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2022年全球肝癌新發病例居順位第6位，而中國肝癌新發病例數順位第4位；全球肝癌死亡居順位第3位，而中國肝癌死亡順位第2位[1-3]。原發性肝癌主要分為肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）、肝內膽管癌以及混合型肝癌，其中HCC占到所有類型肝癌的75%～85%左右[4]。手術治療仍是HCC根治性治療的手段。但是多數HCC患者在確診時已是中晚期，僅能通過經導管動脈化療栓塞（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）、靶向治療（如索拉非尼、侖伐替尼等）、免疫治療（如信迪利單抗、替雷利珠單抗等）以及溶瘤病毒來阻止腫瘤進展、延長患者生存期[5]。因此需要早期診斷及治療以提高患者的生存率。目前臨床上針對HCC的診斷、病情評估及治療指導通常依賴于血清甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）與影像學資料，然而AFP缺乏特異性，影像學檢查如CT、MRI等雖精確但難以發現<1 cm的微小結節[6]。因此，為了提升HCC管理的效率、改善患者預后，亟需探索并引入新的檢測工具。循環游離DNA（circulating free DNA，cfDNA）作為一種新興的檢測技術，具有非侵入性、實時監測、分子信息豐富等優勢，已經在多種良惡性疾病的全程管理中展現出其獨特的價值。本綜述全面了解cfDNA在HCC的診斷和治療中的應用情況，以期為臨床醫生提供更優化的診斷和治療方案選擇，從而實現對HCC患者的早期診斷、早期治療，以進一步提高HCC患者的生存率。
1 cfDNA的生化特性
cfDNA是一種在生理或病理狀態下由細胞主動釋放或被動泄露的、裸露于細胞外部空間的DNA分子片段，長度為160～200 bp[7]，其生成源于正常細胞的自然凋亡、細胞焦亡、活細胞主動分泌、細胞壞死，也可來自于病原體裂解[8-11]。關于cfDNA的清除機制，現有研究[12-14]認為它主要依賴于肝臟Kuppfer細胞的吞噬作用[12]以及血漿中核酸酶分解[13-14]，也認為腎臟和脾臟參與了cfDNA的代謝[14]，但具體機制尚不十分清楚。
在健康狀態下，cfDNA的濃度通常維持在一個較低的穩態水平，其生成與清除之間保持著動態平衡。然而當機體內發生大量的病理性細胞死亡時，如劇烈運動、嚴重創傷應激、重癥感染、器官功能衰竭等情況，這一平衡狀態將被打破，導致血漿中cfDNA的濃度急劇上升[15-19]。值得注意的是，當腫瘤細胞及它所在腫瘤微環境內的細胞因缺氧、營養不良或免疫清除等作用而壞死時同樣會釋放大量的cfDNA，這些特殊的DNA片段也被稱為循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）。cfDNA為腫瘤診斷提供了新視角，也為腫瘤治療及預后評估提供了新的生物標志物[20]。
2 cfDNA在HCC中的應用
2.1 確定cfDNA的來源
由于cfDNA的來源及存在部位非常廣泛，確定cfDNA的來源是cfDNA應用于HCC的診斷和治療中有意義的一步。目前，對cfDNA溯源主要通過DNA甲基化分析、片段組學分析等方式。DNA甲基化是最常見的表觀遺傳修飾之一，指的是在DNA分子中胞嘧啶（Cytosine）的第五碳原子上添加一個甲基基團，這種修飾通常發生在胞嘧啶和鳥嘌呤相鄰的CpG位點上[21]；由于DNA甲基化模式具有組織特異性，并且在腫瘤轉化過程中保持穩定，因此通過DNA甲基化生物標志物的表征可指導cfDNA樣本中癌癥特征和組織起源的檢測[22]。片段組學分析則是基于cfDNA片段的長度、核小體印跡、末端序列的差異進行綜合分析，進而識別出cfDNA片段的起源[23]。此外，還有研究者[24]通過推斷轉錄因子結合位點、組蛋白修飾等方法進行cfDNA組織來源分析。
2.2 cfDNA用于HCC的早期診斷
2.2.1 定量檢測血漿cfDNA濃度
