通過靶向PML-RARα融合基因的小干擾RNA(siRNA)的體外干擾,研究其對急性早幼粒細胞白血病細胞NB4活性的影響。設計合成5對靶向PML-RARα融合基因的siRNA,轉染NB4細胞,采用MTT比色法、軟瓊脂細胞集落形成實驗檢測siRNA對NB4細胞的增殖抑制作用,用流式細胞術測定細胞的凋亡,結果顯示siRNA顯著抑制了NB4細胞的增殖并有效誘導細胞凋亡。靶向PML-RARα融合基因的siRNA有望成為治療急性早幼粒細胞白血病的有效方法。
引用本文： 羅海希, 潘彥鵬, 郝新寶, 曹獻英. 靶向PML-RARα融合基因的siRNA對急性早幼粒細胞白血病細胞NB4活性的影響. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(4): 850-854. doi: 10.7507/1001-5515.20140160 復制
版權信息： ?四川大學華西醫院華西期刊社《生物醫學工程學雜志》版權所有，未經授權不得轉載、改編
引言
急性早幼粒細胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)是急性髓細胞白血病(acute myelocytic leukemia，AML)的一種亞型，極易發生彌散性血管內凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)而導致死亡[1]。95%以上的APL具有特異性染色體易位t(15,17)(q22,q21)，形成特有的PML-RARαL型融合基因[2]，另有約5%的M3為其他亞型[3]。現今臨床上多使用全反式維甲酸(all trans retinoic acid，ATRA)和ATO(As2O3，俗稱砒霜)治療APL患者。ATRA可以使大部分患者完全緩解，但是多數患者于3～4個月后復發，出現對ATRA耐藥，并發高白細胞綜合征，少數患者出現肝功能損害，甚至累及腦、肺、心臟等，嚴重者可致死。ATO是中國傳統中藥砒霜的主要有效成分，劇毒，長期使用易引起蓄積中毒，可能誘發第二腫瘤，不利于患者長期生存，且全球使用的ATO注射液每支高達200多美元。因此，當前需要一種安全、有效、經濟的治療APL的方法。
RNA干擾(RNA interference，RNAi)是一種轉錄后基因沉默機制，它具有高效性和序列特異性，是在體外沉默特定基因的有效手段[4]。雙鏈RNA(double strand RNAs，dsRNA)被導入特定細胞后，被Dicer酶水解為19~21 nt的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)，或者可以將siRNA直接導入到細胞內。這些siRNA在細胞內會與同源的mRNA配對結合，并激活一系列反應將mRNA降解，最終導致基因沉默。
APL分子機制明確，有穩定的致病基因，發病率高，難以根治，而RNAi技術操作簡單高效，技術成熟，毒副作用小，療效顯著，可以特異性靶向致病基因，但目前尚未應用于APL。NB4細胞是Lanotte等1991年從APL復發患者骨髓細胞中分離建系，具有典型的t(15,17)易位和表達阻滯髓系細胞分化、抑制早幼粒階段細胞成熟的PML-RARα-L型融合蛋白[5]。
本文中我們設計了一些針對PML-RARα融合基因的siRNA，探討其抑制NB4細胞增殖和誘導細胞凋亡的作用。
1 材料與方法
1.1 細胞培養
NB4細胞購自廣州博特生物技術公司(來源于美國細胞收藏中心，ATCC)，使用含10%(V/V)胎牛血清(Gibco)的RPMI-1640培養基(Gibco)，在37 ℃、5% CO2的條件下培養。
1.2 siRNA的設計
針對PML-RARα融合基因，我們設計了5條siRNA序列，每條siRNA以在PML-RARα mRNA序列上所對應的核苷酸位置(5′~3′)命名。5條siRNA序列和未標記的陰性對照siRNA(negative control siRNA,NC siRNA,針對非相關基因的且與人、鼠無同源性的siRNA)均由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。所有序列如表 1所示。
表1
靶向PML-RARα mRNA的siRNA序列
Table1.
