引用本文： 毛戩, 孫洪英, 張舒雅, 孟晨曦. 環狀RNA在癲癇患者外周血單個核細胞中的表達分析及生物信息學預測. 癲癇雜志, 2022, 8(2): 127-132. doi: 10.7507/2096-0247.202112009 復制
版權信息： ?四川大學華西醫院華西期刊社《癲癇雜志》版權所有，未經授權不得轉載、改編
癲癇是最常見的神經系統疾病之一，其特征是腦神經元過度同步放電導致短暫性中樞神經系統功能障礙[1]。癲癇具有很高的發病率和死亡率，據估計全世界有超過 7 000 萬人患有該疾病，其中約1/3為難治性癲癇，低收入和中等收入國家的癲癇患者占癲癇患者總數的80%[2]。癲癇可由遺傳異常或腦卒中、感染等大腦損傷引起[3]。據估計，超過半數的癲癇病例與遺傳因素有關[4]。目前癲癇的發病機制尚不明確，這對癲癇的診斷和治療提出了很大的挑戰，鑒定新的致癲癇標志物已經受到了學者們的廣泛關注。
環狀RNA（circular RNA，circRNA）是一類具有閉環結構的非編碼RNA，曾經被認為是基因表達的垃圾產物，隨著不斷對非編碼RNA的研究表明環狀RNA可以作為微小RNA（micro RNA，miRNA）海綿調節基因表達，吸附蛋白 、調控其它基因轉錄 、干擾其它基因剪接 、翻譯多肽、作為生物學標記物等多種功能[5]，但是對于circRNA在癲癇中發揮怎樣的功能目前仍認識有限。有研究通過運用高通量測序技術在顳葉癲癇患者的海馬組織中發現circ_EFCAB2、C14orf159、PARG、TMEM39B的表達上調[6]。本研究將探究上述4種環狀RNA在癲癇患者外周血單個核細胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC）的相對表達及進行生物信息學對其功能進行預測。
1 資料與方法
1.1 資料來源
選取2020年5月—2021年5月內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院門診及住院癲癇患者22例為試驗組；選取同期健康體檢者22名為對照組。癲癇患者和對照組的年齡保持在18～50歲之間，對性別不做特殊要求。所有癲癇患者均符合國際抗癲癇聯盟 2017年提出的診斷標準[7]。排除因腦外傷、腦腫瘤、腦卒中、感染、免疫等繼發性癲癇因素及明確為遺傳性癲癇患者，均接受了頭部核磁共振成像（Magnetic resonance imaging，MRI）檢查且結果無神經系統異常。所有癲癇患者和健康對照組無消化系統、血液系統、內分泌系統、免疫系統、泌尿生殖系統等疾病。該研究獲得內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院醫學倫理委員會審核批準，且所有參與者均簽署知情同意書。
1.2 主要試劑與儀器
TRIzol試劑；反轉錄試劑盒；實時熒光定量 PCR（ real-time quantitative PCR，qPCR）試劑盒；qPCR 儀等。
1.3 癲癇患者外周血單個核細胞circRNA的檢測
清晨抽取受試者空腹靜脈血5 mL收集在EDTA管，與5 mL生理鹽水混勻，加入淋巴細胞分離液Ficoll 5 mL，水平離心（2 000 r/min，20 min，22 ℃）后吸取中間層PBMC。加PBS清洗PBMC液，混勻，離心（2 000 r/min，10 min）后棄上清液，置于1.5 mL EP管中，加入Trizol試劑1mL混勻，放置于?80 ℃冰箱中備用。Trizol法提取總RNA，使用反轉錄試劑盒反轉錄合成 cDNA，以GAPDH為內參基因，采用qRT-PCR得到CT值，反應條件為：95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環 40 次。采用 2?ΔΔCt法計算各環狀RNA的相對表達量，引物信息見表1。
表1
4種circRNA和內參的引物序列
Table1.
