引用本文： 杜志坡, 廖婕, 王冰冰, 于素香, 李曉明. 細胞來源脫細胞外基質用作組織工程支架的優勢與展望. 中國修復重建外科雜志, 2024, 38(11): 1291-1298. doi: 10.7507/1002-1892.202404114 復制
版權信息： ?四川大學華西醫院華西期刊社《中國修復重建外科雜志》版權所有，未經授權不得轉載、改編
隨著經濟發展，人口老齡化趨勢加重，退行性疾病、先天性異常和創傷等發生概率不斷增加，對組織修復和器官重建的需求也隨之增多。組織修復和器官重建基于組織再生，即通過內源性干細胞或祖細胞的活化、增殖以及新基質的產生，將組織修復為正常組織的相似結構和功能。然而，當原始組織存在破壞性缺陷或組織功能障礙時，人體將無法正確自動再生其大部分主要組織和器官[1]。同時，由于部分組織再生能力低，炎癥對傷口修復的負面影響以及隨著年齡增長宿主干細胞/祖細胞群質量的降低，也會破壞活體組織自動再生的潛力[2]。因此，組織工程和再生醫學通過構建替代性生物組織，甚至整個器官來替代受損、惡化或丟失的身體部位，或通過刺激患者自身固有的治愈潛力加速再生[3-4]。
作為組織工程學的三個關鍵因素之一，生物材料充當臨時細胞外基質（extracellular matrix，ECM），提供機械支持并輔助物質運輸以促進細胞黏附、增殖和分化，并以時空精度呈現物理化學信號來調節細胞行為，指導正確的組織再生[5-6]。因此，理想的生物材料應在較長時間內提供暫時結構支撐，并以與新生組織相近的再生速率通過受控的方式降解和吸收[7-8]。此外，通過加載活性分子（包括細胞趨化因子、細胞黏附肽等），生物材料可以促進干細胞募集及分化，從而提供足夠的修復細胞，指導新的組織形成和整合[9-13]。因此，生物材料通常模擬天然ECM的組成、結構及機械和生化特性，以創造有利微環境以誘導組織形成[14]。然而，由于天然ECM的復雜性，傳統的物理化學方法很難重建與天然ECM相同的支架。脫細胞外基質（decellularized extracellular matrix，dECM）由于較好地保留了天然ECM的復雜成分、宏觀結構和表面微結構，已成為一種十分具有潛力的組織工程支架材料。
dECM包括組織來源dECM（tissue derived dECM，TDM）和細胞來源dECM（cell derived dECM，CDM），是通過物理、化學或生物化學等方法去除組織/器官、細胞膜片中的細胞及其他抗原成份，從而獲得接近ECM的天然結構與形狀，并保留了活性成份和維持形狀的蛋白、纖維、多糖、膠原等成份的ECM材料[15]。TDM即是從組織或器官中經過脫細胞處理提取的ECM，已被廣泛用作組織工程生物支架，并獲得了突出成果。當前，基于TDM的研究主要集中在小腸黏膜下層、心臟瓣膜、血管、皮膚、神經、肌腱、韌帶、膀胱、聲帶、羊膜、心、肝、肺等[16-17]。然而，盡管TDM在組成、微結構和生物力學特性方面具有許多優勢，但其效用受到來源組織或器官的可用性、幾何形狀和特性的限制[18]；并且TDM難以獲得特定組織區域，如特定發育階段分化細胞周圍的ECM[19-20]。隨著3D打印等技術的出現，TDM在結構和機械性能上的優勢已不顯著；此外，TDM都是同種異體或異種來源，這一特征增加了病原體傳播潛在風險，并容易引發不良炎癥和免疫反應，導致再生組織和器官的不良后果，并且其供體組織和器官來源非常有限。
為了避免上述TDM的問題并維持近天然組織成分帶來的高生物活性，CDM提供了一種有前途的支架制備方法。本文將對CDM的優勢、制備及表征及其在組織工程中的應用綜述如下。
1 CDM的優勢
CDM是通過體外培養細胞1～6周后，將獲得的細胞及ECM的混合物經脫細胞處理后得到的產物[21]，這些產物可以支持人類干細胞的培養和分化[22]。相比于TDM，CDM主要有以下優勢：① CDM可以篩選培養的細胞病原體，在保持無病原體條件下獲取ECM[23]。② CDM可以提供所需的幾何形狀和孔隙度，不受脫細胞原生組織再生過程中細胞穿透性差的限制；此外，CDM可通過使用合成聚合物作為模板，生產出各種三維形狀和結構的支架，并通過改性賦予其更多功能。③ 體外培養細胞操作靈活，可以根據組織特異性需求通過不同細胞類型和培養方法定制CDM。④ CDM可以通過使用自體細胞避免同種異體或異種材料可能引起的宿主反應，并突破TDM供體組織和器官有限的局限。⑤ CDM由于培養的細胞層較薄，選擇較為溫和的脫細胞方法即可達到較好的脫細胞效果，防止損傷ECM。TDM與CDM的具體比較見表1。
表1
TDM與CDM比較
Table1.
