器官移植是終末期器官疾病的重要治療手段，移植術后感染顯著影響患者預后。傳統感染檢測及診斷因靈敏度、特異性和檢測速度的不足難以滿足精準預防和控制感染的需求。定向納米孔病原學測序技術（簡稱“納米孔測序技術”）憑借讀長優勢、實時檢測及靈活適應性的特點，在病原體鑒定、結構變異分析和耐藥基因解析中展現出獨特優勢，為術后感染防治提供了新的技術手段。本共識圍繞納米孔測序技術在器官移植術后感染防治中的規范化應用，從技術原理、臨床應用建議及檢測流程3個方面展開闡述，結合其特點，探討納米孔測序技術在感染性疾病診斷中的價值，提出樣本處理及結果解讀的標準化建議。本共識的制定旨在推動納米孔測序技術在器官移植術后感染的診斷和治療中的合理應用，提高診斷效率與精準性，改善患者預后，為該技術的普及提供指導。
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器官移植是終末期器官疾病的重要治療手段，術后感染問題是影響患者預后的重要因素[1]。傳統的基于病原分離培養、免疫學檢測、分子生物學檢測等的感染診斷方法在靈敏度、特異性、檢測速度等方面存在一定局限性，難以滿足臨床精準防治的需求。隨著基因組學技術的發展，高通量測序技術彌補了傳統技術的不足，現已發展至第二代和第三代，其中第三代測序技術因其超長測序讀長逐漸被應用于臨床各個領域，它又分為定向、宏基因組、全基因組測序等方向，依據測序原理分為納米孔和單分子熒光信號測序。其中的定向納米孔病原學測序（以下簡稱“納米孔測序”）技術以其獨特優勢，為提升器官移植術后感染診斷及防治水平提供了條件[2-5]。為了讓納米孔測序技術在器官移植術后感染防治中規范化應用，特制定了“定向納米孔病原學測序技術在器官移植感染防治中應用的多中心專家共識”，為其臨床推廣與合理使用提供指導。
1 納米孔測序技術的原理與特點
1.1 原理
納米孔測序技術無需對樣本進行擴增，而是將DNA 分子單鏈化，并在驅動酶的幫助下逐個通過納米孔。納米孔中的離子流被通過的堿基阻斷，不同堿基引起的電信號被實時記錄，從而可以通過特定算法將電流信號翻譯成相應的堿基序列，實現從樣本處理到數據生成的實時分析。
1.2 特點
1.2.1 讀長優勢
納米孔測序技術能夠在單次運行中可以讀取超長的DNA或RNA分子序列，有助于復雜基因組區域的分析及病原體全基因組測序，對于鑒定病原體亞型、追蹤感染源及研究病原體進化具有重要意義，可減少因短讀長拼接導致的誤差和信息丟失[6]。
1.2.2 在結構變異檢測中的優勢
納米孔測序技術的核心優勢之一是其超長讀長能力，能夠生成長度達數萬甚至數十萬堿基的連續序列，其超長讀長能力這一特點在基因組結構變異的檢測中具有顯著優勢。① 相比第二代測序的短讀長，第三代測序納米孔測序技術的長讀長在識別復雜區域如重復序列、串聯重復、大片段插入或缺失以及染色體重排中尤為突出[6]。在臨床應用中，對下呼吸道感染患者的病原體進行基因組分析時，長讀長不僅可以精準識別耐藥基因的插入或移動元件的存在，還能解析病原體基因組的重組或進化過程。② 長讀長對檢測與病原體毒力或抗性相關的大型結構變異（如毒力島或抗性島）具有天然優勢，從而為復雜感染的診斷和個體化治療提供了重要依據[7-8]。③ 還可以避免因短讀長無法覆蓋重復區域或跨變異區域的局限，從而顯著降低假陰性率，并提高檢測的靈敏度和特異性。這使得第三代測序納米孔測序技術成為包括罕見病致病基因檢測和復雜微生物群體結構解析在內的諸多領域的理想選擇。
1.2.3 快速、靈活適應臨床需求
相比于第二代測序，第三代測序納米孔測序技術憑借實時數據生成和無需擴增的特點，通過直接讀取單分子核酸鏈，可以實現從樣本處理到數據生成的實時分析，可在數小時內完成病原體檢測并在短時間內得到初步結果，有效縮短了從采樣到報告的時間窗口，滿足臨床急性需求；可根據臨床需求調整測序深度和終點，實現快速診斷與精細分析的平衡，極大地支持個體化精準醫療[7]；它適用于多種樣本類型（如血液、痰液等），操作靈活，尤其在器官移植術后搶救性治療或復雜或多重感染的檢測中優勢顯著，可快速識別病原體，從而及時指導抗感染治療[7-10]。
2 納米孔測序技術的臨床應用建議
2.1 術前評估
2.1.1 供者器官檢測
由于供者體內的巨細胞病毒、Epstein-Barr病毒、人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒，特異性感染中的狂犬病病毒、破傷風梭菌、結核分枝桿菌，耐藥菌中的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌、耐萬古霉素腸球菌，真菌感染中的念珠菌感染、曲霉菌感染、隱球菌感染、毛霉菌感染等病原體，可通過供者感染器官傳播給受者，移植術后引發嚴重的術后感染并發癥。通過納米孔測序技術在術前對供者器官進行全面，可有效篩查出供者器官中的病原體感染情況，評估移植風險。對檢測出特定病原體感染的供者器官，可根據病原體的種類、感染程度以及受者的具體情況，制定個體化的預防策略，如對受者進行預防性抗病毒治療、調整免疫抑制方案等，以降低術后感染的發生率[11]。
