版權信息： ?四川大學華西醫院華西期刊社《中國普外基礎與臨床雜志》版權所有，未經授權不得轉載、改編
膽石癥是指膽汁成分受不同因素作用，于膽道析出形成結石的一種疾病。調查顯示我國膽石癥患病率為4.2%～12.1%[1]。既往研究[1]顯示膽石癥的發生與日常飲食、肥胖、基因調控水平、膽囊運動障礙、黏蛋白異常積累、膽汁酸代謝障礙等有關。人體內居住著大量微生物，它們在皮膚、泌尿生殖系統、胃腸道、呼吸道等處繁殖，細菌在共生微生物中的數量遠超其他，且在胃腸道分布最多，因此腸道微生態是人體最為復雜的環境[2]。隨著高通量測序技術的應用，許多研究發現腸道菌群與膽石癥存在關聯。可目前大多數研究屬于臨床觀察性研究，會受到臨床偏倚及混雜因素的干擾，還會有反向因果的影響。孟德爾隨機化（Mendelian randomization，MR）是將遺傳變異作為工具變量（instrumental variables，IVs），用來推斷暴露與結局間是否存在因果關系，其原理是利用自然界中隨機分配的基因型對表型的影響來推斷生物學因素對疾病的影響，它能很好地克服潛在混雜和反向因果關系的影響[3]。本研究利用全基因組關聯研究（genome-wide association studies，GWAS）的數據進行雙樣本孟德爾隨機化分析（two-sample MR，TSMR），以探討腸道菌群的差異與膽石癥發生是否具有因果關系，希望能在膽石癥的預防、診治以及改善預后上提供菌群調整新思路。
1 資料和方法
1.1 研究設計
本研究借助公共GWAS數據，暴露因素為腸道菌群，結局表型為膽石癥，利用與暴露因素密切相關的單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNPs）作為IVs，通過TSMR探索腸道菌群與膽石癥間的因果關聯，首選逆方差加權法（inverse variance weighted，IVW）進行因果效應估計方法，其他如MR-Egger、加權中位數等方法用以補充因果推斷[4]。質量控制可以確保本研究具有可靠性與穩定性，質量控制方法包括敏感性分析、異質性檢驗、水平基因多效性檢驗。該分析具有3個關鍵假設。① 關聯性假設：IVs的選取需要與腸道菌群具有較強的關聯性；② 獨立性假設：需排除混雜因素的影響以確保IVs與混雜因素不相關；③ 排他性假設：IVs只通過腸道菌群對膽石癥發生起作用，而不通過其他途徑[4]。本研究的技術路線見圖1。
圖1
示TSMR分析的技術路線圖
1.2 數據來源
本研究使用的腸道菌群GWAS匯總統計數據來自MiBioGen聯盟，其收集了來自亞洲和歐洲國家18 340例受試者的16S rRNA基因測序圖譜和基因分型數據。本研究共有211個腸道菌群分類群（從屬到門級別），排除了15個沒有特定種名的細菌類群（3個未知科與12個未知屬），共納入研究196個種類群（119個屬，32個科，20個目，16個綱和9個門）。膽石癥的GWAS數據來自芬蘭數據庫，且均為歐洲人群，包含了32 894例膽石癥患者和301 383例對照組。研究所使用的數據均來源于公共數據庫，可免費下載[5]，且涉及的每個GWAS都得到了各自機構的倫理批準。
1.3 IVs選擇
為確保研究結論的真實性和準確性，通過設置篩選條件以選擇最佳的IVs。① 為獲得更加全面的數據，篩選與腸道菌群最具相關性的SNPs，設定閾值為P<1×10–5。② 基于獨立性假設，SNPs間需相互獨立，確保各IVs間不存在連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD），故設定LD系數的r2<0.1，SNPs之間的距離kb=500。③ 通過回文序列檢測刪除回文SNPs，防止等位基因對結果產生影響。回文序列是指SNPs所在DNA的正向鏈和反向鏈的堿基順序一樣，但方向相反，所以無法判斷其所在鏈是正向鏈或反向鏈。④ 通過計算F統計量評估IVs的強度以排除弱IVs偏倚[6]。F統計量的計算公式如下：