Comparison between TDM and CDM
2 CDM的制備與表征
CDM可以在二維或三維細胞培養條件下制備以適應不同應用需求。CDM制備過程包括細胞擴增、接種、ECM生成/沉積和脫細胞4個主要步驟。其中，ECM生成/沉積是最重要步驟，需要創造理想的培養條件，才能刺激細胞更快地分泌和沉積所需ECM。制備的CDM需要對其成分與結構進行表征，符合安全要求后才能使用。一般來說，同種異體或異種細胞來源的CDM中DNA含量需保持在50 ng/mg以下，以降低免疫原性反應風險[24]。CDM成分與結構的表征方式見表2。
表2
CDM成分與結構的表征方式
Table2.
Characterizations of the components and structures of CDM
CDM最終的組成和功能與細胞的培養條件和方法、細胞來源以及脫細胞方法息息相關[26]。通過系統優化內在因素（例如通過基因改造細胞）和外在因素（支架、培養基、生長因子和物理興奮劑），可以實現最終CDM產品所需的物理和生化特性。
2.1 細胞培養條件與方法的影響
細胞的培養條件與方法涉及培養基種類、培養平臺、氣體環境等。需要一定培養條件（如添加生長因子、旋轉瓶生物反應器等）來控制細胞生長和ECM分泌，并根據需求選擇合適細胞進行培養和擴增。除了一般的二維培養方法，三維細胞培養平臺越來越受到人們關注。現有的三維細胞培養平臺主要有中空纖維生物反應器、微載體（直徑100～300 μm，分為固體球形微載體和多孔微載體）、搖臂式生物反應器和滾筒式生物反應器[26]。這些三維細胞培養平臺通常通過增大細胞附著表面積、促進培養基中氣體交換來顯著提高細胞黏附密度，從而提高CDM的生產效率。具體使用哪種類型培養平臺，需要根據細胞類型和使用需求選擇。
不同培養方法與條件制備的CDM具有不同特性（成分、形貌、剛度等）和生物功能。Zhang等[27]研究了在普通生長培養基和成脂培養基中培養的脂肪來源干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）構建的CDM對ADSCs的影響。在以上兩種CDM上接種ADSCs后，發現ADSCs在普通生長培養基組CDM表面表現出更強遷移能力，而在成脂培養基組CDM表面經歷了成脂分化。此外，缺氧、底物剛度等培養條件也會對CDM組成產生影響，缺氧可以改善成纖維細胞的膠原纖維沉積[28]；基質硬度則會影響細胞表型，進而影響ECM的組成和性質[29]。同樣，基底形貌也可決定ECM的結構組織，微模具和凹槽的使用已被證明可在沉積的ECM中產生各向異性的纖維結構[30]。
2.2 細胞來源的影響
不同來源細胞制備的CDM擁有不同的形貌、成分及生物學功能。Lu等[31]研究了正常人BMSCs、關節軟骨細胞和真皮成纖維細胞制備的CDM，發現3種細胞制備的CDM呈現出由不同ECM生物分子構成的微孔結構。此外，他們進一步檢測了3種CDM的成分，發現存在細微差異。其中，BMSCs制備的CDM主要包含Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、纖連蛋白、玻連蛋白、層粘連蛋白、蛋白聚糖、核心蛋白聚糖和二聚糖；而關節軟骨細胞制備的CDM除了上述成分，還包含多能蛋白聚糖；真皮成纖維細胞制備的CDM則較BMSCs來源CDM成分缺少了蛋白聚糖。
在功能方面，有研究[32]通過將BMSCs、MC3T3成骨前細胞和成纖維細胞接種至纖維墊上，脫細胞制備不同的CDM并展開細胞成骨分化研究，結果發現，BMSCs制備的CDM促進了更強的成骨分化，成骨相關因子VEGF和BMP-2表達水平更高。Marinkovic等[33]研究了由BMSCs和ADSCs制備的兩種CDM分別對BMSCs和ADSCs的影響，結果顯示，兩種細胞在對應的CDM上培養時分別促進了BMSCs和ADSCs的增殖和分化。此外，研究表明，盡管不同CDM的結構蛋白處于相似水平，但其結構（纖維取向和致密性）仍然存在差異。有研究探討了不同干細胞制備的CDM對于BMSCs遷移的影響[34-35]。他們分別將BMSCs和肌腱源性干細胞培養在脫細胞牛跟腱表面，一段時間后脫細胞得到相應的CDM 修飾支架；隨后，將BMSCs培養在支架表面，發現兩種干細胞制備的CDM均能促進BMSCs遷移，而肌腱源性干細胞比BMSCs分泌更多的基質細胞衍生因子1（stromal cell-derived factor 1，SDF-1）和單核細胞趨化蛋白1，且主要通過SDF-1/趨化因子受體4軸激活PI3K/AKT信號通路來調節BMSCs的遷移功能。因此，可以根據需求有目的地培養細胞，以產生所需的ECM支架。近年，Carvalho等[36]研究了由干細胞和人臍靜脈內皮細胞共培養制備的CDM，與僅來自干細胞或人臍靜脈內皮細胞的CDM相比，細胞共培養制備的CDM增強了人BMSCs的成骨分化，并能產生更成熟的礦化基質和更好地生成血管，表明細胞共培養制備的CDM在促進ECM環境方面具有協同作用。上述研究表明，CDM能夠根據基質組成和生化線索來指導組織/譜系特異性再生，調節細胞行為。
