引用本文： 顧競賽, 陳震, 徐奕爽, 鄭紅梅, 花蒂豪. 過表達Krüppel樣因子7對小鼠視神經鉗夾后視網膜神經節細胞保護作用及機制研究. 中華眼底病雜志, 2024, 40(4): 303-310. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20230504-00196 復制
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視網膜神經節細胞（RGC）可以接收和整合來自視網膜中其他神經元的信號，但其受損后不易再生[1]。此外，RGC為單向軸突傳遞途徑，只有當其受損部位的神經纖維再生或修復后才能傳導視覺信息，而不能依靠側支軸突傳導信號[2]。青光眼、缺血性視神經病變和視神經挫傷常伴有RGC損傷，但此類疾病一直缺乏成效的治療方法，所以促進神經細胞修復、再生是目前研究熱點。Krüppel樣因子（KLF）是一組高度保守的鋅指蛋白轉錄因子家族，在調節細胞分化、生長和發育等生物學過程中發揮重要作用[3-4]。文獻報道，KLF4、KLF5、KLF7等可能參與調節神經元存活、軸突生長和引導以及突觸形成[5-8]。此外，神經元成熟后KLF7表達下調，阻礙KLF7發揮保護神經和促神經軸突再生的功能[9]。KLF7在視神經、視網膜損傷中研究較少且機制尚未明確。視神經鉗夾損傷（ONC）是一種建立視神經和RGC急性損傷模型的成熟方法，具有手術操作簡單、建模周期短、成功率高等特點[10]。本研究建立小鼠ONC模型，通過重組腺相關病毒（rAAV）載體過表達小鼠視網膜KLF7，初步探索KLF7對小鼠ONC后RGC的保護作用及其保護機制。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
健康C57BL/6J小鼠87只，10周齡，體重18～22 g，無特定病原體（SPF）級（武漢大學A3實驗動物中心），飼養于湖北省人民醫院動物中心SPF級環境中，所有流程嚴格按照《武漢大學實驗動物護理與使用指南》規定，并獲得武漢大學實驗動物倫理委員會許可［倫理編號：WDRM動（福）第20190113號］。過表達KLF7的rAAV載體［rAVV- KLF7-重組增強綠色熒光蛋白（EGFP）］、僅攜帶EGFP的空白腺相關病毒載體（AAV2-EGFP）（上海吉凱基因有限公司）；KLF7、神經生長因子（NGF）、生長相關蛋白43（GAP43）、腦源性神經營養因子（BNDF）、胱天蛋白酶3（Caspase-3）、B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）（美國Abcam公司）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、抗綠色熒光蛋白抗體（武漢賽維爾公司）；酪氨酸激酶A（TrkA）、磷酸化TrkA（pTrkA）（美國Affinity Biosciences公司）；酪氨酸激酶B（TrkB）（武漢三鷹生物技術有限公司），磷酸化TrkB（pTrkB）（北京博奧森生物技術公司）；Bcl-2相關X蛋白（BAX）（美國CST公司）。
1.2 病毒構建
rAVV-KLF7-EGFP載體為GV388，序列元件CMV bGlobin-MCS-EGFP-3FLAG-WPRE-hGH polyA，構建針對KLF7的小發夾（sh）RNA-rAAV2。基因插入位點為KpnI/BamHI。KLF7目的基因片段，正向引物：GGAGGTAGTGGAATGGATCCCGCCACCATGGACGTGTTGGCTAGTTATAG；反向引物：TCACCATGGTGGCGGGATCGATATGTCTCTTCATAT GGAGCG。提純并使用稀釋梯度法測量病毒滴度。rAVV2-EGFP、rAVV2-shRNA（KLF7）-EGFP滴度分別為3.34×1012、1.20×1012 vg/ml。分裝凍存于－80 ℃冰箱。
1.3 實驗動物分組和ONC模型建立
采用隨機數字表法將小鼠分為對照組、rAVV2-EGFP組、rAVV2-KLF7-EGFP組，每組分別為7、2、4只小鼠；ONC后3 d組（ONC-3組）、7 d組（ONC-7組）、14 d組（ONC-14組），每組各3只小鼠；空白對照組（A組）、玻璃體腔注射（IVT）rAVV2-KLF7-EGFP后4周組（B組）、IVT磷酸鹽緩沖液（PBS）后4周ONC組（C組）、IVT rAVV2-KLF7-EGF后4周ONC（D組）、IVT rAVV2-EGFP后4周ONC組（E組），每組各13只小鼠。
ONC-3 d組、ONC-7組、ONC-14 d組建立ONC模型。小鼠10周齡時，參照文獻[10]的方法雙眼建立ONC模型。小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后，鹽酸奧布卡因點眼表面麻醉，于顳側角鞏緣后2～3 mm處剪開球結膜，鈍性分離暴露視神經，恒壓反向鑷于球后視神經近端2 mm處鉗夾視神經并持續10 s，過程中可觀察到模型眼瞳孔逐漸散大，直接對光反射消失。剔除ONC建模失敗、手術中視神經周圍血管出血、手術后眼底出血的小鼠。
rAVV2-EGFP組、E組和rAVV2-KLF7-EGFP組、B組、D組小鼠雙眼分別于角鞏膜緣下2.0 mm處行IVT rAVV2-EGFP、rAVV2-shRNA（KLF7）-EGFP 1 μl，病毒滴度分別為3.34×1012、1.20×1012 vg/ml。C組小鼠雙眼IVT等體積PBS。IVT后4周，C組、D組、E組建立ONC模型。