 |
N代表暴露GWAS研究的樣本數，k代表IVs的個數，R2是IVs解釋暴露的程度（回歸方程的決定系數）。F<10表示存在弱IVs偏差，剔除F<10的IVs。
1.4 MR分析
本研究的TSMR分析使用4.2.2版本的R軟件和0.5.6版本的“TwoSampleMR”軟件包進行分析，并在R軟件中完成繪圖。結果根據效應指標優勢比（odds ratio，OR）和95%可信區間進行評估。
本研究采用5種方法評估因果效應：IVW、MR-Egger回歸、加權中位數法（weighted median estimator，WME）、簡單眾數法（simple mode，SM）和加權眾數法（weighted mode，WM）[4]。與其他4種分析方法相比，IVW法的檢驗效能更高，首選其進行因果效應估計[7]，結果解釋也基于該方法。IVW法估計值可視作結局中的IVs在腸道菌群中加權線性回歸的斜率，且截距項視為0，當所選SNPs都是有效的IVs時，其可以提供更為準確的估計值[5]。WME的優勢在于即使有超過50%的無效IVs，仍可以一致性地估計因果關系[8]。MR-Egger回歸截距可用于評估 IVs 之間的多效性。SM和WM相似，都是基于眾數的分析方法。檢驗水準α=0.05。
1.5 質量控制
質量控制包括敏感性分析、異質性檢驗、水平基因多效性檢驗，其中敏感性分析是評價IVW法有效性的必要手段。之前提到的多種算法也應用于質量控制，通過不同算法來驗證結論是否一致。使用留一法（leave-one-out）進行敏感性分析，采用Cochran的Q檢驗統計量檢驗IVs間的異質性，采用MR-Egger回歸與MR-PRESSO分析進行水平基因多效性檢驗，質量控制可以確保本研究結果具有可靠性與準確性。
2 結果
2.1 MR分析結果
IVW結果顯示：梭狀芽胞桿菌屬 ［Clostridiumsensustricto1，OR=1.160，95%CI（1.023，1.314），P=0.020］、糞球菌屬［Coprococcus3，OR=1.136，95%CI（1.014，1.272），P=0.028］、消化球菌屬 ［Peptococcus，OR=1.074，95%CI（1.023，1.128），P=0.004］豐度升高增加膽石癥的發生風險；芽孢桿菌綱 ［Bacilli，OR=0.897，95%CI（0.818，0.984），P=0.022］、FamilyXIIIAD3011group菌屬 ［OR=0.908，95%CI（0.830，0.992），P=0.033］、乳桿菌目 ［Lactobacillales，OR=0.884，95%CI（0.802，0.974），P=0.013］豐度升高降低膽石癥的發生風險，見表1。其余4種分析方法的結果大多不具有統計學意義，但趨勢與IVW相同。5種分析方法結果的散點圖如圖2所示，其中不同顏色的線表示不同的算法。
表1
基于IVW法的與膽石癥具有相關性的腸道菌群MR效應值
圖2
示5種MR分析結果散點圖
a：
2.2 質量控制
