肺癌是全球癌癥相關死亡的主要原因。盡管通過篩查高危人群進行早期檢測越來越普遍，但大多數肺癌患者確診時已是晚期。在過去10年中，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）治療有了顯著進步。新出現的靶向治療和免疫治療方案已使NSCLC治療更具個體化，這顯著影響了NSCLC患者的病程和結局。目前，分子生物標志物已經成為診斷癌癥、預測治療反應結果和評估預后的有利工具。本文總結了NSCLC診斷、預測和預后相關的生物標志物以及新型潛在預測性生物標志物。
引用本文： 洪子強, 金大成, 白向豆, 崔百強, 茍云久. 非小細胞肺癌生物標志物的研究進展. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2024, 31(2): 311-318. doi: 10.7507/1007-4848.202204084 復制
版權信息： ?四川大學華西醫院華西期刊社《中國胸心血管外科臨床雜志》版權所有，未經授權不得轉載、改編
根據2022年國家癌癥中心發布的最新一期全國癌癥統計數據[1]顯示，肺癌在男性及女性中的死亡率均居首位。肺癌分為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）和小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）[2]。NSCLC較SCLC發展和轉移慢，受到現有檢查方式、體檢意識和醫療資源分配等相關因素的影響，大部分患者診斷為肺癌時已是晚期，針對晚期肺癌有意義的治療方案較少，5年生存率不足20%[3-4]。而早期診斷為肺癌的患者5年生存率可顯著提高[5]。故癌癥篩查和早期診斷對于降低肺癌死亡率具有重要意義。
由于缺乏有效的早期篩查工具，NSCLC患者的臨床預后仍然很差。因此，越來越多的研究人員致力于尋找可用于早期癌癥檢測或預測治療結果的非侵入性生物標志物。然而，并非所有的生物標志物都像甲胎蛋白在肝癌的臨床檢測中一樣，具有高度的敏感性和特異性，可隨時監測疾病的發展和預后。故尋找合適的生物標志物，用于肺癌早期篩查或提前預測臨床結果，從而為癌癥治療提供指導十分必要。本文將介紹NSCLC診斷、預測和預后的相關生物標志物，以期為臨床實踐提供一些參考。
1 生物標志物的定義
生物標志物具有可測量的特征，可指示腫瘤的生物學過程或指示治療干預的反應[6]。診斷性生物標志物能夠檢測和區分特定疾病與其他疾病，或者識別特定疾病的相關亞型。預測性生物標志物可用來識別最有可能從某些治療中獲益的個體。預后性生物標志物可指示臨床結果的可能性或疾病復發和進展的速度。生物標志物最具參考價值的特征是特異性和敏感性，敏感性為試驗組患者中真陽性病例的百分比，特異性為對照組患者中真陰性病例的百分比[7]。本文討論了NSCLC的診斷性、預測性和預后性生物標志物。此外，我們還討論了一些尚未在臨床實踐中應用的新型生物標志物，且這些新型生物標志物已經顯示出臨床應用潛力。
2 診斷性生物標志物在非小細胞肺癌臨床治療中的應用
腺癌比鱗狀細胞癌（鱗癌）有更高的靶向突變率，獲批的治療NSCLC的藥物對于攜帶驅動基因改變的腺癌患者療效顯著[6]。因此，組織學的劃分對于決定最佳治療方案至關重要。在本節中，我們將討論在臨床實踐中使用的生物標志物，如免疫組織化學和血液/血清診斷性生物標志物。此外，我們也將討論一些新型生物標志物，這些標志物還沒有進入臨床實踐，但顯示出較大的診斷潛力。
2.1 外泌體源性蛋白質作為肺癌的診斷性生物標志物
有文獻[8]報道，外泌體源性蛋白質能反映與疾病相關的病理過程，且不受蛋白酶的影響，可穩定存在于體液中而易于被檢測。因此，外泌體源性蛋白質也是臨床應用的理想生物標志物。
肺癌患者血漿外泌體中CD91、CD317等蛋白的高表達，可作為NSCLC診斷的新型生物標志物[9]。Mo等[10]研究了γ射線輻射后的NSCLC細胞釋放出的外泌體，發現外泌體可促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力，外泌體中血管生成素樣蛋白４在A549細胞的轉移中發揮重要作用，證明其是診斷肺癌轉移的標志物和治療靶點。
2.2 血液和血清中的循環腫瘤蛋白生物標志物
血液和血清樣本很容易獲得，細胞角蛋白19片段、癌胚抗原、鱗癌抗原和糖類抗原125是檢測肺癌最常用的血液和血清生物標志物，它們既可作為單個生物標志物使用，又可作為聯合生物標志物組合使用[11]。一些研究[12-13]提出了已確定的生物標志物和新型標志物的不同組合，如癌癥/睪丸抗原1B、催乳素、視黃醇結合蛋白、神經元特異性烯醇化酶。上述研究結果都表明，與單一標志物的性能相比，聯合新型標志物增加了檢測的特異性和敏感性。此外，將自身抗體與已建立的生物標志物一起檢測，可增加已建立的生物標志物在早期癌癥檢測中的作用，因為自身抗體在腫瘤發生早期產生，可比腫瘤相關的抗原更早地在血清中檢測出來。
2.3 潛在的診斷性生物標志物
2.3.1 lncRNA
lncRNA已成為癌癥發生和進展的關鍵因素。lncRNA表達水平與肺癌發病風險呈顯著負相關[14]。受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析發現，CHIAP2、LINC00961、SFTA1P和LINC00312具有較高的單獨診斷價值和聯合診斷價值，曲線下面積（area under the curve，AUC）為0.81，可能成為肺癌潛在的診斷性生物標志物[14]。
2.3.2 circRNA