不同類型腫瘤患者的cfDNA濃度差異較大。在HCC患者中，有諸多研究表明，cfDNA濃度與HCC的腫瘤負荷密切相關。Huang等[25]利用實時定量PCR技術研究發現，乙型肝炎相關性HCC患者的血漿cfDNA水平顯著高于健康對照組及乙型肝炎肝硬化患者（中位值分別為173、9及46 μg/L，均P<0.001），其臨界值為143.0 μg/L時，它區分HCC和良性肝臟疾病的靈敏度為59.7%、特異度為78.4%；還發現腫瘤直徑≥5 cm的大肝癌患者血漿cfDNA水平高于腫瘤直徑≤5 cm的小肝癌（P=0.012），而未發現它與年齡、性別、AFP水平有關。在另一項研究[26]中，應用實時定量PCR技術，通過擴增血漿中游離TERT基因（端粒酶反轉錄酶基因，HCC中常見的突變），發現血漿cfDNA在61%的HCC患者、57%的肝硬化患者和22%的慢性肝炎患者中呈陽性（P=0.000 3），且HCC患者的血漿cfDNA濃度明顯高于肝硬化及慢性肝炎患者（P=0.02）；當血漿cfDNA濃度為1 ng/L時區分HCC與非腫瘤患者（包括肝硬化及慢性肝炎）的靈敏度為91%、特異度為43%，受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線下面積（area under ROC curve，AUC）為 0.69［95%CI=（0.60，0.78）］。Wang等[27]利用液滴數字PCR檢測了81例接受腫瘤切除術的HCC患者術前cfDNA濃度，發現術前cfDNA呈陽性的患者中有58%發生了腫瘤微血管浸潤，而在cfDNA陰性患者中僅為8.6%；與之有著相似結論的是，Migue等[28]采用超低通量全基因組測序的方式檢測HCC患者的cfDNA，發現cfDNA陽性患者中的36.36%發生了大血管侵犯事件，高于陰性患者的11.76%（P=0.023）。此外，Zhao等[29]研究發現，發生遠處轉移的HCC患者的cfDNA濃度也明顯高于未發生遠處轉移的患者（中位數53.20 ng/μL比21.20 ng/μL，P=0.04）。這些研究表明，cfDNA濃度不僅在HCC的早期診斷中具有潛力，也可能作為評估腫瘤負荷、微血管浸潤、遠處轉移等臨床特征的有用生物標志物；但是，因檢測方式和平臺不同，診斷、評價病情的標準也多種多樣，這是后續研究需要解決的主要問題。
2.2.2 檢測cfDNA中的拷貝數畸變（copy number variation，CNV）
CNV即基因在拷貝數量上的非正常增減，通常涉及長度在 1 kb到數Mb之間的DNA片段。無論是癌基因還是抑癌基因發生非正常增減均可能成為癌癥演進的關鍵因素[30]。目前，已有研究報道了HCC中特定CNV位點的存在和特定基因的拷貝數改變，例如CCND1（編碼細胞周期蛋白D1，位于染色體11q13）的增益或擴增，VEGFA（編碼血管內皮生長因子A，位于染色體6p21）、MYC（編碼Myc蛋白，位于染色體8q24）的拷貝數增加，以及TP53（編碼p53蛋白，位于染色體17p13）的丟失或缺失，這些變化均被視為HCC發生的潛在驅動因素[31]。檢測cfDNA中的CNV在腫瘤的早期診斷及病情評估中發揮著重要作用。Dong等[32]通過低通量全基因組測序檢測64例HCC患者、57例肝硬化患者以及32例健康自愿者者cfDNA，發現HCC最常見的前10種CNV 是染色體1q、6p、8q、20q、20q 區域的拷貝數增加和染色體4q、13q、8p、16q和17p區域的拷貝數丟失，這與 HCC組織樣本的CNV分析結果基本一致；再通過 ichorCNA算法分析CNV和腫瘤分數，HCC患者的腫瘤分數顯著高于健康自愿者和肝硬化患者，而健康自愿者和肝硬化患者之間未觀察到顯著差異；ROC 曲線還顯示，腫瘤分數有高達85.3%的靈敏度和94.4%的特異度。與cfDNA靶向突變分析相比，檢測腫瘤來源的CNV可能為基于cfDNA檢測的HCC篩查帶來顯著的增益。原因在于，癌癥早期階段，ctDNA在cfDNA中的比例較低，這為僅基于靶向突變位點的高靈敏度測試帶來了挑戰。而結合CNV分析（涵蓋整個基因組及特定染色體位點）的靶向突變檢測策略，能夠顯著提升cfDNA的檢出效率[33]，這也意味著，臨床醫生可以將檢測cfDNA中的CNV作為一種肝癌早期診斷的策略。
2.2.3 檢測cfDNA中的甲基化異常
DNA甲基化是基因調控的重要環節，也是維持基因正常表達穩定性和基因組穩定性的重要保障。當DNA甲基化發生異常時，它可能是癌癥發展的早期信號之一，這種異常的甲基化狀態在包括HCC在內的幾乎所有癌癥類型中被發現。利用此原理，可以對HCC進行早期診斷甚至實現血漿cfDNA的溯源[34]。Luo等[35]利用組織活檢的結果，篩選出2 321個差異甲基化位點，構建出基于cfDNA的HCC篩查模型，在其驗證隊列中獲得了84%的靈敏度及96%的特異度，在區分HCC患者和非HCC對照者的AUC為0.957 ［95%CI（0.939，0.975）］，與之相比，AFP的AUC僅為0.803 ［95%CI（0.758，0.847）］。而Wang等[36]則是以基于cfDNA全基因組測序的方式，通過并行分析HCC中熱點甲基化和基因突變，開發出一種HCC的檢測模型，在驗證隊列中敏感度為90%、特異度為94%，AUC為 0.93；隨后該研究團隊還將此模型應用于311例肝臟超聲檢查和血清AFP濃度正常的無癥狀乙型肝炎病毒攜帶者的前瞻性隊列，檢測出隊列中5例HCC患者中的4例，顯示出80%的敏感度和94%的特異度。可以看出，cfDNA甲基化檢測在HCC的篩查和早期診斷中具有很大的潛力，尤其是在對比傳統檢測方法（如AFP）時，往往顯示出更高的敏感度和特異度，這對于HCC的早篩早治，給臨床醫生提供了一種新的思路。
