非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是最常見的癌癥類型之一，也是導致癌癥死亡的重要原因。雖然近年來免疫治療的應用極大改善了NSCLC的預后，但NSCLC的治療依然存在巨大挑戰。免疫微環境在NSCLC發展、浸潤和轉移過程中發揮重要作用，二者可相互作用、相互影響，形成惡性循環。單細胞轉錄組測序可以對單個細胞進行高分辨率分析，在揭示免疫微環境中的細胞類型、細胞演變軌跡、細胞分化的分子機制以及細胞間相互調節中有重要價值。通過單細胞轉錄組測序有望發現更多有潛力的免疫治療方法。本文綜述了單細胞轉錄組測序在NSCLC免疫微環境中的重要研究及最新成果，旨在探討應用單細胞轉錄組測序分析NSCLC免疫微環境的重要意義。
引用本文： 楊文文, 何立, 張敏, 孫碩, 王峰, 馬敏杰, 韓彪. 單細胞轉錄組測序技術在非小細胞肺癌免疫微環境分析中應用的研究進展. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2024, 31(3): 467-472. doi: 10.7507/1007-4848.202206064 復制
版權信息： ?四川大學華西醫院華西期刊社《中國胸心血管外科臨床雜志》版權所有，未經授權不得轉載、改編
根據2020年的數據[1]，肺癌是世界上第二常見的癌癥，同時也是癌癥死亡的最重要原因。與小細胞肺癌相比，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）更為常見[2]。NSCLC與腫瘤免疫微環境（tumor immune microenvironment，TIME）有著極其復雜的關系，正常情況下微環境內的免疫細胞發揮抗腫瘤免疫的作用；在某些因素的作用下微環境內的免疫細胞組成及功能會發生變化，形成腫瘤細胞改變TIME、TIME促進腫瘤進展的惡性循環。單細胞轉錄組測序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）在NSCLC的TIME中有巨大的應用潛力，可用于評價不同階段TIME變化、分析TIME基因組特征、評價免疫治療效果和耐藥性及其可能的機制。總之，scRNA-seq技術有望揭開NSCLC與TIME的復雜關系。
1 非小細胞肺癌與腫瘤免疫微環境
1.1 TIME
TIME是指腫瘤組織內的腫瘤細胞及各種免疫成分，主要包括腫瘤細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞、單核巨噬細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞及其分泌的各種因子。TIME可分為富含免疫細胞但腫瘤中心缺乏細胞毒性淋巴細胞的浸潤-排除型TIME、特異淋巴細胞高度浸潤的浸潤-發炎型TIME和包含大量多樣性淋巴細胞的三級淋巴結構型TIME[3]。
1.2 NSCLC促進TIME形成
首先，NSCLC可通過分泌各種細胞因子和趨化因子或者影響免疫細胞的表達及其分布來巧妙地控制其周圍環境。NSCLC發展過程中會使腫瘤細胞產生大量的抗原，這些抗原會激活體內的免疫系統進而殺死癌細胞并釋放更多新的抗原，如此循環往復，不斷改變TIME的構成[4]。其次，NSCLC可影響TIME內免疫細胞數量和活性。Kargl等[5]發現NSCLC組織內的免疫細胞數量是非相鄰肺組織的3倍；Kim等[6]發現NSCLC細胞分泌的外泌體可抑制T細胞活性；Oh等[7]發現NSCLC內雌激素和孕激素受體基因的高表達可使T細胞浸潤減少。NSCLC細胞分泌免疫抑制因子抑制細胞毒性T淋巴細胞的細胞因子分泌，并作用于調節性T淋巴細胞，間接抑制細胞毒性T淋巴細胞的增殖和分化[8]。此外，Chen等[9]也發現NSCLC細胞膜上的鈣網蛋白可促進肺癌組織中的樹突狀細胞浸潤來抑制肺癌進展。總之，NSCLC可以通過各種機制改變TIME的構成，影響TIME的功能。
1.3 TIME促進NSCLC進展
