引用本文： 劉建盛, 吳洵昳, 洪震. 腦靶向納米系統及其在癲癇診治中的應用. 癲癇雜志, 2015, 1(1): 54-63. doi: 10.7507/2096-0247.20150009 復制
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癲癇是由腦神經元異常放電所引起的反復癇性發作為特征的臨床常見神經系統綜合征。近二十余年來盡管不斷有新的抗癲癇藥物(Antiepileptic drugs,AEDs)問世，但難治性癲癇的比例仍然維持在25％~30%左右[1]。大量研究發現難治性癲癇的產生可能與基因突變、靶點(離子通道或受體)失敏以及局部多藥轉運體高表達等有關[2]，因此提示之前以離子通道及神經遞質為藥物靶點的AEDs研發策略仍具有較大的局限性[3]。此外，難治性癲癇中的部分患者需要手術切除病灶方可有效控制發作，但由于目前診斷技術的局限性，在很多患者仍難以確定致癇灶。因此，新型癲癇診斷和治療技術的開發具有重要的臨床意義。
納米技術在近十余年來取得了重大進展，特別是在腫瘤、感染等疾病中已有多種藥物進入臨床試驗階段[4]。在神經系統疾病領域，近年來大量基礎研究提示其可有效應用于中樞神經系統(Central nervous system,CNS)腫瘤、感染以及退行性疾病的診治。傳統上為提高AEDs的療效，主要是通過提高AEDs的血藥濃度進而提高藥物在腦內的蓄積。然而，網狀內皮系統(Reticuloendothelial system,RES)的吞噬作用以及系統給藥對患者其它器官系統產生的毒副作用限制了該策略的實施[1]。此外，相當一部分癲癇患者其癲癇發作類型為部分性發作，在腦內局灶部位存在解剖上或功能上的異常，而無選擇性的系統性給藥則會增加藥物對正常腦區功能的不良影響。癲癇多藥耐藥的多藥轉運體假說則認為，癲癇病灶局部血腦屏障(Blood-brain barrier,BBB)上以P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)為代表的外泵蛋白出現過度表達，而這將進一步減少藥物進入致癇灶局部[5]。為解決上述問題，采用靶向納米技術提高遞送AEDs至病灶局部的效率，有望提高 AEDs的療效。同時靶向納米分子構建的顯影劑或對比劑也有助增加致癇灶的發現率，為癲癇的外科治療提供更準確的術前定位。
本文首先綜述了目前廣泛研究的腦靶向納米載體，包括脂質體、脂質納米粒、聚合物納米粒、聚合物膠束、樹枝狀高分子材料以及磁性納米粒等，同時扼要闡述了納米粒腦靶向轉運可能的途徑和機制，最后介紹并展望這些納米載體在癲癇診斷和治療中的應用。
1 納米載體
1.1 脂質納米材料
1.1.1 脂質體
脂質體(Liposomes)是第一代新型藥物載體，具有生物相容性好、無毒以及可生物降解等特點，一經發現即受到了廣泛的關注。傳統的脂質體是由磷脂分子形成的類似細胞膜的磷脂雙分子層結構，粒徑在50~1 000 nm，可作為疏水性、親水性以及兩親性藥物的載體[6]。脂質體具有很高的親脂性，能夠通過多種途徑(如被動擴散、內吞作用等)將其包載的內容物轉運至腦實質[7]。Postmes等應用此類脂質體包載促甲狀腺素釋放激素(Thyrotropin-releasing hormone，TRH)進行實驗后發現，與游離TRH組相比，靜脈注射TRH脂質體3 h后大鼠腦內的TRH含量增高了2~4倍[8]。在傳統的脂質體表面修飾惰性的聚合物材料如聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)等，可以形成空間穩定脂質體(Sterically stabilized liposomes,SSL)，有助于阻止傳統脂質體本身的調理作用，從而避免其被肝和脾等組織的網狀內皮系統的吞噬。研究表明，修飾后可將載藥脂質體的半衰期從數分鐘提高到數十小時[9]，同時由于PEG等表面活性劑可以與血液中的載脂蛋白E結合，后者可與BBB上高表達的低密度脂蛋白(Low density lipoprotein，LDL)受體特異結合而發揮腦靶向作用[10]。
為了進一步提高脂質體的靶向性，近年來大量研究在前期工作的基礎上采取了一系列修飾來改善該遞送系統。①陽離子脂質體：Migliore等應用陽性脂質體制備給藥系統遞送卵白蛋白[11]。鼻內給予不同劑型的Alexa 488熒光素標志的卵白蛋白(50 μg/只)，結果顯示，在給藥后6 h，脂質體包載的模型蛋白和直接溶解在磷酸緩沖液(Phosphate buffered solution，PBS)均可在腦內紋狀體和黑質等區域出現密集熒光分布； 但在給藥后24 h，只有脂質體包載的熒光標記卵白蛋白在大鼠腦內仍有很強的熒光分布，而溶解于PBS的則只能見到少量稀疏的熒光分布。用111In標記模型蛋白后后應用γ計數進行定量實驗，結果顯示在給藥后1 h兩組腦內蛋白均達到最大量，且兩組沒有明顯統計學差異；但在4、6和24 h，脂質體組的入胞量是PBS組的1.5~4.0倍，以上結果提示陽離子脂質體可以作為一種無創的腦靶向給藥系統。 有研究在實驗性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)模型上比較了陰離子脂質體、陽離子脂質體以及普通脂質體對脊髓的特異性結合，結果發現正常大鼠尾靜脈注射三種脂質體，均未在動物脊髓血管內出現聚集；而在EAE大鼠臨床癥狀出現之前，陽離子脂質體即可在EAE大鼠的脊髓神經內膜血管上聚集，并且其聚集程度隨著病變加重而增強。普通脂質體和陰離子脂質體在正常及EAE 大鼠脊髓內均未出現聚集。這提示陽離子脂質體可以不依賴局部BBB的通透性，將藥物靶向輸送至病灶，可能成為一些CNS疾病診斷和治療的有效工具[12]。陽離子靶向入胞的機制目前尚未研究清楚，但目前傾向于認為是由于吸附介導的細胞內吞作用[13]，即帶正電荷的脂質體可以與表面帶負電荷的腦血管內皮細胞相互吸引從而促進粒子吸附。②免疫脂質體：該類脂質體通常是以血腦屏障上高表達的諸如轉鐵蛋白受體(Transferrin receptor,TfR)等受體蛋白作為靶分子，設計單克隆抗體或者具有和生理性配體類似功能的類似物，再將這些小分子接到PEG修飾的脂質體上，從而實現藥物載體的靶向遞送。Huwyler等采用TfR的單克隆抗體OX26修飾脂質體，包載經典的P-gp底物地高辛，在RBE4腦微血管內皮細胞(Brain capillary endothelial cells，BCECs)系上進行實驗后發現，免疫脂質體可以使得地高辛的入胞量提高25倍，這種增高能夠被OX26抗體和諾考達唑(胞吞抑制劑)抑制，卻不能被P-gp的抑制劑所抑制，提示該抗體修飾的免疫脂質體可以通過受體介導的內吞作用而繞過BBB表面的P-gp蛋白，因此可以作為一種潛在的腦靶向遞送系統[14]。Zhao等在隨后的研究中應用該靶向頭基修飾的脂質體包載編碼β-半乳糖苷酶的LacZ 基因質粒，結果發現可以明顯促進基因的腦內遞送；若再加上腦特異性的神經膠質原纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein，GFAP)的啟動子，則可以使得β-半乳糖苷酶的表達更加局限于腦組織而在其他器官中明顯減少[15]。應用可結合小鼠TfR的單克隆抗體8D3mAb構建的基因遞送脂質體系統發現了類似的腦靶向效果[16]。Soni等直接利用轉鐵蛋白(Transferrin，Tf)修飾脂質體，發現其可使得5-氟尿嘧啶的腦內攝取增加17倍，遠高于普通脂質體的10倍[17]。還有針對BCECs上高表達的B緩激肽受體的緩激肽類似物RMP-7構建的免疫脂質體[18]。免疫脂質體的腦靶向作用通常依賴于具有免疫反應性的靶向頭基與BBB上相應受體的特異性結合，后者常可觸發受體介導的跨胞轉運(Receptor-mediated transcytosis，RMT)。RMT是一種依賴細胞內膜囊泡轉運來實現藥物或其他分子跨膜運動的方式[19]。
1.1.2 脂質納米粒
