引用本文： 何珍, 寇振宇, 東莉潔, 李筱榮. 組織蛋白酶L抑制劑經線粒體途徑抑制氧化應激誘導的視網膜色素上皮細胞凋亡. 中華眼底病雜志, 2024, 40(5): 379-386. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20231207-00474 復制
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氧化應激所導致的視網膜色素上皮（RPE）細胞凋亡，可引起年齡相關性黃斑變性、糖尿病視網膜病變等視網膜疾病[1-3]。線粒體是細胞中活性氧（ROS）的主要來源，而ROS含量的增加是氧化應激的主要原因[4]。過量的ROS可導致線粒體形態改變、膜電位降低，最終誘發線粒體功能障礙和細胞凋亡[5]。組織蛋白酶（CTS）L是溶酶體半胱氨酸蛋白酶家族的主要成員之一，幾乎在所有組織或細胞類型中都有表達[6-7]。文獻報道，CTSL通過活化細胞周期調節因子和調節細胞周期蛋白誘導神經細胞凋亡[8]；也可誘導卵巢癌細胞凋亡，而通過shRNA和選擇性抑制劑抑制CTSL表達后可顯著抑制細胞凋亡[9]。線粒體是參與能量產生、細胞代謝和氧化還原穩態的重要細胞器，也是調控細胞凋亡的重要部位[10-12]。內在凋亡途徑由線粒體外膜透化（MOMP）決定，其促進細胞色素C的釋放，加重線粒體功能障礙，激活半胱天冬酶，最終可導致細胞凋亡[13-14]。目前有研究發現，CTSL釋放到細胞質后，可將Bid切割為tBid，從而觸發MOMP，導致線粒體功能障礙，而CTSL抑制劑的應用可減少細胞色素C釋放，并降低半胱天冬酶活性[15]。本研究旨在觀察CTSL抑制劑對氧化應激誘導RPE細胞凋亡的作用，并進一步探索在細胞凋亡時其對線粒體功能的影響，以期為RPE細胞凋亡相關疾病的治療提供線索。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
人RPE細胞（ARPE-19）由本實驗室自行保存。Dublecco改良Eagle培養基（DMEM）/F12培養基（L310KJ，上海源培生物科技股份有限公司）；選擇性CTSL抑制劑Z-Phe-Tyr（tBu）-diazomethylketone（GC45599，美國Glpbio公司）；乙二胺四乙酸（EDTA）（12604013，美國Gibco公司）；二甲基亞砜（DMSO，D8370）、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，C0065）（北京索萊寶科技有限公司）；膜聯蛋白Ⅴ（Annexin Ⅴ）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（PI）細胞凋亡檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；CTSL（DF12880）、β-肌動蛋白（actin）（AF7018）一抗、二抗（美國Affinity公司）；Mito-Sox（40778EA50）、MitoTracker Green（40742ES50）[翌圣生物科技（上海）股份有限公司]；MitoTracker Red（C1049B，上海碧云天生物技術有限公司）。
1.2 方法
細胞培養和分組。ARPE-19置于含5 ml胎牛血清和0.5 ml雙抗的DMEM/F12培養基中常規培養，3～5 d 傳代1次，取對數生長期細胞用于后續實驗。將細胞正常組、過氧化氫（H2O2）組、H2O2+DMSO組、H2O2+CTSL抑制劑組。正常組常規培養，不作任何處理；H2O2組、H2O2+CTSL抑制劑組、H2O2+DMSO組置于含400 μmol/L H2O2的培養基孵育24 h；H2O2+CTSL抑制劑組、H2O2+DMSO組分別同時加入10 μmol/l CTSL抑制劑（根據前期預實驗結果）、0.1% DMSO。建模后24 h進行后續實驗。
DAPI染色檢測正常組、H2O2組細胞核數量。48孔板中每孔滴加100 μl的DAPI染液，5 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，5 min/次。熒光顯微鏡觀察拍照。實驗重復3次。
流式細胞儀檢測正常組、H2O2組細胞凋亡率。細胞按分組處理后，用不含EDTA的胰蛋白酶消化收集細胞，離心沉淀細胞。PBS重懸細胞，再次離心沉淀細胞。1倍結合緩沖液重懸細胞，調節細胞濃度為（1～5）×106/ml；取100 μl細胞懸液于5 ml流式管中，加入5 μl Annexin V/FITC混勻后于室溫避光孵育5 min；加入5 μl PI和400 μl PBS，流式細胞儀分析并計算各組細胞凋亡率，具體方法按試劑盒說明進行，采用Flowjo軟件分析。實驗重復3次。
