視網膜母細胞瘤（RB）是嬰幼兒最常見的原發性眼內惡性腫瘤，嚴重影響患兒的視功能，當發生全身轉移時可危及生命。環狀RNA（circRNA）是一類最新發現的非編碼RNA，主要通過競爭性結合微小核糖核酸參與調控基因的表達。circRNA可作為促癌或抑癌因子調控RB細胞的增殖、遷移、凋亡、自噬及耐藥等多種生物學過程，為RB提供新的藥物治療靶點。此外，腫瘤組織或外泌體中circRNA的差異表達有望成為RB潛在的生物標志物。對于circRNA在RB中的功能和調控機制仍然需要進一步的研究和探索，以揭示其在生物體內的精確作用和潛在的臨床應用。
引用本文： 魏朋雪, 梁佳, 王世靜, 方冬, 張少沖. 環狀RNA在視網膜母細胞瘤的研究進展. 中華眼底病雜志, 2024, 40(6): 478-484. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20231120-00465 復制
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視網膜母細胞瘤（RB）是嬰幼兒最常見的原發性眼內惡性腫瘤，全球發病率約為1/16 000～18 000，并呈逐漸上升的趨勢[1]。發達國家由于基因檢測技術、早期診斷率的提高以及新型靶向治療和多模式治療方法的普及，RB患兒的3年存活率提高至98%～100%，但在低收入國家，僅約50%[2]。主要原因包括診斷延遲、醫療水平落后等。早診斷、早治療是改善RB患兒生存結果的關鍵[3]。目前，RB的治療方法主要包括靜脈及動脈介入化學藥物治療（以下簡稱為化療）、經眼動脈介入化療、玻璃體腔藥物注射化療、眼球摘除手術、激光光凝治療及冷凍治療等。治療時機對保眼療法的選擇及視力的挽救至關重要，化療藥物的耐藥性和高毒性使得RB對基因靶向治療的需求日益增長[4]。因此，尋找RB的生物標志物及基因治療靶點，對疾病的早診斷、早治療和預后評估具有重要意義。近年來，研究發現，多種環狀RNA（circRNA）在RB中異常表達，參與腫瘤發生和發展過程的調控[5-6]。此外，多種circRNA在RB診斷、靶向治療等方面的潛力也被逐步挖掘。現就circRNA在RB的研究進展作一綜述。
1 circRNA概述
circRNA是一類特殊的非編碼RNA分子，其序列形成一個環狀結構，廣泛存在于多種生物系統中，包括植物、動物和微生物[7]。circRNA的產生通常是由于原轉錄體的剪切事件發生錯誤，導致剪切酶在前體信使RNA（mRNA）鏈上形成閉合的環結構，80%的circRNA位于細胞質中。與線性RNA不同，circRNA的環狀結構使其具有較高的穩定性，不易被核酸酶降解，從而在細胞中具有較長的半衰期。circRNA根據其結構可分為3種主要類型：內含子circRNA、外顯子環狀RNA（ecircRNA）和外顯子-內含子circRNA，其中ecircRNA含量最高[8]。
circRNA可通過多種分子機制發揮生物學功能。一方面，circRNA有多個微小RNA（miRNA）結合位點，充當miRNA的“海綿”，吸附下游多個miRNA分子，從而解除miRNA對其他靶基因的作用，這也被稱為競爭性內源性RNA（ceRNA）調控機制[9]。另一方面，circRNA能夠作用于RNA結合蛋白，改變RNA穩定性、轉錄活性以及轉錄后修飾等，從而調控蛋白的表達和功能[10]。此外，circRNA還能直接與其他RNA分子，如mRNA或其他非編碼RNA等形成復合物，調節RNA的甲基化水平，參與轉錄調控、剪接調控等過程，從而調節基因表達和功能[11]。最新研究證明，circRNA能編碼和翻譯蛋白質[12]。近年來有大量文獻報道，circRNA在多種腫瘤的發生和發展中發揮調節作用，如circZNF566通過作為miR-4738-3p的ceRNA，加速肝細胞癌中的腫瘤生長和轉移[13]。circ-0052112通過結合miR-125a-5p加速乳腺癌細胞的遷移和侵襲等[14]。同樣，circRNA在RB發生、發展、診斷、治療和預后中也扮演著重要的角色（表1）[5, 6, 15-39]。
表1
circRNA在RB中的作用機制及靶點
2 circRNA調控RB的發生發展
2.1 促癌circRNA
2.1.1 circ-0000527