不僅NSCLC促進TIME形成，TIME也會促進NSCLC的生長、侵襲和轉移。多項研究[10-12]均發現腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophages，TAM）同時具有促腫瘤和抑制腫瘤的雙重作用。除TAM外，Casanova-Acebes等[13]發現組織駐留巨噬細胞可促進腫瘤細胞的上皮-間質轉化，使腫瘤細胞獲得較強侵襲性。Aloe等[14]發現中性粒細胞分泌的中性粒細胞彈性蛋白酶可通過調節基質金屬蛋白酶-9的活性影響腫瘤的侵襲性。Najafi等[15]也發現Th17細胞會導致抗腫瘤免疫的消散，促進腫瘤進展。綜上所述，NSCLC可促進TIME形成，同時TIME促進NSCLC的進展，不斷將NSCLC推向晚期。這些發現成為開發免疫治療的基礎，而scRNA-seq技術的應用有望發現更多免疫治療方法。
2 單細胞轉錄組測序
scRNA-seq技術是指通過對單個細胞轉錄測序分析，識別生物體內各種細胞的轉錄特征，了解各個細胞的表達基因及代謝產物，并進行數據分析，scRNA-seq能夠高分辨率分析腫瘤浸潤細胞的分子特征。
2.1 單細胞捕獲
對分離和捕獲的目標細胞進行單細胞捕獲是scRNA-seq技術的第一步，分離單個細胞的常用方法包括將細胞液進行倍比稀釋的有限稀釋技術、用顯微操作器在顯微鏡下進行細胞操作的顯微操作技術、使用特定表面標記的熒光單克隆抗體標記細胞的熒光激活細胞分選技術、在計算機幫助下使用激光系統分離細胞的激光捕獲顯微切割技術以及操作極少量流體分離細胞的微流體技術，此外CellSearch專門開發了一項獲取循環腫瘤細胞的技術[16]。
2.2 基因組RNA的捕獲與擴增
細胞裂解是scRNA-seq的一種重要方法，大多數細胞裂解技術通過化學或物理方法破壞細胞。細胞裂解之后需首先捕獲mRNA，對捕獲的mRNA進行逆轉錄合成雙鏈cDNA。單個細胞的DNA含量一般達不到基因測序的需要，因此需要對基因組進行擴增。目前常見的DNA擴增方法包括基于PCR的DNA片段擴增、基于位點置換擴增的DNA片段擴展以及基于多重退火環狀循環擴增的DNA片段擴展[17]。
2.3 文庫建立與測序
文庫建立：（1）用mRNA制備cDNA；（2）使用各種酶促使cDNA片段化；（3）修復這些DNA片段的末端并添加A核苷酸；（4）使用接頭特異性引物擴增和純化樣品用于測序[18]。將單個細胞來源的、經過擴增的cDNA匯集并通過高通量下一代測序技術（next-generation sequencing，NGS）進行測序。NGS區別于第一代Sanger測序技術的特點是，在執行大規模并行測序的同時執行大量的、單獨的測序，目前常用的第二代測序技術較為成熟，包括通過合成進行短讀測序、離子半導體測序和納米球測序[19]。
2.4 數據分析
一般來說，基因組測序所得原始數據以FASTQ文件格式保存，其后將所得數據與參考基因組進行對比[20]，找出其中的基因變異，并獲得一個序列比對圖文件及其二進制格式BAM文件。綜合基因組學查看器可對BAM文件進行可視化訪問和處理[21]，同時其也非常適合NGS數據集的全基因組探索[22]。通過檢測可識別插入缺失、單核苷酸和拷貝數變異等變異。之后必須對VCF文件中記錄的變異進行注釋以確定其生物學意義[23]。
3 單細胞轉錄組測序在非小細胞肺癌腫瘤免疫微環境中的應用潛力
scRNA-seq可分析TIME中各種細胞成分及其與正常微環境內單個細胞在基因層面的區別，被廣泛應用于研究腫瘤細胞和各種免疫細胞的基因表達，有助于了解TIME在NSCLC進展過程中的重要作用。
3.1 不同階段NSCLC的TIME評價
隨著NSCLC細胞的增殖，TIME也會動態改變，這將更有利于腫瘤的發展、浸潤和轉移。scRNA-seq技術能夠分析不同階段NSCLC的TIME組成和功能變化。
3.1.1 早期肺癌的異質性