脂質納米粒(Lipid nanoparticles)主要包括固體脂質納米粒(Solid lipid nanoparticles，SLNs)和納米結構脂質載體(Nanostructured lipid carriers,NLCs)組成。SLNs是20世紀90年代初發展起來的新一代脂質類給藥系統，以天然或合成的固體類脂如卵磷脂、三酰甘油、脂肪酸等為基質，將藥物包裹或夾嵌于類脂核中制成的固體膠粒給藥系統。該納米粒以毒性低、生物相容性好、可生物降解的材料作為載體，具有生物相容性好、可生物降解、載藥能力強、理化性質較穩定、對靶器官有特異趨向性、成本低等優點，一經發現即受到了廣泛的關注。SLNs的粒徑大多在10~200 nm之間，因此有助于其逃避RES的吞噬，并且能夠通過緊密聯系的BBB內皮細胞[13]。Manjunath等構建了載尼群地平的SLNs，結果發現其血藥濃度-時間曲線下面積(Area under the curve,AUC)增大了3~5倍，而清除減緩了4.5倍左右，組織分布結果顯示SLNs在腦內的蓄積量提高了3~7倍[20]。 Bondi等采用水包油技術包載利魯唑構建SLNs，體內實驗顯示SLNs能夠增加藥物入腦的量(1.5倍)，而在心、肝、脾、肺、腎等其他器官內的含量則減少[21]。Dhawan等則構建了以山崳酸甘油酯作為脂質層、吐溫-80作為表面活性劑的載槲皮素納米給藥系統，研究顯示該載藥系統能夠明顯延緩氯化鋁所誘導的阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)模型大鼠腦內谷胱甘肽的下降水平以及丙二醛和亞硝酸鹽的增高水平，行為學實驗也證實SLNs組AD大鼠的記憶保留時間較普通藥物組明顯延長[22]。這些結果都提示SLNs本身即可作為一種腦靶向遞藥系統。
NLCs是為了進一步提高SLCs載藥量、穩定性和緩釋效果而發明的一種改良的脂質載體[23]。NLCs以一定比例的液態油或其他不同的脂質和固體脂質為混合類脂質代替了SLNs中的固體脂質基質，從而能夠在提高載藥量的同時仍然保留SLCs的控釋效果。Kasongo等用聚乙二醇硬脂酸酯15(Solutol? HS 15)作為表面活性劑構建的NLCs可以吸附apoE蛋白，還能夠抑制P-gp的活性，因此推測其具有潛在的腦靶向能力[24]。使用該載體包載度洛西汀構建鼻腔給藥系統，結果發現其入腦能力是普通藥物組的2.5倍[25]。與普通脂質體類似，NLCs的表面還可修飾功能性小分子以提高腦靶向能力。有研究嘗試在NLCs表面接上具有腦靶向作用的F(ab’)片段和OX26單抗，結果發現在正常大鼠靜脈給藥后，修飾后的納米載體入腦量均高于未修飾的藥物載體。靜脈給藥24 h后F(ab’)和OX26修飾的NLCs的入腦量分別是未修飾的NLCs的1.5倍和2倍[26]。
1.2 聚合物納米材料
1.2.1 聚合物納米粒
聚合物納米粒(Polymeric nanoparticles)是一類由聚合物材料所制備的固態膠體粒子，可以將需要遞送的藥物溶解、包載、化學結合或者吸附在粒子上而構建成遞藥系統，其粒徑通常在100~200 nm之間。與脂質納米材料相比，聚合物納米粒在血循環中的狀態更穩定而且具有更強的對抗消化酶代謝的能力，可能是由于此類納米粒與血液成分的相互作用較少[13]。可以用于制備納米粒的聚合物材料有聚烷基氰基丙烯酸酯、聚甲基異丁烯酸、聚D，L-丙交酯-乙交酯以及聚乳酸等。多項研究均提示聚合物納米粒可以增強藥物的入腦能力[27]。Alyaudtin等用熒光素異硫氰酸鹽標志不同包被的聚氰基丙烯酸丁酯(Poly-butyl-cyanoacrylate，PBCA)納米粒子，觀察其被永生化的腦血管內皮細胞系RBE4攝取的情況[28]。實驗結果顯示只有表面包被了吐溫80的納米粒才能被細胞攝取，提示聚合物納米粒的入腦能力與其表面包被的表面活性劑密切相關。這一點在后續的研究中得到了證實。用表面包被吐溫80的PBCA納米粒包載由6個氨基酸殘基組成的腦啡肽類似物達拉根，靜脈注射后行熱板實驗以及甩尾實驗，均顯示出顯著的鎮痛效果[29]。在納米粒表面包被吐溫20、40以及60時，納米給藥系統仍然能夠發揮鎮痛效果；而當納米粒表面包被泊洛沙姆184、188、338、407、Cremophore?EL、Cremophore?RH以及Brij?75時，藥物則無法起到鎮痛作用[30]。進一步的研究提示吐溫80等表面活性劑包被的聚合物納米粒穿過BBB主要是通過與BCECs的相互作用實現的[31, 32]。包括吐溫80在內的表面活性劑主要通過與血液中的蛋白結合(主要是載脂蛋白B和載脂蛋白E)，而這些蛋白能夠識別BCECs上的相應受體(脂蛋白受體)從而實現受體介導的內吞以及跨膜轉運。
除了表面活性劑，還可以通過其他物質進行表面修飾以實現納米粒的腦內遞送。Calvo等制備了PEG修飾的聚十六烷基氰丙烯酸酯納米粒(PEG-PHDCA)，比較其與未修飾PHDCA、吐溫80包被的PHDCA以及泊洛沙姆98包被的PHDCA納米粒進入小鼠和大鼠大腦的能力[33]。結果顯示，PEG-PHDCA的入腦能力不僅強于未修飾的納米粒，而且還強于吐溫80包被的納米粒，而泊洛沙姆98包被則不能增強納米粒的入腦能力，再次驗證了表面包被分子對聚合物納米粒入腦能力的影響。進一步的研究提示長循環以及與BCECs的相互作用是納米粒促進藥物入腦的主要機制。
除了上述幾種聚合物材料，還有研究采用天然的多糖(葡聚糖、淀粉和殼聚糖)以及蛋白(如白蛋白和明膠)制備此類納米粒。Agyare等構建了以殼聚糖為聚合物核心的智能納米系統，并在其表面修飾抗淀粉樣蛋白抗體的F(ab’)段分子，體內外評估顯示其可明顯增強藥物載體穿透BBB并定位到淀粉樣斑塊的能力[34]。
1.2.2 聚合物膠束
聚合物膠束(Polymeric micelles)是兩親性嵌段共聚物在水溶液里形成的穩定的核-殼結構。其內核是由疏水性的聚合物嵌段(例如聚氧丙烯、聚D，L-乳酸、聚己內酯以及疏水性的飽和脂肪鏈等)組成，而外殼則是由親水性的聚合物嵌段(如聚乙二醇、聚氧乙烯等)組成。當嵌段共聚物在水溶液中的濃度達到了臨界膠束濃度，便會發生自組裝而形成聚合物膠束。聚合物膠束的材料大多安全性高，具有良好的生物可降解性以及生物相容性。此外，聚合物膠束的粒徑通常在10～100 nm之間。小粒徑(<100 nm)是納米粒有效入腦的先決條件[35]。推測原因可能是小粒徑的粒子在體內可有效避開RES的吞噬，從而延長粒子在體內的循環時間而為有效到達包括腦在內的靶器官提供了必要條件。普朗尼克(Pluronic)聚合物材料是常用的一種聚合物膠束的制備材料。其單體嵌段共聚物是由兩端親水的聚氧乙烯(PEO)鏈以及中間疏水的聚氧丙烯(PPO)嵌段組成的三嵌段共聚物。Pluronic形成的聚合物膠束能夠在體外穿過腦微血管內皮細胞膜，并且具有抑制P-糖蛋白等外泵蛋白對藥物的外排作用[36, 37]。因此采用Pluronic制備的聚合物膠束包載疏水性的P-糖蛋白底物的藥物，可以增加藥物向腦內的積累量。Liu等采用Pluronic P123包載疏水性的AEDs拉莫三嗪(Lamotrigine,LTG)，發現制備出來的載藥納米系統粒徑約為20 nm，并且具有緩釋效果[38]。大鼠體內實驗顯示聚合物膠束包載藥物后可使得藥物的入腦量增加約2倍。采用同一載體包載P-糖蛋白的經典熒光底物羅丹明123對聚合物膠束的入腦機制進行了初步探討，發現游離的羅丹明在腦內幾乎沒有分布，而膠束組在腦組織的紋狀體、海馬、皮層以及黑質等各個區域均有分布，說明將藥物包載進入聚合物膠束中可減少P-糖蛋白對藥物的外排；而提前給予P-gp抑制劑維拉帕米卻不能進一步增加載藥膠束的入腦量，該現象則進一步提示載藥膠束可能是通過抑制BBB上以P-gp為主的多種外泵蛋白的作用而發揮效果的。
聚乙二醇化的磷脂材料(DSPE-PEG)是近年來研究較多的另外一種聚合物膠束材料[39]。Shao等采用DSPE-PEG作為載體材料包載疏水性的抗生素兩性霉素B，得到粒徑約20 nm的載藥納米遞送系統[40]。在體外與體內評價了該納米給藥體系的入腦效率。結果表明，該給藥系統可顯著增加兩性霉素B在小鼠腦微血管內皮細胞的攝取量，并能顯著降低兩性霉素B對正常細胞的毒性；體內實驗顯示載藥膠束可促進兩性霉素B聚合物膠束跨過BBB向腦內積累，在膠束表面修飾靶向性的小分子多肽可以進一步增加藥物的入腦量。在后繼的研究中該課題組在CNS真菌感染的動物模型中證實了該納米給藥體系能夠明顯提高兩性霉素B的療效[41]，其主要機制可能是納米給藥系統可以繞過BBB上P-gp的識別及外泵作用。
