”被引入骨/軟骨修復領域。通過調節該凝膠的物理、化學性質及負載的免疫相關制劑，可以激活機體的免疫系統進行免疫應答，誘導形成有利于骨/軟骨再生的免疫微環境，從而增強骨/軟骨細胞的再生修復能力，最終發揮促進骨/軟骨修復作用[10-12]（圖1）。
圖1
免疫調節水凝膠修復骨/軟骨缺損作用機制示意圖
Figure1.
Schematic diagram of mechanism of immunomodulating hydrogels in repairing bone/cartilage defects
但目前具有骨/軟骨免疫調控特性的免疫調節水凝膠研究尚處于初級階段。現對機體損傷后免疫細胞一般免疫應答及相關免疫機制，骨/軟骨缺損修復的免疫調節水凝膠構建策略，以及基于上述策略制備的免疫調節水凝膠在骨/軟骨組織工程中的應用研究進行深入總結，以期為骨/軟骨免疫調節水凝膠的開發研究提供參考。
1 免疫系統
免疫系統通過協調炎癥級聯反應對有害刺激物（包括受損細胞、病原體和無菌損傷等）侵襲進行防御，這種級聯反應涉及一系列連續過程，包括威脅檢測、危險清除和穩態恢復[13-14] 。免疫系統分為先天性和適應性兩種不同類型。先天性免疫系統是有害刺激物侵襲的第一反應者，其包括中性粒細胞、單核細胞和巨噬細胞。當這些先天性免疫細胞未能清除風險時，它們可以調動 B 細胞和 T 淋巴細胞的適應性免疫，從而特異性消除威脅[15]。在支架材料激起的炎癥過程中，免疫細胞除了清除凋亡細胞的碎片、細胞外基質片段和病原體外，還參與組織修復/再生過程。它們既可以減輕炎癥，增強干細胞/組織細胞增殖和分化，促進組織修復；也可增強炎癥反應，妨礙細胞增殖分化，最終導致瘢痕形成[16]。因此，為了實現所需的骨/軟骨組織再生，了解支架材料引起的不同免疫細胞的免疫應答機制非常重要。
1.1 中性粒細胞
中性粒細胞屬于多形核家族，起源于BMSCs，是先天性免疫細胞，被認為是響應損傷或外部入侵時向損傷部位遷移的第1個細胞[17]。中性粒細胞一旦到達損傷部位，立即參與消除感知到的威脅。它們既可以分泌殺菌物質和蛋白酶來破壞病原體，也可以產生中性粒細胞胞外陷阱來吞噬細菌[18]。另一方面，中性粒細胞還可以分泌VEGF [19]、生長因子[20]和基質金屬蛋白酶[21]，促進血管生成、刺激細胞增殖和細胞外基質重塑。通常，中性粒細胞的蓄積被認為對組織再生有害[22]。但有研究表明中性粒細胞可以參與巨噬細胞極化，有利于組織再生[23]。
1.2 巨噬細胞
組織固有巨噬細胞主要來自胚胎形成期間的卵黃囊，在組織發育過程中發揮關鍵作用，有助于維持組織穩態[24]。機體受到損傷后，大量單核細胞通過感知趨化因子和細胞因子信號被募集到損傷部位。這些單核細胞與固有巨噬細胞在參與炎癥和隨后的組織愈合過程時發生顯著的表型和功能變化，通過分泌IL-1、IL-8、單核細胞趨化蛋白 1和巨噬細胞炎癥蛋白1β，在植入部位募集更多的單核細胞，并促進巨噬細胞表型轉化[25]。這些單核及巨噬細胞通過釋放炎癥介質和組織重塑相關酶（例如基質金屬蛋白酶）、促進成纖維細胞遷移和分泌相關細胞因子、生長因子，參與炎癥發生、發展過程，在炎癥和組織再生中發揮重要作用[26]。