通過留一法評估MR結果的穩定性，逐個剔除SNPs并將IVW法應用于剩余的SNPs。在剔除任何SNPs后未發現有顯著的關聯變化，大部分結果與總效應值比較接近，不會對結果產生根本影響，證明本研究分析結果的穩定性和可靠性，如補充材料1所示。本研究應用MR-Egger和IVW模型估算異質性以對研究結果進行更嚴格的質量控制。如表2所示，Q檢驗統計量的P>0.05，提示無統計學意義，即IVs之間不存在異質性，表明不需要考慮異質性對研究結果造成的影響[9]。對于水平基因多效性檢驗，本研究用MR-Egger回歸與MR-PRESSO分析進行檢驗，均滿足P>0.05，表明不需要考慮基因多效性對研究結果造成的影響[10-11]。同時，MR-Egger截距結果的P>0.05，表示基因多效性的可能性較弱，其對研究結果的影響可無需考慮。水平基因多效性檢驗結果見表3。
表2
異質性檢驗結果
表3
水平基因多效性檢驗結果
3 討論
本研究結果顯示腸道菌群在膽石癥發病過程中發揮了重要作用。腸道菌群發生了失調或者其代謝功能發生變化可能會導致內毒素移位進入肝臟，造成肝臟發生炎癥反應，從而影響肝臟的形態及功能[12]。腸道微生態之所以對肝臟微環境如此重要，是因為肝臟通過門靜脈接收近70%的血液供應，腸道內75%的血液匯入門靜脈進入肝臟，輸送著營養物質、細菌及各種代謝產物[13]。膽汁酸在肝細胞中由膽固醇合成，其中經典途徑由膽固醇7α-羥化酶（cholesterol 7-alpha hydroxylase，CYP7A1）介導，而替代途徑由甾醇27-羥化酶完成，生成游離態的初級膽汁酸，再與牛磺酸等結合進入腸道。產膽鹽水解酶（bile salt hydrolase，BSH）的細菌催化腸道內結合膽汁酸分解為游離膽汁酸，再被7α-脫羥基細菌轉化為次級膽汁酸，最終各種類型的膽汁酸被腸道上皮吸收，穿過基底外側膜進入門靜脈返回肝臟，由此完成了腸肝循環（enterohepatic circulation）[14]。若產BSH菌群數量增多或活性增強，則導致游離膽汁酸增多。游離膽汁酸通過法尼醇X受體（farnesoid X receptor，FXR）和G蛋白偶聯膽汁酸受體1（G protein-coupled bile acid receptor 1，GPBAR1）負反饋抑制7α-羥化酶活性及表達，使膽汁酸正向合成減少，膽固醇增多過飽和析出形成結石[15]。
Liu等[16]從結石樣本中提取DNA后，通過單鏈構象多態性分析鑒定細菌種類，發現厭氧桿菌如梭菌屬和脆弱擬桿菌屬出現在肝內膽管結石中。脫氧膽酸的水平升高與膽石癥風險增加相關，這與7α-去羥基化細菌的水平升高有關，脫氧膽酸是7α-脫羥細菌的一種代謝產物[17]。梭菌屬通過羥基類固醇膽汁酸脫氫酶來完成胃腸道中膽汁酸3-、7-和12-羥基的氧化和差向異構化，它還具有酶解膽汁鹽的能力，膽固醇性膽石癥患者的7α-去羥基化細菌水平是未患病者的42倍以上[18]。產膽鹽水解酶的細菌增多后，次級膽汁酸水平升高，增加了膽固醇結晶的可能，在梭菌屬編碼蛋白分析的研究中可以得知梭菌屬有兩個膽鹽水解酶基因分布[19]；同時，在該研究[19]中發現糞球菌屬也編碼膽鹽水解酶蛋白，被預測為膽石癥發生的危險因素。這些與本研究所得結果相符合，本研究發現梭狀芽胞桿菌屬、糞球菌屬會增加膽石癥的發生風險。此外，有研究[20]發現除了梭菌屬外，消化球菌屬具有β-葡糖苷酸酶活性，使膽紅素二葡糖醛酸解結合，形成游離的未結合膽紅素，后者與鈣結合后結石形成，這可能是膽色素鈣結石形成的因素[20]。Song等[21]通過16S rRNA技術檢測和對比了30例無癥狀膽結石患者與30例健康對照者的腸道菌群結構差異，發現在無癥狀膽結石患者中Lactobacillales目的豐度下降，提示Lactobacillales目可能是膽石癥發生的保護因素。本研究結果與之一致。