Sequences of siRNAs targeting the PML-RARα mRNA
1.3 細胞轉染
采用96孔板、HiPerFect轉染試劑進行轉染。siRNA母液的配置：在150 μL DEPC水中加入siRNA(1 OD，2.5 nmol/L)，配制成20 μmol/L的溶液，放置于4 ℃。在轉染的前一天將細胞接種于25 cm2培養瓶，接種密度為3×105/mL，置于5% CO2培養箱37 ℃培養。轉染當天，用30 μL含血清培養基將細胞種到96孔板中，每孔約含細胞6×104。用無血清培養基將siRNA稀釋成不同的濃度，加入適量的HiPerFect轉染試劑混勻，每孔30 μL，于室溫(15～25 ℃)下靜置5～10 min。然后將siRNA和轉染試劑的復合物轉染細胞，放置于5% CO2培養箱37 ℃培養6 h，每孔加入140 μL RPMI-1640培養基(10% FBS)，轉染后24~72 h進行檢測。
1.4 細胞增殖活性檢測
用3-(4,5-dimethylthiahiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)檢測細胞增殖率：離心收集對數期細胞，用無雙抗無血清培養基懸浮細胞(30 μL，6×104活細胞)接種到96孔板，分別加入不同濃度的靶向siRNA和NC siRNA轉染溶液30 μL，每孔加30 μL無雙抗無血清培養基。轉染6 h，每孔加140 μL完全培養基。實驗組和對照組均設3復孔。每塊板上另設一組調零孔(加培養液，不加細胞和藥物)。培養24~72 h加入MTT溶液20 μL/孔，繼續培養4 h，加入三聯液(10% SDS、5% isopropyl alcohol、0.012 mol/L HCl)100 μL/孔，于37 ℃放置12~16 h[6]，用酶標儀測吸光度值A(570 nm)。 細胞增殖抑制率(%)=(A對照組－A實驗組)/A實驗組×100%。將各0 nmol/L siRNA的細胞增殖設定為100%，作為相應siRNA其他濃度組的基準。
軟瓊脂細胞集落形成實驗：收集對數生長期實驗組(siRNA1244、siRNA1246、siRNA1690，50 nmol/L)和陰性對照組(NC siRNA，50nmol/L)的NB4細胞，測定細胞活力，調整細胞濃度為3×102活細胞/mL的細胞懸液。取9 mL細胞懸液與1 mL 3%瓊脂(已融化，在65 ℃水浴中放置)混勻。6孔培養板每孔加3 mL細胞瓊脂懸液，在室溫放置20 min使細胞瓊脂懸液凝固，移培養板于CO2培養箱37 ℃培養14 d，肉眼觀察并計數細胞集落。結果以肉眼可見的細胞團作為計數集落的標準。集落的計數和計算：集落數=n孔中細胞集落數總和/n；集落形成率(%)=集落數/接種培養細胞總數×100%。
1.5 細胞凋亡的檢測
將轉染siRNA(siRNA 30、siRNA 382、siRNA 1244、siRNA1246、siRNA1690、NC siRNA，50nmol/L，24 h和48 h)后培養的NB4細胞離心(1 000 g，5 min)棄培養基上清。調NB4細胞密度為1×106細胞/mL，冷PBS洗滌3次(1 000 g，5 min)，400 μL Binding Buffer懸浮。加入5 μL Annexin V-FITC染液于2~8 ℃避光孵育5 min。加入5 μL PI于2~8 ℃避光孵育5 min，流式細胞儀檢測(加入兩種染色液1 h內)。Annexin V、PI染色都為陰性的NB4細胞鑒定為活細胞，Annexin V陰性、PI染色檢測陽性的NB4細胞為機械損傷細胞，而Annexin V染色顯示陽性、PI染色陰性的NB4細胞是早期凋亡的細胞，Annexin V、PI染色均陽性的NB4細胞為晚期凋亡細胞。細胞的特異性凋亡率(%)=(實驗組凋亡率－自發凋亡率)/(1－自發凋亡率)×100% 。
1.6 統計學處理
實驗結果用SPSS 18.0統計軟件分析處理。IC50采用加權直線線性回歸法求得，兩樣本均數采用t檢驗，多樣本間比較用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統計學意義。
2 結果
2.1 不同濃度siRNA對NB4細胞的增殖抑制作用