根據不同組織的需求，通常選擇相應的特異性細胞作為制備CDM的原料。然而，干細胞由于獨特的生物功能而備受青睞，被廣泛應用于制備修復各類組織的CDM，其形成的CDM是指導細胞活動的關鍵因素[37]。干細胞逐步分化為體細胞的過程中，產生的ECM也是動態變化的，分化細胞分泌和沉積的ECM會根據發育、分化和組織再生的階段繼續進行重塑（即組裝和降解）。來自體外干細胞培養物的CDM已被證明可以提供一種指導性的干細胞微環境，使衰老的祖細胞恢復活力，促進干細胞擴增和分化[38]。多種干細胞（包括多能干細胞[39]、BMSCs[40]、滑膜來源干細胞[41]、ADSCs[42]、牙髓干細胞[43]、臍帶間充質干細胞[44]等）制備的CDM在過去幾十年里得到了廣泛研究。經肌腱來源干細胞制備的CDM修飾的支架在體外顯著改善了BMSCs的遷移，并且可以招募更多內源性基質細胞來加速體內肌腱-骨界面的愈合[45]。在各種干細胞來源中，ADSCs顯示出獨特的臨床應用優勢。與BMSCs等相比，ADSCs可從脂肪組織中大量獲得，且患者幾乎無不適感；此外，ADSCs還表現出與中胚層來源細胞（脂肪生成、成骨和軟骨譜系）相當的分化潛力[46]。值得一提的是，除了ADSCs，在臨床研究中還可以通過來自患者的活檢組織或骨髓提取細胞開發無免疫原性CDM，避免發生與TDM相關的不良反應。
2.3 脫細胞方法的影響
脫細胞方法也會影響CDM的組成與結構，進而影響細胞功能。目前，專門用于制備CDM的脫細胞方法雖然報道很少，但用于制備TDM的脫細胞方法已有廣泛而深入的研究。不同脫細胞方法（物理、化學、生物和混合方法）及其對TDM組成和微觀結構的影響，在既往報道的綜述文獻中已有詳細描述[47]，總的來說幾種方法各有優劣。物理方法雖然操作簡單，不含化學試劑，可減少機體不良反應，但難以完全去除某些較厚組織的細胞；此外，機械攪拌等方法容易破壞ECM的結構，一定程度上影響其力學性能。化學方法雖然能在對ECM結構和組成影響較小的情況下有效去除細胞，但容易去除一些生長因子，降低ECM的生物活性；同時易殘留試劑，降低生物相容性。生物方法雖然可以特異性去除細胞和抗原成分，且對其他生物活性成分損害較小，但容易損害蛋白質微觀結構，且易發生由特異性酶殘留引起的免疫反應。相比單一使用以上某種方法，混合方法更加安全有效，但需要根據特定組織的需求進行定制。
目前，用于TDM制備的脫細胞方法已應用于CDM的制備。CDM較薄，因此較溫和的脫細胞方法（如循環凍融、Triton X-100）對CDM損害較小，適用于CDM的制備，尤其是在二維培養中制備CDM。此外，為了盡可能減小脫細胞過程對于CDM組分生物活性的破壞，有研究通過優化培養技術來實現。比如，有研究者構建了單個小尺寸三維細胞球體（幾百微米），其可以實現溫和而有效的脫細胞（使用Triton X-100），保護了組裝的ECM的微結構和生物活性，重新接種細胞后，可以獲得足夠的氧氣和營養，并均勻分布和增殖[48-49]。但仍需要進一步研究專門用于CDM的脫細胞方法。
3 CDM在組織工程中的應用
如今，可以在各種培養條件下制備各類CDM，以滿足細胞擴增、組織工程、生長因子的遞送等特定應用需求。由于CDM的突出活性和可定制特性，其已成為組織工程領域一種富有前景的材料。見表3。
表3
不同細胞來源的CDM在組織工程中的應用
Table3.
Application of CDM from different cells in tissue engineering
目前，CDM在組織工程領域主要有4種應用方法，包括：① 將細胞培養在平板上，一段時間后脫細胞處理，獲得CDM薄片作為生物材料使用；② 將細胞培養在顆粒狀基板上，獲得CDM球作為生物材料直接使用；③ 將細胞直接培養在多孔生物材料上，脫細胞后可獲得由CDM修飾的生物材料；④ 將所得的CDM經尿素等提取為溶液，涂敷在生物材料表面作為涂層使用，或進行3D打印。其中，CDM薄片保留了ECM完整性，已成為一種新興的ECM產品用于多種生物醫學用途。它們提供了天然基質和具有復雜生理功能的生物分子集，可用于細胞擴增并支持同種異體再細胞化[53-54]。而將CDM提取為溶液制備涂層或3D打印由于產量有限而應用較少，其通常需要與其他聚合物聯合使用。例如，Santos等[55]將聚合物溶液與來源于人牙周韌帶干細胞/基質細胞的CDM相結合，開發了負載CDM的聚己內酯/殼聚糖活性納米纖維支架。