人體細胞中存在大量circRNA。Huang等[15]發現：hsa_circ_0070354在NSCLC組織、細胞和血清中高表達，具有敏感性、穩定性和重復性；ROC曲線分析結果顯示，hsa_circ_0070354在檢測NSCLC方面優于常規腫瘤標志物，聯合診斷對NSCLC的診斷更有意義。Zhu等[16]發現has_circ_0013958在49例患者的肺腺癌組織、細胞和血漿中的表達均顯著上調，促進癌細胞增殖和侵襲，被認為是早期檢測和篩查肺癌的潛在非侵入性生物標志物。關于腫瘤抑制circRNA，Zhang等[17]證實circRNA_FOXO3在NSCLC組織及細胞中下調，AUC為0.782［95%CI（0.682，0.862）］，靈敏度為80.0%，特異性為73.3%，說明其對NSCLC具有潛在的診斷價值。
2.3.3 miRNA
miRNA是一類由內源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼RNA分子，主要通過轉錄后水平調控基因表達，在細胞生長、凋亡、炎癥和癌癥等生物學過程中發揮重要作用[18]。由于miRNA較穩定，可在血清、血漿、胸膜液、尿液或腦脊液等多種生物液體中檢測到，因此miRNA可成為理想的診斷性生物標志物。
某些miRNA的表達水平在疾病狀態下和健康狀態下存在差異，這些差異可能會為肺癌的診斷提供新的思路。例如，在肺癌組織中miR-33a-5p和miR-128-3p相對于相鄰正常組織表達下調，這些miRNA的組合顯示出良好的診斷性能[19]。一些miRNA被證明可用于NSCLC亞型的特異性診斷[20]，如miR-205可用于鱗癌的診斷，而miR-375可用于腺癌的診斷。研究[21]表明，外周血中m6A水平在幾種癌癥類型中明顯失調，并具有診斷價值。m6A miRNA標記在肺癌中表現出很高的敏感性（AUC=0.976），可用于肺癌的鑒別。此外，m6A miRNA的診斷性能不受性別、年齡和良性疾病的影響，可成為肺癌診斷的生物標志物。
2.4 免疫組織化學生物標志物
免疫組織化學是臨床中肺癌組織學診斷和分型的主要技術。根據在肺癌診斷中使用免疫組織化學的最佳實踐建議[22]，甲狀腺轉錄因子1（thyroid transcription factor-1，TTF-1）（用于腺癌）和p40（用于鱗癌）被認為是NSCLC分型的最佳標志物，特別是當用8G7G3/1單克隆抗體檢測TTF-1時。對于TTF-1，只有局灶性陽性反應被認為是有效陽性；而對于p40，>50%的腫瘤細胞需表現出陽性。此外，在TTF-1陰性腺癌中，應考慮轉移可能。
3 預測性生物標志物在非小細胞肺癌臨床治療中的應用
NSCLC的組織學類型是化療效果的預測因素。例如，培美曲塞對非鱗癌患者有益，而在培美曲塞和安慰劑組中，鱗癌患者的總生存期（overall survival，OS）相似[23]。因此，非鱗癌是培美曲塞化療的預測因素。除了組織學之外，特定的基因改變也是NSCLC治療的預測性生物標志物。
預測性生物標志物的識別對治療有很大的影響，檢測出已知基因的改變是治療的先決條件。在檢測預測性生物標志物時，需要考慮兩個重要因素：獲得足夠的標本和選擇正確的檢測方法。在本節中，我們將重點關注在靶向治療和免疫治療中最常用的預測性生物標志物。靶向治療的預測性生物標志物見表1；已批準的免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors，ICIs）見表2。
表1
靶向治療的預測性生物標志物
表2
已批準的免疫檢查點抑制劑匯總
3.1 靶向治療
3.1.1 c-ros原癌基因1受體酪氨酸激酶（c-ros oncogene 1 receptor tyrosine kinase，ROS1）
ROS1參與細胞生長和分化，盡管ROS1主要在胚胎發育過程中表達，但在成人肺組織中也有少量表達。在1%～3%的肺腺癌中，可觀察到ROS1基因的重排[24]。這些重排導致ROS1基因的組成性激活，并導致細胞增殖和遷移。ROS1重排在從未吸煙的年輕患者中更為常見，且幾乎只在腺癌中觀察到[25]。目前許多研究和試驗[25-26]正在測試多激酶抑制劑的有效性，如用賽瑞替尼、布加替尼、阿來替尼、卡博替尼或勞拉替尼治療ROS1重排的NSCLC患者。
3.1.2 轉染重排（rearranged during transfection，RET）
RET融合發生于0.7%～2%的NSCLC，在腺癌組織學類型中檢出率更高[27]。RET最常見的融合基因是KIF5B[28]。RET融合基因蛋白的卷曲螺旋結構域促進了RET融合蛋白的二聚化，導致RET激酶的組成性激活和幾種激酶的激活，包括MAPK、PI3K/AKT和JNK[28]。有試驗和病例報告[29-30]顯示，卡博替尼和凡德他尼治療RET重排的NSCLC患者效果顯著。2020年美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批準塞爾帕替尼和普拉斯替尼用于治療伴有RET基因改變的NSCLC。
3.1.3 間充質-上皮轉化因子受體（mesenchymal-epithelial transition tyrosine kinase receptor，MET）
在與配體結合后，MET介導多種信號通路的激活，如PI3K/AKT、STAT3、SRC/FAK和MAPK/ERK[31]。據報道，NSCLC中的MET突變包括擴增、外顯子14跳躍突變和激酶結構域突變[31]。克唑替尼對攜帶MET外顯子14跳躍突變和MET過度表達的NSCLC患者的治療效果顯著[32]。FDA還根據GEOMETRY mono-1試驗[33]結果，批準卡馬替尼治療有MET外顯子14跳躍突變的轉移性NSCLC患者。同時，2021年FDA批準特泊替尼用于治療MET外顯子14發生跳躍突變的轉移性NSCLC。
3.2 免疫治療
程序性死亡配體1（programmed death-ligand 1，PD-L1），也稱為B7-H1，由CD274基因編碼。PD-L1在巨噬細胞、抗原呈遞細胞、B細胞、T淋巴細胞等多種免疫細胞表面組成性表達。PD-L1結合程序性死亡受體1（programmed death-1，PD-1），這種結合會導致免疫系統的抑制，并且對于預防炎癥期間的自身免疫反應很重要。