circ-0000527是FAM158A基因上已知唯一circRNA，又名circ-FAM158A。多項研究證明，circ-0000527在RB細胞和腫瘤組織中高表達，沉默circ-0000527的表達能夠抑制RB細胞的增殖、遷移、侵襲和血管生成，并促進腫瘤細胞死亡[5, 15-19]。研究發現，在RB患者中circ-0000527通過結合miR-646間接上調LDL受體相關蛋白6（LRP6）和B淋巴細胞瘤-2基因（BCL-2）的表達，從而促進RB細胞的發展[5, 15]。BCL-2蛋白是BCL蛋白家族的抗凋亡成員之一，其異常高表達會促進RB腫瘤的侵襲及分化不良[40]。而LRP6是Wnt信號通路中的經典受體之一，在多種癌癥中可異常激活Wnt/β-連環蛋白信號級聯反應，增加腫瘤侵襲轉移的能力[41]。除Wnt/β-連環蛋白通路外，circ-0000527還通過miR-27a-3p靶向組蛋白去乙酰化酶，下調磷脂酰肌醇激酶和蛋白激酶B（AKT）蛋白的磷酸化水平，參與腫瘤發生、遷移侵襲、上皮間質轉化（EMT）和耐藥形成等，促進腫瘤血管生成[16]。研究發現，circ-0000527通過調控miR-1236-3p/SMAD家族成員2軸，影響轉化生長因子-β信號傳導途徑，促進RB腫瘤的血管生成。circ-0000527還能抑制凋亡相關通路阻止細胞的凋亡[17]。circ-0000527通過miR-98-5p/X連鎖凋亡抑制蛋白軸下調凋亡執行蛋白半胱氨酸蛋白酶的表達，抑制腫瘤細胞凋亡，從而促進RB的發生和發展[18]。同時，circ-0000527還可作為miR-138-5p的ceRNA上調氨基酸轉運蛋白溶質載體家族7成員5的表達，滿足癌細胞對氨基酸的高需求，減弱miR-138-5p的抗腫瘤效應[19]。
2.1.2 circ-0000034
circ-0000034，又名circ-001787、circDHDDS等，位于DHDDS基因上，該基因的突變與視網膜色素變性有關[42]。circ-0000034可以通過多種途徑促進體外RB細胞的活力、遷移、侵襲、自噬和EMT過程，調低circ-0000034能夠導致RB細胞停滯在細胞周期的靜止期（G0）/DNA合成前期（G1）階段，并誘導細胞凋亡[20-23]。miR-361-3p是目前研究發現circ-0000034在RB中的唯一靶點，且被證實在RB中起抑癌基因的作用[43]。circ-0000034作為miR-361-3p的ceRNA，調節下游多個靶基因，如WNT3A、STX17等基因。circ-0000034通過miR-361-3p調節WNT3A的表達，起到促癌作用[21]。活性金屬蛋白酶ADAM金屬肽酶結構域19也是miR-361-3p的下游靶點之一，其通過細胞黏附和蛋白水解參與RB細胞遷移，促進RB腫瘤的侵襲[22]。
2.1.3 circ-0075804
circ-0075804源自E2F轉錄因子3（E2F3）基因，位于6號染色體。E2F3能與RB蛋白直接相互作用，調節參與細胞周期的基因表達[44]。研究表明，在RB組織和細胞中，circ-0075804的表達上調能夠促進RB細胞增殖和腫瘤的惡性表型，并減少RB細胞凋亡[24-27]。這可能與circ-0075804能結合異質性核糖核蛋白，增加E2F3的穩定性有關[24]。Rho相關卷曲螺旋形成蛋白激酶1（ROCK1）是絲氨酸/蘇氨酸AGC激酶家族的成員之一，位于染色體18q11.1上，負責多種細胞信號傳導，包括增殖、分化、遷移、黏附和細胞骨架重建等[45]。circ-0075804可通過結合miR-204-5p激活ROCK1通路，調控RB的進展[25]。circ-0075804還作為miR-138-5p的“海綿”，作用于PEG10基因的3'非翻譯區[26]，促進RB發展。circ-0075804通過靶向miR-1287-5p來促進細胞骨架支架蛋白LIM和SH3蛋白1的表達，使腫瘤細胞侵襲增加，促進RB的轉移[27]。
2.1.4 其他circRNA
除了上述circRNA，還有不少circRNA也在RB的發生和發展中起重要的促進作用，如circRNF20、circ-ODC1、circ-0099198、circROBO1、circ-0000989等[28-32]。PAX6基因屬于PAX基因家族，是視網膜形成和其他眼組織發育過程中關鍵的調節因子。該基因異常可以導致先天性無虹膜癥前節發育不全、青光眼以及RB的發生[46]。circRNF20直接靶向RB的抑癌基因miR-132-3p，間接作用于PAX6基因，促進RB的發生和發展[28]。長鏈非編碼RNA ZFPM2-AS1及miR-130a-3p都通過靶向PAX6參與調節RB的發展及耐藥過程[47-48]。
此外，ODC1基因是多胺合成中的關鍵代謝酶，已被證實在許多癌癥中有致癌性[49]。Du等[29]證實circ-ODC1通過靶向miR-422a，激活S期激酶相關蛋白2（SKP2）促進RB腫瘤的發展。SKP2屬于F-box蛋白家族，是一種參與泛素化、自噬、細胞周期調控和信號轉導的基因。研究發現，抑制SKP2基因可在體內外實驗中增加非小細胞肺癌細胞及骨肉瘤細胞對順鉑的敏感性，克服腫瘤耐藥[50]。circ-0099198也通過調節miR-1287/LRP6軸促進RB Y79和SO-RB50細胞系的增殖和轉移，加快細胞周期進程[30]。
2.2 抑癌circRNA
2.2.1 circMKLN1