2.1.2 受者感染狀態評估
部分病原體在受者體內可能處于潛伏感染狀態，在器官移植后，由于免疫抑制藥物的使用，機體免疫功能下降，這些潛伏的病原體可能被激活，從而引發感染。因此，采用納米孔測序技術在術前對移植受者檢測，有助于了解其體內潛在的病原體感染或攜帶狀態，為術后的感染監測和預防提供重要依據，制定更具針對性的術后管理方案。
2.2 術后感染診斷
2.2.1 血液感染
① 菌血癥與真菌血癥。器官移植受者術后免疫功能低下，極易發生菌血癥和真菌血癥。傳統的血培養方法雖為診斷金標準，但存在培養周期長、陽性率低等局限性，尤其是對于一些苛養菌、厭氧菌以及生長緩慢的真菌，培養難度較大[12]。納米孔測序技術能夠快速、靈敏地檢測血液中的細菌和真菌核酸，對于常見的病原菌如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、念珠菌屬、曲霉菌屬等，以及一些罕見的病原體，均能實現準確鑒定；同時，通過對病原體核酸序列的分析，可精確檢測出耐藥基因，為臨床合理選用抗菌藥物提供關鍵信息，避免盲目用藥，提高治療效果。② 病毒血癥。多種病毒感染可對器官移植受者造成嚴重威脅，如巨細胞病毒、Epstein-Barr病毒、人類皰疹病毒6型、人類皰疹病毒7型、腺病毒等，這些病毒感染可能導致發熱、乏力、器官功能損害等癥狀，嚴重影響移植器官的功能和受者的預后。納米孔測序技術能夠快速檢測血液中的病毒核酸，確定病毒的種類和載量，實現早期診斷。對于病毒感染的動態監測，可通過定期檢測病毒核酸序列的變化，評估抗病毒治療的療效，及時調整治療方案，防止病毒耐藥的發生[13]。
2.2.2 肺部感染
① 細菌感染。肺部是器官移植受者術后感染的高發部位之一。常見的細菌病原體包括肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌等。采用納米測序技術對支氣管肺泡灌洗液、痰液等樣本進行檢測，能夠快速、準確地檢測到病原體，并明確其耐藥基因譜。這有助于臨床醫生根據病原體的種類和耐藥情況，精準選擇抗菌藥物，提高治療的針對性和有效性，減少抗菌藥物的不合理使用。② 病毒感染。呼吸道病毒感染在器官移植受者中較為常見，可導致發熱、咳嗽、呼吸困難等癥狀，嚴重時可引發呼吸功能衰竭。常見的呼吸道病毒包括流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等。傳統的檢測方法如病毒培養、抗原檢測等存在靈敏度低、檢測時間長等問題。納米孔測序技術能夠快速檢測多種呼吸道病毒，同時還能對病毒進行分型和基因變異分析，有助于及時發現新的病毒變異株，為疫情防控和臨床治療提供重要信息。③ 真菌感染。由于長期使用免疫抑制劑，器官移植受者肺部真菌感染的風險顯著增高。常見的肺部真菌病原體有曲霉菌、念珠菌、肺孢子菌等。納米孔測序技術對肺部真菌感染的診斷具有較高的靈敏度和特異性，能夠檢測到傳統方法難以發現的真菌病原體，對于早期診斷和治療肺部真菌感染具有重要意義。通過對真菌核酸序列的分析，還可以了解真菌的耐藥機制，為臨床抗真菌治療提供依據[14-15]。
2.2.3 泌尿系統感染
器官移植受者術后常因留置導尿管、免疫功能低下等因素，易發生泌尿系統感染。常見的病原體包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、奇異變形桿菌等。采用納米孔測序技術對尿液樣本進行測序，能夠快速準確地檢測到病原體，并明確其耐藥情況，這有助于臨床醫生及時調整治療方案，合理選用抗菌藥物，提高泌尿系統感染的治療效果[16]。
2.2.4 其他部位感染
除上述常見部位感染外，納米孔測序技術還可應用于傷口、中樞神經系統、胃腸道等部位感染的診斷。對于傷口感染，通過對傷口分泌物進行檢測，可明確病原體種類，指導清創和抗感染治療；對于中樞神經系統感染，腦脊液樣本的檢測有助于診斷腦膜炎、腦炎等疾病的病原體；對于胃腸道感染，糞便樣本的檢測可幫助確定引起腹瀉、腹痛等癥狀的病原體。
2.3 耐藥監測
對于臨床疑似耐藥菌感染的病例，如經驗性抗感染治療效果不佳、感染反復發生或病原體具有已知耐藥機制相關特征時，采用納米孔測序技術對病原體的耐藥基因進行檢測和分析，可確定其耐藥基因型，包括常見的β-內酰胺酶基因、碳青霉烯酶基因、氨基糖苷類修飾酶基因、氟喹諾酮類耐藥基因，以及抗病毒藥物耐藥基因（如人類免疫缺陷病毒耐藥突變、皰疹病毒耐藥相關突變等）和抗真菌藥物耐藥基因（如azole 類耐藥基因、棘白菌素類耐藥基因等），以指導臨床精準選擇有效的抗感染藥物，優化治療方案，提高治療成功率，同時有助于監測耐藥菌的傳播和流行趨勢，為醫院感染防控提供數據支持[5-6, 10, 17]。