2.3 cfDNA用于HCC治療指導
應用cfDNA可以在非侵入條件下檢測HCC患者的特異性基因改變，并且可以一定程度上減少因腫瘤異質性帶來的假陰性結果，這對HCC患者的個體化治療具有非常重要的意義。例如，索拉非尼作為一種多激酶抑制劑，是晚期不可切除HCC的一線用藥，然而索拉非尼僅僅可以使30%的HCC患者獲益，并且這部分患者往往在治療6個月后發生耐藥反應以及嚴重的副反應和沉重的用藥經濟負擔。EZH2（zeste同源物2增強子，一種組蛋白賴氨酸甲基轉移酶）基因過表達是導致索拉非尼治療HCC耐藥的原因之一[37-38]，通過靶向檢測cfDNA中的EZH2過表達[39]，可篩選出索拉非尼的適用者以實現精準用藥；同時對于過表達EZH2而產生耐藥性的患者，也可考慮通過靶向抑制EZH2，如使用EZH2抑制劑UNC1999、GSK126以及聯合使用甲基轉移酶抑制劑5-氮雜-2′-脫氧胞苷而增強HCC對索拉非尼的敏感性[40-41]，這無疑對改善索拉非尼的獲益有著積極的作用。此外，根據多個不同中心的研究報道，利用cfDNA檢測出HCC患者最常見為TP53（47%～66.7%）、CTNNB1（16.7%～37%）及TERT啟動子突變（35.7%～57%）[42-44]，這與進行肝切除術或肝穿刺病理活檢的結果一致[45-46]。雖然針對TP53、CTNNB1等突變的靶向治療一度被認為難以成藥[47-48]，但令人鼓舞的是針對這些基因突變而進行靶向藥物研究的工作并沒有停止，如根據p53的致癌特性，開發靶向藥物的策略之一是專注于野生型p53，通過抑制p53/MDM2復合物來防止p53蛋白的降解；目前，已有11種MDM2抑制劑進入了臨床試驗階段[49]。因此，臨床醫生可考慮通過檢測cfDNA中的特異性基因改變，并根據結果推行個體化治療方案，從而改善HCC患者的治療獲益。
2.4 cfDNA用于監測HCC治療效果及評估預后
cfDNA檢測在評價HCC治療效果及評估預后也有著不俗的潛力。Zhao等[29]指出，HCC患者在接受腫瘤根治性切除術后血漿cfDNA可在數天內迅速下降并保持低水平穩態，而cfDNA濃度在術后6～12個月內上升并達峰則意味著腫瘤復發，提示預后不良，并且這種變化更早地出現于影像學如CT、MRI的改變。Fu等[50]的研究則通過術前檢測cfDNA的豐度及特異性突變，確認了攜帶有APC、ARID1A、CDKN2A、FAT1、TERT、TP53等組成的基因組為術后復發高危基因，與預后不良相關，可用于預測術后快速復發。Matsumae等[51]通過將使用阿替利珠單抗聯合貝伐珠單抗進行治療前的患者cfDNA水平進行分組，發現低cfDNA水平組相較于高水平組的患者有著更好的客觀緩解率（76.2%比22.5%）、無進展生存期和總生存期（P＜0.05），這表明簡單的 cfDNA定量檢測可能有助于預測聯合免疫治療患者的臨床結局。Dong等[32]通過檢測接受TACE治療的患者術前與術后的cfDNA中的CNV，再利用算法將CNV轉化為腫瘤分數值，發現高腫瘤分數組相較于低腫瘤分數組，無進展生存期（中位生存期97 d 比189 d，P=0.002）和總生存期更短（中位生存期243d 比630 d，P<0.001）；在經TACE治療后，腫瘤分數增加的患者的無進展生存期和總生存期更差（P＜0.001）。因此，cfDNA 檢測不僅可以作為評估腫瘤負荷和復發風險的早期指標，還能幫助預測 HCC 患者的治療效果及預后，特別是在根治性手術、免疫治療和 TACE 等治療方案中的應用。其作為一種無創、動態監測工具，為個體化治療和臨床決策提供了新的思路和依據。
3 cfDNA的檢測方法
cfDNA在HCC的診治過程中具有廣泛的應用前景，目前已經開發了許多檢測方法。根據檢測策略不同，cfDNA的檢測方法可分為兩類，一類是靶向檢測，即通過一個或多個已知的腫瘤特異性突變序列來檢測在血漿中的特異性改變，常用的方法有熒光定量實時PCR（real-time PCR，RT-PCR，亦即第二代PCR）、液滴數字PCR（drop digital PCR，dd-PCR，亦即第三代PCR）、BEAMing［由磁珠（Beads）、乳化（Emulsion）、擴增（Amplification）、磁學（Magnetic）這四個主要組分構建］等；第二類是非靶向測序，常用方法有全基因組測序（whole-genome sequencing，WGS）或全外顯子組測序（whole-exome sequencing，WES）[52]。各檢測方法的主要特點見表1。