巨噬細胞根據功能通常分為經典活化（M1型）和替代活化（M2型）兩類[27]。刺激NK細胞所產生的干擾素c、樹突狀細胞的輔助性 T 淋巴細胞 1（T helper cell-1，Th1）和 TNF-α可以誘導巨噬細胞M1型極化，引起炎癥因子分泌，促進炎癥并募集參與獲得性免疫的淋巴細胞[28]。另一方面，粒細胞和Th2細胞產生的 IL-4 以及單核細胞產生的 IL-10 觸發 M2 型極化。這些 M2型巨噬細胞通過細胞外基質沉積和細胞增殖啟動炎癥下調，促進切口愈合和組織修復[29]。然而，持續激活的M1、M2型巨噬細胞可分別觸發組織損傷或纖維化。并且，巨噬細胞還可通過吞噬異物影響免疫反應。如果異物持續存在，巨噬細胞進一步分化并最終融合成異物巨細胞，包括多達100個細胞核。這些細胞可在生物材料周圍形成纖維囊，將其與周圍組織隔離[30]。此外，巨噬細胞的極化狀態并不恒定，可受環境的調節[31]。由于其顯著的可塑性和功能性，巨噬細胞已成為免疫調節研究熱點。
1.3 T淋巴細胞
除了先天性免疫系統，適應性免疫系統也參與宿主對支架材料的反應。T 淋巴細胞屬于適應性免疫系統，在特異性免疫應答中發揮關鍵作用，是炎癥消退和組織再生的強效靶標，在組織修復中也發揮重要作用。它們可以分泌生長因子和細胞因子，如IGF-1、FGF-1α和IL-17A，促進組織細胞穩態和免疫細胞募集[32]。T 淋巴細胞主要附著在巨噬細胞上，促進巨噬細胞黏附和融合，調節巨噬細胞極化[33]。與巨噬細胞一樣，T 淋巴細胞存在由不同趨化因子和細胞因子觸發的細胞亞群（如輔助性T淋巴細胞、抑制性T淋巴細胞和細胞毒性T淋巴細胞），這些細胞亞群具有不同功能。此外，T 淋巴細胞和巨噬細胞可以共同釋放炎癥介質，募集炎癥效應細胞。并且，這些炎癥介質隨著時間推移而減少[34]。在小鼠模型中發現由Th1細胞分泌的 IFN-γ可抑制骨形成[35]。相反，Th2細胞通過調節抗炎性 M2 型巨噬細胞（由細胞因子如 IL-4 和 IL-10誘導）的生成來降低炎癥反應[36]。Treg細胞可以調節中性粒細胞向損傷部位遷移[37]；還有助于抑制單核細胞分泌炎癥因子，并促進巨噬細胞向 M2 型極化[38]。如上述，常規T淋巴細胞分泌細胞因子（如 INF-γ和TNF-α）以維持炎癥。相反，Treg細胞產生抗炎因子，以抑制這些常規 T 淋巴細胞的活性。除了對其他免疫細胞的調節外，還發現 Treg 細胞對組織細胞有直接影響[39]。
綜上述，免疫系統在應對組織損傷和隨后的組織再生中起著至關重要的作用。近年來，通過生物材料適當調控組織內免疫應答反應，以快速實現機體組織修復愈合過程，是組織修復領域研究熱點。
2 用于骨/軟骨修復的免疫調節水凝膠構建策略
水凝膠作為一種新興的生物材料，具有良好生物相容性，可以為細胞生長提供類似細胞外基質的微環境，還可以通過負載生物活性因子、藥物或細胞對免疫反應進行目的性調控，形成有利于組織再生的微環境，在組織修復方面展現出巨大潛力。此外，水凝膠的理化性質具有可調性。如通過調節交聯劑的種類和濃度，可以合成不同彈性模量（剛度）和孔徑（孔隙率）的水凝膠；利用特殊制備方法，可以在水凝膠表面構建微尺度或納米級形貌。水凝膠的化學性質同樣為其設計和優化提供了可能。例如，通過接枝一些相關高分子聚合物或者生物活性基團，可以改變水凝膠表面的親/疏水性；通過表面改性，也可以改變水凝膠表面所帶電荷；通過改變水凝膠表面不同生物活性基團和分子結構，可以進一步影響細胞行為[40-41]。因此，通過調控水凝膠特性影響宿主免疫細胞，進而調控免疫反應，對于免疫調節水凝膠的開發和研究至關重要。