采用scRNA-seq技術可以發現早期肺癌組織中免疫細胞數量發生明顯變化。Lavin等[24]發現，早期肺腺癌組織富含PD-L1hiCD64hiCD14hiPPARγhiIL-6hi巨噬細胞、CD1c+DC、Treg和耗盡的T細胞，而缺乏CD141+DC、CD16+單核細胞、自然殺傷細胞和顆粒酶B+效應細胞。Kim等[25]發現，正常肺組織和早期肺腺癌組織分別富含促炎和抗炎巨噬細胞。Song等[26]通過軌跡分析發現，早期NSCLC普遍存在單核細胞向M2巨噬細胞分化。Lavin等[24]發現，早期肺腺癌的TAM表達更高水平的免疫調節轉錄因子PPARγ。此前的研究[27]表明，PPARγ可促進腫瘤的發展。
3.1.2 不同分期肺癌特征
不同時期的肺癌組織內免疫細胞在數量、功能上存在明顯異質性，采用scRNA-seq技術可以分析不同分期肺癌特征。Wu等[28]發現晚期肺鱗狀細胞癌（鱗癌）內富含中性粒細胞，而晚期肺腺癌的中性粒細胞顯著耗竭。肺腺癌是從非典型腺瘤樣增生到原位腺癌、微浸潤性腺癌，再到浸潤性腺癌不斷發展的[29]，而scRNA-seq技術可以對這一過程進行連續分析。Wang等[30]發現從正常肺組織到浸潤性腺癌的進展過程中出現了T和B淋巴細胞的富集，自然殺傷細胞和粒細胞的減少，肺泡2型細胞標志物SFTPC的差異表達（在正常和早期腫瘤組織中高表達，在浸潤期組織中表達明顯減少），肺泡2型細胞在整個癌癥進展過程中顯示出逐漸增加的染色體獲得/丟失事件，程序性細胞死亡受體-1的差異性表達（在非典型腺瘤樣增生和原位腺癌階段的pan-CK?細胞中高表達，在微浸潤性腺癌和浸潤性腺癌階段的pan-CK+細胞中高表達）的特征。此外，對肺癌轉移區域進行scRNA-seq分析也發現了不同的特征。Kim等[25]發現，肺腺癌轉移性淋巴結中含有大量骨髓細胞，隨著肺腺癌的發展，單核細胞衍生的巨噬細胞的比例明顯增加，CD8+T細胞逐漸耗盡。Huang等[31]發現，晚期NSCLC患者的惡性胸腔積液中，細胞毒性T細胞消耗、Treg細胞出現、調節性B細胞顯著富集，T濾泡輔助細胞和巨噬細胞中代謝相關基因的表達明顯增加。總之，scRNA-seq可以用于研究不同階段免疫細胞的異質性，通過比較彼此之間的差異揭示更多NSCLC中TIME的特征。
3.2 NSCLC基因組與預后
3.2.1 NSCLC內基因突變
基因突變是腫瘤發生的基礎，導致細胞失控地生長分化，通過改變為蛋白合成編碼的基因活性而誘發癌癥。通過scRNA-seq可發現NSCLC內基因突變。Kim等[32]在肺腺癌患者的異種移植物腫瘤細胞中發現包括Kras-G12D在內的單核苷酸突變；Xiong等[33]在小鼠肺鱗癌細胞中發現癌癥基因反復發生突變。
3.2.2 NSCLC內基因特異性表達
在腫瘤發展過程中，基因差異化表達發揮至關重要的作用。使用scRNA-seq可以對單個細胞的表達進行高分辨率分析。Min等[34]在肺腺癌中發現G64基因過表達；Suber等[35]在NSCLC中發現了FBXO17過表達；Ma等[36]在肺腺癌中發現抗原呈遞途徑和IFN-γ信號通路等基因異質表達。此外，Kim等[25]發現從晚期活檢或淋巴及腦轉移灶中分離出的腫瘤細胞的特異性基因表達也增加。Wu等[28]發現與肺腺癌相比，肺鱗癌具有更高的瘤間和瘤內異質性。以上研究充分說明了不同階段、不同類型的NSCLC表現出不同的基因表達特征，而這些表達特征又與腫瘤的發展、侵襲和預后息息相關。
3.2.3 NSCLC患者的預后
了解疾病的預后有助于指導臨床決策，使用scRNA-seq可發現有潛力的預后標志物。相關研究表明，ADAM12（P=0.014）[37]、IL1R2（P=0.000 5）[38]的表達預示了NSCLC的不良預后。scRNA-seq同樣有構建多種基于各種基因和蛋白的預后模型及預后標志物的潛力[39]。此外，肺癌細胞生長極為活躍，侵襲性強，易致局部擴散和血道轉移而影響預后，scRNA-seq可發現有潛力的轉移標志物。Ruan等[40]發現，肺腺癌軟腦膜轉移患者的腦脊液內腫瘤細胞中CEACAM6（P<0.001）、SCGB3A2（P<0.001）和C3（P<0.001）表達明顯上升，說明以上3種分子具有作為腫瘤轉移標志物的潛力。綜上所述，scRNA-seq具有發現基因突變、基因差異性表達和預后轉移標志物的巨大潛力。