表1
各檢測方法的主要特點
3.1 靶向檢測
3.1.1 熒光定量RT-PCR
熒光定量RT-PCR作為研究基因表達水平的檢測手段被廣泛使用，原理是在PCR反應體系中添加特定的熒光基團，利用熒光信號的累積，實時監測整個PCR進程中產物的變化，對目標基因的表達進行定量分析，可以實時監測不同細胞、組織、個體、發育不同階段或是特殊處理條件下某個基因的表達水平。該技術不僅實現了對DNA的定量檢測，而且具有高特異度、高敏感度的特點，但缺點是僅能檢測已知突變、低通量，且因使用標準曲線進行定量檢測時，結果易受到干擾[53-54]。
3.1.2 dd-PCR
dd-PCR的原理是基于熒光定量PCR，將PCR反應區室化為微小液滴單元，使目標分子在每個反應單元中獨立、平行地進行反應擴增，擴增完成后對所有的液滴進行熒光信號識別并計數，計算出陰性和陽性反應的數量，通過泊松分布原理計算靶標分子的濃度，無需標準曲線即可對變異等位基因進行定量分析，同時避免了非目標基因的污染。因此，ddPCR的優點是更高的敏感度和特異度、更可靠的檢測結果（可檢測低至0.1%突變），但缺點是價格相對昂貴，以及對檢測標本的質量要求比較高等[55-57]。
3.1.3 BEAMing
BEAMing技術實際上是PCR與流式細胞術的結合。在BEAMing技術中，樣品中的每個DNA分子都被擴增并轉化為獨立的磁珠，由此產生的磁性粒子（珠子）與原始DNA分子是一一對應的關系，并被分隔到油包水微乳滴中，以確保每個乳滴中僅包含1個DNA分子模板。在這樣的環境中，對每一個乳滴進行后續的擴增步驟，確保每個DNA分子都得到充分的擴增，然后應用流式細胞術來評估原始DNA分子群內的變異。BEAMing技術能高效評估數以億計的單個DNA分子，它能識別和量化腫瘤的cfDNA分子，這些分子因體細胞突變而與正常DNA區分。其高靈敏度使其能可靠檢測低至0.01%的罕見突變。然而，由于BEAMing基于PCR原理，存在通量較低和無法檢測未知突變的限制，同時操作相對復雜，成本也相對較高[58-59]。
3.2 非靶向測序
3.2.1 WES
WES是基于下一代測序技術的重要基因檢測方法，是基于高通量測序的方式，它通過探針捕獲外顯子并對它進行測序分析，能夠檢出樣本中的未知突變。
3.2.2 WGS
WGS也是一種高通量的基因組分析技術，它與WES的檢測目的和側重點稍有不同。WGS用于讀取并分析整個基因組的DNA序列，不僅覆蓋編碼區（外顯子），還包括基因組中的非編碼區（如內含子、調控區和重復序列）。通過全面掃描基因組，WGS可以發現所有類型的變異，包括單核苷酸變異、插入缺失、結構變異和拷貝數變異。WGS的基本步驟大致包括：首先，從樣本中提取基因組DNA并剪切成較小的片段；接著，在這些片段的兩端連接適配子，以便與測序平臺結合；隨后，這些片段經過擴增后使用下一代測序技術對數百萬甚至數十億個DNA片段進行并行測序；最后，測序得到的短片段會與參考基因組進行比對，以識別其中的變異，再借助生物信息學工具分析結果，確定這些變異與疾病或生物特征之間的關系，以及檢測未知的突變和非編碼區的結構變異[60-61]。相對于WES，WGS分析范圍更廣，數據更全面，檢測能力更強，當然這也意味著更高昂的成本、更復雜的數據處理和更大的工作量[62]。
4 總結與展望
cfDNA作為液體活檢的一種，在HCC診治過程中相較于AFP檢測、影像學檢查、病理活檢等傳統工具，它是非侵入性的，并且可能提高早期診斷效率、實現對HCC的病情監測、提供更精準的個體化治療方案、探索HCC的腫瘤異質性以及評估雨后，達到優化HCC的全程管理的目的。但是將cfDNA全面應用于HCC患者的診治過程，目前還存在一些困難與挑戰。例如，cfDNA檢測方法眾多，尚無受到廣泛認可的方案，而且不同中心研究的診斷界值不同，因此敏感度和特異性也存在著爭議；其次，相較于傳統方法，cfDNA檢測成本相對較高且技術難度較大，阻礙了cfDNA檢測在臨床上的推廣與應用。盡管如此，隨著人工智能快速發展和大數據分析的日益豐富和多樣化，加之檢測技術的不斷革新以及多種檢測方法的聯合應用，未來cfDNA必將在HCC的診治過程中發揮更加重要的作用。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：本文中，周凱負責參考文獻的檢索以及文章的撰寫和修改；陳剛提出了文章總體構思，指導修改，并負責文章審閱；宋書賢、帕成周參與參考文獻的補充查閱以及協助文章修改；