1.4 激光共聚焦顯微鏡觀察病毒轉染情況
IVT后4周，分別隨機選取對照組、rAVV2-KLF7-EGFP組小鼠各2只，頸椎脫臼法處死摘除眼球。眼球扎孔后在脂肪酸合成酶眼球固定液中固定1 h，取視網膜置于30%蔗糖溶液過夜脫水，OCT膠包埋后用冰切機切成厚度為14 μm的切片，用抗綠色熒光蛋白抗體（1∶1 000）孵育，激光共聚焦顯微鏡觀察病毒轉染情況。
1.5 全視網膜鋪片免疫熒光染色計數RGC存活率
ONC建模后7 d，隨機選取A組、B組、C組、D組、E組小鼠各3只，頸椎脫臼法處死小鼠。參照文獻[11]的方法，取出眼球置于組織固定液中固定1 h。手術顯微鏡下完整分離視網膜組織，并將其置于PBS中漂洗5 min，3次，室溫環境下牛血清白蛋白洗膜緩沖液（含5%牛血清白蛋白，0.4%的Triton X-100的PBS）封閉2 h；Brn3a一抗（1∶500）4 ℃孵育48 h，PBS漂洗后AlexaFluor594 免疫球蛋白G二抗（1∶500）4 ℃孵育24 h，PBS漂洗后視網膜上剪4個切口呈“四葉草狀”鋪平，抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡觀察拍攝，10×40倍視野下，分別在距視盤約1/6、1/2、5/6半徑處取3個視野，4個視網膜瓣共12個視野，拍照并應用ImageJ軟件對存活RGC進行計數。
1.6 蛋白質免疫印跡法（Western blot）檢測視網膜組織中蛋白表達
隨機選取對照組、rAVV2-EGFP組、rAVV2-KLF7-EGFP組小鼠各2只，對照組、ONC-3組、ONC-7組、ONC-14組小鼠各3只，ONC建模后7 d，A組、B組、C組、D組、E組小鼠各10只，頸椎脫臼法處死并摘除眼球，提取視網膜總蛋白，二喹啉甲酸法測定蛋白濃度。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳、制膠與上樣、轉膜、抗體孵育，孵育盒分別孵育KLF7（1∶10 000）、NGF（1∶1 000）、TrkA（1∶2 000）、pTrkA（1∶500）、TrkB（1∶1 000）、pTrkB（1∶5 000）、GAP43（1∶500）、BNDF（1∶1 000）、GAPDH（1∶10 000）、Bcl-2（1∶10 000）、BAX抗體（1∶2 000）、Caspase-3。其后加入辣根過氧化物偶聯的二抗，化學發光底物試劑盒制備免疫反應條帶，使用ImageJ軟件分析每個條帶的灰度值，以GAPDH作為內參照，評估目的蛋白的相對表達量。
1.7 統計學方法
采用GraphPad Prism 8.0進行統計分析。計量資料以均數±標準差（x±s）表示。符合正態分布的數據，組間比較采用單因素方差分析，并使用Tukey校正檢驗；不符合正態分布的數據，組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 rAAV2-KLF7-EGFP成功轉染至視網膜
熒光顯微鏡觀察結果顯示，對照組小鼠視網膜各細胞層未見綠色熒光染色（圖1A）。rAVV2-KLF7-EGFP組小鼠視網膜神經節細胞層、內叢狀層（IPL）可見強熒光；內核層、外叢狀層熒光較弱；外核層未見明顯熒光（圖1B）。
圖1
對照組、rAVV2-KLF7-EGFP組小鼠視網膜組織熒光顯微鏡像（EGFP+DAPI，標尺：50 μm）
1A示對照組，視網膜各細胞層未見綠色熒光染色；1B示rAVV2-KLF7-EGFP組，GCL、IPL可見綠色強熒光，INL、OPL僅見微弱綠色熒光，ONL未見綠色熒光染色 rAVV：重組腺相關病毒；KLF7：Krüppel樣因子7；EGFP：增強綠色熒光蛋白；GCL：神經節細胞層；IPL：內叢狀層；INL：內核層；OPL：外叢狀層；DAPI：4'，6-二脒基-2-苯基吲哚；對照組：不做任何處理；rAVV2-KLF7-EGFP組：玻璃體腔注射rAVV2-小發夾RNA（KLF7）-EGFP
Western blot檢測結果顯示，rAVV2-KLF7-EGFP組、AVV2-EGFP組、對照組小鼠視網膜中KLF7蛋白相對表達量分別為0.489±0.051、0.120±0.004、0.124±0.007；與AVV2-EGFP組、對照組比較，rAVV2-KLF7-EGFP組小鼠視網膜中KLF7蛋白相對表達量顯著升高，差異有統計學意義（F=203.44，P＜0.01）（圖2）。組間兩兩比較，rAVV2-KLF7-EGFP組與AVV2-EGFP組、對照組，差異均有統計學意義（P＜0.01）；對照組與AVV2-EGFP組，差異無統計學意義（P＞0.05）。
圖2
對照組、rAVV2-EGFP組、rAVV2-KLF7-EGFP組小鼠視網膜中KLF7蛋白表達情況（n=2）
2A示電泳圖；2B示3組視網膜中KLF7蛋白表達結果，與對照組、rAVV2-EGFP組比較，rAVV2-KLF7-EGFP組小鼠視網膜中KLF7蛋白表達顯著升高 rAVV：重組腺相關病毒；KLF7：Krüppel樣因子7；EGFP：增強綠色熒光蛋白；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶；對照組：不做任何處理；rAVV2-EGFP組、rAVV2-KLF7-EGFP組：玻璃體腔分別注射rAVV2-EGFP、rAVV2-小發夾RNA（KLF7）-EGFP
2.2 ONC后KLF7表達結果