3 納米孔測序技術的檢測流程
3.1 樣本類型及要求
3.1.1 臨床樣本
包括血液、尿液、痰液、支氣管肺泡灌洗液、胸腔積液等樣本，應盡可能在采集后立即分裝并提取全基因組或轉錄組，DNA樣本可于–20 ℃條件下保存并等待建庫，RNA樣本應于–80 ℃條件下儲存并避免反復凍融。若無法立即進行DNA或RNA提取，當采集與提取的時間間隔在24 h內時可將標本于2～8 ℃條件下存放，當時間間隔超過24 h時則需將樣本于–80 ℃條件下儲存。
3.1.2 樣本濃度及質量的最低需求
① DNA樣本質量要求。純度：使用NanoDrop測定DNA純度，要求 吸光度（absorbance，A）260/A280比值為1.8、A260/A230 為2.0～2.2；片段大小：通過脈沖場凝膠分析測定片段平均大小，需＞30 kb；輸入量：使用Qubit測定DNA質量，要求輸入量至少為1 μg。② RNA樣本質量要求。化學污染物：避免樣本中含有化學雜質，如去污劑、變性劑、螯合劑及高濃度鹽類，這些可能會影響酶促反應步驟的效率，其他污染物（如DNA、蛋白質和染料）也會降低文庫制備步驟的效率；純度：對于濃度高于20 ng/μL的RNA樣本，可使用NanoDrop評估質量，推薦A260/A280接近2.0、A260/A230 為2.0～2.2（如果A260/A280低于2.0可能存在DNA污染，如果A260/A280低于1.8可能存在蛋白質或酚類污染；A260/A230 顯著低于2.0～2.2則可能表明樣本中含有其他雜質，建議進一步純化RNA樣本）；完整性：使用Agilent生物分析儀（Bioanalyzer）及RNA分析試劑盒評估RNA是否降解，確保樣本質量滿足測序要求[18]。
3.2 樣本保存及運輸注意事項
如果標本可以在24 h內送抵實驗室，可采用冰袋低溫運輸，否則應使用干冰運輸并在送達后立即進行樣本前處理和核酸提取。如果暫時沒有對樣本進行核酸提取的條件，應將樣本于–80 ℃條件下保存，并避免多次凍融。
3.3 數據分析流程
3.3.1 數據生成與初步質控
納米孔測序技術原始測序數據可以實時生成并分析。使用NanoQC、NanoPlot等軟件采集讀取質量（Q值）、堿基分布、樣本覆蓋深度及平均堿基長度。隨后根據質控結果去除低質量數據[19-20]。
3.3.2 數據比對與序列分析
將高質量讀長比對到參考基因組，識別關鍵區域（如結構變異、重復區域等）并使用Minimap2等工具排除宿主DNA[21-22]。
3.3.3 物種及耐藥基因的鑒定
使用Centrifuge、Kraken2等軟件進行宏基因組物種鑒定[23-24]，使用ARGpore2等軟件進行耐藥基因預測[25]。
3.3.4 與二代測序數據進行混合組裝
三代測序納米孔測序數據具有長讀長優勢，可解析復雜結構，但存在單堿基錯誤率較高的問題，而二代測序數據短讀長、錯誤率低，適合補充單堿基突變和高精度分析。混合組裝流程包括：獨立數據預處理，分別對三代測序納米孔測序和二代測序數據進行質控；初步組裝，即基于三代測序納米孔測序數據進行長讀長組裝；二代測序數據校正，即利用二代測序數據對三代測序納米孔測序組裝的序列進行堿基校正，提升精度；混合數據整合，即通過軟件（如SPAdes）生成高質量的混合組裝序列[26]。與二代測序數據進行混合組裝的優勢在于提高基因組組裝的連續性和精度，這在病原微生物基因組組裝及復雜變異分析中尤為重要。
3.3.5 使用規范化的生信分析平臺系統
在三代測序納米孔測序分析流程中，采用標準化和統一的生物信息學分析平臺對規范化分析流程和質量控制具有重要意義。標準化的分析平臺能夠確保不同樣本和項目的數據處理方法一致，從而減少因分析工具選擇和參數設置不同而導致的結果偏差。比如“基因組數據多功能拼接與分析可視化平臺系統”通過整合自動化流程、可重復的分析管道以及完善的質量控制模塊，能夠有效提高臨床工作中數據分析的效率和準確性。此外，統一的分析平臺通常包括實時質控功能，能夠在數據處理的各個階段提供關鍵指標監控，及時識別潛在問題。這種規范化的流程還便于研究者進行多中心研究或大規模臨床應用，確保數據和結果具有可比性和一致性。因此，在三代測序納米孔測序應用中，選擇經過驗證的標準化生信分析平臺，不僅可以提升整體分析質量，還能夠減少人工干預的誤差，為臨床診斷和科研提供可靠依據。
3.4 報告內容與結構
3.4.1 關鍵結果與描述