2022年全球肝癌新發病例居順位第6位，而中國肝癌新發病例數順位第4位；全球肝癌死亡居順位第3位，而中國肝癌死亡順位第2位[1-3]。原發性肝癌主要分為肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）、肝內膽管癌以及混合型肝癌，其中HCC占到所有類型肝癌的75%～85%左右[4]。手術治療仍是HCC根治性治療的手段。但是多數HCC患者在確診時已是中晚期，僅能通過經導管動脈化療栓塞（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）、靶向治療（如索拉非尼、侖伐替尼等）、免疫治療（如信迪利單抗、替雷利珠單抗等）以及溶瘤病毒來阻止腫瘤進展、延長患者生存期[5]。因此需要早期診斷及治療以提高患者的生存率。目前臨床上針對HCC的診斷、病情評估及治療指導通常依賴于血清甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）與影像學資料，然而AFP缺乏特異性，影像學檢查如CT、MRI等雖精確但難以發現<1 cm的微小結節[6]。因此，為了提升HCC管理的效率、改善患者預后，亟需探索并引入新的檢測工具。循環游離DNA（circulating free DNA，cfDNA）作為一種新興的檢測技術，具有非侵入性、實時監測、分子信息豐富等優勢，已經在多種良惡性疾病的全程管理中展現出其獨特的價值。本綜述全面了解cfDNA在HCC的診斷和治療中的應用情況，以期為臨床醫生提供更優化的診斷和治療方案選擇，從而實現對HCC患者的早期診斷、早期治療，以進一步提高HCC患者的生存率。
1 cfDNA的生化特性
cfDNA是一種在生理或病理狀態下由細胞主動釋放或被動泄露的、裸露于細胞外部空間的DNA分子片段，長度為160～200 bp[7]，其生成源于正常細胞的自然凋亡、細胞焦亡、活細胞主動分泌、細胞壞死，也可來自于病原體裂解[8-11]。關于cfDNA的清除機制，現有研究[12-14]認為它主要依賴于肝臟Kuppfer細胞的吞噬作用[12]以及血漿中核酸酶分解[13-14]，也認為腎臟和脾臟參與了cfDNA的代謝[14]，但具體機制尚不十分清楚。
在健康狀態下，cfDNA的濃度通常維持在一個較低的穩態水平，其生成與清除之間保持著動態平衡。然而當機體內發生大量的病理性細胞死亡時，如劇烈運動、嚴重創傷應激、重癥感染、器官功能衰竭等情況，這一平衡狀態將被打破，導致血漿中cfDNA的濃度急劇上升[15-19]。值得注意的是，當腫瘤細胞及它所在腫瘤微環境內的細胞因缺氧、營養不良或免疫清除等作用而壞死時同樣會釋放大量的cfDNA，這些特殊的DNA片段也被稱為循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）。cfDNA為腫瘤診斷提供了新視角，也為腫瘤治療及預后評估提供了新的生物標志物[20]。
2 cfDNA在HCC中的應用
2.1 確定cfDNA的來源
由于cfDNA的來源及存在部位非常廣泛，確定cfDNA的來源是cfDNA應用于HCC的診斷和治療中有意義的一步。目前，對cfDNA溯源主要通過DNA甲基化分析、片段組學分析等方式。DNA甲基化是最常見的表觀遺傳修飾之一，指的是在DNA分子中胞嘧啶（Cytosine）的第五碳原子上添加一個甲基基團，這種修飾通常發生在胞嘧啶和鳥嘌呤相鄰的CpG位點上[21]；由于DNA甲基化模式具有組織特異性，并且在腫瘤轉化過程中保持穩定，因此通過DNA甲基化生物標志物的表征可指導cfDNA樣本中癌癥特征和組織起源的檢測[22]。片段組學分析則是基于cfDNA片段的長度、核小體印跡、末端序列的差異進行綜合分析，進而識別出cfDNA片段的起源[23]。此外，還有研究者[24]通過推斷轉錄因子結合位點、組蛋白修飾等方法進行cfDNA組織來源分析。
2.2 cfDNA用于HCC的早期診斷
2.2.1 定量檢測血漿cfDNA濃度