Western blot檢測結果顯示，對照組、ONC-3組、ONC-7組、ONC-14組小鼠視網膜中KLF7蛋白相對表達量分別為0.13±0.01、0.26±0.04、0.46±0.04、0.44±0.04；與對照組比較，ONC-3組、ONC-7組、ONC-14組小鼠視網膜中KLF7蛋白相對表達量顯著增高，差異均有統計學意義（F=43.52，P＜0.01）（圖3）。組間兩兩比較，對照組分別與ONC-3組、ONC-7組、ONC-14組比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）。
圖3
對照組、ONC-3組、ONC-7組、ONC-14組小鼠視網膜中KLF7蛋白表達情況（n=3）
3A示電泳圖；3B示4組視網膜中KLF7蛋白表達結果，與對照組比較，ONC-3組、ONC-7組、ONC-14組小鼠視網膜中KLF7蛋白相對表達量顯著增高 KLF7：Krüppel樣因子7；ONC：視神經鉗夾損傷；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶；對照組：不做任何處理；ONC-3組、ONC-7組、ONC-14組：ONC后3、7、14 d
2.3 RGC存活率檢測結果
熒光顯微鏡觀察結果顯示，ONC后7 d，A組、B組RGC邊界及細胞亞結構清楚，染色明亮；C組、D組、E組RGC邊界較為模糊，染色較淡，RGC數量較對照組下降，且D組RGC數量較C組、E組相對升高（圖4A～4E）。A組、B組、C組、D組、E組視網膜中RGC密度分別為（3 707.4±12.8）、（3 582.4±13.3）、（1 396.3±16.1）、（1 658.3±22.2）、（1 323.6±16.9）個/mm2；5組RGC密度比較，差異有統計學意義（F=206.90，P＜0.01）（圖5）；C組、E組RGC存活率較A組、B組顯著減少約65%；D組RGC存活率較C組、E組提高約10%。組間兩兩比較，C組、D組、E組分別與A組、B組，差異均有統計學意義（P＜0.01）；D組與C組、E組，差異有統計學意義（P=0.028、0.007）；其余組間差異均無統計學意義（P＞0.05）。
圖4
ONC后7 d A組、B組、C組、D組、E組小鼠視網膜熒光顯微鏡像（Brn3a免疫熒光染色，標尺：50 μm）
4A～4E分別示A組、B組、C組、D組、E組，A組、B組RGC邊界及細胞亞結構清楚，染色明亮；C組、D組、E組RGC邊界較為模糊，染色較淡，RGC數量較對照組下降，且D組RGC數量較C組、E組相對升高 RGC：視網膜神經節細胞；rAVV：重組腺相關病毒；KLF7：Krüppel樣因子7；EGFP：增強綠色熒光蛋白；ONC：視神經鉗夾損傷；IVT：玻璃體腔注射；A組：空白對照組；B組：IVT rAVV2- KLF7-EGFP后4周；C組：IVT磷酸鹽緩沖液后4周建立ONC模型；D組：IVT rAVV2-KLF7-EGFP后4周建立ONC模型；E組：IVT rAVV2-EGFP后4周建立ONC模型
圖5
ONC后7 d A組、B組、C組、D組、E組小鼠視網膜中RGC密度比較（n=3）
RGC：視網膜神經節細胞；rAVV：重組腺相關病毒；KLF7：Krüppel樣因子7；EGFP：增強綠色熒光蛋白；ONC：視神經鉗夾損傷；IVT：玻璃體腔注射；A組：空白對照組；B組：IVT rAVV2- KLF7-EGFP后4周；C組：IVT磷酸鹽緩沖液后4周建立ONC模型；D組：IVT rAVV2-KLF7-EGFP后4周建立ONC模型；E組：IVT rAVV2-EGFP后4周建立ONC模型
2.4 視網膜中蛋白表達結果
Western blot檢測結果顯示，ONC后7 d，A組、B組、C組、D組、E組小鼠視網膜中NGF、pTrkA、pTrkB、GAP43、Bcl-2、BAX、Caspase-3蛋白相對表達量比較，差異均有統計學意義（F=18.214、44.380、27.559、45.476、193.140、26.160、522.180，P＜0.01）；TrkA、BDNF、TrkB蛋白相對表達量比較，差異均無統計學意義（F=0.328、1.699、0.600，P＞0.05）（圖6）。組間兩兩比較：NGF：D組與A組、B組、C組、E組，差異有統計學意義（P＜0.01）。pTrkA：C組、E組、D組分別與A組、B組，差異有統計學意義（P＜0.01）；D組與C組、E組，差異有統計學意義（P＜0.01）。pTrkB、GAP43：D組與A組、B組、C組、E組，差異有統計學意義（P＜0.01）。Bcl-2：C組、E組、D組分別與A組、B組，差異均有統計學（P＜0.01）；D組與C組、E組，差異有統計學意義（P＜0.01）。BAX：C組、E組、D組分別與A組、B組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；D組與C組，差異有統計學意義（P＜0.01）。Caspase-3：C組、E組、D組分別與A組、B組，差異均有統計學意義（P＜0.01）；D組與C組、E組，差異均有統計學意義（P＜0.01）。
圖6
ONC后7 d A組、B組、C組、D組、E組小鼠視網膜中各檢測因子蛋白相對表達量比較（n=10）
6A示pTrkA、TrkA、pTrkB、TrkB、BNDF，*
3 討論
