目的建立一種小鼠氣管–支氣管上皮細胞氣–液界面（ALI）培養及纖毛擺動頻率測量的方法，最大程度還原氣道上皮的生理功能。方法利用 1 mg/mL ⅪⅤ型鏈蛋白酶冷消化的方法獲取 BALB/c 小鼠氣管–支氣管上皮細胞，篩選出最佳消化時長以保證所得細胞的數量及活力。差速貼壁法去除成纖維細胞后，接種于Ⅰ型鼠尾膠原預包被的 Transwell 小室，用不同培養基進行增殖期和 ALI 分化期培養。結果采用鏈蛋白酶冷消化 12 h、14 h 和 16 h 所得細胞數目分別為（1.78±0.33）×105、（1.93±0.26）×105和（2.01±0.28）×105，經臺盼藍染色活細胞率分別為（96.86±0.25）%、（94.73±1.63）% 和（86.87±5.95）%。1 周左右細胞鋪滿小室，繼續 ALI 培養 2～3 周后光學顯微鏡下可見纖毛節律性擺動，電鏡及免疫熒光均證實纖毛結構。培養所得細胞纖毛擺動頻率與小鼠氣管在體纖毛擺動頻率與一致。結論本實驗建立的氣管–支氣管上皮細胞分離、ALI 培養及纖毛擺動頻率測量體系簡便、穩定、高效、可靠，為探索氣道疾病的致病和治療機制創造了基礎，亦可為其他物種氣道上皮和（或）其他器官上皮的培養提供參考依據。