3.3 NSCLC免疫治療療效評價
免疫檢查點抑制劑通過阻斷免疫檢查點來誘導抗腫瘤免疫反應，代表了過去10年腫瘤學藥物開發的重大突破。使用scRNA-seq可評價TIME對免疫檢查點的影響。Van Damme等[41]發現，CCR8+ Treg細胞的特異性消耗可減緩腫瘤進展并增強免疫檢查點阻斷治療的效能。除了免疫檢查點，scRNA-seq還可以評估其他免疫治療效果。Maroni等[42]檢測NSCLC細胞在第二代BMI-1抑制劑PTC596治療前后的數量變化（腫瘤細胞TEC-C8和TEC-C13分別減少為原來的18.0%和37.1%，并且腫瘤縮小了16.3%），發現PTC596可以作用于KRAS突變肺腺癌。Pan等[43]發現一種名為CA170的VISTA拮抗劑的抗腫瘤作用（與對照組相比，CA170治療使腫瘤負荷降低了63%）。Leader等[44]發現一個由多種免疫細胞組成的肺癌激活模塊（lung cancer activation module，LCAM），并且高LCAM評分的NSCLC患者對免疫治療更敏感。scRNA-seq的應用有望發現并不斷改進免疫治療方法，提高NSCLC患者的生存狀態和預后。
3.4 NSCLC免疫治療耐藥
各種免疫治療的應用極大改善了NSCLC的臨床治療結果，但耐藥性也在大量患者中發現。免疫治療的耐藥機制主要包括內源性和外源性兩大類，前者包括缺乏抗原蛋白和抗原呈遞、T細胞排斥和對T細胞低敏感，后者包括缺乏T細胞、抑制性免疫檢查點和抑制性免疫細胞[45]。使用scRNA-seq可以發現NSCLC免疫治療耐藥。Kim等[32]在肺腺癌異種移植物腫瘤細胞中發現了具有耐藥特征的腫瘤細胞亞群；Suzuki等[46]也確定了一個對凡德他尼耐藥的亞群，并發現產生耐藥的亞群細胞核糖體基因和管家基因的相對表達降低，而直接靶向的表皮生長因子受體和RET基因保持不變。除了發現耐藥性，scRNA-seq還可以發現潛在的耐藥機制。此前的研究[47]已經證明葡萄糖轉運蛋白（glucose transporters，GLUT）抑制劑可作為新型選擇性抗癌藥物。在此基礎上Na等[48]聯合包括scRNA-seq在內的多種方法分析肺鱗癌細胞，發現免疫不良的肺鱗癌細胞中氟代脫氧葡萄糖攝取與GLUT1正相關（r=0.27，P=0.04），并且抗程序性死亡受體-1應答者的GLUT比率顯著高于無應答者（P=0.002），這提示GLUT比率可能與耐藥性相關。總之，應用scRNA-seq技術不僅可以發現耐藥性，同時也可以揭示其背后的機制。
4 總結與展望
近年來scRNA-seq技術已成為剖析NSCLC中細胞異質性的重要工具。使用這一工具可以提高我們對NSCLC的TIME中細胞類型、細胞演變軌跡、細胞分化的分子機制及細胞之間調節作用的認識。目前，scRNA-seq多對mRNA進行分析，對包括microRNA等的非mRNA的分析在未來可能會揭示更多NSCLC的異質性。將scRNA-seq與其他分析方法結合，整合來自同一細胞的不同分子和細胞信號將能夠克服scRNA-seq技術本身的不足。許多研究報告了scRNA-seq在肺癌研究中的應用，但仍有一些挑戰需要克服。從不同肺組織中分離足夠數量的細胞需要進行機械或化學操作，該過程可能很難得到功能完好無損且無菌的單個細胞進行scRNA-seq分析，這極大影響了scRNA-seq分析的精準度。高昂的成本以及復雜的步驟也限制了scRNA-seq的廣泛應用。對海量scRNA-seq數據進行生物信息學分析也是一項巨大的挑戰。雖然scRNA-seq技術有其不足之處，但不可否認的是，scRNA-seq技術依然將是未來NSCLC研究的熱點。同時也期待在細胞分離技術、scRNA-seq技術以及生物信息分析技術等方面有更多的進展和突破，使scRNA-seq技術在NSCLC的研究中得到更普遍的應用。