免疫熒光染色法檢測各組細胞中CTSL蛋白表達。4%多聚甲醛固定細胞10 min，加入含0.1% Triton X-100的PBS通透細胞10 min，含1%牛血清白蛋白（BSA）的聚丁二酸-共-對苯二甲酸丁二醇酯（PBST）（PBS+0.1% Tween20）室溫封閉細胞30 min。含1% BSA的PBST稀釋CTSL一抗，4 ℃孵育過夜。PBST洗3次。含1% BSA的PBST稀釋Alexa Fluor488標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（熒光二抗），室溫避光孵育1 h。加入DAPI對細胞進行復染，熒光顯微鏡下觀察拍照。實驗重復3次。
蛋白質免疫印跡法（Western blot）檢測各組細胞中CTSL蛋白相對表達量。收集各組細胞，提取蛋白定量。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳中上樣電泳，轉至聚偏氟乙烯膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入CTSL、β-actin一抗，4 ℃孵育過夜，洗膜緩沖液（TBST）洗膜，加入辣根過氧化物酶羊抗兔二抗，室溫孵育2 h，TBST洗膜，加入化學發光底物進行曝光并拍照，凝膠成像系統掃描分析蛋白條帶。Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值，計算蛋白相對表達水平。實驗重復3次。
實時定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測各組細胞中CTSL mRNA相對表達量。RNA提取試劑盒提取各組細胞總RNA，反轉錄成cDNA。應用Primer 5.0軟件設計引物序列。CTSL正向引物：CTGGTGGTTGGCTACGGATT，反向引物：CTCCGGTCTTTGGCCATCTT；β-actin正向引物：CCTGGCACCCAGCACAAT，反向引物：GGGCCGGACTCGTCATAC。置于RT-PCR儀中進行擴增并輸出循環閾值（Cq值），以β-actin為內參照，依照公式2-ΔΔCq計算mRNA相對表達量。實驗重復3次。
MitoSox熒光探針檢測各組細胞中線粒體超氧化物表達水平；MitoTracker染色觀察線粒體形態，定量分析線粒體平均面積、形狀因子、分支節點。細胞按分組處理后，與含有5 μmol/L MitoSox和100 nmol/LMitoTracker的30 μl PBS于37 °C下孵育30 min。熒光顯微鏡下觀察拍照，MitoTracker染色示蹤線粒體。采集的圖像使用Image J軟件按照文獻[16-17]的計算方法進行二值化處理得到黑白圖（圖1A），使用自適應閾值方法調整閾值，捕捉原始圖像中線粒體信號的形態，同時避免合并緊密相鄰但物理上分離的線粒體或分裂單個線粒體，對閾值圖像應用“骨架化2D/3D”命令生成骨架圖（圖1B，1C）。實驗重復3次。
圖1
視網膜色素上皮細胞線粒體面積、形狀因子、分支測量示意圖
1A～1C分別示二值化處理后、閾值調整后、二維分析像
1.3 統計學分析
采用SPSS26.0軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差（x±s）表示。定量數據兩組間比較采用雙尾Student t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析。采用Graph-Prism軟件對數據進行圖表整理。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 H2O2誘導RPE細胞凋亡
與正常組比較，H2O2組細胞核數量明顯減少（圖2A，2B），細胞凋亡率明顯增加，差異有統計學意義（t=3.307，P=0.029 7）（圖2C～2E）。
圖2
H2O2誘導視網膜色素上皮細胞凋亡（n=3）
2A、2B分別示正常組、H2O2組細胞熒光顯微鏡像（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚染色，標尺：50 μm），與正常組比較，H2O2組細胞核數量明顯減少；2C、2D分別示正常組、H2O2組流式細胞儀檢測像；2E示正常組、H2O2組細胞早期凋亡率比較，*