1.2.3 樹枝狀高分子材料
樹枝狀高分子材料(Dendrimers)是一類具有特定空間結構的、由聚合物分子高度接枝而成的球狀納米高分子材料。該材料由一個內核、自內核發出的分子支鏈以及含有多個相同功能基團的外層構成，粒徑大小與聚合物膠束相仿。藥物或基因分子可以通過疏水作用進入樹枝狀高分子材料的內腔，或者通過與外層功能基團的直接結合而形成遞藥系統[13]。研究發現以樹枝狀高分子材料為基礎構建的納米給藥系統具有腦靶向作用。Dhanikuls等合成了一種聚醚-聚酯(polyether-copolyester，PEPE)樹枝狀高分子材料，并用羅丹明B標記以考察該材料透過BBB的能力和機制[42]。研究顯示當納米粒濃度達到一定程度后，bEnd.3細胞對該納米粒的攝取不能繼續增加，也即具有飽和性。應用網格蛋白和小窩蛋白抑制劑均能部分抑制細胞的攝取作用，提示這兩種蛋白介導的內吞作用在bEnd.3細胞攝取納米粒中均發揮作用。研究還應用共培養bEnd．3細胞和U373 MG細胞作為體外BBB模型以考察不同結構的PEPE跨越BBB的能力。結果發現在24 h內，Den-2-(G2)-400的穿透能力是Den-1-(G2)-400的2倍左右，提示PEPE的空間結構也對此種納米粒跨BBB的能力有重要影響。Dhanikula等進一步構建了葡糖胺修飾的PEPE用來遞送甲氨蝶呤，結果發現葡糖胺不僅可以作為有效的膠質瘤靶向配體，也可以促進納米粒透過BBB。在以共培養的bEnd.3細胞和U373 MG細胞構建的體外BBB模型上的研究發現，糖基化的PEPE促進MTX跨過BBB的量是非糖基化PEPE組的3～5倍[43]。
基因治療作為一個概念已經提出多年，但由于諸多原因長期不能應用于臨床，其中基因的遞送方式即為一個重要因素。傳統的病毒遞送由于潛在的安全性問題難以解決，近年來越來越多的研究開始轉向非病毒載體來遞送具有治療作用的基因。樹枝狀高分子材料聚氨胺(Polyamidoamine，PAMAM)和聚賴氨酸樹枝分子(Dendrigraft poly-L-lysine，DGL)是這類載體的典型代表。Huang等構建了觸角肽(Antennapedia peptide，Antp)修飾的PAMAM用來遞送pEGFP-N2質粒，分別在孵育20 min及3 h后檢測BCECs中基因的轉染和表達情況，結果發現，PAMAM可以促進內皮細胞對基因的攝取，在材料分子表面進行適當的修飾后效率更高[44]。將PAMAM表面修飾Tf也有類似的促進基因入腦的作用[45]。后續的研究發現乳鐵蛋白(Lactoferrin，Lf)修飾的PAMAM具有更強的促進基因入腦效果，是Tf修飾載體的2.3倍左右[46]。預先連續靜脈注射包載人膠質細胞系來源的神經營養因子基因(human Glial cell line-derived neurotrophic factor gene，hGDNF)的Lf-PAMAM載體，可以明顯改善6-羥基多巴胺所誘導的帕金森大鼠的肢體活動能力，減少多巴胺能神經元的丟失并提高單胺神經遞質的水平[47]。
相比與PAMAM，DGL因其可以更加高效的遞送基因且對正常細胞的毒性較小而在近年受到廣泛關注[48]。Li等的研究顯示DGL也可作為基因的載體用來遞送入腦，在其表面修飾上膽堿衍生物其入腦能力可以進一步提高[49]。在魚藤酮誘導大鼠帕金森的過程中，給予多次注射DGL包載的hGDNF，行為學實驗顯示可有效改善帕金森動物模型的肢體活動能力，免疫組織化學顯示此類基因載體能夠挽救多巴胺能神經元[50]。在表面修飾低密度脂蛋白受體相關蛋白(Low-density lipoprotein receptor-related protein，LRP)的配體Angiopep后其跨BBB的能力明顯增強，對模型大鼠的保護作用也有所增強。還有研究應用該高分子材料同時包載具有協同抗腫瘤效應的化學藥物和基因構建納米載體——阿霉素和腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(Tumornecrosis factor related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)，均具有顯著的抗腫瘤效應，且兩者的作用具有協同效應。Liu等應用DGL構建了能夠同時包載阿霉素(Doxorubicin，DOX)和表達TRAIL基因的質粒(pORF-hTRAIL)，并在載體表面修飾了能與TfR特異性結合的多肽T7 (HAIYPRH)[51]，在腦膠質瘤模型小鼠上進行的體內實驗顯示出了明顯的跨越BBB能力和抗腫瘤效應。
1.3 新型納米載藥系統
1.3.1 磁性納米粒
磁性納米粒(Magnetic nanoparticles,MNP)是一類具有磁性的氧化鐵納米粒以及其他金屬納米粒所組成的特殊粒子[52]。此種納米粒子一般以帶磁性的氧化鐵(Fe3O4或γFe2O3)或鈷、鎳等金屬為核心，外殼包被聚合物或脂質體以減少粒子被RES識別和吞噬。研究發現此類納米粒子在腦部疾病的診斷和靶向治療中具有巨大的潛在應用空間[53]。大量研究發現，磁性納米粒可以作為新型的核磁共振對比劑而應用于疾病診斷。磁性納米粒可以在縱軸和橫軸上縮短周圍質子的弛豫時間，在T2加權像上更明顯而使得增強部位因負性增強效應(Negative enhancement effect,NCE)而呈現比正常組織更低的信號強度[54]。研究顯示與傳統的釓螯合對比劑相比，長循環的超順磁Fe3O4納米粒(Superparamagnetic iron oxide，SPIO)可以更加清晰顯示腦部腫瘤與其周圍正常組織的邊界[55]。為了提高MNP的主動靶向能力，有研究在其表面修飾上蛋白、多肽或其他小分子物質可以提高對特定疾病的示蹤能力。氯毒素(Chlorotoxin，CTX)是提純自以色列金蝎毒液的一種多肽，研究發現此多肽可以特異性地與神經外胚層來源的腫瘤細胞進行結合[56]。利用這一特性，有研究將該多肽與多功能的磁性納米粒(PEG聚合物包被的Fe3O4)結合，結果發現此對比劑可靶向至神經膠質瘤細胞[57]。
除了成像，MNP還可用于藥物的靶向遞送，即所謂的磁性藥物靶向[58]。磁性藥物靶向載體(Magnetic targeted carrier,MTC)是由MNP和所要遞送的藥物通過共價或非共價的方式結合而成。由于粒子本身所帶的磁性，因此可以通過在病變部位施加外界磁場的方法來提高MTC的靶向能力。Kirthivasan等利用構建由聚(DL-丙交酯-co-乙醇酸交酯)和PEG-PLA包被的MTC，用后者遞送P-gp經典底物羅丹明123。結果顯示，與正常對照相比，MTC可以使得羅丹明123的入腦量增加1.6倍，而在靜脈給藥的同時在大鼠頭部額外加一個0.8 T的磁鐵則可使得藥物入腦的能力增高到原來的13.4倍[59]。由于MTC所含的磁性成分(如Fe3O4)和藥物成分相對固定，還可通過核磁共振成像來示蹤藥物進入靶點部位的量[60]。與傳統的納米粒類似，MTC也可以在其表面再修飾上具有靶向功能的多肽等小分子基團，從而形成多功能MTC。單核細胞和中性粒細胞表面表達整合素受體，可選擇性地與精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸(Arginine-glycine-aspartic acid，RGD)三肽結合。有研究發現采用RGD修飾的磁性脂質體(脂質體包被的Fe3O4)可選擇性地被血液循環中的單核細胞/中性粒細胞攝取，從而避免被肝等組織的巨噬細胞吞噬，在外部炎癥區域或病灶部位加入磁場，由于被細胞攝入的脂質體帶有磁性，可以使得攝取了磁性脂質體的細胞在磁場的作用下聚集到靶部位，利用這一特性可以用于腦靶向藥物遞送[61]。研究比較不同載體遞送雙氯芬酸入腦的能力。結果發現，無磁性的脂質體組不能使雙氯芬酸入腦增加，而修飾RGD后藥物的入腦能力是普通藥物的1.5倍左右；應用磁性脂質體可以使得大腦內藥物的含量增高到普通藥物5.95倍；在磁性納米脂質體的基礎上再修飾RGD則可進一步增加載體的腦內遞送能力至普通藥物的9.1倍。該研究提示多功能的MTC能夠通過協同作用而明顯增強給藥系統靶向能力。
1.3.2 生物仿生遞藥系統