納米孔測序的報告需要圍繞檢測的關鍵結果展開，包括目標區域的變異檢測、病原微生物的鑒定、耐藥基因鑒定、相關臨床信息的提取和描述等。報告內容應突出重點，提供清晰的結論，便于臨床醫生快速理解和應用。關鍵結果部分不僅需要展示陽性檢測結果，還應說明檢測的靈敏度和特異性，以支持臨床決策。
3.4.2 結構變異、大型插入或缺失以及致病突變
報告應詳細描述目標區域內發現的基因組變異，包括：① 結構變異，如倒位、易位、重復序列、缺失等變異形式，并附帶變異的具體位置和大小；② 大型插入或缺失，提供插入或缺失的具體序列信息及其可能影響的基因功能；③ 致病突變，結合數據庫注釋和文獻支持，報告已知或潛在的致病性突變。
3.4.3 病原微生物鑒定及耐藥基因信息
在病原微生物的檢測中，報告應包括以下內容：檢測到的微生物物種及其相對豐度。特定耐藥基因（如抗生素耐藥基因、毒力因子）的存在情況及其功能描述。病原體的基因組完整性及特殊標記（如抗性島、毒力島）的注釋。
3.4.4 致病性分析
報告應基于變異注釋信息，評估其可能的致病性，分類為致病、可能致病、不確定意義或良性突變。同時結合患者臨床背景，分析變異的潛在影響。對于病原微生物檢測結果，評估微生物的致病風險，結合定量信息（如相對豐度）及臨床癥狀，提出針對性的治療建議，例如抗生素選擇或進一步檢查的必要性。
3.4.5 報告附錄
報告附錄中應包含詳細的質控數據：① 測序覆蓋深度，即目標區域的平均覆蓋深度及均勻性；② 數據量，即樣本生成的總數據量和有效數據比例；③ 錯誤率，測序過程中檢測到的錯誤率范圍；④ 數據完整性，如測序片段長度分布、獨特比對率；⑤ 參考文獻和附加信息報告應引用相關數據庫、算法和文獻，為檢測結果提供支持，同時附加技術細節說明（如建庫和測序平臺參數）和分析工具列表，便于進一步驗證。
3.5 解讀與臨床應用
3.5.1 微生物分類與致病性分級
依據微生物在下呼吸道中的致病性特點，可分為致病性微生物、條件致病微生物和定植微生物。對于條件致病微生物的判定，需要結合患者的宿主狀態、血液理化指標、影像學表現、抗感染治療史及其效果，并參考傳統微生物學檢測結果進行綜合評估。
3.5.2 未檢測出病原微生物以及耐藥基因或豐度稀少
納米孔測序有可能出現假陰性結果，即未報告明確病原體，對此需結合臨床表現和常規微生物實驗室檢測結果綜合判斷結果是真陰性還是假陰性。報告中的假陰性結果可能由于樣本提取時部分微生物破壁不完全導致DNA或者RNA未能釋放（比如革蘭陽性細菌、真菌等）、數據庫以及生信分析軟件版本落后、宿主DNA含量過多（可采取納米孔選擇性測序等方式去除宿主DNA）、樣本本身微生物載量低等（比如血清、腦脊液等樣本）導致。
3.5.3 檢測出過多病原微生物及耐藥基因
應去除豐度過低的微生物種類，著重分析豐度前10位的物種。提高數據庫比對時的嚴格度，過濾掉部分可信度不高的物種或耐藥性比對結果。
4 局限性與展望
盡管納米孔測序技術在器官移植術后感染防治領域展現出顯著優勢，但目前仍存在一些局限性。首先，在技術準確性方面，雖然它在不斷進步，但對于某些復雜基因組區域、高度相似的病原體序列以及低水平的核酸變異檢測仍可能存在一定的誤差率，需要進一步優化算法和技術流程，提高檢測的靈敏度和特異性。其次，數據分析的復雜性對臨床醫生和實驗室人員的專業素質提出了較高要求，需要具備扎實的生物信息學知識和豐富的臨床實踐經驗才能準確解讀測序結果并應用于臨床決策，這在一定程度上限制了該技術的廣泛應用和普及速度。此外，該技術設備及配套試劑的成本相對較高，在一定程度上制約了它在基層醫療機構和經濟欠發達地區的推廣使用，需要進一步降低成本，提高性價比，以促進其更廣泛的臨床應用。
然而，隨著科技的不斷進步和創新，納米孔測序技術有望在未來取得更大的突破和發展。一方面，技術的持續改進將不斷提高其檢測性能，降低誤差率，增強對復雜樣本和罕見病原體的檢測能力，使它成為更加精準、可靠的感染診斷工具。另一方面，生物信息學的快速發展將簡化數據分析流程，開發出更加智能化、用戶友好的數據分析軟件和平臺，降低對專業人員的依賴程度，提高臨床醫生對測序結果的解讀和應用能力。同時，隨著產業規模的擴大和技術的普及，設備和試劑成本有望逐漸降低，為它在各級醫療機構的廣泛應用創造有利條件，最終實現該技術在器官移植術后感染防治中的常規化、規范化應用，為改善器官移植患者的預后和提高生活質量提供強有力的技術支持，推動器官移植醫學事業邁向新的高度。
本共識將根據納米孔測序技術的發展和臨床實踐經驗的積累，適時進行更新和完善，以確保它始終為臨床提供科學、準確、實用的指導意見，促進該技術在器官移植領域的合理應用和健康發展。
需要注意，本共識內容是基于當前的科學知識和臨床實踐經驗編寫，實際應用中應結合具體情況進行判斷和決策，并不斷積累和總結經驗，以進一步優化納米孔測序技術在器官移植術后感染防治中的應用。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