2.2 H2O2誘導RPE細胞CTSL中表達水平升高
與正常組比較，H2O2組細胞中CTSL表達水平顯著升高，差異有統計學意義（t=19.950，P＜0.000 1）（圖3A～3C）；CTSL蛋白、mRNA相對表達量明顯升高，差異有統計學意義（t=6.916、14.220，P=0.002 3、0.000 1）（圖3D～3F）。
圖3
H2O2誘導視網膜色素上皮細胞CTSL表達水平升高（n=3）
3A、3B分別示正常組、H2O2組細胞熒光顯微鏡像（DAPI染色，標尺：50 μm），CTSL呈綠色熒光表達；3C示兩組細胞中CTSL表達水平比較，****
2.3 CTSL抑制劑有效抑制RPE細胞中CTSL表達
免疫熒光檢測結果顯示，正常組、H2O2組、H2O2+DMSO組、H2O2+CTSL抑制劑組細胞中CTSL表達水平比較，差異有統計學意義（F=110.800，P＜0.000 1）。組間兩兩比較，與正常組比較，H2O2組（t=20.750，P＜0.000 1）、H2O2+DMSO組（t=13.690，P=0.000 2）CTSL表達水平顯著升高，差異有統計學意義；與H2O2組比較，H2O2+CTSL抑制劑組CTSL表達水平顯著降低，差異有統計學意義（t=11.940，P=0.000 3）（圖4A～4C）。
圖4
CTSL抑制劑有效抑制CTSL表達（n=3）
4A～4D分別示正常組、H2O2組、H2O2+DMSO組、H2O2+CTSL抑制劑組細胞熒光顯微鏡像（DAPI染色，標尺：50 μm），CTSL呈綠色熒光表達；4E示4組細胞中CTSL表達水平比較，***
RT-PCR檢測結果顯示，正常組、H2O2組、H2O2+DMSO組、H2O2+CTSL抑制劑組細胞中CTSL mRNA相對表達量比較，差異有統計學意義（F= 43.040，P＜0.000 1）。組間兩兩比較，與正常組比較，H2O2組、H2O2+DMSO組CTSL表達水平顯著升高，差異有統計學意義（t=5.795、8.537，P=0.004 4、0.001 0）；與H2O2組比較，H2O2+CTSL抑制劑組CTSL表達水平顯著降低，差異有統計學意義（t=7.276，P=0.001 9）。
2.4 CTSL抑制劑抑制H2O2誘導的RPE細胞凋亡
流式細胞儀檢測結果顯示，正常組、H2O2組、H2O2+DMSO組、H2O2+CTSL抑制劑組細胞凋亡率比較，差異有統計學意義（F=49.190，P＜0.000 1）。組間兩兩比較，與正常組比較，H2O2組、H2O2+DMSO組細胞凋亡率顯著上升，差異有統計學意義（t=8.875、11.300，P=0.000 9、0.000 3）；與H2O2組比較，H2O2+CTSL抑制劑組細胞凋亡率顯著下降，差異有統計學意義（t=4.718，P=0.009 2）（圖5A～5E）。
圖5
CTSL抑制劑抑制H2O2誘導的RPE細胞凋亡（n=3）
5A～5D分別示正常組、H2O2組、H2O2+DMSO組、H2O2+CTSL抑制劑組流式細胞儀檢測像；5E示4組細胞凋亡率比較，**
2.5 CTSL抑制劑降低RPE細胞線粒體超氧化物水平
熒光顯微鏡觀察結果顯示，正常組、H2O2組、H2O2+DMSO組、H2O2+CTSL抑制劑組細胞中線粒體超氧化物水平比較，差異有統計學意義（F=221.500，P＜0.000 1）（圖6）。組間兩兩比較，與正常組比較，H2O2組、H2O2+DMSO組細胞線粒體超氧化物水平顯著升高，差異有統計學意義（t=16.900、22.160，P＜0.000 1）；與H2O2組比較，H2O2+CTSL抑制劑組細胞線粒體超氧化物水平顯著下降，差異有統計學意義（t=16.680，P＜0.000 1）。
圖6
CTSL抑制劑降低RPE細胞線粒體超氧化物水平（n=3）
6A～6D分別示正常組、H2O2組、H2O2+DMSO組、H2O2+CTSL抑制劑組熒光顯微鏡像（Mito-Sox、MitoTracker染色，標尺：50 μm），綠色熒光為MitoTracker，紅色熒光為Mito-Sox；與正常組比較，H2O2組及H2O2+DMSO組紅色熒光信號明顯增強，綠色熒光信號明顯減弱；與H2O2組比較，H2O2+CTSL抑制劑組紅色熒光信號明顯減弱，綠色熒光信號明顯增強。6E示4組細胞線粒體超氧化物水平比較，****
2.6 CTSL抑制劑有效恢復線粒體形態