circMKLN1位于MKLN1基因上。研究表明，circMKLN1參與糖尿病視網膜病變發展中的自噬過程，促進新生血管的生成[51]。MKLN1編碼的肌肉蛋白可以作為細胞擴散和細胞骨架形成過程中的介質，參與細胞增殖。circMKLN1上調可以結合miR-425-5p，下游調控RB的抑癌基因程序性細胞死亡因子4（PDCD4），發揮抑癌作用。蛋白免疫印跡法證明，circMKLN1的表達上調會導致Y79和WERI-RB1細胞中的原癌基因c-MYC及基質金屬蛋白酶9的表達水平下降，組成細胞骨架的波形蛋白的水平也降低。另外，作為癌細胞侵襲和生長的活性抑制蛋白，E-鈣粘蛋白的表達水平也隨著circMKLN1的表達上調而增加，沉默PDCD4基因使circMKLN1的抑癌作用大大減弱[6]。
2.2.2 circ-0001649
circ-0001649是DNA修復蛋白基因SHPRH的轉錄產物，作為腫瘤抑制基因，通過Wnt/β-catenin信號通路負向調控腫瘤的發生發展[52]。circ-0001649已被證實與前列腺癌、胃癌、肝癌等癌癥相關[53]。circ-0001649在RB組織和細胞中表達下調，可能通過激活AKT/哺乳類動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路發揮抑癌作用。AKT在參與腫瘤活動的多條信號通路中發揮著關鍵作用，如細胞增殖、凋亡、腫瘤血管生成和葡萄糖代謝等。在RB細胞的體內外實驗中均發現上調circ-0001649表達，可下調mTOR及AKT的表達，使RB細胞的活力明顯下降，細胞增殖減少而凋亡增加[37]。
2.2.3 circ-0093996
circ-0093996位于TET1基因上。TET1作為TET蛋白家族的成員，是影響DNA甲基化/去甲基化周期的重要腫瘤抑制因子[54]。circ0093996過表達會導致RB細胞系Y79和WERI-RB1細胞在G0/G1期停滯，阻止細胞周期進程。circTET1通過結合miR-492/miR-494-3p降低了β-連環蛋白、c-MYC的表達水平，并增加了糖原合酶激酶3的水平。糖原合酶激酶3是一種在進化上非常保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，能使β-連環蛋白活性降低，避免其在胞漿內大量聚集，從而抑制Wnt/β-連環蛋白通路，最終導致RB細胞增殖、遷移和侵襲能力的減弱[38]。
2.2.4 circCUL2
cirCUL2起源于E3泛素連接酶CUL2 mRNA的反向剪接，具有細胞周期調節作用[55]。E2F轉錄因子家族成員2（E2F2）是在終末紅細胞成熟過程中誘導的RB調節的轉錄因子，作為癌癥進展中細胞侵襲和增殖的重要調節因子。cirCUL2可作為miR-214-5p的ceRNA，作用于E2F2。cirCUL2在RB細胞中高表達，可間接抑制E2F2的表達，抑制腫瘤血管的生成，從而降低RB細胞增殖、遷移的能力[6]。
2.3 circRNA參與RB的耐藥過程
腫瘤耐藥是一個涉及多基因、多個信號通路的復雜過程，是導致患者腫瘤復發及轉移的主要因素，與患者的預后密切相關。circ-0000527、circ-0000034及circ-0093996都通過Wnt/β-catenin通路等參與腫瘤細胞的耐藥過程。circ-ODC1和circRNF20可分別通過對SKP2和PAX6的調控，降低RB耐藥性。未來仍需更深入的研究去證實其在克服腫瘤耐藥性中的作用。Wang等[21]研究報道，給裸鼠皮下植入轉染sh-circ-0000034/sh-NC的Y79細胞，建立體外RB腫瘤模型，結果表明敲低circ-0000034可顯著縮小腫瘤的體積和重量，這可能與沉默circ-0000034能降低RB細胞中與癌癥干細胞特征相關的基因CD133、SOX2和Nanog的表達水平有關，這些基因對于腫瘤細胞耐藥性和復發性具有重要意義。細胞自噬是將細胞內受損、變性或衰老的蛋白質以及細胞器運輸到溶酶體進行消化降解的過程。自噬在幫助多種腫瘤細胞抵抗放射損傷及藥物治療方面起著關鍵作用。circ-0000034能作用于STX17，促進自噬體與溶酶體融合，激活細胞質內自噬過程[23]。此外，敲除circ-0000034還可以下調RB細胞系Y79及WERI-RB1中微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅱ型/微管相關蛋白1輕鏈3-I型和芐氯素1的表達水平，減弱自噬活性，RB細胞的耐藥性也隨之下降。這表示circ-0000034可能通過激活自噬增加RB細胞對藥物的抵抗[51]。總之，靶向circRNA可能有效抑制RB的惡性生物學行為，有望降低腫瘤細胞的耐藥，從而改善患者預后。未來研究可致力于考察靶向耐藥相關circRNA與當前主流抗癌藥物聯合應用在RB耐藥細胞株及體內腫瘤移植小鼠模型中的治療效果及復發率，以進一步驗證circRNA在RB靶向治療中的應用效果。
3 circRNA在RB診治中的應用前景
3.1 circRNA是RB潛在的診斷標志物