Primer sequence of four circRNAs and reference gene
1.4 生物信息學分析
使用circbank數據庫（http://www.circbank.cn/index.html）、circInteractor數據庫（http://circinteractome.nia.nih.gov）和circ-miR生物信息學軟件系統（http://www.bio-inf.cn）對circRNA進行生物信息學分析，尋找可能結合的下游的miRNA靶點，對結果取交集。使用TargetScan（http://www.targetscan.org/vert_72/）將得到的miRNA與癲癇相關的基因進行預測，得到結果以CWCS（Cumulative weighted context++ score）分數進行排名，得到circRNA作為分子海綿參與的調節癲癇的內源性RNA通路，使用Cytoscape軟件構建網絡圖。
1.5 統計學方法
采用SPSS 25.0統計學軟件對數據進行處理。資料服從正態分布的計量資料用 
±s表示，兩組資料間的比較采用獨立樣本t檢驗，男女比例采用χ2檢驗，以P值<0.05為差異具有統計學意義。
2 結果
2.1 受試者一般資料
癲癇患者及對照組在年齡、性別、體重指數比較無統計學差異， P>0.05。見表2。
表2
癲癇組及對照組一般資料比較
Table2.
Comparison between epilepsy group and control group about general information
2.2 受試者外周血單個核細胞中circRNA的表達
EFCAB2和C14orf159在癲癇組PBMC中的表達顯著高于對照組（P<0.05）。ircRNAPARG、circRNATMEM39B在兩組中均未檢測到。詳見表3、圖1。
表3
癲癇組及對照組PBMC上環狀RNA的相對表達
Table3.
Relative expression about circRNAs in PBMC of epilepsy group and control group
圖1
環狀RNA的相對表達
Figure1.
Relative expression of circRNAs
2.3 生物信息學分析
對結果有陽性意義的兩個circRNA：EFCAB2和C14orf159，分別通過數據庫進行預測，對所得到的結果取交集。EFCAB2得到3個miRNA：miR-6873-3p、miR-6739-3p、miR-7110-3p；C14orf159得到3個miRNA：miR-1180-3p、miR-6501-3p、miR-3622b-5p。將6個miRNA通過TargetScan對癲癇相關的基因進行預測，以CWCS≤ ?0.1為最低要求，按照評分排名：
EFCAB2：miR-6873-3p符合條件的共有11個下游基因；miR-6739-3p符合條件的共有7個下游基因；miR-7110-3p符合條件的共有14個下游基因。C14orf159：miR-6501-3p符合條件的共有9個下游基因；miR-3622b-5p符合條件的共有14個下游基因；miR-1180-3p符合條件的共個1下游基因。見表4、表5。將所得結果構建circRNA-miRNA-mRNA生物信息學網絡圖，見圖2。
表4
EFCAB2下游癲癇基因CWCS評分
Table4.
CWCS of downstram epilepsy gene related to EFCAB2
表5
C14orf159下游癲癇基因CWCS評分
Table5.
CWCS of downstram epilepsy gene related to C14orf159
圖2
預測的生物信息學網絡圖
○代表circRNA，△代表miRNA，□代表下游基因
Figure2. Bioinformatics network diagram based on prodiction○ represent circRNA, △ represent miRNA, □ represent gene of epilepsy
3 討論
癲癇是一種常見的神經系統疾病，發病時神經系統內產生抑制性和興奮性神經傳遞失衡，從而導致神經遞質的差異性傳遞[8]。目前已知的癲癇病理改變常包括：持續的神經變性、突觸可塑性改變、異常血腦屏障通透性增加、表觀遺傳變化和炎癥改變等[9]。治療上，目前抗癲癇藥物主要旨在調節離子通道或神經遞質，最終抑制大腦中的神經元興奮性，但是30%～40% 的癲癇患者在使用藥物后仍出現難治性癲癇發作[10]，這些藥物僅能緩解癥狀，并未解決癲癇的潛在機制 ，因此，研究癲癇的潛在發病機制來抑制癲癇勢在必行，而circRNA有望為解開癲癇的奧秘提供新的可能。
circRNA是一種環形閉合的特殊RNA，因為大多數circRNA不具備翻譯功能，因此把它暫時歸結為非編碼RNA一種。circRNA以及穩定的結構、相對保守及其具備多種的功能備受關注。circRNA在腦組織中相對豐富，尤其神經元突觸內含有更多的circRNA[11]，這提示circRNA在神經元功能中起著重要作用。然而，circRNA在癲癇中的作用仍不清楚，其與癲癇的關系已經展開研究，但相對較少。