盡管近年來在人工合成藥物載體上取得了很大的進展，但一些天然具有載體功能的粒子由于其所特有的一些性質使得它們能夠成為某些特定疾病的合適載體。研究發現某些病原體(細菌和病毒)以及一些哺乳動物的細胞均可用來作為藥物載體遞送藥物，稱之為生物仿生遞藥系統(Biomimetic drug delivery carriers)[62]。紅細胞(RBCs)是其中的一個典型代表。作為人體內最重要的一類血細胞，RBCs可以攜帶氧供應全身各器官。近年來多項研究發現，RBCs能夠用來構建藥物載體從而實現藥物的靶向遞送[63-65]。RBCs擁有一些一般納米藥物載體難以比擬的優點：極好的生物相容性、超長的體內半衰期(~120 d)、載體本身未攜帶任何基因組以及細胞表面積大(~140 μm2)等。Murciano等利用抗生蛋白鏈菌素將纖溶藥物組織型纖溶酶原激活物(tissue-type Plasminogen activator，tPA)和生物素化得RBCs共價結合形成給藥體系[65]。體內實驗研究發現靜脈給予RBC-tPA后大鼠血液內的纖溶活性的維持時間是給予游離tPA后的10倍。在小鼠肺栓塞和頸動脈血栓所致的腦缺血模型中的實驗發現，游離tPA可以裂溶掉肺靜脈內已有的血栓卻不能預防血栓再生，對頸動脈血栓則均無作用；RBC-tPA對已形成的靜脈血栓無效但能有效預防新生血栓的形成，此效應在大動脈上也存在。然而這種直接對RBCs進行修飾的方法會干擾紅細胞膜的完整性而降低載藥系統的體內半衰期。為了解決這個問題，新近的一項研究利用轉基因技術在RBCs前體細胞核內插入一段能表達修飾型Kell蛋白或血型糖蛋白A(Glycophorin A，GPA)的基因。當RBCs逐漸成熟并排出細胞核，這種蛋白仍留在細胞表面。在轉肽酶A的催化下，Kell蛋白和GPA蛋白可以在不損傷RBCs膜完整性的情況下與生物素分子結合，體內實驗此種方法制備的RBCs在體內可存活達28 d。他們還在GPA蛋白上附著了一種可以特異識別小鼠MHC-II類分子的單抗VHH 7，發現其可高效識別表面高表達MHC-II類分子的B淋巴細胞[63]。然而由于RBCs只在血管內循環，因此限制了其在其他疾病的應用，近年來已經有一些研究開始嘗試使用仿真RBC膜或仿RBC的聚合物粒子來遞送藥物[66, 67]。
2 納米技術在癲癇診斷中的應用
目前癲癇的診斷主要依賴于臨床表現和腦電圖檢查結果，而癲癇病因的診斷則更多的依賴于基因、影像學以及病理學的檢查。初步的研究發現納米技術也可用于癲癇病灶的診斷。Akhtari等應用經修飾的具有磁性的Fe2O3納米粒來定位急性和慢性顳葉癲癇的致癇灶[68]。研究中將磁性納米粒(Magnetonanoparticles,MNP)的末端修飾了既往研究證實的極具臨床應用潛力的靶向頭基α-甲基色氨酸(α-Methyl-tryptophan,AMT)[69, 70]。結果顯示，AMT修飾的MNP可特異的聚集在海人酸顳葉癲癇模型急性期和慢性期的腦內，應用核磁磁共振成像進行掃描發現其在T2加權像下呈低信號，即所謂的“負性增強”效應。顱內電極檢查結果證實AMT-MNP聚集部位即為癲癇發作的起源灶，這提示了MNP可以透過BBB并在癲癇病灶聚集，這可能是由于癲癇病灶局部的異常的色氨酸代謝所致[71]。在后續的研究中，該課題組又用2-脫氧葡萄糖(2-Deoxy glucose，2-DG)修飾MNP，結果顯示靶向基團修飾的MNP在腦內的聚集程度與特定區域神經元的活動狀態密切相關[72]。利用這一特點示蹤急性和慢性癲癇模型的致癇灶，發現MNP示蹤的部位與顱內腦電記錄所提示的癲癇起源灶高度吻合，提示該2-DG-MNP可以作為潛在的對比劑示蹤致癇灶。
3 納米技術在癲癇治療中的應用
由于BBB本身的結構特點以及BCECs上外泵蛋白的存在，一些具有抗癲癇效應的藥物的入腦能力受到極大的限制[73-75]，而納米遞藥系統能夠促進此類藥物入腦。Loeb等用脂質體包載抑制性神經遞質γ-氨基丁酸(γ-Amino butyric acid，GABA)來構建納米遞藥系統，通過腹腔注射給盤尼西林誘導的癲癇大鼠模型體內，能夠降低或避免癲癇發作，而對于游離的GABA給藥組，SD大鼠的癲癇行為沒有明顯改善。在另外一項研究中，作者構建了一個包被吐溫80的PBCA納米粒來遞送非競爭性的N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受體拮抗劑MRZ 2/576。該藥具有很強的抗驚厥效果，但由于腦內一種丙磺舒依賴的轉運作用，其抗癲癇維持時間極短(5~15 min)。在最大電驚厥模型上研究發現，應用納米粒遞送MRZ 2/516之后，抗驚厥效果可維持210 min，遠高于預先給予丙磺舒組的150 min，而且在給予丙磺舒預處理后給予納米載藥系統，抗癲癇維持時間還可進一步延長至270 min[76]。 這提示納米給藥系統不僅能夠促進那些難以入腦的物質有效通過BBB，而且還能夠通過控釋釋放等方式延長入腦藥物在病變局部的作用時間。
促甲狀腺激素釋放激素(Thyrotropin-releasing hormone，TRH)是一種具有抗癲癇作用的內源性神經肽[77, 78]。然而由于該激素容易被組織代謝且又難以透過BBB，因而難以推廣應用。近年來有研究應用聚交酯納米粒包載該激素構建載藥系統，體外實驗發現該納米粒能夠減輕谷氨酸所致的神經元毒性作用[79]。進一步在體外電點燃顳葉癲癇模型上考察療效[80]，結果顯示在電點燃開始前及過程中同時鼻腔給予載TRH納米粒的大鼠，其后發放持續時間(After discharge duration，ADD)明顯縮短，且達到V級癲癇發作以及完全點燃所需的電刺激次數也延長至對照組的1.5~2.0倍。
目前臨床上正在使用的AEDs都已經經過了合適的修飾以使得其能夠通過BBB。但大量研究發現，雖然這些藥物(大多是脂溶性的小分子)可以通過跨膜轉運等進入腦內，但由于它們中有許多是BBB上P-gp等外泵蛋白的底物，因此能從腦內被泵回血液中[81-84]。癲癇耐藥的“多藥轉運體假說”即認為是由于癲癇病灶局部以P-gp為主的多藥轉運體的表達和功能水平增高，從而導致了AEDs在人體能耐受的血藥濃度內難以達到有效的組織藥物濃度，從而使患者表現出對多種不同機制的AEDs耐藥[5]。LTG是臨床上常用的一種抗癲癇藥物，可以應用于多種癲癇發作類型，但其對難治性癲癇的療效仍然非常局限，部分可能是由于它也是P-gp的底物[81, 83]。Liu等應用聚合物膠束普朗尼克類材料P123包載LTG構建了粒徑約為20 nm的注射用納米載藥系統，體內實驗顯示此類載體可以促進P-gp底物類AEDs的入腦，其效應和預先予以P-gp抑制劑的效果類似[38]。Alam等應用NLCs構建了包載該藥的鼻腔納米遞藥系統，結果也發現該系統具有類似的控釋作用，并且能夠促進藥物入腦[85]。
4 展望
納米技術在近十余年來的發展可謂日新月異，在CNS疾病的診斷和治療中也已經取得了許多喜人的成就[13, 86]。然而，其在癲癇的診斷和治療方面的應用卻仍然很少[75]，至今尚未有進入臨床研究階段的藥物。在未來的研究中，我們認為在以下領域納米技術很可能還大有所為。第一、繼續尋找合適的納米材料，優化制備載AEDs納米遞藥系統的方法，最好是能夠同時將多種不同作用機制的AEDs包在同一個納米給藥系統內，從而方便給藥并提高藥物的協同作用。第二、選擇有生物反應調節能力的納米載體包載AEDs，比如選擇具有抑制P-gp功能的普朗尼克類材料、維生素E衍生物或殼聚糖等作為納米載體，可能有助于對抗P-gp增高所致的癲癇多藥耐藥。第三、進一步加強對癲癇發病機制的研究以尋找癲癇特異的靶向分子，從而構建新型的可以特異性靶向至致癇灶的納米對比劑或給藥系統。在我們課題組的初步研究中發現，利用癲癇局灶對色氨酸攝取明顯增高，可以構建以色氨酸衍生物為靶向頭基的納米給藥系統，結果顯示新構建的納米遞藥系統能夠有效靶向至癲癇病灶而減少其他正常腦組織內的分布。此外，近些年大量研究提示難治性癲癇病灶局部的P-gp蛋白表達和功能增強[87]，未來或可利用這一點來設計針對P-gp的靶向頭基，從而協助診斷和治療難治性癲癇。第四、構建同時具有診斷和治療功能的納米材料。
近年來已有多項研究顯示納米材料可以同步用于診斷和治療腫瘤等疾病[88]，而在癲癇中尚未有類似應用。在我們的前期研究中發現，利用石墨烯納米復合材料的光熱效應[89]和Fe3O4的磁敏感效應[68]，將兩者結合形成新型納米粒，注入老鼠體內，不僅可以在核磁共振成像下清楚顯示局部病灶，而且在經顱孔給予紅外光照射后，發現能夠實現的致癇灶局部熱切除。