目前，直接培養在多孔生物材料表面獲得由CDM修飾的生物材料支架在組織工程中應用最為廣泛。其可以使支架在擁有CDM生物活性的同時具備模板支架的機械性能。此外，通過設計制備特定結構的模板支架，可以使CDM支架具有近天然組織的微結構，從而進一步提升活性。Gu等[56]將雪旺細胞在殼聚糖纖維蛋白支架上培養，脫細胞后獲得CDM修飾的支架以修復神經，結果表明該支架的再生作用與脫細胞神經移植物相似，且明顯優于普通的殼聚糖/絲素蛋白支架。Tang等[52]結合聚乳酸-羥基乙酸共聚物靜電紡絲納米纖維模板和人ADSCs制造用于傷口愈合的CDM修飾納米纖維敷料，其保留了Ⅰ型膠原蛋白和層粘連蛋白，具有親水性，并具有適合傷口愈合的適當機械強度；當接種成纖維細胞時，該納米纖維敷料支持細胞存活和增殖。通過交聯，CDM的穩定性和降解性能進一步提高[39]。此外，CDM還可與3D打印聯合使用。骨細胞來源的CDM與3D打印多孔聚己內酯支架相結合，與單純聚己內酯支架相比，修飾了CDM的支架增加了間充質祖細胞的黏附、增殖和成骨活性[57]。Pati等[58]也開發了CDM修飾的3D打印支架，與裸3D打印支架相比，它可以通過調節4個典型的成骨細胞基因來促進人鼻甲間充質干細胞的成骨細胞分化，并增加鈣沉積，誘導新骨形成。
為了獲得具有理想功能的CDM支架，還可以針對表面誘導的ECM組裝定制聚合物的表面微結構。如在具有 2～6 μm 寬的垂直微紋理聚二甲基硅氧烷支架表面培養人成纖維細胞，其形態、黏附力和肌動蛋白細胞骨架發生了顯著變化[59]。在另一項研究中[60]，通過在合成的取向納米光柵上培養人真皮成纖維細胞，得到高度排列的納米纖維CDM支架。由于保留了高度排列的彈性蛋白纖維，其彈性模量得到了很好維持。細胞重新接種后發現該活性支架可提供細胞黏附位點，并支持和指導細胞沿下層纖維增殖和排列。這些研究顯示了CDM修飾精心設計的合成聚合物作為混合支架的前景，其結合了模板支架的結構和機械性能，以及細胞分泌的天然ECM大分子的生物學指導信號，超越了傳統材料合成與制備方法的局限，在組織工程領域具有獨特優勢[59]。
4 總結與展望
總的來說，盡管由于體外培養細胞ECM分泌模式不同于體內，ECM的體外自組裝很難復制復雜的天然ECM體系結構。但是，與TDM相比，CDM具有無限的可用性、靈活的可調節性、對不同發育階段的適應性和充分的安全性等優勢，在組織工程方面仍然具有很大發展前景。但是，盡管CDM已被引入組織工程各種領域（如使用CDM制備人造組織和器官），目前仍只有CDM構建的人工血管在臨床環境中進行了檢測[61]，而許多TDM已在各種組織中進行了廣泛測試。因此，基于CDM的組織工程支架的開發及臨床應用還需進一步研究。
此外，CDM的規模化是局限其廣泛應用的一個關鍵。一方面，需有合適的技術以保障足夠量的ECM沉積；另一方面，要維持細胞在長期培養過程中不變性。雖然當前已有一些技術被開發用于促進ECM沉積，如添加抗壞血酸（維生素C）、生長因子和基質蛋白酶抑制劑以增加CDM中膠原蛋白含量[62-63]，利用帶負電荷的聚葡萄糖 ［硫酸葡聚糖（DxS），相對分子質量500×103］ 在介導ECM合成和組裝過程中聚集和共沉淀ECM組分[64]；將帶中性電荷的大分子，如基于多蔗糖的共聚物（可變大小的Ficolls）添加到細胞培養基中，以產生由大分子擁擠驅動的排除體積效應[65-66]。但是，在制造過程中，內在因素和外在因素的任何變化都會導致CDM產品的偏差。擴大生產規模首先要考慮形成穩定的細胞來源、培養基成分、生物反應器、化學品和加工方法。其中，原代細胞和細胞系等細胞來源在CDM的批次變異性中起主要作用。原代細胞本質上是可變的，因此必須實施適當的預表征和細胞庫策略，以保持所需標準。在沒有基因改造的情況下，只有來自主要來源的干細胞才有能力進行足夠的細胞分裂，以大規模生產CDM。例如，胚胎干細胞在培養中通常被認為是長久的，間充質干細胞可以有13～25個群體倍增，表皮干細胞在衰老之前可以有多達115個群體倍增。然而，對于工業制造來說，維持干細胞來源是一項艱巨任務。細胞系或基因工程細胞由于能夠長期維持，是大規模生產CDM的更好選擇；然而，細胞系仍可能失去其特殊特性，需要定期進行質量控制和表征。此外，現有的擴增技術雖然解決了高表面積與體積比的營養轉移問題，但是沒有解決其他因素，例如動態培養的影響和下游加工的其他步驟。平臺的動態特性（例如中空纖維生物反應器的灌注速率、微載體生物反應器的噴泡速率、滾筒瓶每分鐘的轉數、搖臂生物反應器每分鐘的搖擺周期）將影響最終CDM產品的組成。因此，需要探索特定細胞與培養方式的固定制備體系。同時，大多數擴增平臺是為提取細胞或生物制劑（如可溶性蛋白質）而開發的，不針對具有豐富不溶性大分子的整個ECM。因此，仍然需要開發特定下游工藝，以從現有系統中獲取CDM（例如，從中空纖維通道、微載體或容器表面去除細胞）。
總之，盡管仍然存在一些局限，但CDM因其突出的可調節性、安全性和高生物活性，在組織工程領域中顯示出優越性。隨著技術的不斷進步，適用于臨床的CDM支架將有望不斷出現。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點及其報道
作者貢獻聲明 杜志坡、廖婕：資料收集和文章撰寫；王冰冰：文稿修改；于素香、李曉明：內容構思、觀點形成、結構設計以及提出文章修改意見