《定向納米孔病原學測序技術在器官移植感染防治中應用的多中心專家共識》編審委員會成員名單
主審專家
鐘 林
編委會成員
栗光明 蔡金貞 呂國悅 吳忠均 楊家印 傅志仁 陳昌斌 高 偉 陳 剛 郭文治 王普森 趙 東 闕偉濤 方泰石 陳琦軍
執筆專家
黃一鳴 孫云柯 楊 亮 夏 雨 孔凌祥 汪守平 鐘 林 楊家印
器官移植是終末期器官疾病的重要治療手段，術后感染問題是影響患者預后的重要因素[1]。傳統的基于病原分離培養、免疫學檢測、分子生物學檢測等的感染診斷方法在靈敏度、特異性、檢測速度等方面存在一定局限性，難以滿足臨床精準防治的需求。隨著基因組學技術的發展，高通量測序技術彌補了傳統技術的不足，現已發展至第二代和第三代，其中第三代測序技術因其超長測序讀長逐漸被應用于臨床各個領域，它又分為定向、宏基因組、全基因組測序等方向，依據測序原理分為納米孔和單分子熒光信號測序。其中的定向納米孔病原學測序（以下簡稱“納米孔測序”）技術以其獨特優勢，為提升器官移植術后感染診斷及防治水平提供了條件[2-5]。為了讓納米孔測序技術在器官移植術后感染防治中規范化應用，特制定了“定向納米孔病原學測序技術在器官移植感染防治中應用的多中心專家共識”，為其臨床推廣與合理使用提供指導。
1 納米孔測序技術的原理與特點
1.1 原理
納米孔測序技術無需對樣本進行擴增，而是將DNA 分子單鏈化，并在驅動酶的幫助下逐個通過納米孔。納米孔中的離子流被通過的堿基阻斷，不同堿基引起的電信號被實時記錄，從而可以通過特定算法將電流信號翻譯成相應的堿基序列，實現從樣本處理到數據生成的實時分析。
1.2 特點
1.2.1 讀長優勢
納米孔測序技術能夠在單次運行中可以讀取超長的DNA或RNA分子序列，有助于復雜基因組區域的分析及病原體全基因組測序，對于鑒定病原體亞型、追蹤感染源及研究病原體進化具有重要意義，可減少因短讀長拼接導致的誤差和信息丟失[6]。
1.2.2 在結構變異檢測中的優勢
納米孔測序技術的核心優勢之一是其超長讀長能力，能夠生成長度達數萬甚至數十萬堿基的連續序列，其超長讀長能力這一特點在基因組結構變異的檢測中具有顯著優勢。① 相比第二代測序的短讀長，第三代測序納米孔測序技術的長讀長在識別復雜區域如重復序列、串聯重復、大片段插入或缺失以及染色體重排中尤為突出[6]。在臨床應用中，對下呼吸道感染患者的病原體進行基因組分析時，長讀長不僅可以精準識別耐藥基因的插入或移動元件的存在，還能解析病原體基因組的重組或進化過程。② 長讀長對檢測與病原體毒力或抗性相關的大型結構變異（如毒力島或抗性島）具有天然優勢，從而為復雜感染的診斷和個體化治療提供了重要依據[7-8]。③ 還可以避免因短讀長無法覆蓋重復區域或跨變異區域的局限，從而顯著降低假陰性率，并提高檢測的靈敏度和特異性。這使得第三代測序納米孔測序技術成為包括罕見病致病基因檢測和復雜微生物群體結構解析在內的諸多領域的理想選擇。
1.2.3 快速、靈活適應臨床需求
相比于第二代測序，第三代測序納米孔測序技術憑借實時數據生成和無需擴增的特點，通過直接讀取單分子核酸鏈，可以實現從樣本處理到數據生成的實時分析，可在數小時內完成病原體檢測并在短時間內得到初步結果，有效縮短了從采樣到報告的時間窗口，滿足臨床急性需求；可根據臨床需求調整測序深度和終點，實現快速診斷與精細分析的平衡，極大地支持個體化精準醫療[7]；它適用于多種樣本類型（如血液、痰液等），操作靈活，尤其在器官移植術后搶救性治療或復雜或多重感染的檢測中優勢顯著，可快速識別病原體，從而及時指導抗感染治療[7-10]。
2 納米孔測序技術的臨床應用建議
2.1 術前評估
2.1.1 供者器官檢測
由于供者體內的巨細胞病毒、Epstein-Barr病毒、人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒，特異性感染中的狂犬病病毒、破傷風梭菌、結核分枝桿菌，耐藥菌中的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌、耐萬古霉素腸球菌，真菌感染中的念珠菌感染、曲霉菌感染、隱球菌感染、毛霉菌感染等病原體，可通過供者感染器官傳播給受者，移植術后引發嚴重的術后感染并發癥。通過納米孔測序技術在術前對供者器官進行全面，可有效篩查出供者器官中的病原體感染情況，評估移植風險。對檢測出特定病原體感染的供者器官，可根據病原體的種類、感染程度以及受者的具體情況，制定個體化的預防策略，如對受者進行預防性抗病毒治療、調整免疫抑制方案等，以降低術后感染的發生率[11]。
2.1.2 受者感染狀態評估