癲癇是由腦神經元異常放電所引起的反復癇性發作為特征的臨床常見神經系統綜合征。近二十余年來盡管不斷有新的抗癲癇藥物(Antiepileptic drugs,AEDs)問世，但難治性癲癇的比例仍然維持在25％~30%左右[1]。大量研究發現難治性癲癇的產生可能與基因突變、靶點(離子通道或受體)失敏以及局部多藥轉運體高表達等有關[2]，因此提示之前以離子通道及神經遞質為藥物靶點的AEDs研發策略仍具有較大的局限性[3]。此外，難治性癲癇中的部分患者需要手術切除病灶方可有效控制發作，但由于目前診斷技術的局限性，在很多患者仍難以確定致癇灶。因此，新型癲癇診斷和治療技術的開發具有重要的臨床意義。
納米技術在近十余年來取得了重大進展，特別是在腫瘤、感染等疾病中已有多種藥物進入臨床試驗階段[4]。在神經系統疾病領域，近年來大量基礎研究提示其可有效應用于中樞神經系統(Central nervous system,CNS)腫瘤、感染以及退行性疾病的診治。傳統上為提高AEDs的療效，主要是通過提高AEDs的血藥濃度進而提高藥物在腦內的蓄積。然而，網狀內皮系統(Reticuloendothelial system,RES)的吞噬作用以及系統給藥對患者其它器官系統產生的毒副作用限制了該策略的實施[1]。此外，相當一部分癲癇患者其癲癇發作類型為部分性發作，在腦內局灶部位存在解剖上或功能上的異常，而無選擇性的系統性給藥則會增加藥物對正常腦區功能的不良影響。癲癇多藥耐藥的多藥轉運體假說則認為，癲癇病灶局部血腦屏障(Blood-brain barrier,BBB)上以P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)為代表的外泵蛋白出現過度表達，而這將進一步減少藥物進入致癇灶局部[5]。為解決上述問題，采用靶向納米技術提高遞送AEDs至病灶局部的效率，有望提高 AEDs的療效。同時靶向納米分子構建的顯影劑或對比劑也有助增加致癇灶的發現率，為癲癇的外科治療提供更準確的術前定位。
本文首先綜述了目前廣泛研究的腦靶向納米載體，包括脂質體、脂質納米粒、聚合物納米粒、聚合物膠束、樹枝狀高分子材料以及磁性納米粒等，同時扼要闡述了納米粒腦靶向轉運可能的途徑和機制，最后介紹并展望這些納米載體在癲癇診斷和治療中的應用。
1 納米載體
1.1 脂質納米材料
1.1.1 脂質體
脂質體(Liposomes)是第一代新型藥物載體，具有生物相容性好、無毒以及可生物降解等特點，一經發現即受到了廣泛的關注。傳統的脂質體是由磷脂分子形成的類似細胞膜的磷脂雙分子層結構，粒徑在50~1 000 nm，可作為疏水性、親水性以及兩親性藥物的載體[6]。脂質體具有很高的親脂性，能夠通過多種途徑(如被動擴散、內吞作用等)將其包載的內容物轉運至腦實質[7]。Postmes等應用此類脂質體包載促甲狀腺素釋放激素(Thyrotropin-releasing hormone，TRH)進行實驗后發現，與游離TRH組相比，靜脈注射TRH脂質體3 h后大鼠腦內的TRH含量增高了2~4倍[8]。在傳統的脂質體表面修飾惰性的聚合物材料如聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)等，可以形成空間穩定脂質體(Sterically stabilized liposomes,SSL)，有助于阻止傳統脂質體本身的調理作用，從而避免其被肝和脾等組織的網狀內皮系統的吞噬。研究表明，修飾后可將載藥脂質體的半衰期從數分鐘提高到數十小時[9]，同時由于PEG等表面活性劑可以與血液中的載脂蛋白E結合，后者可與BBB上高表達的低密度脂蛋白(Low density lipoprotein，LDL)受體特異結合而發揮腦靶向作用[10]。
為了進一步提高脂質體的靶向性，近年來大量研究在前期工作的基礎上采取了一系列修飾來改善該遞送系統。①陽離子脂質體：Migliore等應用陽性脂質體制備給藥系統遞送卵白蛋白[11]。鼻內給予不同劑型的Alexa 488熒光素標志的卵白蛋白(50 μg/只)，結果顯示，在給藥后6 h，脂質體包載的模型蛋白和直接溶解在磷酸緩沖液(Phosphate buffered solution，PBS)均可在腦內紋狀體和黑質等區域出現密集熒光分布； 但在給藥后24 h，只有脂質體包載的熒光標記卵白蛋白在大鼠腦內仍有很強的熒光分布，而溶解于PBS的則只能見到少量稀疏的熒光分布。用111In標記模型蛋白后后應用γ計數進行定量實驗，結果顯示在給藥后1 h兩組腦內蛋白均達到最大量，且兩組沒有明顯統計學差異；但在4、6和24 h，脂質體組的入胞量是PBS組的1.5~4.0倍，以上結果提示陽離子脂質體可以作為一種無創的腦靶向給藥系統。 有研究在實驗性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)模型上比較了陰離子脂質體、陽離子脂質體以及普通脂質體對脊髓的特異性結合，結果發現正常大鼠尾靜脈注射三種脂質體，均未在動物脊髓血管內出現聚集；而在EAE大鼠臨床癥狀出現之前，陽離子脂質體即可在EAE大鼠的脊髓神經內膜血管上聚集，并且其聚集程度隨著病變加重而增強。普通脂質體和陰離子脂質體在正常及EAE 大鼠脊髓內均未出現聚集。這提示陽離子脂質體可以不依賴局部BBB的通透性，將藥物靶向輸送至病灶，可能成為一些CNS疾病診斷和治療的有效工具[12]。陽離子靶向入胞的機制目前尚未研究清楚，但目前傾向于認為是由于吸附介導的細胞內吞作用[13]，即帶正電荷的脂質體可以與表面帶負電荷的腦血管內皮細胞相互吸引從而促進粒子吸附。②免疫脂質體：該類脂質體通常是以血腦屏障上高表達的諸如轉鐵蛋白受體(Transferrin receptor,TfR)等受體蛋白作為靶分子，設計單克隆抗體或者具有和生理性配體類似功能的類似物，再將這些小分子接到PEG修飾的脂質體上，從而實現藥物載體的靶向遞送。Huwyler等采用TfR的單克隆抗體OX26修飾脂質體，包載經典的P-gp底物地高辛，在RBE4腦微血管內皮細胞(Brain capillary endothelial cells，BCECs)系上進行實驗后發現，免疫脂質體可以使得地高辛的入胞量提高25倍，這種增高能夠被OX26抗體和諾考達唑(胞吞抑制劑)抑制，卻不能被P-gp的抑制劑所抑制，提示該抗體修飾的免疫脂質體可以通過受體介導的內吞作用而繞過BBB表面的P-gp蛋白，因此可以作為一種潛在的腦靶向遞送系統[14]。Zhao等在隨后的研究中應用該靶向頭基修飾的脂質體包載編碼β-半乳糖苷酶的LacZ 基因質粒，結果發現可以明顯促進基因的腦內遞送；若再加上腦特異性的神經膠質原纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein，GFAP)的啟動子，則可以使得β-半乳糖苷酶的表達更加局限于腦組織而在其他器官中明顯減少[15]。應用可結合小鼠TfR的單克隆抗體8D3mAb構建的基因遞送脂質體系統發現了類似的腦靶向效果[16]。Soni等直接利用轉鐵蛋白(Transferrin，Tf)修飾脂質體，發現其可使得5-氟尿嘧啶的腦內攝取增加17倍，遠高于普通脂質體的10倍[17]。還有針對BCECs上高表達的B緩激肽受體的緩激肽類似物RMP-7構建的免疫脂質體[18]。免疫脂質體的腦靶向作用通常依賴于具有免疫反應性的靶向頭基與BBB上相應受體的特異性結合，后者常可觸發受體介導的跨胞轉運(Receptor-mediated transcytosis，RMT)。RMT是一種依賴細胞內膜囊泡轉運來實現藥物或其他分子跨膜運動的方式[19]。
1.1.2 脂質納米粒