綜上所述，單細胞基因組學對于繪制腫瘤生態系統至關重要。近年來scRNA-seq技術的迅速發展使得我們對NSCLC的TIME產生了更加深刻的認識，在大多數研究中scRNA-seq技術展現出優秀的應用前景。總之，scRNA-seq是NSCLC的TIME研究中的強大工具，有助于了解不同階段NSCLC中TIME的細胞和分子機制。scRNA-seq還可用于分析NSCLC基因組特征及預后。此外在分析免疫治療及其耐藥性方面，scRNA-seq也有著其獨特優勢。盡管技術和生物信息學方面的挑戰可能會限制scRNA-seq在NSCLC TIME研究中的應用，相信隨著技術的進步和成熟，更多scRNA-seq的研究將進一步揭開NSCLC中TIME的奧秘。
利益沖突：無。
作者貢獻：楊文文、何立、張敏、孫碩、王峰、馬敏杰進行數據整理與分析，論文初稿撰寫與修改；韓彪負責文章的整體構思；楊文文負責修改后審校。
根據2020年的數據[1]，肺癌是世界上第二常見的癌癥，同時也是癌癥死亡的最重要原因。與小細胞肺癌相比，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）更為常見[2]。NSCLC與腫瘤免疫微環境（tumor immune microenvironment，TIME）有著極其復雜的關系，正常情況下微環境內的免疫細胞發揮抗腫瘤免疫的作用；在某些因素的作用下微環境內的免疫細胞組成及功能會發生變化，形成腫瘤細胞改變TIME、TIME促進腫瘤進展的惡性循環。單細胞轉錄組測序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）在NSCLC的TIME中有巨大的應用潛力，可用于評價不同階段TIME變化、分析TIME基因組特征、評價免疫治療效果和耐藥性及其可能的機制。總之，scRNA-seq技術有望揭開NSCLC與TIME的復雜關系。
1 非小細胞肺癌與腫瘤免疫微環境
1.1 TIME
TIME是指腫瘤組織內的腫瘤細胞及各種免疫成分，主要包括腫瘤細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞、單核巨噬細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞及其分泌的各種因子。TIME可分為富含免疫細胞但腫瘤中心缺乏細胞毒性淋巴細胞的浸潤-排除型TIME、特異淋巴細胞高度浸潤的浸潤-發炎型TIME和包含大量多樣性淋巴細胞的三級淋巴結構型TIME[3]。
1.2 NSCLC促進TIME形成
首先，NSCLC可通過分泌各種細胞因子和趨化因子或者影響免疫細胞的表達及其分布來巧妙地控制其周圍環境。NSCLC發展過程中會使腫瘤細胞產生大量的抗原，這些抗原會激活體內的免疫系統進而殺死癌細胞并釋放更多新的抗原，如此循環往復，不斷改變TIME的構成[4]。其次，NSCLC可影響TIME內免疫細胞數量和活性。Kargl等[5]發現NSCLC組織內的免疫細胞數量是非相鄰肺組織的3倍；Kim等[6]發現NSCLC細胞分泌的外泌體可抑制T細胞活性；Oh等[7]發現NSCLC內雌激素和孕激素受體基因的高表達可使T細胞浸潤減少。NSCLC細胞分泌免疫抑制因子抑制細胞毒性T淋巴細胞的細胞因子分泌，并作用于調節性T淋巴細胞，間接抑制細胞毒性T淋巴細胞的增殖和分化[8]。此外，Chen等[9]也發現NSCLC細胞膜上的鈣網蛋白可促進肺癌組織中的樹突狀細胞浸潤來抑制肺癌進展。總之，NSCLC可以通過各種機制改變TIME的構成，影響TIME的功能。
1.3 TIME促進NSCLC進展
不僅NSCLC促進TIME形成，TIME也會促進NSCLC的生長、侵襲和轉移。多項研究[10-12]均發現腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophages，TAM）同時具有促腫瘤和抑制腫瘤的雙重作用。除TAM外，Casanova-Acebes等[13]發現組織駐留巨噬細胞可促進腫瘤細胞的上皮-間質轉化，使腫瘤細胞獲得較強侵襲性。Aloe等[14]發現中性粒細胞分泌的中性粒細胞彈性蛋白酶可通過調節基質金屬蛋白酶-9的活性影響腫瘤的侵襲性。Najafi等[15]也發現Th17細胞會導致抗腫瘤免疫的消散，促進腫瘤進展。綜上所述，NSCLC可促進TIME形成，同時TIME促進NSCLC的進展，不斷將NSCLC推向晚期。這些發現成為開發免疫治療的基礎，而scRNA-seq技術的應用有望發現更多免疫治療方法。