部分病原體在受者體內可能處于潛伏感染狀態，在器官移植后，由于免疫抑制藥物的使用，機體免疫功能下降，這些潛伏的病原體可能被激活，從而引發感染。因此，采用納米孔測序技術在術前對移植受者檢測，有助于了解其體內潛在的病原體感染或攜帶狀態，為術后的感染監測和預防提供重要依據，制定更具針對性的術后管理方案。
2.2 術后感染診斷
2.2.1 血液感染
① 菌血癥與真菌血癥。器官移植受者術后免疫功能低下，極易發生菌血癥和真菌血癥。傳統的血培養方法雖為診斷金標準，但存在培養周期長、陽性率低等局限性，尤其是對于一些苛養菌、厭氧菌以及生長緩慢的真菌，培養難度較大[12]。納米孔測序技術能夠快速、靈敏地檢測血液中的細菌和真菌核酸，對于常見的病原菌如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、念珠菌屬、曲霉菌屬等，以及一些罕見的病原體，均能實現準確鑒定；同時，通過對病原體核酸序列的分析，可精確檢測出耐藥基因，為臨床合理選用抗菌藥物提供關鍵信息，避免盲目用藥，提高治療效果。② 病毒血癥。多種病毒感染可對器官移植受者造成嚴重威脅，如巨細胞病毒、Epstein-Barr病毒、人類皰疹病毒6型、人類皰疹病毒7型、腺病毒等，這些病毒感染可能導致發熱、乏力、器官功能損害等癥狀，嚴重影響移植器官的功能和受者的預后。納米孔測序技術能夠快速檢測血液中的病毒核酸，確定病毒的種類和載量，實現早期診斷。對于病毒感染的動態監測，可通過定期檢測病毒核酸序列的變化，評估抗病毒治療的療效，及時調整治療方案，防止病毒耐藥的發生[13]。
2.2.2 肺部感染
① 細菌感染。肺部是器官移植受者術后感染的高發部位之一。常見的細菌病原體包括肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌等。采用納米測序技術對支氣管肺泡灌洗液、痰液等樣本進行檢測，能夠快速、準確地檢測到病原體，并明確其耐藥基因譜。這有助于臨床醫生根據病原體的種類和耐藥情況，精準選擇抗菌藥物，提高治療的針對性和有效性，減少抗菌藥物的不合理使用。② 病毒感染。呼吸道病毒感染在器官移植受者中較為常見，可導致發熱、咳嗽、呼吸困難等癥狀，嚴重時可引發呼吸功能衰竭。常見的呼吸道病毒包括流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等。傳統的檢測方法如病毒培養、抗原檢測等存在靈敏度低、檢測時間長等問題。納米孔測序技術能夠快速檢測多種呼吸道病毒，同時還能對病毒進行分型和基因變異分析，有助于及時發現新的病毒變異株，為疫情防控和臨床治療提供重要信息。③ 真菌感染。由于長期使用免疫抑制劑，器官移植受者肺部真菌感染的風險顯著增高。常見的肺部真菌病原體有曲霉菌、念珠菌、肺孢子菌等。納米孔測序技術對肺部真菌感染的診斷具有較高的靈敏度和特異性，能夠檢測到傳統方法難以發現的真菌病原體，對于早期診斷和治療肺部真菌感染具有重要意義。通過對真菌核酸序列的分析，還可以了解真菌的耐藥機制，為臨床抗真菌治療提供依據[14-15]。
2.2.3 泌尿系統感染
器官移植受者術后常因留置導尿管、免疫功能低下等因素，易發生泌尿系統感染。常見的病原體包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、奇異變形桿菌等。采用納米孔測序技術對尿液樣本進行測序，能夠快速準確地檢測到病原體，并明確其耐藥情況，這有助于臨床醫生及時調整治療方案，合理選用抗菌藥物，提高泌尿系統感染的治療效果[16]。
2.2.4 其他部位感染
除上述常見部位感染外，納米孔測序技術還可應用于傷口、中樞神經系統、胃腸道等部位感染的診斷。對于傷口感染，通過對傷口分泌物進行檢測，可明確病原體種類，指導清創和抗感染治療；對于中樞神經系統感染，腦脊液樣本的檢測有助于診斷腦膜炎、腦炎等疾病的病原體；對于胃腸道感染，糞便樣本的檢測可幫助確定引起腹瀉、腹痛等癥狀的病原體。
2.3 耐藥監測
對于臨床疑似耐藥菌感染的病例，如經驗性抗感染治療效果不佳、感染反復發生或病原體具有已知耐藥機制相關特征時，采用納米孔測序技術對病原體的耐藥基因進行檢測和分析，可確定其耐藥基因型，包括常見的β-內酰胺酶基因、碳青霉烯酶基因、氨基糖苷類修飾酶基因、氟喹諾酮類耐藥基因，以及抗病毒藥物耐藥基因（如人類免疫缺陷病毒耐藥突變、皰疹病毒耐藥相關突變等）和抗真菌藥物耐藥基因（如azole 類耐藥基因、棘白菌素類耐藥基因等），以指導臨床精準選擇有效的抗感染藥物，優化治療方案，提高治療成功率，同時有助于監測耐藥菌的傳播和流行趨勢，為醫院感染防控提供數據支持[5-6, 10, 17]。
3 納米孔測序技術的檢測流程
3.1 樣本類型及要求
3.1.1 臨床樣本