KLF7是一種重要的鋅指轉錄因子，在神經系統損傷后對軸突再生和神經元存活具有積極影響[12-14]。本研究成功將KLF7目的基因轉染至視網膜，尤其是在RGC、內叢狀層，并檢測到小鼠視網膜中KLF7蛋白相對表達量提高；ONC后14 d內，KLF7蛋白表達隨ONC建模時間延長而上升，其中ONC后7 d達到高峰。ONC后7 d，過表達的KLF7相對提高了RGC存活率，并發現NGF-TrkA、NGF-TrkB信號通路被激活，凋亡相關因子Bcl-2表達上升，BAX和Caspase-3表達顯著下降。
本研究結果顯示，ONC后7 d，C組、E組RGC存活率較A組、B組顯著減少約65%。該結果與既往研究結果類似，說明小鼠視神經橫斷或擠壓后會導致RGC凋亡、死亡[15-16]。D組RGC存活率較C組、E組提高約10%。KLF7在神經眼科領域研究較少，通過既往KLF7在中樞神經系統損傷后具有保護作用的研究，可以提供一些D組RGC存活率相對提高的可能機制。既往研究發現，坐骨神經損傷后，過表達KLF7可上調NGF、睫狀神經營養因子、BDNF的表達，從而降低神經細胞死亡并維持其功能作用[17]。同時，KLF7也可能通過激活NGF-TrkA、NGF-TrkB信號通路途徑，維持神經的存活和促進其再生[18]。因此，D組RGC存活率相對提高，可能是通過激活NGF-TrkA、NGF-TrkB信號通路，促進軸突生長、神經細胞存活。
NGF和BDNF是在神經元發育和存活過程中起到關鍵作用的因子，分別通過結合其高親和受體TrkA、TrkB促進神經元生存，為治療部分神經退行性疾病帶來巨大希望[19-20]。本研究結果顯示，D組NGF、pTrkA、pTrkB、GAP43蛋白相對表達量均較其他4組增高。既往研究發現，NGF、TrkA、TrkB、GAP43都是KLF7的直接靶基因[21-22]，KLF7通過激活這些生長因子及其通路，從而在復雜的神經損傷反應中促使神經元的生長和修復。近期研究發現，在坐骨神經損傷中，KLF7可通過提高NGF表達，激活TrkA、TrkB通路，起到促進坐骨神經軸突再生和增強其髓鞘形成的作用[18]。此外，在ONC小鼠模型中通過外源性給予NGF，可以刺激軸突再生并且干擾細胞凋亡通路，減少RGC損傷。其原因可能是因為NGF與TrkA受體結合后促使TrkA磷酸化，并激活下游細胞外調節蛋白激酶（ERK）信號通路，從而起到保護RGC的作用[23]。TrkA作為KLF7的單獨直接靶基因，也可能是直接通過KLF7刺激使TrkA磷酸化，從而起到保護RGC的作用。既往文獻報道，單純選擇TrkA激動劑即可對ONC或高眼壓模型RGC產生保護作用，而不一定需要NGF[24-25]。以上研究結果說明，在ONC模型中，通過NGF間接激活TrkA信號通路或直接激活TrkA信號通路可能是KLF7保護RGC的其中一種機制。本研究僅發現D組小鼠pTrkB蛋白相對表達量較其他4組增高，然而BDNF在5組間的差異并無統計學意義。這可能表明KLF7是直接激活TrkB信號通路，而并非依靠BDNF間接激活TrkB信號通路，起到對RGC的保護作用。此結果和既往研究類似，TrkB是KLF7的直接靶基因，而BDNF不是KLF7的直接靶基因[22]，所以過表達KLF7未能促使BDNF表達量升高。既往研究已證實TrkB信號通路的激活，既可以激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路又可以激活ERK信號通路；前者也可使得多種基因轉錄促進神經元的存活[26-27]。此外，D組BDNF蛋白相對表達量無提高的另一可能原因：小鼠ONC后，因為激活的視網膜星形膠質細胞與神經細胞發生接觸，影響到BDNF循環，使得BDNF表達量無明顯提升，從而影響到BDNF-TrkB信號通路[28]。本研究結果顯示，D組GAP43蛋白相對表達量較其他4組增高。GAP43表達量是評估軸突損傷和再生的重要指標，正常情況下GAP43表達水平較低，當中樞神經損傷后并伴有神經再生時GAP43表達將增多，軸突再生完成后GAP43的表達將再次回到基本表達水平[29-30]，這可能是。ONC后GAP43表達量大幅增加，表明KLF7可能有刺激軸突再生、保護RGC的作用。然而，本研究未能通過RGC軸突染色來證明KLF7具有軸突保護、促進軸突生長的作用，是本研究的不足之處。
Bcl-2家族成員在青光眼、視神經損傷、視網膜缺血等疾病中RGC凋亡或抑制凋亡過程中扮演重要角色[31]。本研究結果顯示，D組較C組、E組Bcl-2蛋白相對表達量增高，而BAX蛋白相對表達量降低，這與既往研究結果類似。兔視神經離斷后，提高Bcl-2蛋白表達即可挽救部分RGC免于死亡；青光眼模型中，提高Bcl-2蛋白水平，具有視神經保護作用[32-33]。這些結果表明，提高Bcl-2表達對RGC具有保護作用。BAX是介導RGC凋亡的重要機制。既往研究發現，在ONC或視神經離斷模型中，通過誘導BAX缺乏，可以防止RGC大量凋亡；與正常小鼠比較，BAX缺乏的小鼠成長至成年，其RGC數量增加了220%[34]。綜上，KLF7可能通過調控Bcl-2和BAX蛋白的表達，從而起到保護RGC的作用。此外，隨著BAX改變了線粒體外膜通透性，可激活Caspase家族，導致細胞內蛋白水解和細胞死亡。既往研究證實，在ONC模型中通過抑制Caspase-3能有效降低RGC死亡率[15]。本研究也發現，D組較C組、E組Caspase-3蛋白相對表達量降低。這或許可以說明，KLF7是通過提高Bcl-2蛋白表達與降低BAX蛋白表達，從而降低Caspase-3表達，起到保護RGC的作用。