2 單細胞轉錄組測序
scRNA-seq技術是指通過對單個細胞轉錄測序分析，識別生物體內各種細胞的轉錄特征，了解各個細胞的表達基因及代謝產物，并進行數據分析，scRNA-seq能夠高分辨率分析腫瘤浸潤細胞的分子特征。
2.1 單細胞捕獲
對分離和捕獲的目標細胞進行單細胞捕獲是scRNA-seq技術的第一步，分離單個細胞的常用方法包括將細胞液進行倍比稀釋的有限稀釋技術、用顯微操作器在顯微鏡下進行細胞操作的顯微操作技術、使用特定表面標記的熒光單克隆抗體標記細胞的熒光激活細胞分選技術、在計算機幫助下使用激光系統分離細胞的激光捕獲顯微切割技術以及操作極少量流體分離細胞的微流體技術，此外CellSearch專門開發了一項獲取循環腫瘤細胞的技術[16]。
2.2 基因組RNA的捕獲與擴增
細胞裂解是scRNA-seq的一種重要方法，大多數細胞裂解技術通過化學或物理方法破壞細胞。細胞裂解之后需首先捕獲mRNA，對捕獲的mRNA進行逆轉錄合成雙鏈cDNA。單個細胞的DNA含量一般達不到基因測序的需要，因此需要對基因組進行擴增。目前常見的DNA擴增方法包括基于PCR的DNA片段擴增、基于位點置換擴增的DNA片段擴展以及基于多重退火環狀循環擴增的DNA片段擴展[17]。
2.3 文庫建立與測序
文庫建立：（1）用mRNA制備cDNA；（2）使用各種酶促使cDNA片段化；（3）修復這些DNA片段的末端并添加A核苷酸；（4）使用接頭特異性引物擴增和純化樣品用于測序[18]。將單個細胞來源的、經過擴增的cDNA匯集并通過高通量下一代測序技術（next-generation sequencing，NGS）進行測序。NGS區別于第一代Sanger測序技術的特點是，在執行大規模并行測序的同時執行大量的、單獨的測序，目前常用的第二代測序技術較為成熟，包括通過合成進行短讀測序、離子半導體測序和納米球測序[19]。
2.4 數據分析
一般來說，基因組測序所得原始數據以FASTQ文件格式保存，其后將所得數據與參考基因組進行對比[20]，找出其中的基因變異，并獲得一個序列比對圖文件及其二進制格式BAM文件。綜合基因組學查看器可對BAM文件進行可視化訪問和處理[21]，同時其也非常適合NGS數據集的全基因組探索[22]。通過檢測可識別插入缺失、單核苷酸和拷貝數變異等變異。之后必須對VCF文件中記錄的變異進行注釋以確定其生物學意義[23]。
3 單細胞轉錄組測序在非小細胞肺癌腫瘤免疫微環境中的應用潛力
scRNA-seq可分析TIME中各種細胞成分及其與正常微環境內單個細胞在基因層面的區別，被廣泛應用于研究腫瘤細胞和各種免疫細胞的基因表達，有助于了解TIME在NSCLC進展過程中的重要作用。
3.1 不同階段NSCLC的TIME評價
隨著NSCLC細胞的增殖，TIME也會動態改變，這將更有利于腫瘤的發展、浸潤和轉移。scRNA-seq技術能夠分析不同階段NSCLC的TIME組成和功能變化。
3.1.1 早期肺癌的異質性
采用scRNA-seq技術可以發現早期肺癌組織中免疫細胞數量發生明顯變化。Lavin等[24]發現，早期肺腺癌組織富含PD-L1hiCD64hiCD14hiPPARγhiIL-6hi巨噬細胞、CD1c+DC、Treg和耗盡的T細胞，而缺乏CD141+DC、CD16+單核細胞、自然殺傷細胞和顆粒酶B+效應細胞。Kim等[25]發現，正常肺組織和早期肺腺癌組織分別富含促炎和抗炎巨噬細胞。Song等[26]通過軌跡分析發現，早期NSCLC普遍存在單核細胞向M2巨噬細胞分化。Lavin等[24]發現，早期肺腺癌的TAM表達更高水平的免疫調節轉錄因子PPARγ。此前的研究[27]表明，PPARγ可促進腫瘤的發展。
3.1.2 不同分期肺癌特征