不同類型腫瘤患者的cfDNA濃度差異較大。在HCC患者中，有諸多研究表明，cfDNA濃度與HCC的腫瘤負荷密切相關。Huang等[25]利用實時定量PCR技術研究發現，乙型肝炎相關性HCC患者的血漿cfDNA水平顯著高于健康對照組及乙型肝炎肝硬化患者（中位值分別為173、9及46 μg/L，均P<0.001），其臨界值為143.0 μg/L時，它區分HCC和良性肝臟疾病的靈敏度為59.7%、特異度為78.4%；還發現腫瘤直徑≥5 cm的大肝癌患者血漿cfDNA水平高于腫瘤直徑≤5 cm的小肝癌（P=0.012），而未發現它與年齡、性別、AFP水平有關。在另一項研究[26]中，應用實時定量PCR技術，通過擴增血漿中游離TERT基因（端粒酶反轉錄酶基因，HCC中常見的突變），發現血漿cfDNA在61%的HCC患者、57%的肝硬化患者和22%的慢性肝炎患者中呈陽性（P=0.000 3），且HCC患者的血漿cfDNA濃度明顯高于肝硬化及慢性肝炎患者（P=0.02）；當血漿cfDNA濃度為1 ng/L時區分HCC與非腫瘤患者（包括肝硬化及慢性肝炎）的靈敏度為91%、特異度為43%，受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線下面積（area under ROC curve，AUC）為 0.69［95%CI=（0.60，0.78）］。Wang等[27]利用液滴數字PCR檢測了81例接受腫瘤切除術的HCC患者術前cfDNA濃度，發現術前cfDNA呈陽性的患者中有58%發生了腫瘤微血管浸潤，而在cfDNA陰性患者中僅為8.6%；與之有著相似結論的是，Migue等[28]采用超低通量全基因組測序的方式檢測HCC患者的cfDNA，發現cfDNA陽性患者中的36.36%發生了大血管侵犯事件，高于陰性患者的11.76%（P=0.023）。此外，Zhao等[29]研究發現，發生遠處轉移的HCC患者的cfDNA濃度也明顯高于未發生遠處轉移的患者（中位數53.20 ng/μL比21.20 ng/μL，P=0.04）。這些研究表明，cfDNA濃度不僅在HCC的早期診斷中具有潛力，也可能作為評估腫瘤負荷、微血管浸潤、遠處轉移等臨床特征的有用生物標志物；但是，因檢測方式和平臺不同，診斷、評價病情的標準也多種多樣，這是后續研究需要解決的主要問題。
2.2.2 檢測cfDNA中的拷貝數畸變（copy number variation，CNV）
CNV即基因在拷貝數量上的非正常增減，通常涉及長度在 1 kb到數Mb之間的DNA片段。無論是癌基因還是抑癌基因發生非正常增減均可能成為癌癥演進的關鍵因素[30]。目前，已有研究報道了HCC中特定CNV位點的存在和特定基因的拷貝數改變，例如CCND1（編碼細胞周期蛋白D1，位于染色體11q13）的增益或擴增，VEGFA（編碼血管內皮生長因子A，位于染色體6p21）、MYC（編碼Myc蛋白，位于染色體8q24）的拷貝數增加，以及TP53（編碼p53蛋白，位于染色體17p13）的丟失或缺失，這些變化均被視為HCC發生的潛在驅動因素[31]。檢測cfDNA中的CNV在腫瘤的早期診斷及病情評估中發揮著重要作用。Dong等[32]通過低通量全基因組測序檢測64例HCC患者、57例肝硬化患者以及32例健康自愿者者cfDNA，發現HCC最常見的前10種CNV 是染色體1q、6p、8q、20q、20q 區域的拷貝數增加和染色體4q、13q、8p、16q和17p區域的拷貝數丟失，這與 HCC組織樣本的CNV分析結果基本一致；再通過 ichorCNA算法分析CNV和腫瘤分數，HCC患者的腫瘤分數顯著高于健康自愿者和肝硬化患者，而健康自愿者和肝硬化患者之間未觀察到顯著差異；ROC 曲線還顯示，腫瘤分數有高達85.3%的靈敏度和94.4%的特異度。與cfDNA靶向突變分析相比，檢測腫瘤來源的CNV可能為基于cfDNA檢測的HCC篩查帶來顯著的增益。原因在于，癌癥早期階段，ctDNA在cfDNA中的比例較低，這為僅基于靶向突變位點的高靈敏度測試帶來了挑戰。而結合CNV分析（涵蓋整個基因組及特定染色體位點）的靶向突變檢測策略，能夠顯著提升cfDNA的檢出效率[33]，這也意味著，臨床醫生可以將檢測cfDNA中的CNV作為一種肝癌早期診斷的策略。
2.2.3 檢測cfDNA中的甲基化異常
DNA甲基化是基因調控的重要環節，也是維持基因正常表達穩定性和基因組穩定性的重要保障。當DNA甲基化發生異常時，它可能是癌癥發展的早期信號之一，這種異常的甲基化狀態在包括HCC在內的幾乎所有癌癥類型中被發現。利用此原理，可以對HCC進行早期診斷甚至實現血漿cfDNA的溯源[34]。Luo等[35]利用組織活檢的結果，篩選出2 321個差異甲基化位點，構建出基于cfDNA的HCC篩查模型，在其驗證隊列中獲得了84%的靈敏度及96%的特異度，在區分HCC患者和非HCC對照者的AUC為0.957 ［95%CI（0.939，0.975）］，與之相比，AFP的AUC僅為0.803 ［95%CI（0.758，0.847）］。而Wang等[36]則是以基于cfDNA全基因組測序的方式，通過并行分析HCC中熱點甲基化和基因突變，開發出一種HCC的檢測模型，在驗證隊列中敏感度為90%、特異度為94%，AUC為 0.93；隨后該研究團隊還將此模型應用于311例肝臟超聲檢查和血清AFP濃度正常的無癥狀乙型肝炎病毒攜帶者的前瞻性隊列，檢測出隊列中5例HCC患者中的4例，顯示出80%的敏感度和94%的特異度。可以看出，cfDNA甲基化檢測在HCC的篩查和早期診斷中具有很大的潛力，尤其是在對比傳統檢測方法（如AFP）時，往往顯示出更高的敏感度和特異度，這對于HCC的早篩早治，給臨床醫生提供了一種新的思路。