免疫調節能力是免疫調節水凝膠在骨/軟骨組織工程應用的關鍵，直接決定了水凝膠修復受損骨/軟骨效果。近幾十年來，人們嘗試了多種控制免疫細胞極化和細胞行為的方法，以達到抗炎效果（促進組織再生和功能恢復）。一旦免疫調節水凝膠植入機體，免疫系統就會根據其物理、化學性質或生物信號作出響應，進而對免疫微環境進行目的性調控，最終形成利于骨/軟骨修復的免疫微環境。
骨/軟骨組織工程所需的免疫調節水凝膠構建策略主要包括以下三方面：① 物理性質調節：包括對水凝膠基質的機械強度、結構及表面特性（即剛度、孔隙率和表面形貌）等進行調節；② 化學性質調節：通過改變水凝膠的化學成分，進而改變其濕潤度（親/疏水性）、電化學性質等進行調節；③ 生物活性分子遞送作用調節：利用水凝膠可控釋的特性，將其作為載體遞送細胞因子、基因等多種生物活性成分，應用于免疫微環境的調控，促進組織穩態和細胞再生。
2.1 通過調節物理性質構建免疫調節水凝膠
2.1.1 水凝膠基質剛度
生物材料的基質剛度是組織工程支架設計的關鍵參數。研究表明，中性粒細胞的遷移黏附受水凝膠基質剛度的影響[42]。水凝膠根據基質剛度可分為軟基質及硬基質兩類，一般而言軟基質水凝膠大部分誘導免疫細胞向免疫耐受或切口愈合表型轉變，而硬基質水凝膠更易引起免疫細胞朝著免疫激活表型轉變。Jannat等[43]研究了中性粒細胞在模擬體內環境中對不同基質剛度水凝膠的反應。結果證明，與基質剛度為2 kPa的軟基質水凝膠相比，在12 kPa硬基質水凝膠上生長的中性粒細胞更易進一步極化。此外，水凝膠的基質剛度也會影響巨噬細胞的行為。一般情況下，軟基質水凝膠可誘導巨噬細胞向抗炎性表型M2 型極化，導致IL-10、CD206和精氨酸酶1分泌增強；而在硬基質水凝膠上生長的巨噬細胞傾向于朝促炎性表型 M1型極化，表達高水平IL-1β、TNF-α、趨化因子配體11和趨化因子配體20等促炎因子[44-47]，且硬基質水凝膠顯著增強了細胞的擴散和遷移。同樣，T淋巴細胞的基因表達和代謝也受到水凝膠基質剛度的影響。研究顯示，硬基質水凝膠顯著提高了適應性免疫細胞中IL-12、IL-22和IFN-c等基因的表達[48-49]。
上述研究說明水凝膠的基質剛度可以影響巨噬細胞、中性粒細胞和淋巴細胞等多種免疫細胞，通過對這些免疫細胞的調控，可營造有利于骨/軟骨修復的微環境。
2.1.2 水凝膠孔隙率
在天然組織中，細胞外基質的多孔結構可以影響細胞之間的物質傳遞和胞間通訊[50]，因此水凝膠孔隙率在調控免疫細胞遷移和浸潤方面發揮著重要作用。Moshaverinia等[51]通過增加交聯劑濃度，開發了一種平均孔徑為600 nm且載有BMSCs的藻酸鹽水凝膠。結果顯示，該納米多孔水凝膠能夠抑制T淋巴細胞及促炎因子的分泌，從而減少 BMSCs 凋亡，促進小鼠體內骨再生。此外，孔隙率還會影響巨噬細胞表型極化[52]。然而，孔隙率影響免疫調節的作用機制尚無定論，還需要更多研究來系統證明。