circRNA根據其來源分為外含子circRNA、內顯子circRNA以及外含子-內顯子混合的circRNA。一般而言，circRNA發揮的功能與其來源的位置密不可分。外顯子circRNA在細胞質中穩定表達，可以與miRNA或RNA結合蛋白相互作用，甚至包繞具備翻譯起始密碼子的區域，可能在基因表達和翻譯中發揮調節作用[6]。相比之下，內顯子circRNA更多位于細胞核中，受其他因素干擾較小，表達穩定[12]。外顯子-內含子circRNA同時具有外顯子和內含子circRNA特征。本次我們所探究的4個circRNA在信息庫中顯示均為外顯子型circRNA。通過生物信息學數據庫來預測circRNA通過circRNA-miRNA-mRNA軸充當“分子海綿”作用從而調節癲癇相關基因的表達。
經生物信息學分析，C14orf159可能結合的3個的miRNA，其中miR-1180-3p據報道與肝癌、胃癌、肺腺癌、乳腺癌、抑郁癥、皮膚黑素瘤有關。miR-3622b-5p與卵巢癌、胃癌、乳腺癌有關，而miR-6501-3p的作用還沒有被報道。C14orf159的下游靶基因CCL3是一種炎性介質產物，已被多篇文章所報道在癲癇中發揮重要作用。EFCAB2可能結合的3個miRNA，其中miR-6873-3p已被報道在內皮細胞中存在與炎癥、氧化應激和細胞凋亡等作用有關[13]。miR-6739-3p、miR-7110-3p的作用尚未被報道。同時發現miR-6873-3p和miR-7110-3擁有共同的下游靶基因微管相關蛋白（Microtubule associated protein 1B，MAP1B），MAP1B通過調控電壓門控鈉通道，參與癲癇發病[14]。
應用生物信息學預測在發現無注釋RNA的非編碼RNA功能或編碼轉錄本的雙重功能方面得到了廣泛應用，但是需要注意的是-應用生物信息預測時，其用途可能是理解circRNA-miRNA-mRNA的集體網絡，而不是單個轉錄本來影響轉錄后調控[15]。雖然測序技術和各種生物信息學的發展為我們對疾病中的circRNA等非編碼RNA的探究提供了極大的方便，癲癇及各種疾病中網絡正在被科研人員相繼挖掘，但一個研究往往僅對某個circRNA，以及所結合的特定某個miRNA、某個基因進行研究，這樣是單對單的“線”性，而無法將“線”的關系延伸為“網”。本研究運用數據庫，對結果進行了生物信息學網絡構建，意外發現EFCAB2具備同時充當miR-6873-3p和miR-7110-3p的分子海綿，最終對MAP1B的表達進行調控，該結論也與從“網絡化”的角度理解circRNA的功能相互對應。
利益沖突聲明 所有作者無利益沖突。
癲癇是最常見的神經系統疾病之一，其特征是腦神經元過度同步放電導致短暫性中樞神經系統功能障礙[1]。癲癇具有很高的發病率和死亡率，據估計全世界有超過 7 000 萬人患有該疾病，其中約1/3為難治性癲癇，低收入和中等收入國家的癲癇患者占癲癇患者總數的80%[2]。癲癇可由遺傳異常或腦卒中、感染等大腦損傷引起[3]。據估計，超過半數的癲癇病例與遺傳因素有關[4]。目前癲癇的發病機制尚不明確，這對癲癇的診斷和治療提出了很大的挑戰，鑒定新的致癲癇標志物已經受到了學者們的廣泛關注。
環狀RNA（circular RNA，circRNA）是一類具有閉環結構的非編碼RNA，曾經被認為是基因表達的垃圾產物，隨著不斷對非編碼RNA的研究表明環狀RNA可以作為微小RNA（micro RNA，miRNA）海綿調節基因表達，吸附蛋白 、調控其它基因轉錄 、干擾其它基因剪接 、翻譯多肽、作為生物學標記物等多種功能[5]，但是對于circRNA在癲癇中發揮怎樣的功能目前仍認識有限。有研究通過運用高通量測序技術在顳葉癲癇患者的海馬組織中發現circ_EFCAB2、C14orf159、PARG、TMEM39B的表達上調[6]。本研究將探究上述4種環狀RNA在癲癇患者外周血單個核細胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC）的相對表達及進行生物信息學對其功能進行預測。
1 資料與方法
1.1 資料來源
選取2020年5月—2021年5月內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院門診及住院癲癇患者22例為試驗組；選取同期健康體檢者22名為對照組。癲癇患者和對照組的年齡保持在18～50歲之間，對性別不做特殊要求。所有癲癇患者均符合國際抗癲癇聯盟 2017年提出的診斷標準[7]。排除因腦外傷、腦腫瘤、腦卒中、感染、免疫等繼發性癲癇因素及明確為遺傳性癲癇患者，均接受了頭部核磁共振成像（Magnetic resonance imaging，MRI）檢查且結果無神經系統異常。所有癲癇患者和健康對照組無消化系統、血液系統、內分泌系統、免疫系統、泌尿生殖系統等疾病。該研究獲得內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院醫學倫理委員會審核批準，且所有參與者均簽署知情同意書。