當前臨床上診斷RB主要依靠影像學檢查技術，包括核磁共振成像、CT和B型超聲等。由于腫瘤組織位于眼內，直接進行組織活檢病理檢查相對困難[56]。此外，患兒的年齡較小，往往難以配合檢查，使診斷效率降低。因此，研究人員近年來致力于采用非侵入性生物標志物、液體活檢來診斷RB。其中，circRNA因高穩定性和高特異性等特點，有望成為早期診斷RB的理想生物標志物。
Lyu等[57]研究報道，通過視網膜RNA測序實驗結果發現，與癌旁視網膜相比，原發性RB患者的腫瘤樣本中有550個circRNA下調，其中circ-0093996下調最為顯著。逆轉錄聚合酶鏈反應實驗也表明，circRNA表達水平在RB腫瘤組織中顯著低表達。研究報道，circ-0000034在RB腫瘤標本中的平均表達量是健康對照組的2～4倍[21-22]。同樣，circ-0075804、circ-0000527、circ-0000989、circ-0001649等以上促抑癌circRNA在RB腫瘤標本與正常組織中存在差異表達[16, 24, 37]。這些差異表達的circRNA都可能成為診斷RB的潛在標記物。遺憾的是，當前這些研究樣本都局限于RB腫瘤組織與原代細胞系，并未探究血漿或其他體液中circRNA的差異表達，距離臨床應用尚有一定距離。
近年來，外泌體中circRNA在惡性腫瘤診斷中的應用逐漸受到關注。腫瘤細胞釋放的外泌體能夠參與血管生成、免疫抑制和腫瘤進展等。外泌體是直徑為40～100 nm的納米級囊泡，攜帶各種生物分子，如脂質、蛋白質、mRNA和miRNA等[58]。circRNA在外泌體中的含量比細胞中更豐富，且性質更穩定。外泌體circRNA可在多種體液中被檢測提取，具有無創或低創、可重復采樣等優點，可以對疾病進展進行動態、實時監測[59]。這些特點為外泌體circRNA成為腫瘤早期診斷的理想分子標志物提供優勢。An等[28]研究報道，RB患者血清來源的外泌體中circRNF20表達水平明顯上調，且TNM Ⅲ期患者中的表達水平高于TNMⅠ/Ⅱ期患者。同時，與RB患者血清來源的外泌體一起孵育的RB細胞株Y79和WERI-RB1細胞活力上升、增殖加快。這些結果印證外泌體circRNF20能夠促進RB進展，并可能作為RB診斷的生物標志物，凸顯了外泌體circRNA在RB診療中的應用前景。
3.2 circRNA可作為RB潛在的治療靶點和預后生物標志物
目前臨床上對于RB的治療以化療為主，必要時行眼球摘除手術。全身靜脈化療療效欠佳，腫瘤復發率高，使眼球摘除率增加，同時全身靜脈化療會產生較大的毒副作用，患兒易發生骨髓抑制、全身感染等嚴重并發癥[36]。盡管近年來出現了經眼動脈介入化療等新手段，降低了藥物的全身毒性，但也會出現脈絡膜血管萎縮、眼動脈阻塞及腦卒中等副作用[60-61]，同時存在RB腫瘤細胞耐藥的問題，療效隨化療周期逐步下降[56]。因此，克服RB化療耐藥復發及轉移，尋找RB潛在的治療靶點和預后生物標志物成為RB治療的當務之急。
腫瘤治療方案的制定取決于臨床分期評估。致癌circRNA circ-0000527和circRNF20的高表達程度與腫瘤分化程度和TNM分期的升高密切相關。高水平的circRNF20預示著總生存率較低，而circ-0000527的表達水平還與腫瘤對視神經和脈絡膜的侵犯程度呈正相關[17, 28]。Sun等[20]研究報道，circ-0000034的高表達預示著更高的眼內期視網膜母細胞瘤國際分期和較早的視神經侵犯。相反，抑癌circRNA circ-0001649的低表達預示著更嚴重的眼內期視網膜母細胞瘤國際分期和較早的視神經侵犯[37]。Xu等[6]研究報道，高水平的circMKLN1與RB患者的良好預后相關。
同時，體內外實驗均證明circ-0000527、circ-0000034、circ-0075804、circ-ODC1、circ-RNF20、circ-0099198及circ-0007534的低表達，circMKLN1、circ-0093996的高表達可延緩RB腫瘤的生長，有望成為RB的治療靶點。An等[28]研究報道，將針對circ-RNF20的特定小干擾shRNA轉染至Y79/WERI-RB1細胞系中，結果發現RB細胞的細胞活力下降約50%，細胞增殖明顯減弱，且RB細胞的集落形成能力明顯下降。研究報道，在異種移植腫瘤的小鼠中，sh-circRNF20組的異種移植腫瘤的體積和重量同樣比sh-空白對照組降低約50%，這提示沉默circRNF20可有效抑制RB腫瘤的生長，達到治療目的。Xu等[6]將circMKLN過表達載體轉染至Y79和WERI-RB1細胞中以提高circMKLN1表達水平，對其集落形成能力抑制率分別為63%和61%，同時在體內實驗中發現上調circMKLN1可使小鼠體內腫瘤體積明顯縮小。研究發現，circRNA還能影響抑癌藥物對RB的治療效果，如過表達circ-0007534能逆轉抑癌藥物蛇床子素對Y79細胞活力和集落數的抑制作用，降低藥物療效[34]。
4 小結與展望