PD-L1也在許多不同的腫瘤細胞表達，例如肺癌細胞，其表達使它們逃避免疫應答。與健康肺組織相比，NSCLC組織中PD-L1在mRNA和蛋白水平上的表達均較高。目前，FDA批準了4種針對PD-1/PD-L1相互作用的單克隆抗體用于NSCLC患者的治療[34]：納武利尤單抗、帕博利珠單抗、阿替利珠單抗和度伐利尤單抗。然而，PD-L1表達作為預測性生物標志物的有效性值得懷疑。因為已有研究[35]表明，PD-L1低表達（<1%）的患者對抗PD-1/PD-L1治療的反應異常。PD-L1的表達可能隨著時間的推移而改變，且在整個腫瘤組織中不一致。
4 新型預測性生物標志物在非小細胞肺癌臨床治療中的應用
4.1 靶向治療
盡管目前生物標志物顯著改善了NSCLC患者的治療，但仍需要新的預測因子和靶向療法以幫助NSCLC患者取得更好的療效。我們將總結已經在臨床試驗[36-39]中進行測試的靶向治療新型預測性生物標志物，這些標志物在未來可能會發揮重要作用；見表3。
表3
已經在臨床試驗中進行測試的新型預測性生物標志物
4.1.1 Kirsten大鼠肉瘤病毒基因同源物（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS）
KRAS基因編碼RAS蛋白，RAS蛋白是一種GTP酶，對激活Raf/MEK/ERK、PI3K/AKT/mTOR和RalGDS/RalAIB信號通路至關重要[40]。KRAS突變引起KRAS信號的結構性激活，導致細胞增殖。KRAS突變的激活幾乎只存在于腺癌中，且在西方人群中更為常見（在西方人群中約30%，在亞洲人群中約10%）[41]。考慮到KRAS和表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）突變的相互排他性以及RAS蛋白在EGFR信號通路下游中的作用，KRAS狀態可用來判斷NSCLC患者是否可從EGFR抑制劑的治療中獲益。KRAS G12C突變是NSCLC最常見的KRAS突變，目前有臨床試驗正在研究治療KRAS G12C突變的方法。
4.1.2 成纖維細胞生長因子受體1（fibroblast growth factor receptor 1，FGFR1）
FGFR1是一種參與增殖調節的細胞表面酪氨酸激酶，參與細胞分化、遷移等。FGFR1的擴增、突變和重排可導致受體的組成性激活，并促進腫瘤的發展。在9%～20%的鱗癌和15%的肺腺癌中發現FGFR1的擴增，且在有吸煙史的男性患者中更為常見[42]。有研究[43]表明，成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）或FGFR家族的異常表達降低了間質樣NSCLC對EGFR抑制劑的敏感性。多年來，許多非選擇性FGFR抑制劑在NSCLC中被研究[44]，如多韋替尼、樂伐替尼、帕唑帕尼、尼達尼布、普納替尼等。但大多數研究觀察到的抗腫瘤活性有限，藥物毒副作用大。然而，評估FGFR作為預測性生物標志物有效性的研究仍在進行中，新型FGFR抑制劑的列表仍在擴大。
4.2 免疫治療
已經在臨床試驗[45-46]中測試的新型免疫治療預測性生物標志物見表3。
4.2.1 腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor-infiltrating lymphocyte，TIL）
腫瘤微環境相關生物標志物是近年研究的熱點，其中TIL在預測療效方面具有一定潛力。PD-L1表達與NSCLC腫瘤內T細胞浸潤顯著相關[47]。根據PD-L1/TIL狀態，NSCLC腫瘤免疫微環境分為Ⅰ型（PD-L1+，TIL+），Ⅱ型（PD-L1?，TIL?），Ⅲ型（PD-L1+，TIL?）和Ⅳ型（PD-L1?，TIL+）[48-49]。與不同腫瘤免疫微環境類型相關的臨床因素的差異決定了患者是否選擇聯合免疫治療[49]。抗PD-1/PD-L1治療可使Ⅰ型受益。然而，Ⅲ型對抗PD-1/PD-L1單一療法具有耐藥性，聯合輔助治療可將T細胞募集到腫瘤上以對抗這種耐藥性。CD8+細胞在CD3+TILs總體中的比例與抗PD-1/PD-L1治療效果密切相關。研究[50]表明，高CD8+/CD3+比值與無病生存率（disease-free survival，DFS）和OS呈正相關。抗PD-1治療后CD8+T細胞的早期增殖預示著抗PD-1治療的良好臨床反應[50]。
4.2.2 錯配修復功能缺陷（different mismatch repair，dMMR）與微衛星不穩定（microsatellite instability，MSI）
DNA錯配修復系統（mismatch repair，MMR）是細胞進化中高度保守的修復機制，MMR系統通過忽略基因重組和修復已識別的錯配核苷酸，同時避免DNA微衛星的缺失或插入，來維持基因組的完整性和穩定性[51]。dMMR是由遺傳突變或在發生散發性腫瘤的情況下引起的，最常見原因是表觀遺傳改變，如4個關鍵基因MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的甲基化狀態，其作為異二聚體形式的DNA MMR酶具有活性，通常為MLH1/PMS2和MSH2/MSH6[52]。在dMMR狀態下，若1個或多個MMR蛋白功能失調或未表達將導致遺傳超突變性最常出現在微衛星位點，即所謂的MSI[51]。MSI測試面板的標準部位是BAT25、BAT26、D5S346、D2S123和D17S250[51]。MSI在NSCLC中并不常見，有研究[53]報道NSCLC中MSI頻率<1%。
4.2.3 腫瘤突變負荷（tumor mutational burden，TMB）