本研究的局限性在于：（1）僅觀察了KLF7在RGC損傷保護機制的部分信號通路以及作用因子，而未針對以上各通路之間是否具有相互作用以及各通路在RGC損傷后的保護作用的強弱占比進行深入研究；（2）未對RGC和視神經軸突形態和密度進行染色觀察，缺乏以此來評估KLF7對RGC和視神經軸突的保護作用。以上不足，值得在今后的研究中深入豐富細化。
視網膜神經節細胞（RGC）可以接收和整合來自視網膜中其他神經元的信號，但其受損后不易再生[1]。此外，RGC為單向軸突傳遞途徑，只有當其受損部位的神經纖維再生或修復后才能傳導視覺信息，而不能依靠側支軸突傳導信號[2]。青光眼、缺血性視神經病變和視神經挫傷常伴有RGC損傷，但此類疾病一直缺乏成效的治療方法，所以促進神經細胞修復、再生是目前研究熱點。Krüppel樣因子（KLF）是一組高度保守的鋅指蛋白轉錄因子家族，在調節細胞分化、生長和發育等生物學過程中發揮重要作用[3-4]。文獻報道，KLF4、KLF5、KLF7等可能參與調節神經元存活、軸突生長和引導以及突觸形成[5-8]。此外，神經元成熟后KLF7表達下調，阻礙KLF7發揮保護神經和促神經軸突再生的功能[9]。KLF7在視神經、視網膜損傷中研究較少且機制尚未明確。視神經鉗夾損傷（ONC）是一種建立視神經和RGC急性損傷模型的成熟方法，具有手術操作簡單、建模周期短、成功率高等特點[10]。本研究建立小鼠ONC模型，通過重組腺相關病毒（rAAV）載體過表達小鼠視網膜KLF7，初步探索KLF7對小鼠ONC后RGC的保護作用及其保護機制。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
健康C57BL/6J小鼠87只，10周齡，體重18～22 g，無特定病原體（SPF）級（武漢大學A3實驗動物中心），飼養于湖北省人民醫院動物中心SPF級環境中，所有流程嚴格按照《武漢大學實驗動物護理與使用指南》規定，并獲得武漢大學實驗動物倫理委員會許可［倫理編號：WDRM動（福）第20190113號］。過表達KLF7的rAAV載體［rAVV- KLF7-重組增強綠色熒光蛋白（EGFP）］、僅攜帶EGFP的空白腺相關病毒載體（AAV2-EGFP）（上海吉凱基因有限公司）；KLF7、神經生長因子（NGF）、生長相關蛋白43（GAP43）、腦源性神經營養因子（BNDF）、胱天蛋白酶3（Caspase-3）、B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）（美國Abcam公司）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、抗綠色熒光蛋白抗體（武漢賽維爾公司）；酪氨酸激酶A（TrkA）、磷酸化TrkA（pTrkA）（美國Affinity Biosciences公司）；酪氨酸激酶B（TrkB）（武漢三鷹生物技術有限公司），磷酸化TrkB（pTrkB）（北京博奧森生物技術公司）；Bcl-2相關X蛋白（BAX）（美國CST公司）。
1.2 病毒構建
rAVV-KLF7-EGFP載體為GV388，序列元件CMV bGlobin-MCS-EGFP-3FLAG-WPRE-hGH polyA，構建針對KLF7的小發夾（sh）RNA-rAAV2。基因插入位點為KpnI/BamHI。KLF7目的基因片段，正向引物：GGAGGTAGTGGAATGGATCCCGCCACCATGGACGTGTTGGCTAGTTATAG；反向引物：TCACCATGGTGGCGGGATCGATATGTCTCTTCATAT GGAGCG。提純并使用稀釋梯度法測量病毒滴度。rAVV2-EGFP、rAVV2-shRNA（KLF7）-EGFP滴度分別為3.34×1012、1.20×1012 vg/ml。分裝凍存于－80 ℃冰箱。
1.3 實驗動物分組和ONC模型建立
采用隨機數字表法將小鼠分為對照組、rAVV2-EGFP組、rAVV2-KLF7-EGFP組，每組分別為7、2、4只小鼠；ONC后3 d組（ONC-3組）、7 d組（ONC-7組）、14 d組（ONC-14組），每組各3只小鼠；空白對照組（A組）、玻璃體腔注射（IVT）rAVV2-KLF7-EGFP后4周組（B組）、IVT磷酸鹽緩沖液（PBS）后4周ONC組（C組）、IVT rAVV2-KLF7-EGF后4周ONC（D組）、IVT rAVV2-EGFP后4周ONC組（E組），每組各13只小鼠。
ONC-3 d組、ONC-7組、ONC-14 d組建立ONC模型。小鼠10周齡時，參照文獻[10]的方法雙眼建立ONC模型。小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后，鹽酸奧布卡因點眼表面麻醉，于顳側角鞏緣后2～3 mm處剪開球結膜，鈍性分離暴露視神經，恒壓反向鑷于球后視神經近端2 mm處鉗夾視神經并持續10 s，過程中可觀察到模型眼瞳孔逐漸散大，直接對光反射消失。剔除ONC建模失敗、手術中視神經周圍血管出血、手術后眼底出血的小鼠。
rAVV2-EGFP組、E組和rAVV2-KLF7-EGFP組、B組、D組小鼠雙眼分別于角鞏膜緣下2.0 mm處行IVT rAVV2-EGFP、rAVV2-shRNA（KLF7）-EGFP 1 μl，病毒滴度分別為3.34×1012、1.20×1012 vg/ml。C組小鼠雙眼IVT等體積PBS。IVT后4周，C組、D組、E組建立ONC模型。
1.4 激光共聚焦顯微鏡觀察病毒轉染情況