結果顯示：siRNA382、siRNA1244、siRNA1246和siRNA1690在不同濃度下均對NB4細胞的增殖有不同程度的抑制作用，并且在0~50 nmol/L濃度范圍內，濃度越大，對細胞的增殖抑制效率越高;siRNA30只有濃度在50.0 nmol/L時抑制了NB4細胞的增殖(見圖 1)。將siRNA30、siRNA382、siRNA1244、siRNA1246和siRNA1690轉染NB4細胞24 h和48 h，siRNA1244對NB4細胞的增殖抑制效果最明顯。當siRNA1244濃度為50.0 nmol/L，轉染24 h后NB4細胞的抑制率為53.73%±6.41%(P＜0.01)。siRNA1244、siRNA1246、siRNA1690在濃度為12.5、25.0、50.0 nmol/L轉染24、48、72 h的情況下均明顯地抑制NB4細胞增殖。將siRNA382、siRNA1244、siRNA1246和siRNA1690轉染NB4細胞24 h，對siRNA的轉染濃度和增殖抑制率進行雙變量相關性分析，相關系數R值分別為0.678、0.885、0.886和0.587(siRNA382和siRNA1690為中度正相關，siRNA1244和siRNA1246為高度正相關)，再進行線性回歸分析，一元線性相關系數分別為0.678、0.885、0.886和0.587。siRNA1244、siRNA1246、siRNA1690 24 h IC50 分別為46.578、59.324和62.620 nmol/L；48 h IC50 分別65.668、76.549和74.430 nmol/L。
圖1
siRNAs對NB4細胞增殖的影響
(a)作用24 h;(b)作用48 h;(c)作用72 h。與NC siRNA組比較：*
(a) 24 h after transfection; (b) 48 h after transfection; (c) 72 h after transfection. Compared to NC siRNA control: *
2.2 細胞集落形成實驗
NB4細胞集落形成實驗顯示：軟瓊脂培養14 d后計數集落形成數，實驗組(siRNA1244、siRNA1246、siRNA1690)轉染細胞形成的集落數目較NC siRNA組明顯減少(P＜0.05)(見表 2)。如圖 2所示，NB4細胞集落邊緣有大片細胞伸出，游離的單細胞向遠處轉移，呈菜花樣向周圍浸潤，而實驗組(siRNA1244轉染)細胞形成的集落明顯小于陰性對照組(NC siRNA轉染)。
表2
不同siRNA作用下NB4細胞集落形成數
Table2.
Colony formation efficiency of NB4 cell in soft agar
圖2
NB4細胞集落圖
Figure2.
Colony size of NB4 cells in soft agar
2.3 siRNA對細胞凋亡的影響
NB4細胞凋亡檢測結果顯示：siRNAs(siRNA382、siRNA1244、siRNA1246、siRNA1690，50 nmol/L)轉染NB4細胞與NC siRNA組相比24 h和48 h特異性凋亡率顯著增加，晚期凋亡率比早期凋亡率差異更大(見表 3)。siRNA30轉染NB4細胞24 h和48 h對細胞的凋亡沒有顯著的影響。siRNA1244轉染組對細胞凋亡的影響最為顯著，特異性凋亡率高達64.50%。
表3
siRNAs作用24 h和48 h后NB4細胞凋亡情況(%)
Table3.
Apoptosis rates of NB4 cells transfected with siRNAs for 24 and 48 hours(%)
3 討論
細胞增殖旺盛或出現凋亡抑制，以及細胞出現分化障礙是腫瘤發生必須具備的兩個條件。在APL細胞中，染色體易位t(15；17)導致能夠調控細胞生長的PML基因與能夠促進細胞分化的RARα基因融合產生特征性的PML-RARα基因，該基因與APL的發病密切相關。反義技術能夠特異地封閉或抑制其靶基因的表達。于文強等[7]曾設計了針對PML-RARα融合位點的18 mer的反義寡核苷酸，在體外成功地抑制了NB4細胞的增殖，抑制細胞增殖的最低濃度為20 μmol/L。陳燁等[8]針對PML-RARα基因(L型)融合位點設計的反義核酸有效地抑制了細胞的增殖(80 μg/mL，4 d，抑制率59.2%)，促進了細胞的凋亡(60 μg/mL，7 d，凋亡率41%)；但當濃度達到80 μg/mL，反義核酸對細胞的正常增殖有一定的影響(增殖抑制率達18.6%)。本研究設計的針對PML-RARα基因(L型)融合點的siRNA1244作用于NB4細胞后，24 h IC50為46.578 nmol/L(0.621 μg/mL)，50 nmol/L(0.667 μg/mL)siRNA1244作用24 h后NB4細胞凋亡率為64.50%。siRNA對NB4細胞的增殖和凋亡的作用與百倍濃度融合位點的反義寡核苷酸相當。本研究中的siRNA對NB4細胞增殖和凋亡影響的效率更高，毒性更小。