TMB是指特定基因組區域內體細胞非同義突變的個數，通常用每兆堿基的突變數量（mut/Mb）表示，是一種定量的生物標志物[54]。TMB可作為納武利尤單抗（PD-1靶向抗體）和伊匹單抗（CTLA-4靶向抗體）治療的預測性生物標志物。與接受化療作為一線治療的患者相比，接受納武利尤單抗和伊匹單抗聯合治療的患者具有高TMB（每兆堿基≥10個突變），從而無進展生存期（progression-free survival，PFS）明顯延長[55]。CheckMate-026研究[46]是一項隨機Ⅲ期臨床試驗，目的是比較納武利尤單抗和含鉑兩藥化療作為一線治療方案對PD-L1表達＞5%的初治NSCLC患者的治療效果。在CheckMate-026研究中TMB高的患者PFS延長（中位PFS為9.7個月 vs. 5.8個月），且有更高的客觀反應率（46.8% vs. 28.3%）。此外，TMB和PD-L1的表達被證明是獨立生物標志物。
5 預后性生物標志物在非小細胞肺癌臨床治療中的應用
5.1 預后性生物標志物
預后性生物標志物可表明患者臨床結局（通常用OS、PFS或DFS表示）的可能性[11]。識別肺癌患者的預后性標志物很重要，因為它可識別可能受益于不同類型治療的患者亞群。尋找預后性標志物最可靠的方法是大型研究或安慰劑對照試驗，因為隊列中的患者特征更加明確和統一。此外，為了擴大患者隊列和增加統計數量，還可通過對試驗或研究進行Meta分析，使用經濟有效的方法來尋找潛在的預后性生物標志物。
5.2 新型預后性生物標志物
我們總結了已有文獻報道的新型預后性生物標志物；見表4。雖然這些新型預后性生物標志物仍存在爭議，但隨著驗證性研究數量的增加，我們相信它們可顯示出良好的潛力。
表4
新型預后性生物標志物
5.2.1 血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）
VEGF影響微血管通透性，刺激內皮細胞的生長，并在新血管的形成中起重要作用[56]。VEGF過表達與腫瘤復發和轉移有關，在肺癌等多種癌癥中都很常見。有研究[57]報道，VEGF過表達提示肺癌的預后不良。
5.2.2 乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）
LDH被廣泛認為是許多晚期實體瘤（包括NSCLC在內）的預后標志物[58]。作為全身炎癥和腫瘤負荷的標志物，LDH可通過增加乳酸的產生來調節腫瘤微環境并促進免疫抑制。對于NSCLC，LDH和其他炎癥標志物已被納入預后模型，以對接受化療和ICIs治療的患者進行風險分層[59]。Mezquita等[59]報道，在接受ICIs治療但未接受化療的患者中，預處理LDH升高與更差的預后相關。
5.2.3 TP53
TP53基因編碼腫瘤抑制蛋白p53，在細胞周期調節、衰老、自噬、凋亡和DNA修復中發揮重要作用。p53突變導致p53腫瘤抑制功能的喪失，導致細胞過度增殖和促進癌癥的發展。在NSCLC中，鱗癌的p53突變比腺癌更為常見（分別為77%和47%）[60]。此外，有研究[60]報道，與TP53WT相比，在NSCLC中p53突變情況與較低的生存率和對癌癥治療的耐藥性增加有關。
5.2.4 肺表面活性物質蛋白A1（pulmonary surfactant-associated protein-A1，SFTPA1）
SFTPA1是C型凝集素亞家族的成員，在維持肺組織內環境穩定和先天性免疫反應中起著關鍵作用[61]。SFTPA1破壞可導致多種急性或慢性肺部疾病，包括肺癌。Yuan等[61]的研究通過癌癥基因組圖譜對肺腺癌樣本的生存進行分析發現，SFTPA1的高表達與良好的預后相關，可作為預測肺腺癌患者對免疫治療反應的生物標志物。
5.2.5 循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）
ctDNA測序可應用于分子殘留病灶（molecular residual disease，MRD）檢測，可輔助識別術后復發高風險患者。四川大學華西醫院劉倫旭教授團隊的LUNGCA-1試驗[62]是大規模多中心前瞻性肺癌預后分子標志物的研究，揭示了圍術期ctDNA能有效預測NSCLC患者術后復發，可作為NSCLC患者術后早期檢測MRD的可靠指標。研究發現術后1個月內ctDNA-MRD陽性患者的復發率80.8%（21/26），顯著高于陰性患者16.2%（49/303）（P<0.001），術后ctDNA-MRD狀態是術后患者復發的預測指標［HR=11.1，95%CI（6.5，19.0），P<0.001］。
5.2.6 轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）
TGF-β屬于細胞因子家族，參與細胞增殖、分化和細胞外基質的產生[63]。有研究[64]報道TGF-β1蛋白高表達提示預后不良。這些發現需要進一步的研究來證實。
5.2.7 腱蛋白樣蛋白1（Chordin-like 1，CHRDL1）
CHRDL1是一種屬于Chordin家族的分泌蛋白，其功能與Chordin類似，主要是作為骨形態發生蛋白的特異性抑制劑。Deng等[65]通過癌癥基因組圖譜的數據證明了CHRDL1和肺腺癌之間的關系。研究發現CHRDL1的表達可很好地將肺腺癌組織與正常樣本區分開來，低CHRDL1與較差的臨床病理特征相關。此外，生存曲線也顯示，低CHRDL1與較低的總體生存率顯著相關（HR=0.60，P<0.001）。
5.2.8 Ki-67
由于Ki-67在整個細胞周期中都在分裂活躍的細胞中表達，且在M期達到表達高峰，因此Ki-67是很好的預后生物標志物[66]。Ki-67的高表達與包括NSCLC在內的多種癌癥的不良預后相關。此外，有學者[67]認為Ki-67與腫瘤組織的病理分級、臨床分期、淋巴結轉移、腫瘤大小有關。
6 總結與展望