不同時期的肺癌組織內免疫細胞在數量、功能上存在明顯異質性，采用scRNA-seq技術可以分析不同分期肺癌特征。Wu等[28]發現晚期肺鱗狀細胞癌（鱗癌）內富含中性粒細胞，而晚期肺腺癌的中性粒細胞顯著耗竭。肺腺癌是從非典型腺瘤樣增生到原位腺癌、微浸潤性腺癌，再到浸潤性腺癌不斷發展的[29]，而scRNA-seq技術可以對這一過程進行連續分析。Wang等[30]發現從正常肺組織到浸潤性腺癌的進展過程中出現了T和B淋巴細胞的富集，自然殺傷細胞和粒細胞的減少，肺泡2型細胞標志物SFTPC的差異表達（在正常和早期腫瘤組織中高表達，在浸潤期組織中表達明顯減少），肺泡2型細胞在整個癌癥進展過程中顯示出逐漸增加的染色體獲得/丟失事件，程序性細胞死亡受體-1的差異性表達（在非典型腺瘤樣增生和原位腺癌階段的pan-CK?細胞中高表達，在微浸潤性腺癌和浸潤性腺癌階段的pan-CK+細胞中高表達）的特征。此外，對肺癌轉移區域進行scRNA-seq分析也發現了不同的特征。Kim等[25]發現，肺腺癌轉移性淋巴結中含有大量骨髓細胞，隨著肺腺癌的發展，單核細胞衍生的巨噬細胞的比例明顯增加，CD8+T細胞逐漸耗盡。Huang等[31]發現，晚期NSCLC患者的惡性胸腔積液中，細胞毒性T細胞消耗、Treg細胞出現、調節性B細胞顯著富集，T濾泡輔助細胞和巨噬細胞中代謝相關基因的表達明顯增加。總之，scRNA-seq可以用于研究不同階段免疫細胞的異質性，通過比較彼此之間的差異揭示更多NSCLC中TIME的特征。
3.2 NSCLC基因組與預后
3.2.1 NSCLC內基因突變
基因突變是腫瘤發生的基礎，導致細胞失控地生長分化，通過改變為蛋白合成編碼的基因活性而誘發癌癥。通過scRNA-seq可發現NSCLC內基因突變。Kim等[32]在肺腺癌患者的異種移植物腫瘤細胞中發現包括Kras-G12D在內的單核苷酸突變；Xiong等[33]在小鼠肺鱗癌細胞中發現癌癥基因反復發生突變。
3.2.2 NSCLC內基因特異性表達
在腫瘤發展過程中，基因差異化表達發揮至關重要的作用。使用scRNA-seq可以對單個細胞的表達進行高分辨率分析。Min等[34]在肺腺癌中發現G64基因過表達；Suber等[35]在NSCLC中發現了FBXO17過表達；Ma等[36]在肺腺癌中發現抗原呈遞途徑和IFN-γ信號通路等基因異質表達。此外，Kim等[25]發現從晚期活檢或淋巴及腦轉移灶中分離出的腫瘤細胞的特異性基因表達也增加。Wu等[28]發現與肺腺癌相比，肺鱗癌具有更高的瘤間和瘤內異質性。以上研究充分說明了不同階段、不同類型的NSCLC表現出不同的基因表達特征，而這些表達特征又與腫瘤的發展、侵襲和預后息息相關。
3.2.3 NSCLC患者的預后
了解疾病的預后有助于指導臨床決策，使用scRNA-seq可發現有潛力的預后標志物。相關研究表明，ADAM12（P=0.014）[37]、IL1R2（P=0.000 5）[38]的表達預示了NSCLC的不良預后。scRNA-seq同樣有構建多種基于各種基因和蛋白的預后模型及預后標志物的潛力[39]。此外，肺癌細胞生長極為活躍，侵襲性強，易致局部擴散和血道轉移而影響預后，scRNA-seq可發現有潛力的轉移標志物。Ruan等[40]發現，肺腺癌軟腦膜轉移患者的腦脊液內腫瘤細胞中CEACAM6（P<0.001）、SCGB3A2（P<0.001）和C3（P<0.001）表達明顯上升，說明以上3種分子具有作為腫瘤轉移標志物的潛力。綜上所述，scRNA-seq具有發現基因突變、基因差異性表達和預后轉移標志物的巨大潛力。
3.3 NSCLC免疫治療療效評價
免疫檢查點抑制劑通過阻斷免疫檢查點來誘導抗腫瘤免疫反應，代表了過去10年腫瘤學藥物開發的重大突破。使用scRNA-seq可評價TIME對免疫檢查點的影響。Van Damme等[41]發現，CCR8+ Treg細胞的特異性消耗可減緩腫瘤進展并增強免疫檢查點阻斷治療的效能。除了免疫檢查點，scRNA-seq還可以評估其他免疫治療效果。Maroni等[42]檢測NSCLC細胞在第二代BMI-1抑制劑PTC596治療前后的數量變化（腫瘤細胞TEC-C8和TEC-C13分別減少為原來的18.0%和37.1%，并且腫瘤縮小了16.3%），發現PTC596可以作用于KRAS突變肺腺癌。Pan等[43]發現一種名為CA170的VISTA拮抗劑的抗腫瘤作用（與對照組相比，CA170治療使腫瘤負荷降低了63%）。Leader等[44]發現一個由多種免疫細胞組成的肺癌激活模塊（lung cancer activation module，LCAM），并且高LCAM評分的NSCLC患者對免疫治療更敏感。scRNA-seq的應用有望發現并不斷改進免疫治療方法，提高NSCLC患者的生存狀態和預后。