脂質納米粒(Lipid nanoparticles)主要包括固體脂質納米粒(Solid lipid nanoparticles，SLNs)和納米結構脂質載體(Nanostructured lipid carriers,NLCs)組成。SLNs是20世紀90年代初發展起來的新一代脂質類給藥系統，以天然或合成的固體類脂如卵磷脂、三酰甘油、脂肪酸等為基質，將藥物包裹或夾嵌于類脂核中制成的固體膠粒給藥系統。該納米粒以毒性低、生物相容性好、可生物降解的材料作為載體，具有生物相容性好、可生物降解、載藥能力強、理化性質較穩定、對靶器官有特異趨向性、成本低等優點，一經發現即受到了廣泛的關注。SLNs的粒徑大多在10~200 nm之間，因此有助于其逃避RES的吞噬，并且能夠通過緊密聯系的BBB內皮細胞[13]。Manjunath等構建了載尼群地平的SLNs，結果發現其血藥濃度-時間曲線下面積(Area under the curve,AUC)增大了3~5倍，而清除減緩了4.5倍左右，組織分布結果顯示SLNs在腦內的蓄積量提高了3~7倍[20]。 Bondi等采用水包油技術包載利魯唑構建SLNs，體內實驗顯示SLNs能夠增加藥物入腦的量(1.5倍)，而在心、肝、脾、肺、腎等其他器官內的含量則減少[21]。Dhawan等則構建了以山崳酸甘油酯作為脂質層、吐溫-80作為表面活性劑的載槲皮素納米給藥系統，研究顯示該載藥系統能夠明顯延緩氯化鋁所誘導的阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)模型大鼠腦內谷胱甘肽的下降水平以及丙二醛和亞硝酸鹽的增高水平，行為學實驗也證實SLNs組AD大鼠的記憶保留時間較普通藥物組明顯延長[22]。這些結果都提示SLNs本身即可作為一種腦靶向遞藥系統。
NLCs是為了進一步提高SLCs載藥量、穩定性和緩釋效果而發明的一種改良的脂質載體[23]。NLCs以一定比例的液態油或其他不同的脂質和固體脂質為混合類脂質代替了SLNs中的固體脂質基質，從而能夠在提高載藥量的同時仍然保留SLCs的控釋效果。Kasongo等用聚乙二醇硬脂酸酯15(Solutol? HS 15)作為表面活性劑構建的NLCs可以吸附apoE蛋白，還能夠抑制P-gp的活性，因此推測其具有潛在的腦靶向能力[24]。使用該載體包載度洛西汀構建鼻腔給藥系統，結果發現其入腦能力是普通藥物組的2.5倍[25]。與普通脂質體類似，NLCs的表面還可修飾功能性小分子以提高腦靶向能力。有研究嘗試在NLCs表面接上具有腦靶向作用的F(ab’)片段和OX26單抗，結果發現在正常大鼠靜脈給藥后，修飾后的納米載體入腦量均高于未修飾的藥物載體。靜脈給藥24 h后F(ab’)和OX26修飾的NLCs的入腦量分別是未修飾的NLCs的1.5倍和2倍[26]。
1.2 聚合物納米材料
1.2.1 聚合物納米粒
聚合物納米粒(Polymeric nanoparticles)是一類由聚合物材料所制備的固態膠體粒子，可以將需要遞送的藥物溶解、包載、化學結合或者吸附在粒子上而構建成遞藥系統，其粒徑通常在100~200 nm之間。與脂質納米材料相比，聚合物納米粒在血循環中的狀態更穩定而且具有更強的對抗消化酶代謝的能力，可能是由于此類納米粒與血液成分的相互作用較少[13]。可以用于制備納米粒的聚合物材料有聚烷基氰基丙烯酸酯、聚甲基異丁烯酸、聚D，L-丙交酯-乙交酯以及聚乳酸等。多項研究均提示聚合物納米粒可以增強藥物的入腦能力[27]。Alyaudtin等用熒光素異硫氰酸鹽標志不同包被的聚氰基丙烯酸丁酯(Poly-butyl-cyanoacrylate，PBCA)納米粒子，觀察其被永生化的腦血管內皮細胞系RBE4攝取的情況[28]。實驗結果顯示只有表面包被了吐溫80的納米粒才能被細胞攝取，提示聚合物納米粒的入腦能力與其表面包被的表面活性劑密切相關。這一點在后續的研究中得到了證實。用表面包被吐溫80的PBCA納米粒包載由6個氨基酸殘基組成的腦啡肽類似物達拉根，靜脈注射后行熱板實驗以及甩尾實驗，均顯示出顯著的鎮痛效果[29]。在納米粒表面包被吐溫20、40以及60時，納米給藥系統仍然能夠發揮鎮痛效果；而當納米粒表面包被泊洛沙姆184、188、338、407、Cremophore?EL、Cremophore?RH以及Brij?75時，藥物則無法起到鎮痛作用[30]。進一步的研究提示吐溫80等表面活性劑包被的聚合物納米粒穿過BBB主要是通過與BCECs的相互作用實現的[31, 32]。包括吐溫80在內的表面活性劑主要通過與血液中的蛋白結合(主要是載脂蛋白B和載脂蛋白E)，而這些蛋白能夠識別BCECs上的相應受體(脂蛋白受體)從而實現受體介導的內吞以及跨膜轉運。
除了表面活性劑，還可以通過其他物質進行表面修飾以實現納米粒的腦內遞送。Calvo等制備了PEG修飾的聚十六烷基氰丙烯酸酯納米粒(PEG-PHDCA)，比較其與未修飾PHDCA、吐溫80包被的PHDCA以及泊洛沙姆98包被的PHDCA納米粒進入小鼠和大鼠大腦的能力[33]。結果顯示，PEG-PHDCA的入腦能力不僅強于未修飾的納米粒，而且還強于吐溫80包被的納米粒，而泊洛沙姆98包被則不能增強納米粒的入腦能力，再次驗證了表面包被分子對聚合物納米粒入腦能力的影響。進一步的研究提示長循環以及與BCECs的相互作用是納米粒促進藥物入腦的主要機制。
除了上述幾種聚合物材料，還有研究采用天然的多糖(葡聚糖、淀粉和殼聚糖)以及蛋白(如白蛋白和明膠)制備此類納米粒。Agyare等構建了以殼聚糖為聚合物核心的智能納米系統，并在其表面修飾抗淀粉樣蛋白抗體的F(ab’)段分子，體內外評估顯示其可明顯增強藥物載體穿透BBB并定位到淀粉樣斑塊的能力[34]。
1.2.2 聚合物膠束
聚合物膠束(Polymeric micelles)是兩親性嵌段共聚物在水溶液里形成的穩定的核-殼結構。其內核是由疏水性的聚合物嵌段(例如聚氧丙烯、聚D，L-乳酸、聚己內酯以及疏水性的飽和脂肪鏈等)組成，而外殼則是由親水性的聚合物嵌段(如聚乙二醇、聚氧乙烯等)組成。當嵌段共聚物在水溶液中的濃度達到了臨界膠束濃度，便會發生自組裝而形成聚合物膠束。聚合物膠束的材料大多安全性高，具有良好的生物可降解性以及生物相容性。此外，聚合物膠束的粒徑通常在10～100 nm之間。小粒徑(<100 nm)是納米粒有效入腦的先決條件[35]。推測原因可能是小粒徑的粒子在體內可有效避開RES的吞噬，從而延長粒子在體內的循環時間而為有效到達包括腦在內的靶器官提供了必要條件。普朗尼克(Pluronic)聚合物材料是常用的一種聚合物膠束的制備材料。其單體嵌段共聚物是由兩端親水的聚氧乙烯(PEO)鏈以及中間疏水的聚氧丙烯(PPO)嵌段組成的三嵌段共聚物。Pluronic形成的聚合物膠束能夠在體外穿過腦微血管內皮細胞膜，并且具有抑制P-糖蛋白等外泵蛋白對藥物的外排作用[36, 37]。因此采用Pluronic制備的聚合物膠束包載疏水性的P-糖蛋白底物的藥物，可以增加藥物向腦內的積累量。Liu等采用Pluronic P123包載疏水性的AEDs拉莫三嗪(Lamotrigine,LTG)，發現制備出來的載藥納米系統粒徑約為20 nm，并且具有緩釋效果[38]。大鼠體內實驗顯示聚合物膠束包載藥物后可使得藥物的入腦量增加約2倍。采用同一載體包載P-糖蛋白的經典熒光底物羅丹明123對聚合物膠束的入腦機制進行了初步探討，發現游離的羅丹明在腦內幾乎沒有分布，而膠束組在腦組織的紋狀體、海馬、皮層以及黑質等各個區域均有分布，說明將藥物包載進入聚合物膠束中可減少P-糖蛋白對藥物的外排；而提前給予P-gp抑制劑維拉帕米卻不能進一步增加載藥膠束的入腦量，該現象則進一步提示載藥膠束可能是通過抑制BBB上以P-gp為主的多種外泵蛋白的作用而發揮效果的。
聚乙二醇化的磷脂材料(DSPE-PEG)是近年來研究較多的另外一種聚合物膠束材料[39]。Shao等采用DSPE-PEG作為載體材料包載疏水性的抗生素兩性霉素B，得到粒徑約20 nm的載藥納米遞送系統[40]。在體外與體內評價了該納米給藥體系的入腦效率。結果表明，該給藥系統可顯著增加兩性霉素B在小鼠腦微血管內皮細胞的攝取量，并能顯著降低兩性霉素B對正常細胞的毒性；體內實驗顯示載藥膠束可促進兩性霉素B聚合物膠束跨過BBB向腦內積累，在膠束表面修飾靶向性的小分子多肽可以進一步增加藥物的入腦量。在后繼的研究中該課題組在CNS真菌感染的動物模型中證實了該納米給藥體系能夠明顯提高兩性霉素B的療效[41]，其主要機制可能是納米給藥系統可以繞過BBB上P-gp的識別及外泵作用。
1.2.3 樹枝狀高分子材料