目前臨床上多使用ATRA和ATO治療APL，由于它們的單藥或聯合用藥治療都存在復發、耐藥性和毒副作用等難以克服的問題，很多研究試圖通過其他藥物或者其他治療方式來取得更好的療效。與化療、放療等傳統治療方法相比，基因治療具有毒副作用小、療效顯著等優勢,尤其是基因治療中日趨成熟的RNAi技術，可以快速有效并特異地靶向致病基因，或其它一些阻遏細胞分化凋亡的重要基因，作為APL治療的一種新策略，具有極大的應用前景。RNAi是siRNA介導的研究基因功能的重要工具，并且逐步成為病毒性疾病、遺傳性疾病以及腫瘤等基因治療研究的一種手段[9]。在過去的十年中，已有14項RNAi藥物項目進入臨床試驗[10]，其中包括7項局部給藥，分別靶向眼睛(4項)、呼吸道(2項)、皮膚(1項)；7項系統性全身給藥，分別靶向肝臟(2項)、肝臟和肝外腫瘤(3項)、白細胞(1項)和腎臟(1項)[11]。本研究以APL細胞系NB4為研究對象，探討siRNA對APL細胞NB4生長增殖的抑制，以及對NB4細胞凋亡的影響。
本研究設計的siRNAs顯著地抑制了NB4細胞的活性。MTT實驗結果表明siRNA能夠顯著地抑制NB4細胞的增殖，軟瓊脂細胞集落形成實驗進一步證明siRNA可以影響NB4細胞集落的數量和大小，抑制細胞集落形成能力。siRNA1244和siRNA1246在明顯抑制細胞增殖活性的同時，其特異性凋亡率高達50%～60%，特異性凋亡主要體現在早期凋亡和晚期凋亡，與陰性對照NC siRNA轉染組相比，siRNA1244、siRNA1246、和siRNA1690作用細胞的晚期凋亡變化更顯著。由于本研究設計的siRNAs是靶向PML-RARα mRNA不同位點，研究結果顯示不同作用位點的siRNA作用效果也有差異，siRNA1244和siRNA1246對NB4細胞增殖和凋亡的影響都比較顯著，而siRAN30在轉染濃度高達50 nmol/L時對NB4細胞才有增殖抑制作用，轉染24 h和48 h的增殖抑制率不到20%，siRAN30 50 nmol/L轉染24 h和48 h對NB4細胞的凋亡均無顯著影響。這可能與其靶位點序列的結構有較大關系：siRNA1244和siRNA1246靶向PML-RARα mRNA的融合位點，而siRNA30靶向mRNA 5′非翻譯區(5′ UTR)，可能是因為高度結構化的5′ UTR折疊成高度穩定的結構而使siRNA難以結合，或者是因為靶位點在生理狀態下被蛋白結合而封閉，使siRNA30難以接近，導致抑制增殖和誘導凋亡的效果不理想。由此，我們推測很可能是相應的siRNA下調了PML-RARα基因表達水平，從而激活了某些細胞信號通路，抑制了細胞的異常增殖。現在我們已經證實siRNA1244和siRNA1246等對APL細胞NB4增殖和凋亡有較顯著的影響。目前基因治療最大的限制因素就是轉染效率較低，藥物不能持續發揮作用，因此提高轉染效率和siRNA在細胞內的穩定性是我們接下來努力的方向。
引言
急性早幼粒細胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)是急性髓細胞白血病(acute myelocytic leukemia，AML)的一種亞型，極易發生彌散性血管內凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)而導致死亡[1]。95%以上的APL具有特異性染色體易位t(15,17)(q22,q21)，形成特有的PML-RARαL型融合基因[2]，另有約5%的M3為其他亞型[3]。現今臨床上多使用全反式維甲酸(all trans retinoic acid，ATRA)和ATO(As2O3，俗稱砒霜)治療APL患者。ATRA可以使大部分患者完全緩解，但是多數患者于3～4個月后復發，出現對ATRA耐藥，并發高白細胞綜合征，少數患者出現肝功能損害，甚至累及腦、肺、心臟等，嚴重者可致死。ATO是中國傳統中藥砒霜的主要有效成分，劇毒，長期使用易引起蓄積中毒，可能誘發第二腫瘤，不利于患者長期生存，且全球使用的ATO注射液每支高達200多美元。因此，當前需要一種安全、有效、經濟的治療APL的方法。