circRNA作為促癌或抑癌因素調控RB細胞的增殖、遷移、凋亡、自噬及耐藥等多種生物學過程，為RB提供新的藥物治療靶點。此外，腫瘤組織或外泌體中circRNA的差異表達有望成為RB潛在的生物標志物。但目前circRNA作為RB的生物標志物還停留于小樣本基礎研究階段，需要大量臨床試驗驗證才能逐步實現臨床轉化。circRNA可以結合多個靶基因調節RB細胞的基因表達，難以確定其精確的生物學意義。對于circRNA在RB中的功能和調控機制仍然需要進一步的研究和探索，以揭示其在生物體內的精確作用和潛在的臨床應用。
視網膜母細胞瘤（RB）是嬰幼兒最常見的原發性眼內惡性腫瘤，全球發病率約為1/16 000～18 000，并呈逐漸上升的趨勢[1]。發達國家由于基因檢測技術、早期診斷率的提高以及新型靶向治療和多模式治療方法的普及，RB患兒的3年存活率提高至98%～100%，但在低收入國家，僅約50%[2]。主要原因包括診斷延遲、醫療水平落后等。早診斷、早治療是改善RB患兒生存結果的關鍵[3]。目前，RB的治療方法主要包括靜脈及動脈介入化學藥物治療（以下簡稱為化療）、經眼動脈介入化療、玻璃體腔藥物注射化療、眼球摘除手術、激光光凝治療及冷凍治療等。治療時機對保眼療法的選擇及視力的挽救至關重要，化療藥物的耐藥性和高毒性使得RB對基因靶向治療的需求日益增長[4]。因此，尋找RB的生物標志物及基因治療靶點，對疾病的早診斷、早治療和預后評估具有重要意義。近年來，研究發現，多種環狀RNA（circRNA）在RB中異常表達，參與腫瘤發生和發展過程的調控[5-6]。此外，多種circRNA在RB診斷、靶向治療等方面的潛力也被逐步挖掘。現就circRNA在RB的研究進展作一綜述。
1 circRNA概述
circRNA是一類特殊的非編碼RNA分子，其序列形成一個環狀結構，廣泛存在于多種生物系統中，包括植物、動物和微生物[7]。circRNA的產生通常是由于原轉錄體的剪切事件發生錯誤，導致剪切酶在前體信使RNA（mRNA）鏈上形成閉合的環結構，80%的circRNA位于細胞質中。與線性RNA不同，circRNA的環狀結構使其具有較高的穩定性，不易被核酸酶降解，從而在細胞中具有較長的半衰期。circRNA根據其結構可分為3種主要類型：內含子circRNA、外顯子環狀RNA（ecircRNA）和外顯子-內含子circRNA，其中ecircRNA含量最高[8]。
circRNA可通過多種分子機制發揮生物學功能。一方面，circRNA有多個微小RNA（miRNA）結合位點，充當miRNA的“海綿”，吸附下游多個miRNA分子，從而解除miRNA對其他靶基因的作用，這也被稱為競爭性內源性RNA（ceRNA）調控機制[9]。另一方面，circRNA能夠作用于RNA結合蛋白，改變RNA穩定性、轉錄活性以及轉錄后修飾等，從而調控蛋白的表達和功能[10]。此外，circRNA還能直接與其他RNA分子，如mRNA或其他非編碼RNA等形成復合物，調節RNA的甲基化水平，參與轉錄調控、剪接調控等過程，從而調節基因表達和功能[11]。最新研究證明，circRNA能編碼和翻譯蛋白質[12]。近年來有大量文獻報道，circRNA在多種腫瘤的發生和發展中發揮調節作用，如circZNF566通過作為miR-4738-3p的ceRNA，加速肝細胞癌中的腫瘤生長和轉移[13]。circ-0052112通過結合miR-125a-5p加速乳腺癌細胞的遷移和侵襲等[14]。同樣，circRNA在RB發生、發展、診斷、治療和預后中也扮演著重要的角色（表1）[5, 6, 15-39]。
表1
circRNA在RB中的作用機制及靶點
2 circRNA調控RB的發生發展
2.1 促癌circRNA
2.1.1 circ-0000527
circ-0000527是FAM158A基因上已知唯一circRNA，又名circ-FAM158A。多項研究證明，circ-0000527在RB細胞和腫瘤組織中高表達，沉默circ-0000527的表達能夠抑制RB細胞的增殖、遷移、侵襲和血管生成，并促進腫瘤細胞死亡[5, 15-19]。研究發現，在RB患者中circ-0000527通過結合miR-646間接上調LDL受體相關蛋白6（LRP6）和B淋巴細胞瘤-2基因（BCL-2）的表達，從而促進RB細胞的發展[5, 15]。BCL-2蛋白是BCL蛋白家族的抗凋亡成員之一，其異常高表達會促進RB腫瘤的侵襲及分化不良[40]。而LRP6是Wnt信號通路中的經典受體之一，在多種癌癥中可異常激活Wnt/β-連環蛋白信號級聯反應，增加腫瘤侵襲轉移的能力[41]。除Wnt/β-連環蛋白通路外，circ-0000527還通過miR-27a-3p靶向組蛋白去乙酰化酶，下調磷脂酰肌醇激酶和蛋白激酶B（AKT）蛋白的磷酸化水平，參與腫瘤發生、遷移侵襲、上皮間質轉化（EMT）和耐藥形成等，促進腫瘤血管生成[16]。研究發現，circ-0000527通過調控miR-1236-3p/SMAD家族成員2軸，影響轉化生長因子-β信號傳導途徑，促進RB腫瘤的血管生成。circ-0000527還能抑制凋亡相關通路阻止細胞的凋亡[17]。circ-0000527通過miR-98-5p/X連鎖凋亡抑制蛋白軸下調凋亡執行蛋白半胱氨酸蛋白酶的表達，抑制腫瘤細胞凋亡，從而促進RB的發生和發展[18]。同時，circ-0000527還可作為miR-138-5p的ceRNA上調氨基酸轉運蛋白溶質載體家族7成員5的表達，滿足癌細胞對氨基酸的高需求，減弱miR-138-5p的抗腫瘤效應[19]。