2.3 cfDNA用于HCC治療指導
應用cfDNA可以在非侵入條件下檢測HCC患者的特異性基因改變，并且可以一定程度上減少因腫瘤異質性帶來的假陰性結果，這對HCC患者的個體化治療具有非常重要的意義。例如，索拉非尼作為一種多激酶抑制劑，是晚期不可切除HCC的一線用藥，然而索拉非尼僅僅可以使30%的HCC患者獲益，并且這部分患者往往在治療6個月后發生耐藥反應以及嚴重的副反應和沉重的用藥經濟負擔。EZH2（zeste同源物2增強子，一種組蛋白賴氨酸甲基轉移酶）基因過表達是導致索拉非尼治療HCC耐藥的原因之一[37-38]，通過靶向檢測cfDNA中的EZH2過表達[39]，可篩選出索拉非尼的適用者以實現精準用藥；同時對于過表達EZH2而產生耐藥性的患者，也可考慮通過靶向抑制EZH2，如使用EZH2抑制劑UNC1999、GSK126以及聯合使用甲基轉移酶抑制劑5-氮雜-2′-脫氧胞苷而增強HCC對索拉非尼的敏感性[40-41]，這無疑對改善索拉非尼的獲益有著積極的作用。此外，根據多個不同中心的研究報道，利用cfDNA檢測出HCC患者最常見為TP53（47%～66.7%）、CTNNB1（16.7%～37%）及TERT啟動子突變（35.7%～57%）[42-44]，這與進行肝切除術或肝穿刺病理活檢的結果一致[45-46]。雖然針對TP53、CTNNB1等突變的靶向治療一度被認為難以成藥[47-48]，但令人鼓舞的是針對這些基因突變而進行靶向藥物研究的工作并沒有停止，如根據p53的致癌特性，開發靶向藥物的策略之一是專注于野生型p53，通過抑制p53/MDM2復合物來防止p53蛋白的降解；目前，已有11種MDM2抑制劑進入了臨床試驗階段[49]。因此，臨床醫生可考慮通過檢測cfDNA中的特異性基因改變，并根據結果推行個體化治療方案，從而改善HCC患者的治療獲益。
2.4 cfDNA用于監測HCC治療效果及評估預后
cfDNA檢測在評價HCC治療效果及評估預后也有著不俗的潛力。Zhao等[29]指出，HCC患者在接受腫瘤根治性切除術后血漿cfDNA可在數天內迅速下降并保持低水平穩態，而cfDNA濃度在術后6～12個月內上升并達峰則意味著腫瘤復發，提示預后不良，并且這種變化更早地出現于影像學如CT、MRI的改變。Fu等[50]的研究則通過術前檢測cfDNA的豐度及特異性突變，確認了攜帶有APC、ARID1A、CDKN2A、FAT1、TERT、TP53等組成的基因組為術后復發高危基因，與預后不良相關，可用于預測術后快速復發。Matsumae等[51]通過將使用阿替利珠單抗聯合貝伐珠單抗進行治療前的患者cfDNA水平進行分組，發現低cfDNA水平組相較于高水平組的患者有著更好的客觀緩解率（76.2%比22.5%）、無進展生存期和總生存期（P＜0.05），這表明簡單的 cfDNA定量檢測可能有助于預測聯合免疫治療患者的臨床結局。Dong等[32]通過檢測接受TACE治療的患者術前與術后的cfDNA中的CNV，再利用算法將CNV轉化為腫瘤分數值，發現高腫瘤分數組相較于低腫瘤分數組，無進展生存期（中位生存期97 d 比189 d，P=0.002）和總生存期更短（中位生存期243d 比630 d，P<0.001）；在經TACE治療后，腫瘤分數增加的患者的無進展生存期和總生存期更差（P＜0.001）。因此，cfDNA 檢測不僅可以作為評估腫瘤負荷和復發風險的早期指標，還能幫助預測 HCC 患者的治療效果及預后，特別是在根治性手術、免疫治療和 TACE 等治療方案中的應用。其作為一種無創、動態監測工具，為個體化治療和臨床決策提供了新的思路和依據。
3 cfDNA的檢測方法
cfDNA在HCC的診治過程中具有廣泛的應用前景，目前已經開發了許多檢測方法。根據檢測策略不同，cfDNA的檢測方法可分為兩類，一類是靶向檢測，即通過一個或多個已知的腫瘤特異性突變序列來檢測在血漿中的特異性改變，常用的方法有熒光定量實時PCR（real-time PCR，RT-PCR，亦即第二代PCR）、液滴數字PCR（drop digital PCR，dd-PCR，亦即第三代PCR）、BEAMing［由磁珠（Beads）、乳化（Emulsion）、擴增（Amplification）、磁學（Magnetic）這四個主要組分構建］等；第二類是非靶向測序，常用方法有全基因組測序（whole-genome sequencing，WGS）或全外顯子組測序（whole-exome sequencing，WES）[52]。各檢測方法的主要特點見表1。
