目的探討在上皮細胞生長因子（EGF）作用下，用懸浮培養法富集結腸癌腫瘤干細胞的最佳培養時間。方法在含 20 ng/mL EGF 的無血清培養基中，懸浮培養人結腸癌 DLD-1 細胞獲取球細胞，設置時間梯度為 10 d、20 d、30 d 及 40 d。采用流式細胞術（FCM）檢測球細胞中 CD133+、CD44+和 CD133+CD44+細胞的比例；采用成球實驗和有限稀釋法檢測細胞球的自我更新能力，平板克隆形成實驗檢測細胞體外成瘤能力。結果流式細胞術檢測結果顯示：30 d 組球細胞中 CD133+及 CD133+CD44+ 細胞的比例較其他組明顯增多（均 P<0.05），其CD44+細胞的比例高于 20 d 組（P<0.05），但與另外 2 組的差異無統計學意義（P>0.05）。有限稀釋法和平板克隆形成實驗中，30 d 組或 40 d 組的數量最高，2 組比較差異無統計學意義（P >0.05），30 d 組與 10 d 及 20 d組比較差異均有統計學意義（均P<0.05）。成球實驗中，30 d 組細胞球自我更新能力較其他組明顯增強（均P<0.05）。結論在 20 ng/mL EGF 懸浮培養 30 d 可最大效率地富集結腸癌 DLD-1 腫瘤干細胞。