肺癌的治療效果取決于患者的特征、腫瘤的組織學類型、經評估的生物標志物以及病理科醫生和臨床醫生之間良好且有效的溝通。目前，診斷性生物標志物在臨床常規中已經很好地建立起來。在過去10年中，利用預測性生物標志物治療NSCLC的研究也取得了重大進展，且有大量的研究正在識別新型預測性生物標志物。結合這些新試驗的發現，我們預估在不久的將來，預測性生物標志物的數量及其相關的治療選擇將會增加。然而，這些生物標志物的發展將如何影響常規臨床實踐仍有待觀察。我們期望生物標志物在未來可更好地應用于臨床，以幫助NSCLC患者取得更好的療效。
利益沖突：無。
作者貢獻：洪子強負責論文設計，開展研究，數據處理與分析，論文撰寫與修改；金大成負責論文審核和修改；白向豆負責實施研究；崔白強負責數據整理與分析；茍云久負責論文設計。
根據2022年國家癌癥中心發布的最新一期全國癌癥統計數據[1]顯示，肺癌在男性及女性中的死亡率均居首位。肺癌分為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）和小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）[2]。NSCLC較SCLC發展和轉移慢，受到現有檢查方式、體檢意識和醫療資源分配等相關因素的影響，大部分患者診斷為肺癌時已是晚期，針對晚期肺癌有意義的治療方案較少，5年生存率不足20%[3-4]。而早期診斷為肺癌的患者5年生存率可顯著提高[5]。故癌癥篩查和早期診斷對于降低肺癌死亡率具有重要意義。
由于缺乏有效的早期篩查工具，NSCLC患者的臨床預后仍然很差。因此，越來越多的研究人員致力于尋找可用于早期癌癥檢測或預測治療結果的非侵入性生物標志物。然而，并非所有的生物標志物都像甲胎蛋白在肝癌的臨床檢測中一樣，具有高度的敏感性和特異性，可隨時監測疾病的發展和預后。故尋找合適的生物標志物，用于肺癌早期篩查或提前預測臨床結果，從而為癌癥治療提供指導十分必要。本文將介紹NSCLC診斷、預測和預后的相關生物標志物，以期為臨床實踐提供一些參考。
1 生物標志物的定義
生物標志物具有可測量的特征，可指示腫瘤的生物學過程或指示治療干預的反應[6]。診斷性生物標志物能夠檢測和區分特定疾病與其他疾病，或者識別特定疾病的相關亞型。預測性生物標志物可用來識別最有可能從某些治療中獲益的個體。預后性生物標志物可指示臨床結果的可能性或疾病復發和進展的速度。生物標志物最具參考價值的特征是特異性和敏感性，敏感性為試驗組患者中真陽性病例的百分比，特異性為對照組患者中真陰性病例的百分比[7]。本文討論了NSCLC的診斷性、預測性和預后性生物標志物。此外，我們還討論了一些尚未在臨床實踐中應用的新型生物標志物，且這些新型生物標志物已經顯示出臨床應用潛力。
2 診斷性生物標志物在非小細胞肺癌臨床治療中的應用
腺癌比鱗狀細胞癌（鱗癌）有更高的靶向突變率，獲批的治療NSCLC的藥物對于攜帶驅動基因改變的腺癌患者療效顯著[6]。因此，組織學的劃分對于決定最佳治療方案至關重要。在本節中，我們將討論在臨床實踐中使用的生物標志物，如免疫組織化學和血液/血清診斷性生物標志物。此外，我們也將討論一些新型生物標志物，這些標志物還沒有進入臨床實踐，但顯示出較大的診斷潛力。
2.1 外泌體源性蛋白質作為肺癌的診斷性生物標志物
有文獻[8]報道，外泌體源性蛋白質能反映與疾病相關的病理過程，且不受蛋白酶的影響，可穩定存在于體液中而易于被檢測。因此，外泌體源性蛋白質也是臨床應用的理想生物標志物。
肺癌患者血漿外泌體中CD91、CD317等蛋白的高表達，可作為NSCLC診斷的新型生物標志物[9]。Mo等[10]研究了γ射線輻射后的NSCLC細胞釋放出的外泌體，發現外泌體可促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力，外泌體中血管生成素樣蛋白４在A549細胞的轉移中發揮重要作用，證明其是診斷肺癌轉移的標志物和治療靶點。
2.2 血液和血清中的循環腫瘤蛋白生物標志物
血液和血清樣本很容易獲得，細胞角蛋白19片段、癌胚抗原、鱗癌抗原和糖類抗原125是檢測肺癌最常用的血液和血清生物標志物，它們既可作為單個生物標志物使用，又可作為聯合生物標志物組合使用[11]。一些研究[12-13]提出了已確定的生物標志物和新型標志物的不同組合，如癌癥/睪丸抗原1B、催乳素、視黃醇結合蛋白、神經元特異性烯醇化酶。上述研究結果都表明，與單一標志物的性能相比，聯合新型標志物增加了檢測的特異性和敏感性。此外，將自身抗體與已建立的生物標志物一起檢測，可增加已建立的生物標志物在早期癌癥檢測中的作用，因為自身抗體在腫瘤發生早期產生，可比腫瘤相關的抗原更早地在血清中檢測出來。
2.3 潛在的診斷性生物標志物
2.3.1 lncRNA
lncRNA已成為癌癥發生和進展的關鍵因素。lncRNA表達水平與肺癌發病風險呈顯著負相關[14]。受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析發現，CHIAP2、LINC00961、SFTA1P和LINC00312具有較高的單獨診斷價值和聯合診斷價值，曲線下面積（area under the curve，AUC）為0.81，可能成為肺癌潛在的診斷性生物標志物[14]。
2.3.2 circRNA
人體細胞中存在大量circRNA。Huang等[15]發現：hsa_circ_0070354在NSCLC組織、細胞和血清中高表達，具有敏感性、穩定性和重復性；ROC曲線分析結果顯示，hsa_circ_0070354在檢測NSCLC方面優于常規腫瘤標志物，聯合診斷對NSCLC的診斷更有意義。Zhu等[16]發現has_circ_0013958在49例患者的肺腺癌組織、細胞和血漿中的表達均顯著上調，促進癌細胞增殖和侵襲，被認為是早期檢測和篩查肺癌的潛在非侵入性生物標志物。關于腫瘤抑制circRNA，Zhang等[17]證實circRNA_FOXO3在NSCLC組織及細胞中下調，AUC為0.782［95%CI（0.682，0.862）］，靈敏度為80.0%，特異性為73.3%，說明其對NSCLC具有潛在的診斷價值。
2.3.3 miRNA