梭菌屬可通過7α-去羥基作用將初級膽汁酸轉化為次級膽汁酸，而脫氧膽酸增加了膽汁酸的疏水性，使膽囊的膽固醇飽和度提高，導致溶解度降低，大大增加了膽囊結石的發生風險[22]。更重要的是，腸道菌群對膽汁酸的代謝可以影響一些參與膽汁酸從頭合成的關鍵酶的表達，包括CYP7A1、CYP7B1、CYP8B1和CYP27A1。例如，梭菌屬與優桿菌屬在該過程中通過法尼醇X受體（FXR）-成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）15/19反饋機制調節膽汁酸的合成，肝臟FXR被激活后會抑制CYP7A1和CYP8B1轉錄[21]。在腸細胞中，FXR通過FXR/FGF19/成纖維細胞生長因子受體-4（fibroblast growth factor receptor 4，FGFR4）途徑抑制膽汁酸合成，其中FXR誘導FGF19/FGF15、FGF19/FGF15反過來結合FGFR4和β-klotho復合物，觸發絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調節激酶1/2途徑，最終抑制肝臟中CYP7A1的基因表達[23]。調節腸道菌群、抑制膽汁酸合成并促進膽汁酸排泄是緩解膽汁淤積癥的有效途徑，而某些益生菌可以實現調節菌群含量、改善腸道屏障功能、減少細菌遷移和改善肝損傷，其中膽鹽水解酶活性是益生菌的主要特征之一[24]。目前利用益生菌的此類機制，可將膽汁酸作為益生菌緩解膽汁淤積的中心靶點[23]。
此外，目前有研究[25-26]提示膽囊切除術后腸道微生態的平衡被打破，而膽囊切除術與腸道微生物群的改變同樣密不可分，更加說明了腸道菌群的差異與膽石癥發生間存在因果關系。未來不僅應加深對腸肝循環的認識，還可借此為膽石癥的診療方案提供新的思路，如生物標志物等方向。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：趙昊負責設計研究，數據分析整理，論文撰寫；南博元負責數據提取與圖片校正，張巍負責論文最終校正。
膽石癥是指膽汁成分受不同因素作用，于膽道析出形成結石的一種疾病。調查顯示我國膽石癥患病率為4.2%～12.1%[1]。既往研究[1]顯示膽石癥的發生與日常飲食、肥胖、基因調控水平、膽囊運動障礙、黏蛋白異常積累、膽汁酸代謝障礙等有關。人體內居住著大量微生物，它們在皮膚、泌尿生殖系統、胃腸道、呼吸道等處繁殖，細菌在共生微生物中的數量遠超其他，且在胃腸道分布最多，因此腸道微生態是人體最為復雜的環境[2]。隨著高通量測序技術的應用，許多研究發現腸道菌群與膽石癥存在關聯。可目前大多數研究屬于臨床觀察性研究，會受到臨床偏倚及混雜因素的干擾，還會有反向因果的影響。孟德爾隨機化（Mendelian randomization，MR）是將遺傳變異作為工具變量（instrumental variables，IVs），用來推斷暴露與結局間是否存在因果關系，其原理是利用自然界中隨機分配的基因型對表型的影響來推斷生物學因素對疾病的影響，它能很好地克服潛在混雜和反向因果關系的影響[3]。本研究利用全基因組關聯研究（genome-wide association studies，GWAS）的數據進行雙樣本孟德爾隨機化分析（two-sample MR，TSMR），以探討腸道菌群的差異與膽石癥發生是否具有因果關系，希望能在膽石癥的預防、診治以及改善預后上提供菌群調整新思路。
1 資料和方法
1.1 研究設計