2.1.2 circ-0000034
circ-0000034，又名circ-001787、circDHDDS等，位于DHDDS基因上，該基因的突變與視網膜色素變性有關[42]。circ-0000034可以通過多種途徑促進體外RB細胞的活力、遷移、侵襲、自噬和EMT過程，調低circ-0000034能夠導致RB細胞停滯在細胞周期的靜止期（G0）/DNA合成前期（G1）階段，并誘導細胞凋亡[20-23]。miR-361-3p是目前研究發現circ-0000034在RB中的唯一靶點，且被證實在RB中起抑癌基因的作用[43]。circ-0000034作為miR-361-3p的ceRNA，調節下游多個靶基因，如WNT3A、STX17等基因。circ-0000034通過miR-361-3p調節WNT3A的表達，起到促癌作用[21]。活性金屬蛋白酶ADAM金屬肽酶結構域19也是miR-361-3p的下游靶點之一，其通過細胞黏附和蛋白水解參與RB細胞遷移，促進RB腫瘤的侵襲[22]。
2.1.3 circ-0075804
circ-0075804源自E2F轉錄因子3（E2F3）基因，位于6號染色體。E2F3能與RB蛋白直接相互作用，調節參與細胞周期的基因表達[44]。研究表明，在RB組織和細胞中，circ-0075804的表達上調能夠促進RB細胞增殖和腫瘤的惡性表型，并減少RB細胞凋亡[24-27]。這可能與circ-0075804能結合異質性核糖核蛋白，增加E2F3的穩定性有關[24]。Rho相關卷曲螺旋形成蛋白激酶1（ROCK1）是絲氨酸/蘇氨酸AGC激酶家族的成員之一，位于染色體18q11.1上，負責多種細胞信號傳導，包括增殖、分化、遷移、黏附和細胞骨架重建等[45]。circ-0075804可通過結合miR-204-5p激活ROCK1通路，調控RB的進展[25]。circ-0075804還作為miR-138-5p的“海綿”，作用于PEG10基因的3'非翻譯區[26]，促進RB發展。circ-0075804通過靶向miR-1287-5p來促進細胞骨架支架蛋白LIM和SH3蛋白1的表達，使腫瘤細胞侵襲增加，促進RB的轉移[27]。
2.1.4 其他circRNA
除了上述circRNA，還有不少circRNA也在RB的發生和發展中起重要的促進作用，如circRNF20、circ-ODC1、circ-0099198、circROBO1、circ-0000989等[28-32]。PAX6基因屬于PAX基因家族，是視網膜形成和其他眼組織發育過程中關鍵的調節因子。該基因異常可以導致先天性無虹膜癥前節發育不全、青光眼以及RB的發生[46]。circRNF20直接靶向RB的抑癌基因miR-132-3p，間接作用于PAX6基因，促進RB的發生和發展[28]。長鏈非編碼RNA ZFPM2-AS1及miR-130a-3p都通過靶向PAX6參與調節RB的發展及耐藥過程[47-48]。
此外，ODC1基因是多胺合成中的關鍵代謝酶，已被證實在許多癌癥中有致癌性[49]。Du等[29]證實circ-ODC1通過靶向miR-422a，激活S期激酶相關蛋白2（SKP2）促進RB腫瘤的發展。SKP2屬于F-box蛋白家族，是一種參與泛素化、自噬、細胞周期調控和信號轉導的基因。研究發現，抑制SKP2基因可在體內外實驗中增加非小細胞肺癌細胞及骨肉瘤細胞對順鉑的敏感性，克服腫瘤耐藥[50]。circ-0099198也通過調節miR-1287/LRP6軸促進RB Y79和SO-RB50細胞系的增殖和轉移，加快細胞周期進程[30]。
2.2 抑癌circRNA
2.2.1 circMKLN1
circMKLN1位于MKLN1基因上。研究表明，circMKLN1參與糖尿病視網膜病變發展中的自噬過程，促進新生血管的生成[51]。MKLN1編碼的肌肉蛋白可以作為細胞擴散和細胞骨架形成過程中的介質，參與細胞增殖。circMKLN1上調可以結合miR-425-5p，下游調控RB的抑癌基因程序性細胞死亡因子4（PDCD4），發揮抑癌作用。蛋白免疫印跡法證明，circMKLN1的表達上調會導致Y79和WERI-RB1細胞中的原癌基因c-MYC及基質金屬蛋白酶9的表達水平下降，組成細胞骨架的波形蛋白的水平也降低。另外，作為癌細胞侵襲和生長的活性抑制蛋白，E-鈣粘蛋白的表達水平也隨著circMKLN1的表達上調而增加，沉默PDCD4基因使circMKLN1的抑癌作用大大減弱[6]。