miRNA是一類由內源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼RNA分子，主要通過轉錄后水平調控基因表達，在細胞生長、凋亡、炎癥和癌癥等生物學過程中發揮重要作用[18]。由于miRNA較穩定，可在血清、血漿、胸膜液、尿液或腦脊液等多種生物液體中檢測到，因此miRNA可成為理想的診斷性生物標志物。
某些miRNA的表達水平在疾病狀態下和健康狀態下存在差異，這些差異可能會為肺癌的診斷提供新的思路。例如，在肺癌組織中miR-33a-5p和miR-128-3p相對于相鄰正常組織表達下調，這些miRNA的組合顯示出良好的診斷性能[19]。一些miRNA被證明可用于NSCLC亞型的特異性診斷[20]，如miR-205可用于鱗癌的診斷，而miR-375可用于腺癌的診斷。研究[21]表明，外周血中m6A水平在幾種癌癥類型中明顯失調，并具有診斷價值。m6A miRNA標記在肺癌中表現出很高的敏感性（AUC=0.976），可用于肺癌的鑒別。此外，m6A miRNA的診斷性能不受性別、年齡和良性疾病的影響，可成為肺癌診斷的生物標志物。
2.4 免疫組織化學生物標志物
免疫組織化學是臨床中肺癌組織學診斷和分型的主要技術。根據在肺癌診斷中使用免疫組織化學的最佳實踐建議[22]，甲狀腺轉錄因子1（thyroid transcription factor-1，TTF-1）（用于腺癌）和p40（用于鱗癌）被認為是NSCLC分型的最佳標志物，特別是當用8G7G3/1單克隆抗體檢測TTF-1時。對于TTF-1，只有局灶性陽性反應被認為是有效陽性；而對于p40，>50%的腫瘤細胞需表現出陽性。此外，在TTF-1陰性腺癌中，應考慮轉移可能。
3 預測性生物標志物在非小細胞肺癌臨床治療中的應用
NSCLC的組織學類型是化療效果的預測因素。例如，培美曲塞對非鱗癌患者有益，而在培美曲塞和安慰劑組中，鱗癌患者的總生存期（overall survival，OS）相似[23]。因此，非鱗癌是培美曲塞化療的預測因素。除了組織學之外，特定的基因改變也是NSCLC治療的預測性生物標志物。
預測性生物標志物的識別對治療有很大的影響，檢測出已知基因的改變是治療的先決條件。在檢測預測性生物標志物時，需要考慮兩個重要因素：獲得足夠的標本和選擇正確的檢測方法。在本節中，我們將重點關注在靶向治療和免疫治療中最常用的預測性生物標志物。靶向治療的預測性生物標志物見表1；已批準的免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors，ICIs）見表2。
表1
靶向治療的預測性生物標志物
表2
已批準的免疫檢查點抑制劑匯總
3.1 靶向治療
3.1.1 c-ros原癌基因1受體酪氨酸激酶（c-ros oncogene 1 receptor tyrosine kinase，ROS1）
ROS1參與細胞生長和分化，盡管ROS1主要在胚胎發育過程中表達，但在成人肺組織中也有少量表達。在1%～3%的肺腺癌中，可觀察到ROS1基因的重排[24]。這些重排導致ROS1基因的組成性激活，并導致細胞增殖和遷移。ROS1重排在從未吸煙的年輕患者中更為常見，且幾乎只在腺癌中觀察到[25]。目前許多研究和試驗[25-26]正在測試多激酶抑制劑的有效性，如用賽瑞替尼、布加替尼、阿來替尼、卡博替尼或勞拉替尼治療ROS1重排的NSCLC患者。
3.1.2 轉染重排（rearranged during transfection，RET）
RET融合發生于0.7%～2%的NSCLC，在腺癌組織學類型中檢出率更高[27]。RET最常見的融合基因是KIF5B[28]。RET融合基因蛋白的卷曲螺旋結構域促進了RET融合蛋白的二聚化，導致RET激酶的組成性激活和幾種激酶的激活，包括MAPK、PI3K/AKT和JNK[28]。有試驗和病例報告[29-30]顯示，卡博替尼和凡德他尼治療RET重排的NSCLC患者效果顯著。2020年美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批準塞爾帕替尼和普拉斯替尼用于治療伴有RET基因改變的NSCLC。
3.1.3 間充質-上皮轉化因子受體（mesenchymal-epithelial transition tyrosine kinase receptor，MET）
在與配體結合后，MET介導多種信號通路的激活，如PI3K/AKT、STAT3、SRC/FAK和MAPK/ERK[31]。據報道，NSCLC中的MET突變包括擴增、外顯子14跳躍突變和激酶結構域突變[31]。克唑替尼對攜帶MET外顯子14跳躍突變和MET過度表達的NSCLC患者的治療效果顯著[32]。FDA還根據GEOMETRY mono-1試驗[33]結果，批準卡馬替尼治療有MET外顯子14跳躍突變的轉移性NSCLC患者。同時，2021年FDA批準特泊替尼用于治療MET外顯子14發生跳躍突變的轉移性NSCLC。
3.2 免疫治療
程序性死亡配體1（programmed death-ligand 1，PD-L1），也稱為B7-H1，由CD274基因編碼。PD-L1在巨噬細胞、抗原呈遞細胞、B細胞、T淋巴細胞等多種免疫細胞表面組成性表達。PD-L1結合程序性死亡受體1（programmed death-1，PD-1），這種結合會導致免疫系統的抑制，并且對于預防炎癥期間的自身免疫反應很重要。
PD-L1也在許多不同的腫瘤細胞表達，例如肺癌細胞，其表達使它們逃避免疫應答。與健康肺組織相比，NSCLC組織中PD-L1在mRNA和蛋白水平上的表達均較高。目前，FDA批準了4種針對PD-1/PD-L1相互作用的單克隆抗體用于NSCLC患者的治療[34]：納武利尤單抗、帕博利珠單抗、阿替利珠單抗和度伐利尤單抗。然而，PD-L1表達作為預測性生物標志物的有效性值得懷疑。因為已有研究[35]表明，PD-L1低表達（<1%）的患者對抗PD-1/PD-L1治療的反應異常。PD-L1的表達可能隨著時間的推移而改變，且在整個腫瘤組織中不一致。