IVT后4周，分別隨機選取對照組、rAVV2-KLF7-EGFP組小鼠各2只，頸椎脫臼法處死摘除眼球。眼球扎孔后在脂肪酸合成酶眼球固定液中固定1 h，取視網膜置于30%蔗糖溶液過夜脫水，OCT膠包埋后用冰切機切成厚度為14 μm的切片，用抗綠色熒光蛋白抗體（1∶1 000）孵育，激光共聚焦顯微鏡觀察病毒轉染情況。
1.5 全視網膜鋪片免疫熒光染色計數RGC存活率
ONC建模后7 d，隨機選取A組、B組、C組、D組、E組小鼠各3只，頸椎脫臼法處死小鼠。參照文獻[11]的方法，取出眼球置于組織固定液中固定1 h。手術顯微鏡下完整分離視網膜組織，并將其置于PBS中漂洗5 min，3次，室溫環境下牛血清白蛋白洗膜緩沖液（含5%牛血清白蛋白，0.4%的Triton X-100的PBS）封閉2 h；Brn3a一抗（1∶500）4 ℃孵育48 h，PBS漂洗后AlexaFluor594 免疫球蛋白G二抗（1∶500）4 ℃孵育24 h，PBS漂洗后視網膜上剪4個切口呈“四葉草狀”鋪平，抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡觀察拍攝，10×40倍視野下，分別在距視盤約1/6、1/2、5/6半徑處取3個視野，4個視網膜瓣共12個視野，拍照并應用ImageJ軟件對存活RGC進行計數。
1.6 蛋白質免疫印跡法（Western blot）檢測視網膜組織中蛋白表達
隨機選取對照組、rAVV2-EGFP組、rAVV2-KLF7-EGFP組小鼠各2只，對照組、ONC-3組、ONC-7組、ONC-14組小鼠各3只，ONC建模后7 d，A組、B組、C組、D組、E組小鼠各10只，頸椎脫臼法處死并摘除眼球，提取視網膜總蛋白，二喹啉甲酸法測定蛋白濃度。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳、制膠與上樣、轉膜、抗體孵育，孵育盒分別孵育KLF7（1∶10 000）、NGF（1∶1 000）、TrkA（1∶2 000）、pTrkA（1∶500）、TrkB（1∶1 000）、pTrkB（1∶5 000）、GAP43（1∶500）、BNDF（1∶1 000）、GAPDH（1∶10 000）、Bcl-2（1∶10 000）、BAX抗體（1∶2 000）、Caspase-3。其后加入辣根過氧化物偶聯的二抗，化學發光底物試劑盒制備免疫反應條帶，使用ImageJ軟件分析每個條帶的灰度值，以GAPDH作為內參照，評估目的蛋白的相對表達量。
1.7 統計學方法
采用GraphPad Prism 8.0進行統計分析。計量資料以均數±標準差（x±s）表示。符合正態分布的數據，組間比較采用單因素方差分析，并使用Tukey校正檢驗；不符合正態分布的數據，組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 rAAV2-KLF7-EGFP成功轉染至視網膜
熒光顯微鏡觀察結果顯示，對照組小鼠視網膜各細胞層未見綠色熒光染色（圖1A）。rAVV2-KLF7-EGFP組小鼠視網膜神經節細胞層、內叢狀層（IPL）可見強熒光；內核層、外叢狀層熒光較弱；外核層未見明顯熒光（圖1B）。
圖1
對照組、rAVV2-KLF7-EGFP組小鼠視網膜組織熒光顯微鏡像（EGFP+DAPI，標尺：50 μm）
1A示對照組，視網膜各細胞層未見綠色熒光染色；1B示rAVV2-KLF7-EGFP組，GCL、IPL可見綠色強熒光，INL、OPL僅見微弱綠色熒光，ONL未見綠色熒光染色 rAVV：重組腺相關病毒；KLF7：Krüppel樣因子7；EGFP：增強綠色熒光蛋白；GCL：神經節細胞層；IPL：內叢狀層；INL：內核層；OPL：外叢狀層；DAPI：4'，6-二脒基-2-苯基吲哚；對照組：不做任何處理；rAVV2-KLF7-EGFP組：玻璃體腔注射rAVV2-小發夾RNA（KLF7）-EGFP
Western blot檢測結果顯示，rAVV2-KLF7-EGFP組、AVV2-EGFP組、對照組小鼠視網膜中KLF7蛋白相對表達量分別為0.489±0.051、0.120±0.004、0.124±0.007；與AVV2-EGFP組、對照組比較，rAVV2-KLF7-EGFP組小鼠視網膜中KLF7蛋白相對表達量顯著升高，差異有統計學意義（F=203.44，P＜0.01）（圖2）。組間兩兩比較，rAVV2-KLF7-EGFP組與AVV2-EGFP組、對照組，差異均有統計學意義（P＜0.01）；對照組與AVV2-EGFP組，差異無統計學意義（P＞0.05）。
圖2
對照組、rAVV2-EGFP組、rAVV2-KLF7-EGFP組小鼠視網膜中KLF7蛋白表達情況（n=2）
2A示電泳圖；2B示3組視網膜中KLF7蛋白表達結果，與對照組、rAVV2-EGFP組比較，rAVV2-KLF7-EGFP組小鼠視網膜中KLF7蛋白表達顯著升高 rAVV：重組腺相關病毒；KLF7：Krüppel樣因子7；EGFP：增強綠色熒光蛋白；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶；對照組：不做任何處理；rAVV2-EGFP組、rAVV2-KLF7-EGFP組：玻璃體腔分別注射rAVV2-EGFP、rAVV2-小發夾RNA（KLF7）-EGFP
2.2 ONC后KLF7表達結果