包括血液、尿液、痰液、支氣管肺泡灌洗液、胸腔積液等樣本，應盡可能在采集后立即分裝并提取全基因組或轉錄組，DNA樣本可于–20 ℃條件下保存并等待建庫，RNA樣本應于–80 ℃條件下儲存并避免反復凍融。若無法立即進行DNA或RNA提取，當采集與提取的時間間隔在24 h內時可將標本于2～8 ℃條件下存放，當時間間隔超過24 h時則需將樣本于–80 ℃條件下儲存。
3.1.2 樣本濃度及質量的最低需求
① DNA樣本質量要求。純度：使用NanoDrop測定DNA純度，要求 吸光度（absorbance，A）260/A280比值為1.8、A260/A230 為2.0～2.2；片段大小：通過脈沖場凝膠分析測定片段平均大小，需＞30 kb；輸入量：使用Qubit測定DNA質量，要求輸入量至少為1 μg。② RNA樣本質量要求。化學污染物：避免樣本中含有化學雜質，如去污劑、變性劑、螯合劑及高濃度鹽類，這些可能會影響酶促反應步驟的效率，其他污染物（如DNA、蛋白質和染料）也會降低文庫制備步驟的效率；純度：對于濃度高于20 ng/μL的RNA樣本，可使用NanoDrop評估質量，推薦A260/A280接近2.0、A260/A230 為2.0～2.2（如果A260/A280低于2.0可能存在DNA污染，如果A260/A280低于1.8可能存在蛋白質或酚類污染；A260/A230 顯著低于2.0～2.2則可能表明樣本中含有其他雜質，建議進一步純化RNA樣本）；完整性：使用Agilent生物分析儀（Bioanalyzer）及RNA分析試劑盒評估RNA是否降解，確保樣本質量滿足測序要求[18]。
3.2 樣本保存及運輸注意事項
如果標本可以在24 h內送抵實驗室，可采用冰袋低溫運輸，否則應使用干冰運輸并在送達后立即進行樣本前處理和核酸提取。如果暫時沒有對樣本進行核酸提取的條件，應將樣本于–80 ℃條件下保存，并避免多次凍融。
3.3 數據分析流程
3.3.1 數據生成與初步質控
納米孔測序技術原始測序數據可以實時生成并分析。使用NanoQC、NanoPlot等軟件采集讀取質量（Q值）、堿基分布、樣本覆蓋深度及平均堿基長度。隨后根據質控結果去除低質量數據[19-20]。
3.3.2 數據比對與序列分析
將高質量讀長比對到參考基因組，識別關鍵區域（如結構變異、重復區域等）并使用Minimap2等工具排除宿主DNA[21-22]。
3.3.3 物種及耐藥基因的鑒定
使用Centrifuge、Kraken2等軟件進行宏基因組物種鑒定[23-24]，使用ARGpore2等軟件進行耐藥基因預測[25]。
3.3.4 與二代測序數據進行混合組裝
三代測序納米孔測序數據具有長讀長優勢，可解析復雜結構，但存在單堿基錯誤率較高的問題，而二代測序數據短讀長、錯誤率低，適合補充單堿基突變和高精度分析。混合組裝流程包括：獨立數據預處理，分別對三代測序納米孔測序和二代測序數據進行質控；初步組裝，即基于三代測序納米孔測序數據進行長讀長組裝；二代測序數據校正，即利用二代測序數據對三代測序納米孔測序組裝的序列進行堿基校正，提升精度；混合數據整合，即通過軟件（如SPAdes）生成高質量的混合組裝序列[26]。與二代測序數據進行混合組裝的優勢在于提高基因組組裝的連續性和精度，這在病原微生物基因組組裝及復雜變異分析中尤為重要。
3.3.5 使用規范化的生信分析平臺系統
在三代測序納米孔測序分析流程中，采用標準化和統一的生物信息學分析平臺對規范化分析流程和質量控制具有重要意義。標準化的分析平臺能夠確保不同樣本和項目的數據處理方法一致，從而減少因分析工具選擇和參數設置不同而導致的結果偏差。比如“基因組數據多功能拼接與分析可視化平臺系統”通過整合自動化流程、可重復的分析管道以及完善的質量控制模塊，能夠有效提高臨床工作中數據分析的效率和準確性。此外，統一的分析平臺通常包括實時質控功能，能夠在數據處理的各個階段提供關鍵指標監控，及時識別潛在問題。這種規范化的流程還便于研究者進行多中心研究或大規模臨床應用，確保數據和結果具有可比性和一致性。因此，在三代測序納米孔測序應用中，選擇經過驗證的標準化生信分析平臺，不僅可以提升整體分析質量，還能夠減少人工干預的誤差，為臨床診斷和科研提供可靠依據。
3.4 報告內容與結構
3.4.1 關鍵結果與描述
納米孔測序的報告需要圍繞檢測的關鍵結果展開，包括目標區域的變異檢測、病原微生物的鑒定、耐藥基因鑒定、相關臨床信息的提取和描述等。報告內容應突出重點，提供清晰的結論，便于臨床醫生快速理解和應用。關鍵結果部分不僅需要展示陽性檢測結果，還應說明檢測的靈敏度和特異性，以支持臨床決策。
3.4.2 結構變異、大型插入或缺失以及致病突變
報告應詳細描述目標區域內發現的基因組變異，包括：① 結構變異，如倒位、易位、重復序列、缺失等變異形式，并附帶變異的具體位置和大小；② 大型插入或缺失，提供插入或缺失的具體序列信息及其可能影響的基因功能；③ 致病突變，結合數據庫注釋和文獻支持，報告已知或潛在的致病性突變。