熒光顯微鏡觀察結果顯示，正常組、H2O2+CTSL抑制劑組細胞線粒體呈細長橢圓形或桿狀；H2O2組、H2O2+DMSO組細胞線粒體失去其連續輪廓與完整形態（圖7）。4組間細胞線粒體平均面積、形狀因子、分支節點比較，差異有統計學意義（F=251.700、34.010、60.500，P＜0.000 1）。組間兩兩比較，與正常組比較，H2O2組（t=27.860、12.050、11.950；P＜0.000 1，P=0.000 3、0.000 3）、H2O2+DMSO組（t=43.890、6.267、9.333；P＜0.000 1，P=0.003 3、0.000 7）細胞線粒體平均面積、形狀因子及分支節點顯著降低，差異有統計學意義；H2O2+CTSL抑制劑組較H2O2組升高，差異有統計學意義（t=11.270、8.362、9.733，P=0.000 4、0.001 1、0.000 6）。
圖7
CTSL抑制劑有效恢復RPE細胞線粒體形態（n=3）
7A～7D分別示正常組、H2O2組、H2O2+DMSO組、H2O2+CTSL抑制劑組熒光顯微鏡像（MitoTracker染色，標尺：50 μm），正常組、H2O2+CTSL抑制劑組細胞線粒體呈細長橢圓形或桿狀，H2O2組、H2O2+DMSO組細胞線粒體失去其連續輪廓與完整形態；7E～7G分別示4組細胞線粒體平均面積、形狀因子、分支節點比較，**
3 討論
CTSL作為溶酶體半胱氨酸CTS家族的成員之一，參與許多生理過程，包括細胞凋亡、自噬、細胞外基質重塑、抗原處理和呈遞等[18-20]。有研究表明，CTSL可通過活化細胞周期調節因子和調節細胞周期蛋白誘導神經細胞凋亡，也可介導抗瘧藥誘導的Bid裂解、細胞色素C釋放等從而促進卵巢癌細胞凋亡[8-9]。本研究結果顯示，H2O2顯著誘導RPE細胞凋亡及CTSL表達水平升高，而CTSL抑制劑顯著降低CTSL表達水平，并抑制H2O2誘導的RPE細胞凋亡。既往文獻報道，高糖刺激下，RPE細胞中CTSL表達水平明顯增加，并參與溶酶體膜透化，從而抑制自噬，在一定程度上促進細胞凋亡[21]，提示CTSL可發揮促進RPE細胞凋亡的作用，一定程度上與本研究結果相符。
線粒體是細胞維持生理功能所必需的能量轉化和生物合成過程的主要位點，癌癥、心血管疾病和神經退行性疾病等都與線粒體功能障礙或損傷有關[22-24]。線粒體是細胞中ROS的主要產生部位，ROS在細胞中的累積可導致氧化應激的加重，造成脂質、蛋白質和DNA的氧化損傷，進而導致線粒體損傷，最終引起細胞死亡[25]。有研究表明，CTSL與線粒體氧化應激相關，且其對心血管內皮細胞ROS產生有影響[26]，因此我們進一步探索了CTSL抑制劑對線粒體氧化應激的作用。結果顯示，在H2O2刺激下，線粒體超氧化物水平明顯升高，線粒體形態破壞，而CTSL抑制劑可降低線粒體超氧化物水平，并有效恢復線粒體形態，提示CTSL抑制劑可抑制H2O2誘導的線粒體氧化應激。線粒體在細胞凋亡中也起著核心作用。在機制上，線粒體外膜透化可通過下游凋亡信號如線粒體釋放細胞色素C和半胱天冬酶激活等誘導細胞凋亡[27]。有研究發現，CTSL可能通過切割Bid，導致線粒體膜通透性升高，細胞色素C從線粒體釋放，從而誘導細胞凋亡[9, 28]。這為進一步研究CTSL抑制劑經線粒體途徑抑制RPE細胞凋亡的具體機制提供了線索。
此外，有研究者對CTSL在其他細胞中的作用進行了探索。在高糖條件下，CTSL活性下降，溶酶體蛋白水解功能下降，Müller細胞自噬功能障礙，導致細胞凋亡增加[29]；在2型顆粒性角膜營養不良中，CTSL抑制劑的應用可導致角膜成纖維細胞凋亡[30]。這些結果的出現可能是由于細胞種類或者細胞所處微環境的不同。除CTSL外，CTS還包括其他半胱氨酸CTS家族成員（如CTSB）以及天冬氨酸CTS（如CTSD）等[6, 19, 31]。其功能各異，可參與細胞死亡、蛋白質降解、蛋白質翻譯后修飾、細胞外基質重塑、自噬和免疫信號傳遞等過程[31]。有學者則對CTSB、CTSD在自噬和凋亡方面的功能進行了研究，發現在高糖誘導的視網膜血管內皮細胞中，CTSB、CTSD表達下調，從而抑制自噬、促進凋亡[32]。這提示多種分型的CTS可在凋亡方面發揮作用，因此未來可以將研究拓展至多種CTS對RPE細胞凋亡的影響，探索治療疾病的多靶點。
CTSL在凋亡中發揮重要作用，也被認為是多種疾病的治療靶點[31]。但本研究僅觀察了CTSL抑制劑對RPE細胞凋亡的影響，缺少對CTSL促凋亡作用的驗證。因此未來應進一步觀察CTSL高表達對RPE細胞凋亡的影響，從而為CTSL抑制劑的保護作用提供更加充分的理論依據。在機制方面，應該更加全面探究CTSL抑制劑對線粒體功能如線粒體膜電位、線粒體動力學、線粒體超微結構等的影響。本研究局限于體外研究，未來應在體內模型中進一步驗證CTSL抑制劑對RPE細胞凋亡的作用，同時探索合適的給藥方式與劑量，以期為CTSL抑制劑的臨床應用提供依據。