Western blot檢測結果顯示，對照組、ONC-3組、ONC-7組、ONC-14組小鼠視網膜中KLF7蛋白相對表達量分別為0.13±0.01、0.26±0.04、0.46±0.04、0.44±0.04；與對照組比較，ONC-3組、ONC-7組、ONC-14組小鼠視網膜中KLF7蛋白相對表達量顯著增高，差異均有統計學意義（F=43.52，P＜0.01）（圖3）。組間兩兩比較，對照組分別與ONC-3組、ONC-7組、ONC-14組比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）。
圖3
對照組、ONC-3組、ONC-7組、ONC-14組小鼠視網膜中KLF7蛋白表達情況（n=3）
3A示電泳圖；3B示4組視網膜中KLF7蛋白表達結果，與對照組比較，ONC-3組、ONC-7組、ONC-14組小鼠視網膜中KLF7蛋白相對表達量顯著增高 KLF7：Krüppel樣因子7；ONC：視神經鉗夾損傷；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶；對照組：不做任何處理；ONC-3組、ONC-7組、ONC-14組：ONC后3、7、14 d
2.3 RGC存活率檢測結果
熒光顯微鏡觀察結果顯示，ONC后7 d，A組、B組RGC邊界及細胞亞結構清楚，染色明亮；C組、D組、E組RGC邊界較為模糊，染色較淡，RGC數量較對照組下降，且D組RGC數量較C組、E組相對升高（圖4A～4E）。A組、B組、C組、D組、E組視網膜中RGC密度分別為（3 707.4±12.8）、（3 582.4±13.3）、（1 396.3±16.1）、（1 658.3±22.2）、（1 323.6±16.9）個/mm2；5組RGC密度比較，差異有統計學意義（F=206.90，P＜0.01）（圖5）；C組、E組RGC存活率較A組、B組顯著減少約65%；D組RGC存活率較C組、E組提高約10%。組間兩兩比較，C組、D組、E組分別與A組、B組，差異均有統計學意義（P＜0.01）；D組與C組、E組，差異有統計學意義（P=0.028、0.007）；其余組間差異均無統計學意義（P＞0.05）。
圖4
ONC后7 d A組、B組、C組、D組、E組小鼠視網膜熒光顯微鏡像（Brn3a免疫熒光染色，標尺：50 μm）
4A～4E分別示A組、B組、C組、D組、E組，A組、B組RGC邊界及細胞亞結構清楚，染色明亮；C組、D組、E組RGC邊界較為模糊，染色較淡，RGC數量較對照組下降，且D組RGC數量較C組、E組相對升高 RGC：視網膜神經節細胞；rAVV：重組腺相關病毒；KLF7：Krüppel樣因子7；EGFP：增強綠色熒光蛋白；ONC：視神經鉗夾損傷；IVT：玻璃體腔注射；A組：空白對照組；B組：IVT rAVV2- KLF7-EGFP后4周；C組：IVT磷酸鹽緩沖液后4周建立ONC模型；D組：IVT rAVV2-KLF7-EGFP后4周建立ONC模型；E組：IVT rAVV2-EGFP后4周建立ONC模型
圖5
ONC后7 d A組、B組、C組、D組、E組小鼠視網膜中RGC密度比較（n=3）
RGC：視網膜神經節細胞；rAVV：重組腺相關病毒；KLF7：Krüppel樣因子7；EGFP：增強綠色熒光蛋白；ONC：視神經鉗夾損傷；IVT：玻璃體腔注射；A組：空白對照組；B組：IVT rAVV2- KLF7-EGFP后4周；C組：IVT磷酸鹽緩沖液后4周建立ONC模型；D組：IVT rAVV2-KLF7-EGFP后4周建立ONC模型；E組：IVT rAVV2-EGFP后4周建立ONC模型
2.4 視網膜中蛋白表達結果
Western blot檢測結果顯示，ONC后7 d，A組、B組、C組、D組、E組小鼠視網膜中NGF、pTrkA、pTrkB、GAP43、Bcl-2、BAX、Caspase-3蛋白相對表達量比較，差異均有統計學意義（F=18.214、44.380、27.559、45.476、193.140、26.160、522.180，P＜0.01）；TrkA、BDNF、TrkB蛋白相對表達量比較，差異均無統計學意義（F=0.328、1.699、0.600，P＞0.05）（圖6）。組間兩兩比較：NGF：D組與A組、B組、C組、E組，差異有統計學意義（P＜0.01）。pTrkA：C組、E組、D組分別與A組、B組，差異有統計學意義（P＜0.01）；D組與C組、E組，差異有統計學意義（P＜0.01）。pTrkB、GAP43：D組與A組、B組、C組、E組，差異有統計學意義（P＜0.01）。Bcl-2：C組、E組、D組分別與A組、B組，差異均有統計學（P＜0.01）；D組與C組、E組，差異有統計學意義（P＜0.01）。BAX：C組、E組、D組分別與A組、B組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；D組與C組，差異有統計學意義（P＜0.01）。Caspase-3：C組、E組、D組分別與A組、B組，差異均有統計學意義（P＜0.01）；D組與C組、E組，差異均有統計學意義（P＜0.01）。
圖6
ONC后7 d A組、B組、C組、D組、E組小鼠視網膜中各檢測因子蛋白相對表達量比較（n=10）
6A示pTrkA、TrkA、pTrkB、TrkB、BNDF，*
3 討論
KLF7是一種重要的鋅指轉錄因子，在神經系統損傷后對軸突再生和神經元存活具有積極影響[12-14]。本研究成功將KLF7目的基因轉染至視網膜，尤其是在RGC、內叢狀層，并檢測到小鼠視網膜中KLF7蛋白相對表達量提高；ONC后14 d內，KLF7蛋白表達隨ONC建模時間延長而上升，其中ONC后7 d達到高峰。ONC后7 d，過表達的KLF7相對提高了RGC存活率，并發現NGF-TrkA、NGF-TrkB信號通路被激活，凋亡相關因子Bcl-2表達上升，BAX和Caspase-3表達顯著下降。