3.4.3 病原微生物鑒定及耐藥基因信息
在病原微生物的檢測中，報告應包括以下內容：檢測到的微生物物種及其相對豐度。特定耐藥基因（如抗生素耐藥基因、毒力因子）的存在情況及其功能描述。病原體的基因組完整性及特殊標記（如抗性島、毒力島）的注釋。
3.4.4 致病性分析
報告應基于變異注釋信息，評估其可能的致病性，分類為致病、可能致病、不確定意義或良性突變。同時結合患者臨床背景，分析變異的潛在影響。對于病原微生物檢測結果，評估微生物的致病風險，結合定量信息（如相對豐度）及臨床癥狀，提出針對性的治療建議，例如抗生素選擇或進一步檢查的必要性。
3.4.5 報告附錄
報告附錄中應包含詳細的質控數據：① 測序覆蓋深度，即目標區域的平均覆蓋深度及均勻性；② 數據量，即樣本生成的總數據量和有效數據比例；③ 錯誤率，測序過程中檢測到的錯誤率范圍；④ 數據完整性，如測序片段長度分布、獨特比對率；⑤ 參考文獻和附加信息報告應引用相關數據庫、算法和文獻，為檢測結果提供支持，同時附加技術細節說明（如建庫和測序平臺參數）和分析工具列表，便于進一步驗證。
3.5 解讀與臨床應用
3.5.1 微生物分類與致病性分級
依據微生物在下呼吸道中的致病性特點，可分為致病性微生物、條件致病微生物和定植微生物。對于條件致病微生物的判定，需要結合患者的宿主狀態、血液理化指標、影像學表現、抗感染治療史及其效果，并參考傳統微生物學檢測結果進行綜合評估。
3.5.2 未檢測出病原微生物以及耐藥基因或豐度稀少
納米孔測序有可能出現假陰性結果，即未報告明確病原體，對此需結合臨床表現和常規微生物實驗室檢測結果綜合判斷結果是真陰性還是假陰性。報告中的假陰性結果可能由于樣本提取時部分微生物破壁不完全導致DNA或者RNA未能釋放（比如革蘭陽性細菌、真菌等）、數據庫以及生信分析軟件版本落后、宿主DNA含量過多（可采取納米孔選擇性測序等方式去除宿主DNA）、樣本本身微生物載量低等（比如血清、腦脊液等樣本）導致。
3.5.3 檢測出過多病原微生物及耐藥基因
應去除豐度過低的微生物種類，著重分析豐度前10位的物種。提高數據庫比對時的嚴格度，過濾掉部分可信度不高的物種或耐藥性比對結果。
4 局限性與展望
盡管納米孔測序技術在器官移植術后感染防治領域展現出顯著優勢，但目前仍存在一些局限性。首先，在技術準確性方面，雖然它在不斷進步，但對于某些復雜基因組區域、高度相似的病原體序列以及低水平的核酸變異檢測仍可能存在一定的誤差率，需要進一步優化算法和技術流程，提高檢測的靈敏度和特異性。其次，數據分析的復雜性對臨床醫生和實驗室人員的專業素質提出了較高要求，需要具備扎實的生物信息學知識和豐富的臨床實踐經驗才能準確解讀測序結果并應用于臨床決策，這在一定程度上限制了該技術的廣泛應用和普及速度。此外，該技術設備及配套試劑的成本相對較高，在一定程度上制約了它在基層醫療機構和經濟欠發達地區的推廣使用，需要進一步降低成本，提高性價比，以促進其更廣泛的臨床應用。
然而，隨著科技的不斷進步和創新，納米孔測序技術有望在未來取得更大的突破和發展。一方面，技術的持續改進將不斷提高其檢測性能，降低誤差率，增強對復雜樣本和罕見病原體的檢測能力，使它成為更加精準、可靠的感染診斷工具。另一方面，生物信息學的快速發展將簡化數據分析流程，開發出更加智能化、用戶友好的數據分析軟件和平臺，降低對專業人員的依賴程度，提高臨床醫生對測序結果的解讀和應用能力。同時，隨著產業規模的擴大和技術的普及，設備和試劑成本有望逐漸降低，為它在各級醫療機構的廣泛應用創造有利條件，最終實現該技術在器官移植術后感染防治中的常規化、規范化應用，為改善器官移植患者的預后和提高生活質量提供強有力的技術支持，推動器官移植醫學事業邁向新的高度。
本共識將根據納米孔測序技術的發展和臨床實踐經驗的積累，適時進行更新和完善，以確保它始終為臨床提供科學、準確、實用的指導意見，促進該技術在器官移植領域的合理應用和健康發展。
需要注意，本共識內容是基于當前的科學知識和臨床實踐經驗編寫，實際應用中應結合具體情況進行判斷和決策，并不斷積累和總結經驗，以進一步優化納米孔測序技術在器官移植術后感染防治中的應用。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者閱讀并理解了《中國普外基礎與臨床雜志》的政策聲明，我們沒有相互競爭的利益。
《定向納米孔病原學測序技術在器官移植感染防治中應用的多中心專家共識》編審委員會成員名單
主審專家
鐘 林
編委會成員
栗光明 蔡金貞 呂國悅 吳忠均 楊家印 傅志仁 陳昌斌 高 偉 陳 剛 郭文治 王普森 趙 東 闕偉濤 方泰石 陳琦軍
執筆專家
黃一鳴 孫云柯 楊 亮 夏 雨 孔凌祥 汪守平 鐘 林 楊家印