氧化應激所導致的視網膜色素上皮（RPE）細胞凋亡，可引起年齡相關性黃斑變性、糖尿病視網膜病變等視網膜疾病[1-3]。線粒體是細胞中活性氧（ROS）的主要來源，而ROS含量的增加是氧化應激的主要原因[4]。過量的ROS可導致線粒體形態改變、膜電位降低，最終誘發線粒體功能障礙和細胞凋亡[5]。組織蛋白酶（CTS）L是溶酶體半胱氨酸蛋白酶家族的主要成員之一，幾乎在所有組織或細胞類型中都有表達[6-7]。文獻報道，CTSL通過活化細胞周期調節因子和調節細胞周期蛋白誘導神經細胞凋亡[8]；也可誘導卵巢癌細胞凋亡，而通過shRNA和選擇性抑制劑抑制CTSL表達后可顯著抑制細胞凋亡[9]。線粒體是參與能量產生、細胞代謝和氧化還原穩態的重要細胞器，也是調控細胞凋亡的重要部位[10-12]。內在凋亡途徑由線粒體外膜透化（MOMP）決定，其促進細胞色素C的釋放，加重線粒體功能障礙，激活半胱天冬酶，最終可導致細胞凋亡[13-14]。目前有研究發現，CTSL釋放到細胞質后，可將Bid切割為tBid，從而觸發MOMP，導致線粒體功能障礙，而CTSL抑制劑的應用可減少細胞色素C釋放，并降低半胱天冬酶活性[15]。本研究旨在觀察CTSL抑制劑對氧化應激誘導RPE細胞凋亡的作用，并進一步探索在細胞凋亡時其對線粒體功能的影響，以期為RPE細胞凋亡相關疾病的治療提供線索。現將結果報道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
人RPE細胞（ARPE-19）由本實驗室自行保存。Dublecco改良Eagle培養基（DMEM）/F12培養基（L310KJ，上海源培生物科技股份有限公司）；選擇性CTSL抑制劑Z-Phe-Tyr（tBu）-diazomethylketone（GC45599，美國Glpbio公司）；乙二胺四乙酸（EDTA）（12604013，美國Gibco公司）；二甲基亞砜（DMSO，D8370）、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，C0065）（北京索萊寶科技有限公司）；膜聯蛋白Ⅴ（Annexin Ⅴ）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（PI）細胞凋亡檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；CTSL（DF12880）、β-肌動蛋白（actin）（AF7018）一抗、二抗（美國Affinity公司）；Mito-Sox（40778EA50）、MitoTracker Green（40742ES50）[翌圣生物科技（上海）股份有限公司]；MitoTracker Red（C1049B，上海碧云天生物技術有限公司）。
1.2 方法
細胞培養和分組。ARPE-19置于含5 ml胎牛血清和0.5 ml雙抗的DMEM/F12培養基中常規培養，3～5 d 傳代1次，取對數生長期細胞用于后續實驗。將細胞正常組、過氧化氫（H2O2）組、H2O2+DMSO組、H2O2+CTSL抑制劑組。正常組常規培養，不作任何處理；H2O2組、H2O2+CTSL抑制劑組、H2O2+DMSO組置于含400 μmol/L H2O2的培養基孵育24 h；H2O2+CTSL抑制劑組、H2O2+DMSO組分別同時加入10 μmol/l CTSL抑制劑（根據前期預實驗結果）、0.1% DMSO。建模后24 h進行后續實驗。
DAPI染色檢測正常組、H2O2組細胞核數量。48孔板中每孔滴加100 μl的DAPI染液，5 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，5 min/次。熒光顯微鏡觀察拍照。實驗重復3次。
流式細胞儀檢測正常組、H2O2組細胞凋亡率。細胞按分組處理后，用不含EDTA的胰蛋白酶消化收集細胞，離心沉淀細胞。PBS重懸細胞，再次離心沉淀細胞。1倍結合緩沖液重懸細胞，調節細胞濃度為（1～5）×106/ml；取100 μl細胞懸液于5 ml流式管中，加入5 μl Annexin V/FITC混勻后于室溫避光孵育5 min；加入5 μl PI和400 μl PBS，流式細胞儀分析并計算各組細胞凋亡率，具體方法按試劑盒說明進行，采用Flowjo軟件分析。實驗重復3次。