本研究結果顯示，ONC后7 d，C組、E組RGC存活率較A組、B組顯著減少約65%。該結果與既往研究結果類似，說明小鼠視神經橫斷或擠壓后會導致RGC凋亡、死亡[15-16]。D組RGC存活率較C組、E組提高約10%。KLF7在神經眼科領域研究較少，通過既往KLF7在中樞神經系統損傷后具有保護作用的研究，可以提供一些D組RGC存活率相對提高的可能機制。既往研究發現，坐骨神經損傷后，過表達KLF7可上調NGF、睫狀神經營養因子、BDNF的表達，從而降低神經細胞死亡并維持其功能作用[17]。同時，KLF7也可能通過激活NGF-TrkA、NGF-TrkB信號通路途徑，維持神經的存活和促進其再生[18]。因此，D組RGC存活率相對提高，可能是通過激活NGF-TrkA、NGF-TrkB信號通路，促進軸突生長、神經細胞存活。
NGF和BDNF是在神經元發育和存活過程中起到關鍵作用的因子，分別通過結合其高親和受體TrkA、TrkB促進神經元生存，為治療部分神經退行性疾病帶來巨大希望[19-20]。本研究結果顯示，D組NGF、pTrkA、pTrkB、GAP43蛋白相對表達量均較其他4組增高。既往研究發現，NGF、TrkA、TrkB、GAP43都是KLF7的直接靶基因[21-22]，KLF7通過激活這些生長因子及其通路，從而在復雜的神經損傷反應中促使神經元的生長和修復。近期研究發現，在坐骨神經損傷中，KLF7可通過提高NGF表達，激活TrkA、TrkB通路，起到促進坐骨神經軸突再生和增強其髓鞘形成的作用[18]。此外，在ONC小鼠模型中通過外源性給予NGF，可以刺激軸突再生并且干擾細胞凋亡通路，減少RGC損傷。其原因可能是因為NGF與TrkA受體結合后促使TrkA磷酸化，并激活下游細胞外調節蛋白激酶（ERK）信號通路，從而起到保護RGC的作用[23]。TrkA作為KLF7的單獨直接靶基因，也可能是直接通過KLF7刺激使TrkA磷酸化，從而起到保護RGC的作用。既往文獻報道，單純選擇TrkA激動劑即可對ONC或高眼壓模型RGC產生保護作用，而不一定需要NGF[24-25]。以上研究結果說明，在ONC模型中，通過NGF間接激活TrkA信號通路或直接激活TrkA信號通路可能是KLF7保護RGC的其中一種機制。本研究僅發現D組小鼠pTrkB蛋白相對表達量較其他4組增高，然而BDNF在5組間的差異并無統計學意義。這可能表明KLF7是直接激活TrkB信號通路，而并非依靠BDNF間接激活TrkB信號通路，起到對RGC的保護作用。此結果和既往研究類似，TrkB是KLF7的直接靶基因，而BDNF不是KLF7的直接靶基因[22]，所以過表達KLF7未能促使BDNF表達量升高。既往研究已證實TrkB信號通路的激活，既可以激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路又可以激活ERK信號通路；前者也可使得多種基因轉錄促進神經元的存活[26-27]。此外，D組BDNF蛋白相對表達量無提高的另一可能原因：小鼠ONC后，因為激活的視網膜星形膠質細胞與神經細胞發生接觸，影響到BDNF循環，使得BDNF表達量無明顯提升，從而影響到BDNF-TrkB信號通路[28]。本研究結果顯示，D組GAP43蛋白相對表達量較其他4組增高。GAP43表達量是評估軸突損傷和再生的重要指標，正常情況下GAP43表達水平較低，當中樞神經損傷后并伴有神經再生時GAP43表達將增多，軸突再生完成后GAP43的表達將再次回到基本表達水平[29-30]，這可能是。ONC后GAP43表達量大幅增加，表明KLF7可能有刺激軸突再生、保護RGC的作用。然而，本研究未能通過RGC軸突染色來證明KLF7具有軸突保護、促進軸突生長的作用，是本研究的不足之處。
Bcl-2家族成員在青光眼、視神經損傷、視網膜缺血等疾病中RGC凋亡或抑制凋亡過程中扮演重要角色[31]。本研究結果顯示，D組較C組、E組Bcl-2蛋白相對表達量增高，而BAX蛋白相對表達量降低，這與既往研究結果類似。兔視神經離斷后，提高Bcl-2蛋白表達即可挽救部分RGC免于死亡；青光眼模型中，提高Bcl-2蛋白水平，具有視神經保護作用[32-33]。這些結果表明，提高Bcl-2表達對RGC具有保護作用。BAX是介導RGC凋亡的重要機制。既往研究發現，在ONC或視神經離斷模型中，通過誘導BAX缺乏，可以防止RGC大量凋亡；與正常小鼠比較，BAX缺乏的小鼠成長至成年，其RGC數量增加了220%[34]。綜上，KLF7可能通過調控Bcl-2和BAX蛋白的表達，從而起到保護RGC的作用。此外，隨著BAX改變了線粒體外膜通透性，可激活Caspase家族，導致細胞內蛋白水解和細胞死亡。既往研究證實，在ONC模型中通過抑制Caspase-3能有效降低RGC死亡率[15]。本研究也發現，D組較C組、E組Caspase-3蛋白相對表達量降低。這或許可以說明，KLF7是通過提高Bcl-2蛋白表達與降低BAX蛋白表達，從而降低Caspase-3表達，起到保護RGC的作用。
本研究的局限性在于：（1）僅觀察了KLF7在RGC損傷保護機制的部分信號通路以及作用因子，而未針對以上各通路之間是否具有相互作用以及各通路在RGC損傷后的保護作用的強弱占比進行深入研究；（2）未對RGC和視神經軸突形態和密度進行染色觀察，缺乏以此來評估KLF7對RGC和視神經軸突的保護作用。以上不足，值得在今后的研究中深入豐富細化。