隨著經濟發展，人口老齡化趨勢加重，退行性疾病、先天性異常和創傷等發生概率不斷增加，對組織修復和器官重建的需求也隨之增多。組織修復和器官重建基于組織再生，即通過內源性干細胞或祖細胞的活化、增殖以及新基質的產生，將組織修復為正常組織的相似結構和功能。然而，當原始組織存在破壞性缺陷或組織功能障礙時，人體將無法正確自動再生其大部分主要組織和器官[1]。同時，由于部分組織再生能力低，炎癥對傷口修復的負面影響以及隨著年齡增長宿主干細胞/祖細胞群質量的降低，也會破壞活體組織自動再生的潛力[2]。因此，組織工程和再生醫學通過構建替代性生物組織，甚至整個器官來替代受損、惡化或丟失的身體部位，或通過刺激患者自身固有的治愈潛力加速再生[3-4]。
作為組織工程學的三個關鍵因素之一，生物材料充當臨時細胞外基質（extracellular matrix，ECM），提供機械支持并輔助物質運輸以促進細胞黏附、增殖和分化，并以時空精度呈現物理化學信號來調節細胞行為，指導正確的組織再生[5-6]。因此，理想的生物材料應在較長時間內提供暫時結構支撐，并以與新生組織相近的再生速率通過受控的方式降解和吸收[7-8]。此外，通過加載活性分子（包括細胞趨化因子、細胞黏附肽等），生物材料可以促進干細胞募集及分化，從而提供足夠的修復細胞，指導新的組織形成和整合[9-13]。因此，生物材料通常模擬天然ECM的組成、結構及機械和生化特性，以創造有利微環境以誘導組織形成[14]。然而，由于天然ECM的復雜性，傳統的物理化學方法很難重建與天然ECM相同的支架。脫細胞外基質（decellularized extracellular matrix，dECM）由于較好地保留了天然ECM的復雜成分、宏觀結構和表面微結構，已成為一種十分具有潛力的組織工程支架材料。
dECM包括組織來源dECM（tissue derived dECM，TDM）和細胞來源dECM（cell derived dECM，CDM），是通過物理、化學或生物化學等方法去除組織/器官、細胞膜片中的細胞及其他抗原成份，從而獲得接近ECM的天然結構與形狀，并保留了活性成份和維持形狀的蛋白、纖維、多糖、膠原等成份的ECM材料[15]。TDM即是從組織或器官中經過脫細胞處理提取的ECM，已被廣泛用作組織工程生物支架，并獲得了突出成果。當前，基于TDM的研究主要集中在小腸黏膜下層、心臟瓣膜、血管、皮膚、神經、肌腱、韌帶、膀胱、聲帶、羊膜、心、肝、肺等[16-17]。然而，盡管TDM在組成、微結構和生物力學特性方面具有許多優勢，但其效用受到來源組織或器官的可用性、幾何形狀和特性的限制[18]；并且TDM難以獲得特定組織區域，如特定發育階段分化細胞周圍的ECM[19-20]。隨著3D打印等技術的出現，TDM在結構和機械性能上的優勢已不顯著；此外，TDM都是同種異體或異種來源，這一特征增加了病原體傳播潛在風險，并容易引發不良炎癥和免疫反應，導致再生組織和器官的不良后果，并且其供體組織和器官來源非常有限。
為了避免上述TDM的問題并維持近天然組織成分帶來的高生物活性，CDM提供了一種有前途的支架制備方法。本文將對CDM的優勢、制備及表征及其在組織工程中的應用綜述如下。
1 CDM的優勢
CDM是通過體外培養細胞1～6周后，將獲得的細胞及ECM的混合物經脫細胞處理后得到的產物[21]，這些產物可以支持人類干細胞的培養和分化[22]。相比于TDM，CDM主要有以下優勢：① CDM可以篩選培養的細胞病原體，在保持無病原體條件下獲取ECM[23]。② CDM可以提供所需的幾何形狀和孔隙度，不受脫細胞原生組織再生過程中細胞穿透性差的限制；此外，CDM可通過使用合成聚合物作為模板，生產出各種三維形狀和結構的支架，并通過改性賦予其更多功能。③ 體外培養細胞操作靈活，可以根據組織特異性需求通過不同細胞類型和培養方法定制CDM。④ CDM可以通過使用自體細胞避免同種異體或異種材料可能引起的宿主反應，并突破TDM供體組織和器官有限的局限。⑤ CDM由于培養的細胞層較薄，選擇較為溫和的脫細胞方法即可達到較好的脫細胞效果，防止損傷ECM。TDM與CDM的具體比較見表1。
表1
TDM與CDM比較
Table1.
Comparison between TDM and CDM
2 CDM的制備與表征
CDM可以在二維或三維細胞培養條件下制備以適應不同應用需求。CDM制備過程包括細胞擴增、接種、ECM生成/沉積和脫細胞4個主要步驟。其中，ECM生成/沉積是最重要步驟，需要創造理想的培養條件，才能刺激細胞更快地分泌和沉積所需ECM。制備的CDM需要對其成分與結構進行表征，符合安全要求后才能使用。一般來說，同種異體或異種細胞來源的CDM中DNA含量需保持在50 ng/mg以下，以降低免疫原性反應風險[24]。CDM成分與結構的表征方式見表2。
表2
CDM成分與結構的表征方式
Table2.