本研究借助公共GWAS數據，暴露因素為腸道菌群，結局表型為膽石癥，利用與暴露因素密切相關的單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNPs）作為IVs，通過TSMR探索腸道菌群與膽石癥間的因果關聯，首選逆方差加權法（inverse variance weighted，IVW）進行因果效應估計方法，其他如MR-Egger、加權中位數等方法用以補充因果推斷[4]。質量控制可以確保本研究具有可靠性與穩定性，質量控制方法包括敏感性分析、異質性檢驗、水平基因多效性檢驗。該分析具有3個關鍵假設。① 關聯性假設：IVs的選取需要與腸道菌群具有較強的關聯性；② 獨立性假設：需排除混雜因素的影響以確保IVs與混雜因素不相關；③ 排他性假設：IVs只通過腸道菌群對膽石癥發生起作用，而不通過其他途徑[4]。本研究的技術路線見圖1。
圖1
示TSMR分析的技術路線圖
1.2 數據來源
本研究使用的腸道菌群GWAS匯總統計數據來自MiBioGen聯盟，其收集了來自亞洲和歐洲國家18 340例受試者的16S rRNA基因測序圖譜和基因分型數據。本研究共有211個腸道菌群分類群（從屬到門級別），排除了15個沒有特定種名的細菌類群（3個未知科與12個未知屬），共納入研究196個種類群（119個屬，32個科，20個目，16個綱和9個門）。膽石癥的GWAS數據來自芬蘭數據庫，且均為歐洲人群，包含了32 894例膽石癥患者和301 383例對照組。研究所使用的數據均來源于公共數據庫，可免費下載[5]，且涉及的每個GWAS都得到了各自機構的倫理批準。
1.3 IVs選擇
為確保研究結論的真實性和準確性，通過設置篩選條件以選擇最佳的IVs。① 為獲得更加全面的數據，篩選與腸道菌群最具相關性的SNPs，設定閾值為P<1×10–5。② 基于獨立性假設，SNPs間需相互獨立，確保各IVs間不存在連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD），故設定LD系數的r2<0.1，SNPs之間的距離kb=500。③ 通過回文序列檢測刪除回文SNPs，防止等位基因對結果產生影響。回文序列是指SNPs所在DNA的正向鏈和反向鏈的堿基順序一樣，但方向相反，所以無法判斷其所在鏈是正向鏈或反向鏈。④ 通過計算F統計量評估IVs的強度以排除弱IVs偏倚[6]。F統計量的計算公式如下：
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N代表暴露GWAS研究的樣本數，k代表IVs的個數，R2是IVs解釋暴露的程度（回歸方程的決定系數）。F<10表示存在弱IVs偏差，剔除F<10的IVs。
1.4 MR分析
本研究的TSMR分析使用4.2.2版本的R軟件和0.5.6版本的“TwoSampleMR”軟件包進行分析，并在R軟件中完成繪圖。結果根據效應指標優勢比（odds ratio，OR）和95%可信區間進行評估。
本研究采用5種方法評估因果效應：IVW、MR-Egger回歸、加權中位數法（weighted median estimator，WME）、簡單眾數法（simple mode，SM）和加權眾數法（weighted mode，WM）[4]。與其他4種分析方法相比，IVW法的檢驗效能更高，首選其進行因果效應估計[7]，結果解釋也基于該方法。IVW法估計值可視作結局中的IVs在腸道菌群中加權線性回歸的斜率，且截距項視為0，當所選SNPs都是有效的IVs時，其可以提供更為準確的估計值[5]。WME的優勢在于即使有超過50%的無效IVs，仍可以一致性地估計因果關系[8]。MR-Egger回歸截距可用于評估 IVs 之間的多效性。SM和WM相似，都是基于眾數的分析方法。檢驗水準α=0.05。
1.5 質量控制
質量控制包括敏感性分析、異質性檢驗、水平基因多效性檢驗，其中敏感性分析是評價IVW法有效性的必要手段。之前提到的多種算法也應用于質量控制，通過不同算法來驗證結論是否一致。使用留一法（leave-one-out）進行敏感性分析，采用Cochran的Q檢驗統計量檢驗IVs間的異質性，采用MR-Egger回歸與MR-PRESSO分析進行水平基因多效性檢驗，質量控制可以確保本研究結果具有可靠性與準確性。