表1
各檢測方法的主要特點
3.1 靶向檢測
3.1.1 熒光定量RT-PCR
熒光定量RT-PCR作為研究基因表達水平的檢測手段被廣泛使用，原理是在PCR反應體系中添加特定的熒光基團，利用熒光信號的累積，實時監測整個PCR進程中產物的變化，對目標基因的表達進行定量分析，可以實時監測不同細胞、組織、個體、發育不同階段或是特殊處理條件下某個基因的表達水平。該技術不僅實現了對DNA的定量檢測，而且具有高特異度、高敏感度的特點，但缺點是僅能檢測已知突變、低通量，且因使用標準曲線進行定量檢測時，結果易受到干擾[53-54]。
3.1.2 dd-PCR
dd-PCR的原理是基于熒光定量PCR，將PCR反應區室化為微小液滴單元，使目標分子在每個反應單元中獨立、平行地進行反應擴增，擴增完成后對所有的液滴進行熒光信號識別并計數，計算出陰性和陽性反應的數量，通過泊松分布原理計算靶標分子的濃度，無需標準曲線即可對變異等位基因進行定量分析，同時避免了非目標基因的污染。因此，ddPCR的優點是更高的敏感度和特異度、更可靠的檢測結果（可檢測低至0.1%突變），但缺點是價格相對昂貴，以及對檢測標本的質量要求比較高等[55-57]。
3.1.3 BEAMing
BEAMing技術實際上是PCR與流式細胞術的結合。在BEAMing技術中，樣品中的每個DNA分子都被擴增并轉化為獨立的磁珠，由此產生的磁性粒子（珠子）與原始DNA分子是一一對應的關系，并被分隔到油包水微乳滴中，以確保每個乳滴中僅包含1個DNA分子模板。在這樣的環境中，對每一個乳滴進行后續的擴增步驟，確保每個DNA分子都得到充分的擴增，然后應用流式細胞術來評估原始DNA分子群內的變異。BEAMing技術能高效評估數以億計的單個DNA分子，它能識別和量化腫瘤的cfDNA分子，這些分子因體細胞突變而與正常DNA區分。其高靈敏度使其能可靠檢測低至0.01%的罕見突變。然而，由于BEAMing基于PCR原理，存在通量較低和無法檢測未知突變的限制，同時操作相對復雜，成本也相對較高[58-59]。
3.2 非靶向測序
3.2.1 WES
WES是基于下一代測序技術的重要基因檢測方法，是基于高通量測序的方式，它通過探針捕獲外顯子并對它進行測序分析，能夠檢出樣本中的未知突變。
3.2.2 WGS
WGS也是一種高通量的基因組分析技術，它與WES的檢測目的和側重點稍有不同。WGS用于讀取并分析整個基因組的DNA序列，不僅覆蓋編碼區（外顯子），還包括基因組中的非編碼區（如內含子、調控區和重復序列）。通過全面掃描基因組，WGS可以發現所有類型的變異，包括單核苷酸變異、插入缺失、結構變異和拷貝數變異。WGS的基本步驟大致包括：首先，從樣本中提取基因組DNA并剪切成較小的片段；接著，在這些片段的兩端連接適配子，以便與測序平臺結合；隨后，這些片段經過擴增后使用下一代測序技術對數百萬甚至數十億個DNA片段進行并行測序；最后，測序得到的短片段會與參考基因組進行比對，以識別其中的變異，再借助生物信息學工具分析結果，確定這些變異與疾病或生物特征之間的關系，以及檢測未知的突變和非編碼區的結構變異[60-61]。相對于WES，WGS分析范圍更廣，數據更全面，檢測能力更強，當然這也意味著更高昂的成本、更復雜的數據處理和更大的工作量[62]。
4 總結與展望
cfDNA作為液體活檢的一種，在HCC診治過程中相較于AFP檢測、影像學檢查、病理活檢等傳統工具，它是非侵入性的，并且可能提高早期診斷效率、實現對HCC的病情監測、提供更精準的個體化治療方案、探索HCC的腫瘤異質性以及評估雨后，達到優化HCC的全程管理的目的。但是將cfDNA全面應用于HCC患者的診治過程，目前還存在一些困難與挑戰。例如，cfDNA檢測方法眾多，尚無受到廣泛認可的方案，而且不同中心研究的診斷界值不同，因此敏感度和特異性也存在著爭議；其次，相較于傳統方法，cfDNA檢測成本相對較高且技術難度較大，阻礙了cfDNA檢測在臨床上的推廣與應用。盡管如此，隨著人工智能快速發展和大數據分析的日益豐富和多樣化，加之檢測技術的不斷革新以及多種檢測方法的聯合應用，未來cfDNA必將在HCC的診治過程中發揮更加重要的作用。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：本文中，周凱負責參考文獻的檢索以及文章的撰寫和修改；陳剛提出了文章總體構思，指導修改，并負責文章審閱；宋書賢、帕成周參與參考文獻的補充查閱以及協助文章修改；