2.1.3 水凝膠表面形貌
通過調節水凝膠的表面形貌引發理想的免疫應答是構建免疫調節水凝膠的另一種策略，其優點在于避免了體內復雜微環境的干擾。目前，通過軟光刻法制備的微槽圖案水凝膠已被用于調控巨噬細胞反應，它能通過調控骨軟骨受損過程中的炎癥反應來促進組織細胞修復；與無圖案水凝膠相比，該水凝膠上的巨噬細胞M2 標記物 IL-1RA分泌顯著增加[53]。Chen等[54]的研究表明粗糙度為68 nm的聚丙烯酸凝膠可以調控巨噬細胞炎癥因子的表達，進而調控免疫微環境，促進骨形成。然而，雖然水凝膠結構特性免疫調節作用很明顯，但目前對此研究有限，需要更多的實驗數據來明確其作用機制。另一方面，在水凝膠表面或內部實現精確的幾何圖案構建難度較大，仍需要研發對水凝膠結構進行精準構建的新技術。
2.2 通過調節化學性質構建免疫調節水凝膠
生物體內的細胞不僅受到物理刺激影響，還受到化學信號的誘導。化學信號可以影響細胞的黏附、遷移、增殖和分化等。因此，通過調節水凝膠的化學性質也可以構建有利于骨/軟骨修復的免疫微環境。
2.2.1 親/疏水性
通過調節材料表面濕潤度來調控材料親/疏水性，能夠改變免疫細胞黏附性能。已有研究表明，巨噬細胞優先黏附在疏水性凝膠表面。但在親水性聚乙二醇水凝膠上生長的巨噬細胞中觀察到更高水平的炎癥因子表達，如 TNF-α和IL-1β。Xu等[55]通過將疏水性烷基分支連接到甲基丙烯酸酯化結冷膠（methacrylated gellan gum，MGG）上，制備出親水性不同的MGG水凝膠，而水凝膠硬度和組成沒有變化，發現在疏水性凝膠表面M1 型巨噬細胞相關細胞因子分泌顯著增加。此外，巨噬細胞的吞噬功能也可以通過改變凝膠親/疏水性來調控。例如，在親水性表面上的巨噬細胞吞噬作用較低，證明了親/疏水性在吞噬作用中的重要性[56]。
2.2.2 電化學性質
電信號幾乎參與活細胞和生物體的所有功能。研究表明，植入物的表面電荷密度可影響吸收蛋白質的量和構象，從而進一步影響免疫應答[57]。通過對水凝膠官能團的修飾，可以設計帶有不同表面電荷的水凝膠來調控機體細胞的免疫應答。通常帶正電荷的水凝膠可誘導巨噬細胞擴散，而帶負電荷的水凝膠可抑制其擴散。并且與帶負電荷的水凝膠相比，巨噬細胞與異物巨細胞的融合在帶正電荷的水凝膠上更明顯。這種細胞擴散和融合的增強歸因于帶正電荷的水凝膠表面和帶負電荷的細胞膜之間的靜電相互作用[58]。一項關于多結構域肽（multidomain peptide，MDP）水凝膠的研究顯示，對于帶正電荷的MDP K2（SL）6K2 和 R2（SL）6R2（氨基酸序列）可以引起小鼠體內組織明顯的異物反應，表現為多個免疫細胞浸潤和高度膠原沉積；相反，帶負電荷的 MDP E2（SL）6E2 和D2（SL）6D2的巨噬細胞低程度浸潤，未發現膠原沉積，表明異物反應水平較低[59]。
2.3 通過生物活性分子遞送釋放影響免疫應答