2 結果
2.1 MR分析結果
IVW結果顯示：梭狀芽胞桿菌屬 ［Clostridiumsensustricto1，OR=1.160，95%CI（1.023，1.314），P=0.020］、糞球菌屬［Coprococcus3，OR=1.136，95%CI（1.014，1.272），P=0.028］、消化球菌屬 ［Peptococcus，OR=1.074，95%CI（1.023，1.128），P=0.004］豐度升高增加膽石癥的發生風險；芽孢桿菌綱 ［Bacilli，OR=0.897，95%CI（0.818，0.984），P=0.022］、FamilyXIIIAD3011group菌屬 ［OR=0.908，95%CI（0.830，0.992），P=0.033］、乳桿菌目 ［Lactobacillales，OR=0.884，95%CI（0.802，0.974），P=0.013］豐度升高降低膽石癥的發生風險，見表1。其余4種分析方法的結果大多不具有統計學意義，但趨勢與IVW相同。5種分析方法結果的散點圖如圖2所示，其中不同顏色的線表示不同的算法。
表1
基于IVW法的與膽石癥具有相關性的腸道菌群MR效應值
圖2
示5種MR分析結果散點圖
a：
2.2 質量控制
通過留一法評估MR結果的穩定性，逐個剔除SNPs并將IVW法應用于剩余的SNPs。在剔除任何SNPs后未發現有顯著的關聯變化，大部分結果與總效應值比較接近，不會對結果產生根本影響，證明本研究分析結果的穩定性和可靠性，如補充材料1所示。本研究應用MR-Egger和IVW模型估算異質性以對研究結果進行更嚴格的質量控制。如表2所示，Q檢驗統計量的P>0.05，提示無統計學意義，即IVs之間不存在異質性，表明不需要考慮異質性對研究結果造成的影響[9]。對于水平基因多效性檢驗，本研究用MR-Egger回歸與MR-PRESSO分析進行檢驗，均滿足P>0.05，表明不需要考慮基因多效性對研究結果造成的影響[10-11]。同時，MR-Egger截距結果的P>0.05，表示基因多效性的可能性較弱，其對研究結果的影響可無需考慮。水平基因多效性檢驗結果見表3。
表2
異質性檢驗結果
表3
水平基因多效性檢驗結果
3 討論
本研究結果顯示腸道菌群在膽石癥發病過程中發揮了重要作用。腸道菌群發生了失調或者其代謝功能發生變化可能會導致內毒素移位進入肝臟，造成肝臟發生炎癥反應，從而影響肝臟的形態及功能[12]。腸道微生態之所以對肝臟微環境如此重要，是因為肝臟通過門靜脈接收近70%的血液供應，腸道內75%的血液匯入門靜脈進入肝臟，輸送著營養物質、細菌及各種代謝產物[13]。膽汁酸在肝細胞中由膽固醇合成，其中經典途徑由膽固醇7α-羥化酶（cholesterol 7-alpha hydroxylase，CYP7A1）介導，而替代途徑由甾醇27-羥化酶完成，生成游離態的初級膽汁酸，再與牛磺酸等結合進入腸道。產膽鹽水解酶（bile salt hydrolase，BSH）的細菌催化腸道內結合膽汁酸分解為游離膽汁酸，再被7α-脫羥基細菌轉化為次級膽汁酸，最終各種類型的膽汁酸被腸道上皮吸收，穿過基底外側膜進入門靜脈返回肝臟，由此完成了腸肝循環（enterohepatic circulation）[14]。若產BSH菌群數量增多或活性增強，則導致游離膽汁酸增多。游離膽汁酸通過法尼醇X受體（farnesoid X receptor，FXR）和G蛋白偶聯膽汁酸受體1（G protein-coupled bile acid receptor 1，GPBAR1）負反饋抑制7α-羥化酶活性及表達，使膽汁酸正向合成減少，膽固醇增多過飽和析出形成結石[15]。