樹枝狀高分子材料(Dendrimers)是一類具有特定空間結構的、由聚合物分子高度接枝而成的球狀納米高分子材料。該材料由一個內核、自內核發出的分子支鏈以及含有多個相同功能基團的外層構成，粒徑大小與聚合物膠束相仿。藥物或基因分子可以通過疏水作用進入樹枝狀高分子材料的內腔，或者通過與外層功能基團的直接結合而形成遞藥系統[13]。研究發現以樹枝狀高分子材料為基礎構建的納米給藥系統具有腦靶向作用。Dhanikuls等合成了一種聚醚-聚酯(polyether-copolyester，PEPE)樹枝狀高分子材料，并用羅丹明B標記以考察該材料透過BBB的能力和機制[42]。研究顯示當納米粒濃度達到一定程度后，bEnd.3細胞對該納米粒的攝取不能繼續增加，也即具有飽和性。應用網格蛋白和小窩蛋白抑制劑均能部分抑制細胞的攝取作用，提示這兩種蛋白介導的內吞作用在bEnd.3細胞攝取納米粒中均發揮作用。研究還應用共培養bEnd．3細胞和U373 MG細胞作為體外BBB模型以考察不同結構的PEPE跨越BBB的能力。結果發現在24 h內，Den-2-(G2)-400的穿透能力是Den-1-(G2)-400的2倍左右，提示PEPE的空間結構也對此種納米粒跨BBB的能力有重要影響。Dhanikula等進一步構建了葡糖胺修飾的PEPE用來遞送甲氨蝶呤，結果發現葡糖胺不僅可以作為有效的膠質瘤靶向配體，也可以促進納米粒透過BBB。在以共培養的bEnd.3細胞和U373 MG細胞構建的體外BBB模型上的研究發現，糖基化的PEPE促進MTX跨過BBB的量是非糖基化PEPE組的3～5倍[43]。
基因治療作為一個概念已經提出多年，但由于諸多原因長期不能應用于臨床，其中基因的遞送方式即為一個重要因素。傳統的病毒遞送由于潛在的安全性問題難以解決，近年來越來越多的研究開始轉向非病毒載體來遞送具有治療作用的基因。樹枝狀高分子材料聚氨胺(Polyamidoamine，PAMAM)和聚賴氨酸樹枝分子(Dendrigraft poly-L-lysine，DGL)是這類載體的典型代表。Huang等構建了觸角肽(Antennapedia peptide，Antp)修飾的PAMAM用來遞送pEGFP-N2質粒，分別在孵育20 min及3 h后檢測BCECs中基因的轉染和表達情況，結果發現，PAMAM可以促進內皮細胞對基因的攝取，在材料分子表面進行適當的修飾后效率更高[44]。將PAMAM表面修飾Tf也有類似的促進基因入腦的作用[45]。后續的研究發現乳鐵蛋白(Lactoferrin，Lf)修飾的PAMAM具有更強的促進基因入腦效果，是Tf修飾載體的2.3倍左右[46]。預先連續靜脈注射包載人膠質細胞系來源的神經營養因子基因(human Glial cell line-derived neurotrophic factor gene，hGDNF)的Lf-PAMAM載體，可以明顯改善6-羥基多巴胺所誘導的帕金森大鼠的肢體活動能力，減少多巴胺能神經元的丟失并提高單胺神經遞質的水平[47]。
相比與PAMAM，DGL因其可以更加高效的遞送基因且對正常細胞的毒性較小而在近年受到廣泛關注[48]。Li等的研究顯示DGL也可作為基因的載體用來遞送入腦，在其表面修飾上膽堿衍生物其入腦能力可以進一步提高[49]。在魚藤酮誘導大鼠帕金森的過程中，給予多次注射DGL包載的hGDNF，行為學實驗顯示可有效改善帕金森動物模型的肢體活動能力，免疫組織化學顯示此類基因載體能夠挽救多巴胺能神經元[50]。在表面修飾低密度脂蛋白受體相關蛋白(Low-density lipoprotein receptor-related protein，LRP)的配體Angiopep后其跨BBB的能力明顯增強，對模型大鼠的保護作用也有所增強。還有研究應用該高分子材料同時包載具有協同抗腫瘤效應的化學藥物和基因構建納米載體——阿霉素和腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(Tumornecrosis factor related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)，均具有顯著的抗腫瘤效應，且兩者的作用具有協同效應。Liu等應用DGL構建了能夠同時包載阿霉素(Doxorubicin，DOX)和表達TRAIL基因的質粒(pORF-hTRAIL)，并在載體表面修飾了能與TfR特異性結合的多肽T7 (HAIYPRH)[51]，在腦膠質瘤模型小鼠上進行的體內實驗顯示出了明顯的跨越BBB能力和抗腫瘤效應。
1.3 新型納米載藥系統
1.3.1 磁性納米粒
磁性納米粒(Magnetic nanoparticles,MNP)是一類具有磁性的氧化鐵納米粒以及其他金屬納米粒所組成的特殊粒子[52]。此種納米粒子一般以帶磁性的氧化鐵(Fe3O4或γFe2O3)或鈷、鎳等金屬為核心，外殼包被聚合物或脂質體以減少粒子被RES識別和吞噬。研究發現此類納米粒子在腦部疾病的診斷和靶向治療中具有巨大的潛在應用空間[53]。大量研究發現，磁性納米粒可以作為新型的核磁共振對比劑而應用于疾病診斷。磁性納米粒可以在縱軸和橫軸上縮短周圍質子的弛豫時間，在T2加權像上更明顯而使得增強部位因負性增強效應(Negative enhancement effect,NCE)而呈現比正常組織更低的信號強度[54]。研究顯示與傳統的釓螯合對比劑相比，長循環的超順磁Fe3O4納米粒(Superparamagnetic iron oxide，SPIO)可以更加清晰顯示腦部腫瘤與其周圍正常組織的邊界[55]。為了提高MNP的主動靶向能力，有研究在其表面修飾上蛋白、多肽或其他小分子物質可以提高對特定疾病的示蹤能力。氯毒素(Chlorotoxin，CTX)是提純自以色列金蝎毒液的一種多肽，研究發現此多肽可以特異性地與神經外胚層來源的腫瘤細胞進行結合[56]。利用這一特性，有研究將該多肽與多功能的磁性納米粒(PEG聚合物包被的Fe3O4)結合，結果發現此對比劑可靶向至神經膠質瘤細胞[57]。
除了成像，MNP還可用于藥物的靶向遞送，即所謂的磁性藥物靶向[58]。磁性藥物靶向載體(Magnetic targeted carrier,MTC)是由MNP和所要遞送的藥物通過共價或非共價的方式結合而成。由于粒子本身所帶的磁性，因此可以通過在病變部位施加外界磁場的方法來提高MTC的靶向能力。Kirthivasan等利用構建由聚(DL-丙交酯-co-乙醇酸交酯)和PEG-PLA包被的MTC，用后者遞送P-gp經典底物羅丹明123。結果顯示，與正常對照相比，MTC可以使得羅丹明123的入腦量增加1.6倍，而在靜脈給藥的同時在大鼠頭部額外加一個0.8 T的磁鐵則可使得藥物入腦的能力增高到原來的13.4倍[59]。由于MTC所含的磁性成分(如Fe3O4)和藥物成分相對固定，還可通過核磁共振成像來示蹤藥物進入靶點部位的量[60]。與傳統的納米粒類似，MTC也可以在其表面再修飾上具有靶向功能的多肽等小分子基團，從而形成多功能MTC。單核細胞和中性粒細胞表面表達整合素受體，可選擇性地與精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸(Arginine-glycine-aspartic acid，RGD)三肽結合。有研究發現采用RGD修飾的磁性脂質體(脂質體包被的Fe3O4)可選擇性地被血液循環中的單核細胞/中性粒細胞攝取，從而避免被肝等組織的巨噬細胞吞噬，在外部炎癥區域或病灶部位加入磁場，由于被細胞攝入的脂質體帶有磁性，可以使得攝取了磁性脂質體的細胞在磁場的作用下聚集到靶部位，利用這一特性可以用于腦靶向藥物遞送[61]。研究比較不同載體遞送雙氯芬酸入腦的能力。結果發現，無磁性的脂質體組不能使雙氯芬酸入腦增加，而修飾RGD后藥物的入腦能力是普通藥物的1.5倍左右；應用磁性脂質體可以使得大腦內藥物的含量增高到普通藥物5.95倍；在磁性納米脂質體的基礎上再修飾RGD則可進一步增加載體的腦內遞送能力至普通藥物的9.1倍。該研究提示多功能的MTC能夠通過協同作用而明顯增強給藥系統靶向能力。
1.3.2 生物仿生遞藥系統