免疫熒光染色法檢測各組細胞中CTSL蛋白表達。4%多聚甲醛固定細胞10 min，加入含0.1% Triton X-100的PBS通透細胞10 min，含1%牛血清白蛋白（BSA）的聚丁二酸-共-對苯二甲酸丁二醇酯（PBST）（PBS+0.1% Tween20）室溫封閉細胞30 min。含1% BSA的PBST稀釋CTSL一抗，4 ℃孵育過夜。PBST洗3次。含1% BSA的PBST稀釋Alexa Fluor488標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（熒光二抗），室溫避光孵育1 h。加入DAPI對細胞進行復染，熒光顯微鏡下觀察拍照。實驗重復3次。
蛋白質免疫印跡法（Western blot）檢測各組細胞中CTSL蛋白相對表達量。收集各組細胞，提取蛋白定量。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳中上樣電泳，轉至聚偏氟乙烯膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入CTSL、β-actin一抗，4 ℃孵育過夜，洗膜緩沖液（TBST）洗膜，加入辣根過氧化物酶羊抗兔二抗，室溫孵育2 h，TBST洗膜，加入化學發光底物進行曝光并拍照，凝膠成像系統掃描分析蛋白條帶。Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值，計算蛋白相對表達水平。實驗重復3次。
實時定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測各組細胞中CTSL mRNA相對表達量。RNA提取試劑盒提取各組細胞總RNA，反轉錄成cDNA。應用Primer 5.0軟件設計引物序列。CTSL正向引物：CTGGTGGTTGGCTACGGATT，反向引物：CTCCGGTCTTTGGCCATCTT；β-actin正向引物：CCTGGCACCCAGCACAAT，反向引物：GGGCCGGACTCGTCATAC。置于RT-PCR儀中進行擴增并輸出循環閾值（Cq值），以β-actin為內參照，依照公式2-ΔΔCq計算mRNA相對表達量。實驗重復3次。
MitoSox熒光探針檢測各組細胞中線粒體超氧化物表達水平；MitoTracker染色觀察線粒體形態，定量分析線粒體平均面積、形狀因子、分支節點。細胞按分組處理后，與含有5 μmol/L MitoSox和100 nmol/LMitoTracker的30 μl PBS于37 °C下孵育30 min。熒光顯微鏡下觀察拍照，MitoTracker染色示蹤線粒體。采集的圖像使用Image J軟件按照文獻[16-17]的計算方法進行二值化處理得到黑白圖（圖1A），使用自適應閾值方法調整閾值，捕捉原始圖像中線粒體信號的形態，同時避免合并緊密相鄰但物理上分離的線粒體或分裂單個線粒體，對閾值圖像應用“骨架化2D/3D”命令生成骨架圖（圖1B，1C）。實驗重復3次。
圖1
視網膜色素上皮細胞線粒體面積、形狀因子、分支測量示意圖
1A～1C分別示二值化處理后、閾值調整后、二維分析像
1.3 統計學分析
采用SPSS26.0軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差（x±s）表示。定量數據兩組間比較采用雙尾Student t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析。采用Graph-Prism軟件對數據進行圖表整理。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 H2O2誘導RPE細胞凋亡
與正常組比較，H2O2組細胞核數量明顯減少（圖2A，2B），細胞凋亡率明顯增加，差異有統計學意義（t=3.307，P=0.029 7）（圖2C～2E）。
圖2
H2O2誘導視網膜色素上皮細胞凋亡（n=3）
2A、2B分別示正常組、H2O2組細胞熒光顯微鏡像（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚染色，標尺：50 μm），與正常組比較，H2O2組細胞核數量明顯減少；2C、2D分別示正常組、H2O2組流式細胞儀檢測像；2E示正常組、H2O2組細胞早期凋亡率比較，*
2.2 H2O2誘導RPE細胞CTSL中表達水平升高