1.2 主要試劑與儀器
TRIzol試劑；反轉錄試劑盒；實時熒光定量 PCR（ real-time quantitative PCR，qPCR）試劑盒；qPCR 儀等。
1.3 癲癇患者外周血單個核細胞circRNA的檢測
清晨抽取受試者空腹靜脈血5 mL收集在EDTA管，與5 mL生理鹽水混勻，加入淋巴細胞分離液Ficoll 5 mL，水平離心（2 000 r/min，20 min，22 ℃）后吸取中間層PBMC。加PBS清洗PBMC液，混勻，離心（2 000 r/min，10 min）后棄上清液，置于1.5 mL EP管中，加入Trizol試劑1mL混勻，放置于?80 ℃冰箱中備用。Trizol法提取總RNA，使用反轉錄試劑盒反轉錄合成 cDNA，以GAPDH為內參基因，采用qRT-PCR得到CT值，反應條件為：95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環 40 次。采用 2?ΔΔCt法計算各環狀RNA的相對表達量，引物信息見表1。
表1
4種circRNA和內參的引物序列
Table1.
Primer sequence of four circRNAs and reference gene
1.4 生物信息學分析
使用circbank數據庫（http://www.circbank.cn/index.html）、circInteractor數據庫（http://circinteractome.nia.nih.gov）和circ-miR生物信息學軟件系統（http://www.bio-inf.cn）對circRNA進行生物信息學分析，尋找可能結合的下游的miRNA靶點，對結果取交集。使用TargetScan（http://www.targetscan.org/vert_72/）將得到的miRNA與癲癇相關的基因進行預測，得到結果以CWCS（Cumulative weighted context++ score）分數進行排名，得到circRNA作為分子海綿參與的調節癲癇的內源性RNA通路，使用Cytoscape軟件構建網絡圖。
1.5 統計學方法
采用SPSS 25.0統計學軟件對數據進行處理。資料服從正態分布的計量資料用 ±s表示，兩組資料間的比較采用獨立樣本t檢驗，男女比例采用χ2檢驗，以P值<0.05為差異具有統計學意義。
2 結果
2.1 受試者一般資料
癲癇患者及對照組在年齡、性別、體重指數比較無統計學差異， P>0.05。見表2。
表2
癲癇組及對照組一般資料比較
Table2.
Comparison between epilepsy group and control group about general information
2.2 受試者外周血單個核細胞中circRNA的表達
EFCAB2和C14orf159在癲癇組PBMC中的表達顯著高于對照組（P<0.05）。ircRNAPARG、circRNATMEM39B在兩組中均未檢測到。詳見表3、圖1。
表3
癲癇組及對照組PBMC上環狀RNA的相對表達
Table3.
Relative expression about circRNAs in PBMC of epilepsy group and control group
圖1
環狀RNA的相對表達
Figure1.
Relative expression of circRNAs
2.3 生物信息學分析
對結果有陽性意義的兩個circRNA：EFCAB2和C14orf159，分別通過數據庫進行預測，對所得到的結果取交集。EFCAB2得到3個miRNA：miR-6873-3p、miR-6739-3p、miR-7110-3p；C14orf159得到3個miRNA：miR-1180-3p、miR-6501-3p、miR-3622b-5p。將6個miRNA通過TargetScan對癲癇相關的基因進行預測，以CWCS≤ ?0.1為最低要求，按照評分排名：
EFCAB2：miR-6873-3p符合條件的共有11個下游基因；miR-6739-3p符合條件的共有7個下游基因；miR-7110-3p符合條件的共有14個下游基因。C14orf159：miR-6501-3p符合條件的共有9個下游基因；miR-3622b-5p符合條件的共有14個下游基因；miR-1180-3p符合條件的共個1下游基因。見表4、表5。將所得結果構建circRNA-miRNA-mRNA生物信息學網絡圖，見圖2。
表4
EFCAB2下游癲癇基因CWCS評分
Table4.
CWCS of downstram epilepsy gene related to EFCAB2
表5
C14orf159下游癲癇基因CWCS評分
Table5.