水凝膠因具有良好生物相容性、可調孔隙率和易于修飾等特性，成為負載外源性生物活性分子的理想支架。其可以通過緩控釋放免疫調節成分來調控免疫反應，從而影響免疫應答，加速骨/軟骨修復進程。
2.3.1 通過孔徑控制釋放影響免疫應答
水凝膠的孔徑不僅能直接影響細胞存活率，還可以調節生物活性分子的釋放，引起所需的免疫調節。例如，Li等[60]用水溶性羥丁基殼聚糖（hydroxybutyl chitosan，HBC）和氧化硫酸軟骨素（oxidized chondroitin sulfate，OCS）通過席夫堿反應制備共價水凝膠，經過材料成分優化工藝，研制出平均孔徑為 100 μm的均勻多孔結構可注射水凝膠。結果表明，人脂肪MSCs可在 HBC/OCS水凝膠中三維培養，保持良好活力。并且，該孔徑的水凝膠降解時間延長，有利于負載的活性分子釋放，降低巨噬細胞促炎因子表達水平，植入小鼠體內后可在7 d內抑制急性免疫反應。
2.3.2 通過靜電作用控制釋放影響免疫應答
由于核酸的電學特性，靜電作用可作用于免疫調節水凝膠上負載的生物活性分子。例如，Kim等[61]用陽離子聚電解質共聚物（MP-NH2）和陰離子BMP-2制備了一種可注射、靜電結合、原位形成的水凝膠。實驗表明，水凝膠注射到小鼠體內后，幾乎立即形成含有 BMP-2的靜電載水凝膠儲庫。BMP-2與MP-NH2的靜電引力作用可影響水凝膠內部BMP-2特征和穩定性，使其在體內停留時間顯著延長，更持久地發揮作用，從而促進人鼻甲MSCs成骨分化。
2.3.3 通過環境響應控制釋放影響免疫應答
細胞外基質是一種具有高度動態性的微環境。而免疫調節水凝膠具有時間和環境可控的特性，因此通過對細胞微環境的調控可以實現對免疫反應的調控。例如，Li等[62]在陽極氧化鈦表面引入了由羥丙基甲基纖維素、殼聚糖（chitosan，CS）、甘油組成的熱敏水凝膠。在正常體溫時水凝膠處于溶膠狀態，可以使巨噬細胞向 M2型極化，促進組織修復；而在細菌感染引起的高溫情況下，溶膠會轉為凝膠狀態，使巨噬細胞向 M1型極化，促進炎癥。實驗表明，這種水凝膠對生理環境的智能識別和調節，與溶膠和凝膠狀態下不同的羥丙基甲基纖維素、CS和甘油釋放量有關。
3 免疫調節水凝膠在骨/軟骨組織工程中的應用
3.1 生長因子和藥物遞送載體
免疫調節水凝膠作為生長因子和藥物的遞送載體，在體內指定部位進行控釋，是其在骨/軟骨組織工程中的主要應用方式。例如，Ji等[63]利用CS微球和羥丙基甲殼素（hydroxypropyl chitin，HPCH）構建了具有巨噬細胞調控特性的溫敏水凝膠藥物遞送系統，并將二甲氧基甘氨酸（dimethyloxalyl glycine，DMOG）負載于溫敏HPCH水凝膠（HD），將Kartogenin接枝于多孔CS微球（kartogenin conjugated CS-porous microspheres，CSK-PMS），共同組成HD/CSK-PMS復合支架，可有效調節缺損部位的再生微環境，募集自體干細胞并提供豐富的細胞黏著位點，實現局部巨噬細胞的M2型極化并促進骨軟骨再生。可快速降解的HD有利于透明軟骨再生，而高穩定性的CSK-PMS則支持軟骨內骨化和軟骨下骨的再生，為再生軟骨提供支撐。體外和體內實驗評價顯示，基于HD/CSK-PMS分層結構的可控藥物輸送組合可有效調控免疫微環境，并促進原位骨軟骨的再生。上述研究結果揭示了免疫微環境和軟骨下骨對高質量軟骨修復的重要性。