與正常組比較，H2O2組細胞中CTSL表達水平顯著升高，差異有統計學意義（t=19.950，P＜0.000 1）（圖3A～3C）；CTSL蛋白、mRNA相對表達量明顯升高，差異有統計學意義（t=6.916、14.220，P=0.002 3、0.000 1）（圖3D～3F）。
圖3
H2O2誘導視網膜色素上皮細胞CTSL表達水平升高（n=3）
3A、3B分別示正常組、H2O2組細胞熒光顯微鏡像（DAPI染色，標尺：50 μm），CTSL呈綠色熒光表達；3C示兩組細胞中CTSL表達水平比較，****
2.3 CTSL抑制劑有效抑制RPE細胞中CTSL表達
免疫熒光檢測結果顯示，正常組、H2O2組、H2O2+DMSO組、H2O2+CTSL抑制劑組細胞中CTSL表達水平比較，差異有統計學意義（F=110.800，P＜0.000 1）。組間兩兩比較，與正常組比較，H2O2組（t=20.750，P＜0.000 1）、H2O2+DMSO組（t=13.690，P=0.000 2）CTSL表達水平顯著升高，差異有統計學意義；與H2O2組比較，H2O2+CTSL抑制劑組CTSL表達水平顯著降低，差異有統計學意義（t=11.940，P=0.000 3）（圖4A～4C）。
圖4
CTSL抑制劑有效抑制CTSL表達（n=3）
4A～4D分別示正常組、H2O2組、H2O2+DMSO組、H2O2+CTSL抑制劑組細胞熒光顯微鏡像（DAPI染色，標尺：50 μm），CTSL呈綠色熒光表達；4E示4組細胞中CTSL表達水平比較，***
RT-PCR檢測結果顯示，正常組、H2O2組、H2O2+DMSO組、H2O2+CTSL抑制劑組細胞中CTSL mRNA相對表達量比較，差異有統計學意義（F= 43.040，P＜0.000 1）。組間兩兩比較，與正常組比較，H2O2組、H2O2+DMSO組CTSL表達水平顯著升高，差異有統計學意義（t=5.795、8.537，P=0.004 4、0.001 0）；與H2O2組比較，H2O2+CTSL抑制劑組CTSL表達水平顯著降低，差異有統計學意義（t=7.276，P=0.001 9）。
2.4 CTSL抑制劑抑制H2O2誘導的RPE細胞凋亡
流式細胞儀檢測結果顯示，正常組、H2O2組、H2O2+DMSO組、H2O2+CTSL抑制劑組細胞凋亡率比較，差異有統計學意義（F=49.190，P＜0.000 1）。組間兩兩比較，與正常組比較，H2O2組、H2O2+DMSO組細胞凋亡率顯著上升，差異有統計學意義（t=8.875、11.300，P=0.000 9、0.000 3）；與H2O2組比較，H2O2+CTSL抑制劑組細胞凋亡率顯著下降，差異有統計學意義（t=4.718，P=0.009 2）（圖5A～5E）。
圖5
CTSL抑制劑抑制H2O2誘導的RPE細胞凋亡（n=3）
5A～5D分別示正常組、H2O2組、H2O2+DMSO組、H2O2+CTSL抑制劑組流式細胞儀檢測像；5E示4組細胞凋亡率比較，**
2.5 CTSL抑制劑降低RPE細胞線粒體超氧化物水平
熒光顯微鏡觀察結果顯示，正常組、H2O2組、H2O2+DMSO組、H2O2+CTSL抑制劑組細胞中線粒體超氧化物水平比較，差異有統計學意義（F=221.500，P＜0.000 1）（圖6）。組間兩兩比較，與正常組比較，H2O2組、H2O2+DMSO組細胞線粒體超氧化物水平顯著升高，差異有統計學意義（t=16.900、22.160，P＜0.000 1）；與H2O2組比較，H2O2+CTSL抑制劑組細胞線粒體超氧化物水平顯著下降，差異有統計學意義（t=16.680，P＜0.000 1）。
圖6
CTSL抑制劑降低RPE細胞線粒體超氧化物水平（n=3）
6A～6D分別示正常組、H2O2組、H2O2+DMSO組、H2O2+CTSL抑制劑組熒光顯微鏡像（Mito-Sox、MitoTracker染色，標尺：50 μm），綠色熒光為MitoTracker，紅色熒光為Mito-Sox；與正常組比較，H2O2組及H2O2+DMSO組紅色熒光信號明顯增強，綠色熒光信號明顯減弱；與H2O2組比較，H2O2+CTSL抑制劑組紅色熒光信號明顯減弱，綠色熒光信號明顯增強。6E示4組細胞線粒體超氧化物水平比較，****
2.6 CTSL抑制劑有效恢復線粒體形態