Characterizations of the components and structures of CDM
CDM最終的組成和功能與細胞的培養條件和方法、細胞來源以及脫細胞方法息息相關[26]。通過系統優化內在因素（例如通過基因改造細胞）和外在因素（支架、培養基、生長因子和物理興奮劑），可以實現最終CDM產品所需的物理和生化特性。
2.1 細胞培養條件與方法的影響
細胞的培養條件與方法涉及培養基種類、培養平臺、氣體環境等。需要一定培養條件（如添加生長因子、旋轉瓶生物反應器等）來控制細胞生長和ECM分泌，并根據需求選擇合適細胞進行培養和擴增。除了一般的二維培養方法，三維細胞培養平臺越來越受到人們關注。現有的三維細胞培養平臺主要有中空纖維生物反應器、微載體（直徑100～300 μm，分為固體球形微載體和多孔微載體）、搖臂式生物反應器和滾筒式生物反應器[26]。這些三維細胞培養平臺通常通過增大細胞附著表面積、促進培養基中氣體交換來顯著提高細胞黏附密度，從而提高CDM的生產效率。具體使用哪種類型培養平臺，需要根據細胞類型和使用需求選擇。
不同培養方法與條件制備的CDM具有不同特性（成分、形貌、剛度等）和生物功能。Zhang等[27]研究了在普通生長培養基和成脂培養基中培養的脂肪來源干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）構建的CDM對ADSCs的影響。在以上兩種CDM上接種ADSCs后，發現ADSCs在普通生長培養基組CDM表面表現出更強遷移能力，而在成脂培養基組CDM表面經歷了成脂分化。此外，缺氧、底物剛度等培養條件也會對CDM組成產生影響，缺氧可以改善成纖維細胞的膠原纖維沉積[28]；基質硬度則會影響細胞表型，進而影響ECM的組成和性質[29]。同樣，基底形貌也可決定ECM的結構組織，微模具和凹槽的使用已被證明可在沉積的ECM中產生各向異性的纖維結構[30]。
2.2 細胞來源的影響
不同來源細胞制備的CDM擁有不同的形貌、成分及生物學功能。Lu等[31]研究了正常人BMSCs、關節軟骨細胞和真皮成纖維細胞制備的CDM，發現3種細胞制備的CDM呈現出由不同ECM生物分子構成的微孔結構。此外，他們進一步檢測了3種CDM的成分，發現存在細微差異。其中，BMSCs制備的CDM主要包含Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、纖連蛋白、玻連蛋白、層粘連蛋白、蛋白聚糖、核心蛋白聚糖和二聚糖；而關節軟骨細胞制備的CDM除了上述成分，還包含多能蛋白聚糖；真皮成纖維細胞制備的CDM則較BMSCs來源CDM成分缺少了蛋白聚糖。
在功能方面，有研究[32]通過將BMSCs、MC3T3成骨前細胞和成纖維細胞接種至纖維墊上，脫細胞制備不同的CDM并展開細胞成骨分化研究，結果發現，BMSCs制備的CDM促進了更強的成骨分化，成骨相關因子VEGF和BMP-2表達水平更高。Marinkovic等[33]研究了由BMSCs和ADSCs制備的兩種CDM分別對BMSCs和ADSCs的影響，結果顯示，兩種細胞在對應的CDM上培養時分別促進了BMSCs和ADSCs的增殖和分化。此外，研究表明，盡管不同CDM的結構蛋白處于相似水平，但其結構（纖維取向和致密性）仍然存在差異。有研究探討了不同干細胞制備的CDM對于BMSCs遷移的影響[34-35]。他們分別將BMSCs和肌腱源性干細胞培養在脫細胞牛跟腱表面，一段時間后脫細胞得到相應的CDM 修飾支架；隨后，將BMSCs培養在支架表面，發現兩種干細胞制備的CDM均能促進BMSCs遷移，而肌腱源性干細胞比BMSCs分泌更多的基質細胞衍生因子1（stromal cell-derived factor 1，SDF-1）和單核細胞趨化蛋白1，且主要通過SDF-1/趨化因子受體4軸激活PI3K/AKT信號通路來調節BMSCs的遷移功能。因此，可以根據需求有目的地培養細胞，以產生所需的ECM支架。近年，Carvalho等[36]研究了由干細胞和人臍靜脈內皮細胞共培養制備的CDM，與僅來自干細胞或人臍靜脈內皮細胞的CDM相比，細胞共培養制備的CDM增強了人BMSCs的成骨分化，并能產生更成熟的礦化基質和更好地生成血管，表明細胞共培養制備的CDM在促進ECM環境方面具有協同作用。上述研究表明，CDM能夠根據基質組成和生化線索來指導組織/譜系特異性再生，調節細胞行為。