Liu等[16]從結石樣本中提取DNA后，通過單鏈構象多態性分析鑒定細菌種類，發現厭氧桿菌如梭菌屬和脆弱擬桿菌屬出現在肝內膽管結石中。脫氧膽酸的水平升高與膽石癥風險增加相關，這與7α-去羥基化細菌的水平升高有關，脫氧膽酸是7α-脫羥細菌的一種代謝產物[17]。梭菌屬通過羥基類固醇膽汁酸脫氫酶來完成胃腸道中膽汁酸3-、7-和12-羥基的氧化和差向異構化，它還具有酶解膽汁鹽的能力，膽固醇性膽石癥患者的7α-去羥基化細菌水平是未患病者的42倍以上[18]。產膽鹽水解酶的細菌增多后，次級膽汁酸水平升高，增加了膽固醇結晶的可能，在梭菌屬編碼蛋白分析的研究中可以得知梭菌屬有兩個膽鹽水解酶基因分布[19]；同時，在該研究[19]中發現糞球菌屬也編碼膽鹽水解酶蛋白，被預測為膽石癥發生的危險因素。這些與本研究所得結果相符合，本研究發現梭狀芽胞桿菌屬、糞球菌屬會增加膽石癥的發生風險。此外，有研究[20]發現除了梭菌屬外，消化球菌屬具有β-葡糖苷酸酶活性，使膽紅素二葡糖醛酸解結合，形成游離的未結合膽紅素，后者與鈣結合后結石形成，這可能是膽色素鈣結石形成的因素[20]。Song等[21]通過16S rRNA技術檢測和對比了30例無癥狀膽結石患者與30例健康對照者的腸道菌群結構差異，發現在無癥狀膽結石患者中Lactobacillales目的豐度下降，提示Lactobacillales目可能是膽石癥發生的保護因素。本研究結果與之一致。
梭菌屬可通過7α-去羥基作用將初級膽汁酸轉化為次級膽汁酸，而脫氧膽酸增加了膽汁酸的疏水性，使膽囊的膽固醇飽和度提高，導致溶解度降低，大大增加了膽囊結石的發生風險[22]。更重要的是，腸道菌群對膽汁酸的代謝可以影響一些參與膽汁酸從頭合成的關鍵酶的表達，包括CYP7A1、CYP7B1、CYP8B1和CYP27A1。例如，梭菌屬與優桿菌屬在該過程中通過法尼醇X受體（FXR）-成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）15/19反饋機制調節膽汁酸的合成，肝臟FXR被激活后會抑制CYP7A1和CYP8B1轉錄[21]。在腸細胞中，FXR通過FXR/FGF19/成纖維細胞生長因子受體-4（fibroblast growth factor receptor 4，FGFR4）途徑抑制膽汁酸合成，其中FXR誘導FGF19/FGF15、FGF19/FGF15反過來結合FGFR4和β-klotho復合物，觸發絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調節激酶1/2途徑，最終抑制肝臟中CYP7A1的基因表達[23]。調節腸道菌群、抑制膽汁酸合成并促進膽汁酸排泄是緩解膽汁淤積癥的有效途徑，而某些益生菌可以實現調節菌群含量、改善腸道屏障功能、減少細菌遷移和改善肝損傷，其中膽鹽水解酶活性是益生菌的主要特征之一[24]。目前利用益生菌的此類機制，可將膽汁酸作為益生菌緩解膽汁淤積的中心靶點[23]。
此外，目前有研究[25-26]提示膽囊切除術后腸道微生態的平衡被打破，而膽囊切除術與腸道微生物群的改變同樣密不可分，更加說明了腸道菌群的差異與膽石癥發生間存在因果關系。未來不僅應加深對腸肝循環的認識，還可借此為膽石癥的診療方案提供新的思路，如生物標志物等方向。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
作者貢獻聲明：趙昊負責設計研究，數據分析整理，論文撰寫；南博元負責數據提取與圖片校正，張巍負責論文最終校正。