4 新型預測性生物標志物在非小細胞肺癌臨床治療中的應用
4.1 靶向治療
盡管目前生物標志物顯著改善了NSCLC患者的治療，但仍需要新的預測因子和靶向療法以幫助NSCLC患者取得更好的療效。我們將總結已經在臨床試驗[36-39]中進行測試的靶向治療新型預測性生物標志物，這些標志物在未來可能會發揮重要作用；見表3。
表3
已經在臨床試驗中進行測試的新型預測性生物標志物
4.1.1 Kirsten大鼠肉瘤病毒基因同源物（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS）
KRAS基因編碼RAS蛋白，RAS蛋白是一種GTP酶，對激活Raf/MEK/ERK、PI3K/AKT/mTOR和RalGDS/RalAIB信號通路至關重要[40]。KRAS突變引起KRAS信號的結構性激活，導致細胞增殖。KRAS突變的激活幾乎只存在于腺癌中，且在西方人群中更為常見（在西方人群中約30%，在亞洲人群中約10%）[41]。考慮到KRAS和表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）突變的相互排他性以及RAS蛋白在EGFR信號通路下游中的作用，KRAS狀態可用來判斷NSCLC患者是否可從EGFR抑制劑的治療中獲益。KRAS G12C突變是NSCLC最常見的KRAS突變，目前有臨床試驗正在研究治療KRAS G12C突變的方法。
4.1.2 成纖維細胞生長因子受體1（fibroblast growth factor receptor 1，FGFR1）
FGFR1是一種參與增殖調節的細胞表面酪氨酸激酶，參與細胞分化、遷移等。FGFR1的擴增、突變和重排可導致受體的組成性激活，并促進腫瘤的發展。在9%～20%的鱗癌和15%的肺腺癌中發現FGFR1的擴增，且在有吸煙史的男性患者中更為常見[42]。有研究[43]表明，成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）或FGFR家族的異常表達降低了間質樣NSCLC對EGFR抑制劑的敏感性。多年來，許多非選擇性FGFR抑制劑在NSCLC中被研究[44]，如多韋替尼、樂伐替尼、帕唑帕尼、尼達尼布、普納替尼等。但大多數研究觀察到的抗腫瘤活性有限，藥物毒副作用大。然而，評估FGFR作為預測性生物標志物有效性的研究仍在進行中，新型FGFR抑制劑的列表仍在擴大。
4.2 免疫治療
已經在臨床試驗[45-46]中測試的新型免疫治療預測性生物標志物見表3。
4.2.1 腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor-infiltrating lymphocyte，TIL）
腫瘤微環境相關生物標志物是近年研究的熱點，其中TIL在預測療效方面具有一定潛力。PD-L1表達與NSCLC腫瘤內T細胞浸潤顯著相關[47]。根據PD-L1/TIL狀態，NSCLC腫瘤免疫微環境分為Ⅰ型（PD-L1+，TIL+），Ⅱ型（PD-L1?，TIL?），Ⅲ型（PD-L1+，TIL?）和Ⅳ型（PD-L1?，TIL+）[48-49]。與不同腫瘤免疫微環境類型相關的臨床因素的差異決定了患者是否選擇聯合免疫治療[49]。抗PD-1/PD-L1治療可使Ⅰ型受益。然而，Ⅲ型對抗PD-1/PD-L1單一療法具有耐藥性，聯合輔助治療可將T細胞募集到腫瘤上以對抗這種耐藥性。CD8+細胞在CD3+TILs總體中的比例與抗PD-1/PD-L1治療效果密切相關。研究[50]表明，高CD8+/CD3+比值與無病生存率（disease-free survival，DFS）和OS呈正相關。抗PD-1治療后CD8+T細胞的早期增殖預示著抗PD-1治療的良好臨床反應[50]。
4.2.2 錯配修復功能缺陷（different mismatch repair，dMMR）與微衛星不穩定（microsatellite instability，MSI）
DNA錯配修復系統（mismatch repair，MMR）是細胞進化中高度保守的修復機制，MMR系統通過忽略基因重組和修復已識別的錯配核苷酸，同時避免DNA微衛星的缺失或插入，來維持基因組的完整性和穩定性[51]。dMMR是由遺傳突變或在發生散發性腫瘤的情況下引起的，最常見原因是表觀遺傳改變，如4個關鍵基因MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的甲基化狀態，其作為異二聚體形式的DNA MMR酶具有活性，通常為MLH1/PMS2和MSH2/MSH6[52]。在dMMR狀態下，若1個或多個MMR蛋白功能失調或未表達將導致遺傳超突變性最常出現在微衛星位點，即所謂的MSI[51]。MSI測試面板的標準部位是BAT25、BAT26、D5S346、D2S123和D17S250[51]。MSI在NSCLC中并不常見，有研究[53]報道NSCLC中MSI頻率<1%。
4.2.3 腫瘤突變負荷（tumor mutational burden，TMB）
TMB是指特定基因組區域內體細胞非同義突變的個數，通常用每兆堿基的突變數量（mut/Mb）表示，是一種定量的生物標志物[54]。TMB可作為納武利尤單抗（PD-1靶向抗體）和伊匹單抗（CTLA-4靶向抗體）治療的預測性生物標志物。與接受化療作為一線治療的患者相比，接受納武利尤單抗和伊匹單抗聯合治療的患者具有高TMB（每兆堿基≥10個突變），從而無進展生存期（progression-free survival，PFS）明顯延長[55]。CheckMate-026研究[46]是一項隨機Ⅲ期臨床試驗，目的是比較納武利尤單抗和含鉑兩藥化療作為一線治療方案對PD-L1表達＞5%的初治NSCLC患者的治療效果。在CheckMate-026研究中TMB高的患者PFS延長（中位PFS為9.7個月 vs. 5.8個月），且有更高的客觀反應率（46.8% vs. 28.3%）。此外，TMB和PD-L1的表達被證明是獨立生物標志物。