盡管近年來在人工合成藥物載體上取得了很大的進展，但一些天然具有載體功能的粒子由于其所特有的一些性質使得它們能夠成為某些特定疾病的合適載體。研究發現某些病原體(細菌和病毒)以及一些哺乳動物的細胞均可用來作為藥物載體遞送藥物，稱之為生物仿生遞藥系統(Biomimetic drug delivery carriers)[62]。紅細胞(RBCs)是其中的一個典型代表。作為人體內最重要的一類血細胞，RBCs可以攜帶氧供應全身各器官。近年來多項研究發現，RBCs能夠用來構建藥物載體從而實現藥物的靶向遞送[63-65]。RBCs擁有一些一般納米藥物載體難以比擬的優點：極好的生物相容性、超長的體內半衰期(~120 d)、載體本身未攜帶任何基因組以及細胞表面積大(~140 μm2)等。Murciano等利用抗生蛋白鏈菌素將纖溶藥物組織型纖溶酶原激活物(tissue-type Plasminogen activator，tPA)和生物素化得RBCs共價結合形成給藥體系[65]。體內實驗研究發現靜脈給予RBC-tPA后大鼠血液內的纖溶活性的維持時間是給予游離tPA后的10倍。在小鼠肺栓塞和頸動脈血栓所致的腦缺血模型中的實驗發現，游離tPA可以裂溶掉肺靜脈內已有的血栓卻不能預防血栓再生，對頸動脈血栓則均無作用；RBC-tPA對已形成的靜脈血栓無效但能有效預防新生血栓的形成，此效應在大動脈上也存在。然而這種直接對RBCs進行修飾的方法會干擾紅細胞膜的完整性而降低載藥系統的體內半衰期。為了解決這個問題，新近的一項研究利用轉基因技術在RBCs前體細胞核內插入一段能表達修飾型Kell蛋白或血型糖蛋白A(Glycophorin A，GPA)的基因。當RBCs逐漸成熟并排出細胞核，這種蛋白仍留在細胞表面。在轉肽酶A的催化下，Kell蛋白和GPA蛋白可以在不損傷RBCs膜完整性的情況下與生物素分子結合，體內實驗此種方法制備的RBCs在體內可存活達28 d。他們還在GPA蛋白上附著了一種可以特異識別小鼠MHC-II類分子的單抗VHH 7，發現其可高效識別表面高表達MHC-II類分子的B淋巴細胞[63]。然而由于RBCs只在血管內循環，因此限制了其在其他疾病的應用，近年來已經有一些研究開始嘗試使用仿真RBC膜或仿RBC的聚合物粒子來遞送藥物[66, 67]。
2 納米技術在癲癇診斷中的應用
目前癲癇的診斷主要依賴于臨床表現和腦電圖檢查結果，而癲癇病因的診斷則更多的依賴于基因、影像學以及病理學的檢查。初步的研究發現納米技術也可用于癲癇病灶的診斷。Akhtari等應用經修飾的具有磁性的Fe2O3納米粒來定位急性和慢性顳葉癲癇的致癇灶[68]。研究中將磁性納米粒(Magnetonanoparticles,MNP)的末端修飾了既往研究證實的極具臨床應用潛力的靶向頭基α-甲基色氨酸(α-Methyl-tryptophan,AMT)[69, 70]。結果顯示，AMT修飾的MNP可特異的聚集在海人酸顳葉癲癇模型急性期和慢性期的腦內，應用核磁磁共振成像進行掃描發現其在T2加權像下呈低信號，即所謂的“負性增強”效應。顱內電極檢查結果證實AMT-MNP聚集部位即為癲癇發作的起源灶，這提示了MNP可以透過BBB并在癲癇病灶聚集，這可能是由于癲癇病灶局部的異常的色氨酸代謝所致[71]。在后續的研究中，該課題組又用2-脫氧葡萄糖(2-Deoxy glucose，2-DG)修飾MNP，結果顯示靶向基團修飾的MNP在腦內的聚集程度與特定區域神經元的活動狀態密切相關[72]。利用這一特點示蹤急性和慢性癲癇模型的致癇灶，發現MNP示蹤的部位與顱內腦電記錄所提示的癲癇起源灶高度吻合，提示該2-DG-MNP可以作為潛在的對比劑示蹤致癇灶。
3 納米技術在癲癇治療中的應用
由于BBB本身的結構特點以及BCECs上外泵蛋白的存在，一些具有抗癲癇效應的藥物的入腦能力受到極大的限制[73-75]，而納米遞藥系統能夠促進此類藥物入腦。Loeb等用脂質體包載抑制性神經遞質γ-氨基丁酸(γ-Amino butyric acid，GABA)來構建納米遞藥系統，通過腹腔注射給盤尼西林誘導的癲癇大鼠模型體內，能夠降低或避免癲癇發作，而對于游離的GABA給藥組，SD大鼠的癲癇行為沒有明顯改善。在另外一項研究中，作者構建了一個包被吐溫80的PBCA納米粒來遞送非競爭性的N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受體拮抗劑MRZ 2/576。該藥具有很強的抗驚厥效果，但由于腦內一種丙磺舒依賴的轉運作用，其抗癲癇維持時間極短(5~15 min)。在最大電驚厥模型上研究發現，應用納米粒遞送MRZ 2/516之后，抗驚厥效果可維持210 min，遠高于預先給予丙磺舒組的150 min，而且在給予丙磺舒預處理后給予納米載藥系統，抗癲癇維持時間還可進一步延長至270 min[76]。 這提示納米給藥系統不僅能夠促進那些難以入腦的物質有效通過BBB，而且還能夠通過控釋釋放等方式延長入腦藥物在病變局部的作用時間。
促甲狀腺激素釋放激素(Thyrotropin-releasing hormone，TRH)是一種具有抗癲癇作用的內源性神經肽[77, 78]。然而由于該激素容易被組織代謝且又難以透過BBB，因而難以推廣應用。近年來有研究應用聚交酯納米粒包載該激素構建載藥系統，體外實驗發現該納米粒能夠減輕谷氨酸所致的神經元毒性作用[79]。進一步在體外電點燃顳葉癲癇模型上考察療效[80]，結果顯示在電點燃開始前及過程中同時鼻腔給予載TRH納米粒的大鼠，其后發放持續時間(After discharge duration，ADD)明顯縮短，且達到V級癲癇發作以及完全點燃所需的電刺激次數也延長至對照組的1.5~2.0倍。
目前臨床上正在使用的AEDs都已經經過了合適的修飾以使得其能夠通過BBB。但大量研究發現，雖然這些藥物(大多是脂溶性的小分子)可以通過跨膜轉運等進入腦內，但由于它們中有許多是BBB上P-gp等外泵蛋白的底物，因此能從腦內被泵回血液中[81-84]。癲癇耐藥的“多藥轉運體假說”即認為是由于癲癇病灶局部以P-gp為主的多藥轉運體的表達和功能水平增高，從而導致了AEDs在人體能耐受的血藥濃度內難以達到有效的組織藥物濃度，從而使患者表現出對多種不同機制的AEDs耐藥[5]。LTG是臨床上常用的一種抗癲癇藥物，可以應用于多種癲癇發作類型，但其對難治性癲癇的療效仍然非常局限，部分可能是由于它也是P-gp的底物[81, 83]。Liu等應用聚合物膠束普朗尼克類材料P123包載LTG構建了粒徑約為20 nm的注射用納米載藥系統，體內實驗顯示此類載體可以促進P-gp底物類AEDs的入腦，其效應和預先予以P-gp抑制劑的效果類似[38]。Alam等應用NLCs構建了包載該藥的鼻腔納米遞藥系統，結果也發現該系統具有類似的控釋作用，并且能夠促進藥物入腦[85]。
4 展望
納米技術在近十余年來的發展可謂日新月異，在CNS疾病的診斷和治療中也已經取得了許多喜人的成就[13, 86]。然而，其在癲癇的診斷和治療方面的應用卻仍然很少[75]，至今尚未有進入臨床研究階段的藥物。在未來的研究中，我們認為在以下領域納米技術很可能還大有所為。第一、繼續尋找合適的納米材料，優化制備載AEDs納米遞藥系統的方法，最好是能夠同時將多種不同作用機制的AEDs包在同一個納米給藥系統內，從而方便給藥并提高藥物的協同作用。第二、選擇有生物反應調節能力的納米載體包載AEDs，比如選擇具有抑制P-gp功能的普朗尼克類材料、維生素E衍生物或殼聚糖等作為納米載體，可能有助于對抗P-gp增高所致的癲癇多藥耐藥。第三、進一步加強對癲癇發病機制的研究以尋找癲癇特異的靶向分子，從而構建新型的可以特異性靶向至致癇灶的納米對比劑或給藥系統。在我們課題組的初步研究中發現，利用癲癇局灶對色氨酸攝取明顯增高，可以構建以色氨酸衍生物為靶向頭基的納米給藥系統，結果顯示新構建的納米遞藥系統能夠有效靶向至癲癇病灶而減少其他正常腦組織內的分布。此外，近些年大量研究提示難治性癲癇病灶局部的P-gp蛋白表達和功能增強[87]，未來或可利用這一點來設計針對P-gp的靶向頭基，從而協助診斷和治療難治性癲癇。第四、構建同時具有診斷和治療功能的納米材料。
近年來已有多項研究顯示納米材料可以同步用于診斷和治療腫瘤等疾病[88]，而在癲癇中尚未有類似應用。在我們的前期研究中發現，利用石墨烯納米復合材料的光熱效應[89]和Fe3O4的磁敏感效應[68]，將兩者結合形成新型納米粒，注入老鼠體內，不僅可以在核磁共振成像下清楚顯示局部病灶，而且在經顱孔給予紅外光照射后，發現能夠實現的致癇灶局部熱切除。