CWCS of downstram epilepsy gene related to C14orf159
圖2
預測的生物信息學網絡圖
○代表circRNA，△代表miRNA，□代表下游基因
Figure2. Bioinformatics network diagram based on prodiction○ represent circRNA, △ represent miRNA, □ represent gene of epilepsy
3 討論
癲癇是一種常見的神經系統疾病，發病時神經系統內產生抑制性和興奮性神經傳遞失衡，從而導致神經遞質的差異性傳遞[8]。目前已知的癲癇病理改變常包括：持續的神經變性、突觸可塑性改變、異常血腦屏障通透性增加、表觀遺傳變化和炎癥改變等[9]。治療上，目前抗癲癇藥物主要旨在調節離子通道或神經遞質，最終抑制大腦中的神經元興奮性，但是30%～40% 的癲癇患者在使用藥物后仍出現難治性癲癇發作[10]，這些藥物僅能緩解癥狀，并未解決癲癇的潛在機制 ，因此，研究癲癇的潛在發病機制來抑制癲癇勢在必行，而circRNA有望為解開癲癇的奧秘提供新的可能。
circRNA是一種環形閉合的特殊RNA，因為大多數circRNA不具備翻譯功能，因此把它暫時歸結為非編碼RNA一種。circRNA以及穩定的結構、相對保守及其具備多種的功能備受關注。circRNA在腦組織中相對豐富，尤其神經元突觸內含有更多的circRNA[11]，這提示circRNA在神經元功能中起著重要作用。然而，circRNA在癲癇中的作用仍不清楚，其與癲癇的關系已經展開研究，但相對較少。
circRNA根據其來源分為外含子circRNA、內顯子circRNA以及外含子-內顯子混合的circRNA。一般而言，circRNA發揮的功能與其來源的位置密不可分。外顯子circRNA在細胞質中穩定表達，可以與miRNA或RNA結合蛋白相互作用，甚至包繞具備翻譯起始密碼子的區域，可能在基因表達和翻譯中發揮調節作用[6]。相比之下，內顯子circRNA更多位于細胞核中，受其他因素干擾較小，表達穩定[12]。外顯子-內含子circRNA同時具有外顯子和內含子circRNA特征。本次我們所探究的4個circRNA在信息庫中顯示均為外顯子型circRNA。通過生物信息學數據庫來預測circRNA通過circRNA-miRNA-mRNA軸充當“分子海綿”作用從而調節癲癇相關基因的表達。
經生物信息學分析，C14orf159可能結合的3個的miRNA，其中miR-1180-3p據報道與肝癌、胃癌、肺腺癌、乳腺癌、抑郁癥、皮膚黑素瘤有關。miR-3622b-5p與卵巢癌、胃癌、乳腺癌有關，而miR-6501-3p的作用還沒有被報道。C14orf159的下游靶基因CCL3是一種炎性介質產物，已被多篇文章所報道在癲癇中發揮重要作用。EFCAB2可能結合的3個miRNA，其中miR-6873-3p已被報道在內皮細胞中存在與炎癥、氧化應激和細胞凋亡等作用有關[13]。miR-6739-3p、miR-7110-3p的作用尚未被報道。同時發現miR-6873-3p和miR-7110-3擁有共同的下游靶基因微管相關蛋白（Microtubule associated protein 1B，MAP1B），MAP1B通過調控電壓門控鈉通道，參與癲癇發病[14]。
應用生物信息學預測在發現無注釋RNA的非編碼RNA功能或編碼轉錄本的雙重功能方面得到了廣泛應用，但是需要注意的是-應用生物信息預測時，其用途可能是理解circRNA-miRNA-mRNA的集體網絡，而不是單個轉錄本來影響轉錄后調控[15]。雖然測序技術和各種生物信息學的發展為我們對疾病中的circRNA等非編碼RNA的探究提供了極大的方便，癲癇及各種疾病中網絡正在被科研人員相繼挖掘，但一個研究往往僅對某個circRNA，以及所結合的特定某個miRNA、某個基因進行研究，這樣是單對單的“線”性，而無法將“線”的關系延伸為“網”。本研究運用數據庫，對結果進行了生物信息學網絡構建，意外發現EFCAB2具備同時充當miR-6873-3p和miR-7110-3p的分子海綿，最終對MAP1B的表達進行調控，該結論也與從“網絡化”的角度理解circRNA的功能相互對應。
利益沖突聲明 所有作者無利益沖突。