熒光顯微鏡觀察結果顯示，正常組、H2O2+CTSL抑制劑組細胞線粒體呈細長橢圓形或桿狀；H2O2組、H2O2+DMSO組細胞線粒體失去其連續輪廓與完整形態（圖7）。4組間細胞線粒體平均面積、形狀因子、分支節點比較，差異有統計學意義（F=251.700、34.010、60.500，P＜0.000 1）。組間兩兩比較，與正常組比較，H2O2組（t=27.860、12.050、11.950；P＜0.000 1，P=0.000 3、0.000 3）、H2O2+DMSO組（t=43.890、6.267、9.333；P＜0.000 1，P=0.003 3、0.000 7）細胞線粒體平均面積、形狀因子及分支節點顯著降低，差異有統計學意義；H2O2+CTSL抑制劑組較H2O2組升高，差異有統計學意義（t=11.270、8.362、9.733，P=0.000 4、0.001 1、0.000 6）。
圖7
CTSL抑制劑有效恢復RPE細胞線粒體形態（n=3）
7A～7D分別示正常組、H2O2組、H2O2+DMSO組、H2O2+CTSL抑制劑組熒光顯微鏡像（MitoTracker染色，標尺：50 μm），正常組、H2O2+CTSL抑制劑組細胞線粒體呈細長橢圓形或桿狀，H2O2組、H2O2+DMSO組細胞線粒體失去其連續輪廓與完整形態；7E～7G分別示4組細胞線粒體平均面積、形狀因子、分支節點比較，**
3 討論
CTSL作為溶酶體半胱氨酸CTS家族的成員之一，參與許多生理過程，包括細胞凋亡、自噬、細胞外基質重塑、抗原處理和呈遞等[18-20]。有研究表明，CTSL可通過活化細胞周期調節因子和調節細胞周期蛋白誘導神經細胞凋亡，也可介導抗瘧藥誘導的Bid裂解、細胞色素C釋放等從而促進卵巢癌細胞凋亡[8-9]。本研究結果顯示，H2O2顯著誘導RPE細胞凋亡及CTSL表達水平升高，而CTSL抑制劑顯著降低CTSL表達水平，并抑制H2O2誘導的RPE細胞凋亡。既往文獻報道，高糖刺激下，RPE細胞中CTSL表達水平明顯增加，并參與溶酶體膜透化，從而抑制自噬，在一定程度上促進細胞凋亡[21]，提示CTSL可發揮促進RPE細胞凋亡的作用，一定程度上與本研究結果相符。
線粒體是細胞維持生理功能所必需的能量轉化和生物合成過程的主要位點，癌癥、心血管疾病和神經退行性疾病等都與線粒體功能障礙或損傷有關[22-24]。線粒體是細胞中ROS的主要產生部位，ROS在細胞中的累積可導致氧化應激的加重，造成脂質、蛋白質和DNA的氧化損傷，進而導致線粒體損傷，最終引起細胞死亡[25]。有研究表明，CTSL與線粒體氧化應激相關，且其對心血管內皮細胞ROS產生有影響[26]，因此我們進一步探索了CTSL抑制劑對線粒體氧化應激的作用。結果顯示，在H2O2刺激下，線粒體超氧化物水平明顯升高，線粒體形態破壞，而CTSL抑制劑可降低線粒體超氧化物水平，并有效恢復線粒體形態，提示CTSL抑制劑可抑制H2O2誘導的線粒體氧化應激。線粒體在細胞凋亡中也起著核心作用。在機制上，線粒體外膜透化可通過下游凋亡信號如線粒體釋放細胞色素C和半胱天冬酶激活等誘導細胞凋亡[27]。有研究發現，CTSL可能通過切割Bid，導致線粒體膜通透性升高，細胞色素C從線粒體釋放，從而誘導細胞凋亡[9, 28]。這為進一步研究CTSL抑制劑經線粒體途徑抑制RPE細胞凋亡的具體機制提供了線索。
此外，有研究者對CTSL在其他細胞中的作用進行了探索。在高糖條件下，CTSL活性下降，溶酶體蛋白水解功能下降，Müller細胞自噬功能障礙，導致細胞凋亡增加[29]；在2型顆粒性角膜營養不良中，CTSL抑制劑的應用可導致角膜成纖維細胞凋亡[30]。這些結果的出現可能是由于細胞種類或者細胞所處微環境的不同。除CTSL外，CTS還包括其他半胱氨酸CTS家族成員（如CTSB）以及天冬氨酸CTS（如CTSD）等[6, 19, 31]。其功能各異，可參與細胞死亡、蛋白質降解、蛋白質翻譯后修飾、細胞外基質重塑、自噬和免疫信號傳遞等過程[31]。有學者則對CTSB、CTSD在自噬和凋亡方面的功能進行了研究，發現在高糖誘導的視網膜血管內皮細胞中，CTSB、CTSD表達下調，從而抑制自噬、促進凋亡[32]。這提示多種分型的CTS可在凋亡方面發揮作用，因此未來可以將研究拓展至多種CTS對RPE細胞凋亡的影響，探索治療疾病的多靶點。
CTSL在凋亡中發揮重要作用，也被認為是多種疾病的治療靶點[31]。但本研究僅觀察了CTSL抑制劑對RPE細胞凋亡的影響，缺少對CTSL促凋亡作用的驗證。因此未來應進一步觀察CTSL高表達對RPE細胞凋亡的影響，從而為CTSL抑制劑的保護作用提供更加充分的理論依據。在機制方面，應該更加全面探究CTSL抑制劑對線粒體功能如線粒體膜電位、線粒體動力學、線粒體超微結構等的影響。本研究局限于體外研究，未來應在體內模型中進一步驗證CTSL抑制劑對RPE細胞凋亡的作用，同時探索合適的給藥方式與劑量，以期為CTSL抑制劑的臨床應用提供依據。