2.2.2 circ-0001649
circ-0001649是DNA修復蛋白基因SHPRH的轉錄產物，作為腫瘤抑制基因，通過Wnt/β-catenin信號通路負向調控腫瘤的發生發展[52]。circ-0001649已被證實與前列腺癌、胃癌、肝癌等癌癥相關[53]。circ-0001649在RB組織和細胞中表達下調，可能通過激活AKT/哺乳類動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路發揮抑癌作用。AKT在參與腫瘤活動的多條信號通路中發揮著關鍵作用，如細胞增殖、凋亡、腫瘤血管生成和葡萄糖代謝等。在RB細胞的體內外實驗中均發現上調circ-0001649表達，可下調mTOR及AKT的表達，使RB細胞的活力明顯下降，細胞增殖減少而凋亡增加[37]。
2.2.3 circ-0093996
circ-0093996位于TET1基因上。TET1作為TET蛋白家族的成員，是影響DNA甲基化/去甲基化周期的重要腫瘤抑制因子[54]。circ0093996過表達會導致RB細胞系Y79和WERI-RB1細胞在G0/G1期停滯，阻止細胞周期進程。circTET1通過結合miR-492/miR-494-3p降低了β-連環蛋白、c-MYC的表達水平，并增加了糖原合酶激酶3的水平。糖原合酶激酶3是一種在進化上非常保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，能使β-連環蛋白活性降低，避免其在胞漿內大量聚集，從而抑制Wnt/β-連環蛋白通路，最終導致RB細胞增殖、遷移和侵襲能力的減弱[38]。
2.2.4 circCUL2
cirCUL2起源于E3泛素連接酶CUL2 mRNA的反向剪接，具有細胞周期調節作用[55]。E2F轉錄因子家族成員2（E2F2）是在終末紅細胞成熟過程中誘導的RB調節的轉錄因子，作為癌癥進展中細胞侵襲和增殖的重要調節因子。cirCUL2可作為miR-214-5p的ceRNA，作用于E2F2。cirCUL2在RB細胞中高表達，可間接抑制E2F2的表達，抑制腫瘤血管的生成，從而降低RB細胞增殖、遷移的能力[6]。
2.3 circRNA參與RB的耐藥過程
腫瘤耐藥是一個涉及多基因、多個信號通路的復雜過程，是導致患者腫瘤復發及轉移的主要因素，與患者的預后密切相關。circ-0000527、circ-0000034及circ-0093996都通過Wnt/β-catenin通路等參與腫瘤細胞的耐藥過程。circ-ODC1和circRNF20可分別通過對SKP2和PAX6的調控，降低RB耐藥性。未來仍需更深入的研究去證實其在克服腫瘤耐藥性中的作用。Wang等[21]研究報道，給裸鼠皮下植入轉染sh-circ-0000034/sh-NC的Y79細胞，建立體外RB腫瘤模型，結果表明敲低circ-0000034可顯著縮小腫瘤的體積和重量，這可能與沉默circ-0000034能降低RB細胞中與癌癥干細胞特征相關的基因CD133、SOX2和Nanog的表達水平有關，這些基因對于腫瘤細胞耐藥性和復發性具有重要意義。細胞自噬是將細胞內受損、變性或衰老的蛋白質以及細胞器運輸到溶酶體進行消化降解的過程。自噬在幫助多種腫瘤細胞抵抗放射損傷及藥物治療方面起著關鍵作用。circ-0000034能作用于STX17，促進自噬體與溶酶體融合，激活細胞質內自噬過程[23]。此外，敲除circ-0000034還可以下調RB細胞系Y79及WERI-RB1中微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅱ型/微管相關蛋白1輕鏈3-I型和芐氯素1的表達水平，減弱自噬活性，RB細胞的耐藥性也隨之下降。這表示circ-0000034可能通過激活自噬增加RB細胞對藥物的抵抗[51]。總之，靶向circRNA可能有效抑制RB的惡性生物學行為，有望降低腫瘤細胞的耐藥，從而改善患者預后。未來研究可致力于考察靶向耐藥相關circRNA與當前主流抗癌藥物聯合應用在RB耐藥細胞株及體內腫瘤移植小鼠模型中的治療效果及復發率，以進一步驗證circRNA在RB靶向治療中的應用效果。
3 circRNA在RB診治中的應用前景
3.1 circRNA是RB潛在的診斷標志物
當前臨床上診斷RB主要依靠影像學檢查技術，包括核磁共振成像、CT和B型超聲等。由于腫瘤組織位于眼內，直接進行組織活檢病理檢查相對困難[56]。此外，患兒的年齡較小，往往難以配合檢查，使診斷效率降低。因此，研究人員近年來致力于采用非侵入性生物標志物、液體活檢來診斷RB。其中，circRNA因高穩定性和高特異性等特點，有望成為早期診斷RB的理想生物標志物。