3.4 NSCLC免疫治療耐藥
各種免疫治療的應用極大改善了NSCLC的臨床治療結果，但耐藥性也在大量患者中發現。免疫治療的耐藥機制主要包括內源性和外源性兩大類，前者包括缺乏抗原蛋白和抗原呈遞、T細胞排斥和對T細胞低敏感，后者包括缺乏T細胞、抑制性免疫檢查點和抑制性免疫細胞[45]。使用scRNA-seq可以發現NSCLC免疫治療耐藥。Kim等[32]在肺腺癌異種移植物腫瘤細胞中發現了具有耐藥特征的腫瘤細胞亞群；Suzuki等[46]也確定了一個對凡德他尼耐藥的亞群，并發現產生耐藥的亞群細胞核糖體基因和管家基因的相對表達降低，而直接靶向的表皮生長因子受體和RET基因保持不變。除了發現耐藥性，scRNA-seq還可以發現潛在的耐藥機制。此前的研究[47]已經證明葡萄糖轉運蛋白（glucose transporters，GLUT）抑制劑可作為新型選擇性抗癌藥物。在此基礎上Na等[48]聯合包括scRNA-seq在內的多種方法分析肺鱗癌細胞，發現免疫不良的肺鱗癌細胞中氟代脫氧葡萄糖攝取與GLUT1正相關（r=0.27，P=0.04），并且抗程序性死亡受體-1應答者的GLUT比率顯著高于無應答者（P=0.002），這提示GLUT比率可能與耐藥性相關。總之，應用scRNA-seq技術不僅可以發現耐藥性，同時也可以揭示其背后的機制。
4 總結與展望
近年來scRNA-seq技術已成為剖析NSCLC中細胞異質性的重要工具。使用這一工具可以提高我們對NSCLC的TIME中細胞類型、細胞演變軌跡、細胞分化的分子機制及細胞之間調節作用的認識。目前，scRNA-seq多對mRNA進行分析，對包括microRNA等的非mRNA的分析在未來可能會揭示更多NSCLC的異質性。將scRNA-seq與其他分析方法結合，整合來自同一細胞的不同分子和細胞信號將能夠克服scRNA-seq技術本身的不足。許多研究報告了scRNA-seq在肺癌研究中的應用，但仍有一些挑戰需要克服。從不同肺組織中分離足夠數量的細胞需要進行機械或化學操作，該過程可能很難得到功能完好無損且無菌的單個細胞進行scRNA-seq分析，這極大影響了scRNA-seq分析的精準度。高昂的成本以及復雜的步驟也限制了scRNA-seq的廣泛應用。對海量scRNA-seq數據進行生物信息學分析也是一項巨大的挑戰。雖然scRNA-seq技術有其不足之處，但不可否認的是，scRNA-seq技術依然將是未來NSCLC研究的熱點。同時也期待在細胞分離技術、scRNA-seq技術以及生物信息分析技術等方面有更多的進展和突破，使scRNA-seq技術在NSCLC的研究中得到更普遍的應用。
綜上所述，單細胞基因組學對于繪制腫瘤生態系統至關重要。近年來scRNA-seq技術的迅速發展使得我們對NSCLC的TIME產生了更加深刻的認識，在大多數研究中scRNA-seq技術展現出優秀的應用前景。總之，scRNA-seq是NSCLC的TIME研究中的強大工具，有助于了解不同階段NSCLC中TIME的細胞和分子機制。scRNA-seq還可用于分析NSCLC基因組特征及預后。此外在分析免疫治療及其耐藥性方面，scRNA-seq也有著其獨特優勢。盡管技術和生物信息學方面的挑戰可能會限制scRNA-seq在NSCLC TIME研究中的應用，相信隨著技術的進步和成熟，更多scRNA-seq的研究將進一步揭開NSCLC中TIME的奧秘。
利益沖突：無。
作者貢獻：楊文文、何立、張敏、孫碩、王峰、馬敏杰進行數據整理與分析，論文初稿撰寫與修改；韓彪負責文章的整體構思；楊文文負責修改后審校。