5 預后性生物標志物在非小細胞肺癌臨床治療中的應用
5.1 預后性生物標志物
預后性生物標志物可表明患者臨床結局（通常用OS、PFS或DFS表示）的可能性[11]。識別肺癌患者的預后性標志物很重要，因為它可識別可能受益于不同類型治療的患者亞群。尋找預后性標志物最可靠的方法是大型研究或安慰劑對照試驗，因為隊列中的患者特征更加明確和統一。此外，為了擴大患者隊列和增加統計數量，還可通過對試驗或研究進行Meta分析，使用經濟有效的方法來尋找潛在的預后性生物標志物。
5.2 新型預后性生物標志物
我們總結了已有文獻報道的新型預后性生物標志物；見表4。雖然這些新型預后性生物標志物仍存在爭議，但隨著驗證性研究數量的增加，我們相信它們可顯示出良好的潛力。
表4
新型預后性生物標志物
5.2.1 血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）
VEGF影響微血管通透性，刺激內皮細胞的生長，并在新血管的形成中起重要作用[56]。VEGF過表達與腫瘤復發和轉移有關，在肺癌等多種癌癥中都很常見。有研究[57]報道，VEGF過表達提示肺癌的預后不良。
5.2.2 乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）
LDH被廣泛認為是許多晚期實體瘤（包括NSCLC在內）的預后標志物[58]。作為全身炎癥和腫瘤負荷的標志物，LDH可通過增加乳酸的產生來調節腫瘤微環境并促進免疫抑制。對于NSCLC，LDH和其他炎癥標志物已被納入預后模型，以對接受化療和ICIs治療的患者進行風險分層[59]。Mezquita等[59]報道，在接受ICIs治療但未接受化療的患者中，預處理LDH升高與更差的預后相關。
5.2.3 TP53
TP53基因編碼腫瘤抑制蛋白p53，在細胞周期調節、衰老、自噬、凋亡和DNA修復中發揮重要作用。p53突變導致p53腫瘤抑制功能的喪失，導致細胞過度增殖和促進癌癥的發展。在NSCLC中，鱗癌的p53突變比腺癌更為常見（分別為77%和47%）[60]。此外，有研究[60]報道，與TP53WT相比，在NSCLC中p53突變情況與較低的生存率和對癌癥治療的耐藥性增加有關。
5.2.4 肺表面活性物質蛋白A1（pulmonary surfactant-associated protein-A1，SFTPA1）
SFTPA1是C型凝集素亞家族的成員，在維持肺組織內環境穩定和先天性免疫反應中起著關鍵作用[61]。SFTPA1破壞可導致多種急性或慢性肺部疾病，包括肺癌。Yuan等[61]的研究通過癌癥基因組圖譜對肺腺癌樣本的生存進行分析發現，SFTPA1的高表達與良好的預后相關，可作為預測肺腺癌患者對免疫治療反應的生物標志物。
5.2.5 循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）
ctDNA測序可應用于分子殘留病灶（molecular residual disease，MRD）檢測，可輔助識別術后復發高風險患者。四川大學華西醫院劉倫旭教授團隊的LUNGCA-1試驗[62]是大規模多中心前瞻性肺癌預后分子標志物的研究，揭示了圍術期ctDNA能有效預測NSCLC患者術后復發，可作為NSCLC患者術后早期檢測MRD的可靠指標。研究發現術后1個月內ctDNA-MRD陽性患者的復發率80.8%（21/26），顯著高于陰性患者16.2%（49/303）（P<0.001），術后ctDNA-MRD狀態是術后患者復發的預測指標［HR=11.1，95%CI（6.5，19.0），P<0.001］。
5.2.6 轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）
TGF-β屬于細胞因子家族，參與細胞增殖、分化和細胞外基質的產生[63]。有研究[64]報道TGF-β1蛋白高表達提示預后不良。這些發現需要進一步的研究來證實。
5.2.7 腱蛋白樣蛋白1（Chordin-like 1，CHRDL1）
CHRDL1是一種屬于Chordin家族的分泌蛋白，其功能與Chordin類似，主要是作為骨形態發生蛋白的特異性抑制劑。Deng等[65]通過癌癥基因組圖譜的數據證明了CHRDL1和肺腺癌之間的關系。研究發現CHRDL1的表達可很好地將肺腺癌組織與正常樣本區分開來，低CHRDL1與較差的臨床病理特征相關。此外，生存曲線也顯示，低CHRDL1與較低的總體生存率顯著相關（HR=0.60，P<0.001）。
5.2.8 Ki-67
由于Ki-67在整個細胞周期中都在分裂活躍的細胞中表達，且在M期達到表達高峰，因此Ki-67是很好的預后生物標志物[66]。Ki-67的高表達與包括NSCLC在內的多種癌癥的不良預后相關。此外，有學者[67]認為Ki-67與腫瘤組織的病理分級、臨床分期、淋巴結轉移、腫瘤大小有關。
6 總結與展望
肺癌的治療效果取決于患者的特征、腫瘤的組織學類型、經評估的生物標志物以及病理科醫生和臨床醫生之間良好且有效的溝通。目前，診斷性生物標志物在臨床常規中已經很好地建立起來。在過去10年中，利用預測性生物標志物治療NSCLC的研究也取得了重大進展，且有大量的研究正在識別新型預測性生物標志物。結合這些新試驗的發現，我們預估在不久的將來，預測性生物標志物的數量及其相關的治療選擇將會增加。然而，這些生物標志物的發展將如何影響常規臨床實踐仍有待觀察。我們期望生物標志物在未來可更好地應用于臨床，以幫助NSCLC患者取得更好的療效。
利益沖突：無。
作者貢獻：洪子強負責論文設計，開展研究，數據處理與分析，論文撰寫與修改；金大成負責論文審核和修改；白向豆負責實施研究；崔白強負責數據整理與分析；茍云久負責論文設計。