Lyu等[57]研究報道，通過視網膜RNA測序實驗結果發現，與癌旁視網膜相比，原發性RB患者的腫瘤樣本中有550個circRNA下調，其中circ-0093996下調最為顯著。逆轉錄聚合酶鏈反應實驗也表明，circRNA表達水平在RB腫瘤組織中顯著低表達。研究報道，circ-0000034在RB腫瘤標本中的平均表達量是健康對照組的2～4倍[21-22]。同樣，circ-0075804、circ-0000527、circ-0000989、circ-0001649等以上促抑癌circRNA在RB腫瘤標本與正常組織中存在差異表達[16, 24, 37]。這些差異表達的circRNA都可能成為診斷RB的潛在標記物。遺憾的是，當前這些研究樣本都局限于RB腫瘤組織與原代細胞系，并未探究血漿或其他體液中circRNA的差異表達，距離臨床應用尚有一定距離。
近年來，外泌體中circRNA在惡性腫瘤診斷中的應用逐漸受到關注。腫瘤細胞釋放的外泌體能夠參與血管生成、免疫抑制和腫瘤進展等。外泌體是直徑為40～100 nm的納米級囊泡，攜帶各種生物分子，如脂質、蛋白質、mRNA和miRNA等[58]。circRNA在外泌體中的含量比細胞中更豐富，且性質更穩定。外泌體circRNA可在多種體液中被檢測提取，具有無創或低創、可重復采樣等優點，可以對疾病進展進行動態、實時監測[59]。這些特點為外泌體circRNA成為腫瘤早期診斷的理想分子標志物提供優勢。An等[28]研究報道，RB患者血清來源的外泌體中circRNF20表達水平明顯上調，且TNM Ⅲ期患者中的表達水平高于TNMⅠ/Ⅱ期患者。同時，與RB患者血清來源的外泌體一起孵育的RB細胞株Y79和WERI-RB1細胞活力上升、增殖加快。這些結果印證外泌體circRNF20能夠促進RB進展，并可能作為RB診斷的生物標志物，凸顯了外泌體circRNA在RB診療中的應用前景。
3.2 circRNA可作為RB潛在的治療靶點和預后生物標志物
目前臨床上對于RB的治療以化療為主，必要時行眼球摘除手術。全身靜脈化療療效欠佳，腫瘤復發率高，使眼球摘除率增加，同時全身靜脈化療會產生較大的毒副作用，患兒易發生骨髓抑制、全身感染等嚴重并發癥[36]。盡管近年來出現了經眼動脈介入化療等新手段，降低了藥物的全身毒性，但也會出現脈絡膜血管萎縮、眼動脈阻塞及腦卒中等副作用[60-61]，同時存在RB腫瘤細胞耐藥的問題，療效隨化療周期逐步下降[56]。因此，克服RB化療耐藥復發及轉移，尋找RB潛在的治療靶點和預后生物標志物成為RB治療的當務之急。
腫瘤治療方案的制定取決于臨床分期評估。致癌circRNA circ-0000527和circRNF20的高表達程度與腫瘤分化程度和TNM分期的升高密切相關。高水平的circRNF20預示著總生存率較低，而circ-0000527的表達水平還與腫瘤對視神經和脈絡膜的侵犯程度呈正相關[17, 28]。Sun等[20]研究報道，circ-0000034的高表達預示著更高的眼內期視網膜母細胞瘤國際分期和較早的視神經侵犯。相反，抑癌circRNA circ-0001649的低表達預示著更嚴重的眼內期視網膜母細胞瘤國際分期和較早的視神經侵犯[37]。Xu等[6]研究報道，高水平的circMKLN1與RB患者的良好預后相關。
同時，體內外實驗均證明circ-0000527、circ-0000034、circ-0075804、circ-ODC1、circ-RNF20、circ-0099198及circ-0007534的低表達，circMKLN1、circ-0093996的高表達可延緩RB腫瘤的生長，有望成為RB的治療靶點。An等[28]研究報道，將針對circ-RNF20的特定小干擾shRNA轉染至Y79/WERI-RB1細胞系中，結果發現RB細胞的細胞活力下降約50%，細胞增殖明顯減弱，且RB細胞的集落形成能力明顯下降。研究報道，在異種移植腫瘤的小鼠中，sh-circRNF20組的異種移植腫瘤的體積和重量同樣比sh-空白對照組降低約50%，這提示沉默circRNF20可有效抑制RB腫瘤的生長，達到治療目的。Xu等[6]將circMKLN過表達載體轉染至Y79和WERI-RB1細胞中以提高circMKLN1表達水平，對其集落形成能力抑制率分別為63%和61%，同時在體內實驗中發現上調circMKLN1可使小鼠體內腫瘤體積明顯縮小。研究發現，circRNA還能影響抑癌藥物對RB的治療效果，如過表達circ-0007534能逆轉抑癌藥物蛇床子素對Y79細胞活力和集落數的抑制作用，降低藥物療效[34]。
4 小結與展望
circRNA作為促癌或抑癌因素調控RB細胞的增殖、遷移、凋亡、自噬及耐藥等多種生物學過程，為RB提供新的藥物治療靶點。此外，腫瘤組織或外泌體中circRNA的差異表達有望成為RB潛在的生物標志物。但目前circRNA作為RB的生物標志物還停留于小樣本基礎研究階段，需要大量臨床試驗驗證才能逐步實現臨床轉化。circRNA可以結合多個靶基因調節RB細胞的基因表達，難以確定其精確的生物學意義。對于circRNA在RB中的功能和調控機制仍然需要進一步的研究和探索，以揭示其在生物體內的精確作用和潛在的臨床應用。