根據不同組織的需求，通常選擇相應的特異性細胞作為制備CDM的原料。然而，干細胞由于獨特的生物功能而備受青睞，被廣泛應用于制備修復各類組織的CDM，其形成的CDM是指導細胞活動的關鍵因素[37]。干細胞逐步分化為體細胞的過程中，產生的ECM也是動態變化的，分化細胞分泌和沉積的ECM會根據發育、分化和組織再生的階段繼續進行重塑（即組裝和降解）。來自體外干細胞培養物的CDM已被證明可以提供一種指導性的干細胞微環境，使衰老的祖細胞恢復活力，促進干細胞擴增和分化[38]。多種干細胞（包括多能干細胞[39]、BMSCs[40]、滑膜來源干細胞[41]、ADSCs[42]、牙髓干細胞[43]、臍帶間充質干細胞[44]等）制備的CDM在過去幾十年里得到了廣泛研究。經肌腱來源干細胞制備的CDM修飾的支架在體外顯著改善了BMSCs的遷移，并且可以招募更多內源性基質細胞來加速體內肌腱-骨界面的愈合[45]。在各種干細胞來源中，ADSCs顯示出獨特的臨床應用優勢。與BMSCs等相比，ADSCs可從脂肪組織中大量獲得，且患者幾乎無不適感；此外，ADSCs還表現出與中胚層來源細胞（脂肪生成、成骨和軟骨譜系）相當的分化潛力[46]。值得一提的是，除了ADSCs，在臨床研究中還可以通過來自患者的活檢組織或骨髓提取細胞開發無免疫原性CDM，避免發生與TDM相關的不良反應。
2.3 脫細胞方法的影響
脫細胞方法也會影響CDM的組成與結構，進而影響細胞功能。目前，專門用于制備CDM的脫細胞方法雖然報道很少，但用于制備TDM的脫細胞方法已有廣泛而深入的研究。不同脫細胞方法（物理、化學、生物和混合方法）及其對TDM組成和微觀結構的影響，在既往報道的綜述文獻中已有詳細描述[47]，總的來說幾種方法各有優劣。物理方法雖然操作簡單，不含化學試劑，可減少機體不良反應，但難以完全去除某些較厚組織的細胞；此外，機械攪拌等方法容易破壞ECM的結構，一定程度上影響其力學性能。化學方法雖然能在對ECM結構和組成影響較小的情況下有效去除細胞，但容易去除一些生長因子，降低ECM的生物活性；同時易殘留試劑，降低生物相容性。生物方法雖然可以特異性去除細胞和抗原成分，且對其他生物活性成分損害較小，但容易損害蛋白質微觀結構，且易發生由特異性酶殘留引起的免疫反應。相比單一使用以上某種方法，混合方法更加安全有效，但需要根據特定組織的需求進行定制。
目前，用于TDM制備的脫細胞方法已應用于CDM的制備。CDM較薄，因此較溫和的脫細胞方法（如循環凍融、Triton X-100）對CDM損害較小，適用于CDM的制備，尤其是在二維培養中制備CDM。此外，為了盡可能減小脫細胞過程對于CDM組分生物活性的破壞，有研究通過優化培養技術來實現。比如，有研究者構建了單個小尺寸三維細胞球體（幾百微米），其可以實現溫和而有效的脫細胞（使用Triton X-100），保護了組裝的ECM的微結構和生物活性，重新接種細胞后，可以獲得足夠的氧氣和營養，并均勻分布和增殖[48-49]。但仍需要進一步研究專門用于CDM的脫細胞方法。
3 CDM在組織工程中的應用
如今，可以在各種培養條件下制備各類CDM，以滿足細胞擴增、組織工程、生長因子的遞送等特定應用需求。由于CDM的突出活性和可定制特性，其已成為組織工程領域一種富有前景的材料。見表3。
表3
不同細胞來源的CDM在組織工程中的應用
Table3.
Application of CDM from different cells in tissue engineering
目前，CDM在組織工程領域主要有4種應用方法，包括：① 將細胞培養在平板上，一段時間后脫細胞處理，獲得CDM薄片作為生物材料使用；② 將細胞培養在顆粒狀基板上，獲得CDM球作為生物材料直接使用；③ 將細胞直接培養在多孔生物材料上，脫細胞后可獲得由CDM修飾的生物材料；④ 將所得的CDM經尿素等提取為溶液，涂敷在生物材料表面作為涂層使用，或進行3D打印。其中，CDM薄片保留了ECM完整性，已成為一種新興的ECM產品用于多種生物醫學用途。它們提供了天然基質和具有復雜生理功能的生物分子集，可用于細胞擴增并支持同種異體再細胞化[53-54]。而將CDM提取為溶液制備涂層或3D打印由于產量有限而應用較少，其通常需要與其他聚合物聯合使用。例如，Santos等[55]將聚合物溶液與來源于人牙周韌帶干細胞/基質細胞的CDM相結合，開發了負載CDM的聚己內酯/殼聚糖活性納米纖維支架。