同樣，Li等[64]通過與抗破骨細胞藥物雙膦酸鹽（bisphosphonate，BP）的配位鍵組裝制備了仿生透明質酸納米復合水凝膠（hyaluronic acid-BP，HA-BP），HA-BP 在酸性環境下表現出負載 BP 的加速釋放。體外研究表明，HA-BP通過釋放的BP抑制RAW264.7細胞向成熟破骨細胞分化過程。此外，HA-BP可以支持原代巨噬細胞向前破骨細胞的初始分化，此分化過程被認為是骨再生過程中所必需的；體內評價也表明HA-BP可增強骨原位再生。
3.2 搭載細胞支架材料
水凝膠作為一種可模擬骨/軟骨細胞外基質的材料，可以直接用于細胞的三維封裝。例如，Yang等[65]利用巰基/硫酯功能化超支化聚氨基酸，通過原位交聯制備了一種新型聚賴氨酸水凝膠。將其負載外周血MSCs植入兔軟骨缺損模型后，表現出優異的修復效果。Micro-CT顯示與空白對照組相比，水凝膠組的軟骨下骨修復效果更佳。進一步研究發現，浸潤在聚賴氨酸水凝膠周圍的細胞主要為M2型巨噬細胞，顯示了免疫調節作用在軟骨組織修復方面的重要性，載干細胞的聚賴氨酸水凝膠在骨軟骨再生領域具有潛在的應用前景。
4 總結與展望
免疫調節水凝膠具有良好生物相容性、易于修飾和可控特性等優點，其構建策略包括調節水凝膠的物理、化學性質以及遞送活性因子控制免疫應答。該水凝膠被廣泛應用于骨/軟骨組織工程，主要包括作為藥物和生長因子的遞送載體和搭載細胞的支架材料，且在骨/軟骨修復方面的療效得到了驗證，為今后治療關節軟骨損傷提供了新思路。
然而，目前具有骨/軟骨免疫調控特性的免疫調節水凝膠研究尚處于初級階段，在實現骨/軟骨缺損理想修復方面仍有許多問題亟待探索和解決：① 需要進一步使用先進的制造方法來提高免疫調節水凝膠在生物響應、物質傳遞、力學性能等多方面的功能性，如使用生物打印、芯片技術等方法。② 水凝膠的免疫調節作用不是單一因素結果，而是多種理化性質共同作用的結果，有必要通過高通量篩選技術篩選水凝膠性質的理想組合效應。③ 免疫調節水凝膠植入體內后與局部微環境的結合程度，對骨/軟骨再生有很大的影響，因此需進一步開展更多的動物實驗以及體內實驗。④ 負載生物活性分子的免疫調節水凝膠在骨/軟骨修復過程中發揮著重要作用，伴隨著免疫調節水凝膠的降解以及負載治療藥物的完全釋放，是否會導致局部藥物濃度激增從而引發全身副反應，值得進一步思考與探索。此外，藥物釋放后水凝膠結構的長期保留是否誘發機體潛在疾病（如異物反應），仍是一個值得關注的問題。⑤ 雖然通過調節水凝膠的理化性質已經可以獲得部分理想的免疫反應，但是水凝膠的理化性質對免疫調節影響的機制還需要深入探索，這有助于個性化定制特異性免疫調節水凝膠。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；項目經費支持沒有影響文章觀點及其報道
作者貢獻聲明 李茂源：文獻檢索、收集以及總結；鄭國爽、楊佳慧：綜述框架設計；陳小芳、許劍鋒：文獻整理、歸類；趙德偉：項目指導、框架引導及文章寫作校對與修改