目前，直接培養在多孔生物材料表面獲得由CDM修飾的生物材料支架在組織工程中應用最為廣泛。其可以使支架在擁有CDM生物活性的同時具備模板支架的機械性能。此外，通過設計制備特定結構的模板支架，可以使CDM支架具有近天然組織的微結構，從而進一步提升活性。Gu等[56]將雪旺細胞在殼聚糖纖維蛋白支架上培養，脫細胞后獲得CDM修飾的支架以修復神經，結果表明該支架的再生作用與脫細胞神經移植物相似，且明顯優于普通的殼聚糖/絲素蛋白支架。Tang等[52]結合聚乳酸-羥基乙酸共聚物靜電紡絲納米纖維模板和人ADSCs制造用于傷口愈合的CDM修飾納米纖維敷料，其保留了Ⅰ型膠原蛋白和層粘連蛋白，具有親水性，并具有適合傷口愈合的適當機械強度；當接種成纖維細胞時，該納米纖維敷料支持細胞存活和增殖。通過交聯，CDM的穩定性和降解性能進一步提高[39]。此外，CDM還可與3D打印聯合使用。骨細胞來源的CDM與3D打印多孔聚己內酯支架相結合，與單純聚己內酯支架相比，修飾了CDM的支架增加了間充質祖細胞的黏附、增殖和成骨活性[57]。Pati等[58]也開發了CDM修飾的3D打印支架，與裸3D打印支架相比，它可以通過調節4個典型的成骨細胞基因來促進人鼻甲間充質干細胞的成骨細胞分化，并增加鈣沉積，誘導新骨形成。
為了獲得具有理想功能的CDM支架，還可以針對表面誘導的ECM組裝定制聚合物的表面微結構。如在具有 2～6 μm 寬的垂直微紋理聚二甲基硅氧烷支架表面培養人成纖維細胞，其形態、黏附力和肌動蛋白細胞骨架發生了顯著變化[59]。在另一項研究中[60]，通過在合成的取向納米光柵上培養人真皮成纖維細胞，得到高度排列的納米纖維CDM支架。由于保留了高度排列的彈性蛋白纖維，其彈性模量得到了很好維持。細胞重新接種后發現該活性支架可提供細胞黏附位點，并支持和指導細胞沿下層纖維增殖和排列。這些研究顯示了CDM修飾精心設計的合成聚合物作為混合支架的前景，其結合了模板支架的結構和機械性能，以及細胞分泌的天然ECM大分子的生物學指導信號，超越了傳統材料合成與制備方法的局限，在組織工程領域具有獨特優勢[59]。
4 總結與展望
總的來說，盡管由于體外培養細胞ECM分泌模式不同于體內，ECM的體外自組裝很難復制復雜的天然ECM體系結構。但是，與TDM相比，CDM具有無限的可用性、靈活的可調節性、對不同發育階段的適應性和充分的安全性等優勢，在組織工程方面仍然具有很大發展前景。但是，盡管CDM已被引入組織工程各種領域（如使用CDM制備人造組織和器官），目前仍只有CDM構建的人工血管在臨床環境中進行了檢測[61]，而許多TDM已在各種組織中進行了廣泛測試。因此，基于CDM的組織工程支架的開發及臨床應用還需進一步研究。
此外，CDM的規模化是局限其廣泛應用的一個關鍵。一方面，需有合適的技術以保障足夠量的ECM沉積；另一方面，要維持細胞在長期培養過程中不變性。雖然當前已有一些技術被開發用于促進ECM沉積，如添加抗壞血酸（維生素C）、生長因子和基質蛋白酶抑制劑以增加CDM中膠原蛋白含量[62-63]，利用帶負電荷的聚葡萄糖 ［硫酸葡聚糖（DxS），相對分子質量500×103］ 在介導ECM合成和組裝過程中聚集和共沉淀ECM組分[64]；將帶中性電荷的大分子，如基于多蔗糖的共聚物（可變大小的Ficolls）添加到細胞培養基中，以產生由大分子擁擠驅動的排除體積效應[65-66]。但是，在制造過程中，內在因素和外在因素的任何變化都會導致CDM產品的偏差。擴大生產規模首先要考慮形成穩定的細胞來源、培養基成分、生物反應器、化學品和加工方法。其中，原代細胞和細胞系等細胞來源在CDM的批次變異性中起主要作用。原代細胞本質上是可變的，因此必須實施適當的預表征和細胞庫策略，以保持所需標準。在沒有基因改造的情況下，只有來自主要來源的干細胞才有能力進行足夠的細胞分裂，以大規模生產CDM。例如，胚胎干細胞在培養中通常被認為是長久的，間充質干細胞可以有13～25個群體倍增，表皮干細胞在衰老之前可以有多達115個群體倍增。然而，對于工業制造來說，維持干細胞來源是一項艱巨任務。細胞系或基因工程細胞由于能夠長期維持，是大規模生產CDM的更好選擇；然而，細胞系仍可能失去其特殊特性，需要定期進行質量控制和表征。此外，現有的擴增技術雖然解決了高表面積與體積比的營養轉移問題，但是沒有解決其他因素，例如動態培養的影響和下游加工的其他步驟。平臺的動態特性（例如中空纖維生物反應器的灌注速率、微載體生物反應器的噴泡速率、滾筒瓶每分鐘的轉數、搖臂生物反應器每分鐘的搖擺周期）將影響最終CDM產品的組成。因此，需要探索特定細胞與培養方式的固定制備體系。同時，大多數擴增平臺是為提取細胞或生物制劑（如可溶性蛋白質）而開發的，不針對具有豐富不溶性大分子的整個ECM。因此，仍然需要開發特定下游工藝，以從現有系統中獲取CDM（例如，從中空纖維通道、微載體或容器表面去除細胞）。
總之，盡管仍然存在一些局限，但CDM因其突出的可調節性、安全性和高生物活性，在組織工程領域中顯示出優越性。隨著技術的不斷進步，適用于臨床的CDM支架將有望不斷出現。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點及其報道
作者貢獻聲明 杜志坡、廖婕：資料收集和文章撰寫；王冰冰：文稿修改；于素香、李曉明：內容構思、觀點形成、結構設計以及提出文章修改意見