RNA干擾(RNA interference，RNAi)是一種轉錄后基因沉默機制，它具有高效性和序列特異性，是在體外沉默特定基因的有效手段[4]。雙鏈RNA(double strand RNAs，dsRNA)被導入特定細胞后，被Dicer酶水解為19~21 nt的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)，或者可以將siRNA直接導入到細胞內。這些siRNA在細胞內會與同源的mRNA配對結合，并激活一系列反應將mRNA降解，最終導致基因沉默。
APL分子機制明確，有穩定的致病基因，發病率高，難以根治，而RNAi技術操作簡單高效，技術成熟，毒副作用小，療效顯著，可以特異性靶向致病基因，但目前尚未應用于APL。NB4細胞是Lanotte等1991年從APL復發患者骨髓細胞中分離建系，具有典型的t(15,17)易位和表達阻滯髓系細胞分化、抑制早幼粒階段細胞成熟的PML-RARα-L型融合蛋白[5]。
本文中我們設計了一些針對PML-RARα融合基因的siRNA，探討其抑制NB4細胞增殖和誘導細胞凋亡的作用。
1 材料與方法
1.1 細胞培養
NB4細胞購自廣州博特生物技術公司(來源于美國細胞收藏中心，ATCC)，使用含10%(V/V)胎牛血清(Gibco)的RPMI-1640培養基(Gibco)，在37 ℃、5% CO2的條件下培養。
1.2 siRNA的設計
針對PML-RARα融合基因，我們設計了5條siRNA序列，每條siRNA以在PML-RARα mRNA序列上所對應的核苷酸位置(5′~3′)命名。5條siRNA序列和未標記的陰性對照siRNA(negative control siRNA,NC siRNA,針對非相關基因的且與人、鼠無同源性的siRNA)均由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。所有序列如表 1所示。
表1
靶向PML-RARα mRNA的siRNA序列
Table1.
Sequences of siRNAs targeting the PML-RARα mRNA
1.3 細胞轉染
采用96孔板、HiPerFect轉染試劑進行轉染。siRNA母液的配置：在150 μL DEPC水中加入siRNA(1 OD，2.5 nmol/L)，配制成20 μmol/L的溶液，放置于4 ℃。在轉染的前一天將細胞接種于25 cm2培養瓶，接種密度為3×105/mL，置于5% CO2培養箱37 ℃培養。轉染當天，用30 μL含血清培養基將細胞種到96孔板中，每孔約含細胞6×104。用無血清培養基將siRNA稀釋成不同的濃度，加入適量的HiPerFect轉染試劑混勻，每孔30 μL，于室溫(15～25 ℃)下靜置5～10 min。然后將siRNA和轉染試劑的復合物轉染細胞，放置于5% CO2培養箱37 ℃培養6 h，每孔加入140 μL RPMI-1640培養基(10% FBS)，轉染后24~72 h進行檢測。
1.4 細胞增殖活性檢測
用3-(4,5-dimethylthiahiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)檢測細胞增殖率：離心收集對數期細胞，用無雙抗無血清培養基懸浮細胞(30 μL，6×104活細胞)接種到96孔板，分別加入不同濃度的靶向siRNA和NC siRNA轉染溶液30 μL，每孔加30 μL無雙抗無血清培養基。轉染6 h，每孔加140 μL完全培養基。實驗組和對照組均設3復孔。每塊板上另設一組調零孔(加培養液，不加細胞和藥物)。培養24~72 h加入MTT溶液20 μL/孔，繼續培養4 h，加入三聯液(10% SDS、5% isopropyl alcohol、0.012 mol/L HCl)100 μL/孔，于37 ℃放置12~16 h[6]，用酶標儀測吸光度值A(570 nm)。 細胞增殖抑制率(%)=(A對照組－A實驗組)/A實驗組×100%。將各0 nmol/L siRNA的細胞增殖設定為100%，作為相應siRNA其他濃度組的基準。
軟瓊脂細胞集落形成實驗：收集對數生長期實驗組(siRNA1244、siRNA1246、siRNA1690，50 nmol/L)和陰性對照組(NC siRNA，50nmol/L)的NB4細胞，測定細胞活力，調整細胞濃度為3×102活細胞/mL的細胞懸液。取9 mL細胞懸液與1 mL 3%瓊脂(已融化，在65 ℃水浴中放置)混勻。6孔培養板每孔加3 mL細胞瓊脂懸液，在室溫放置20 min使細胞瓊脂懸液凝固，移培養板于CO2培養箱37 ℃培養14 d，肉眼觀察并計數細胞集落。結果以肉眼可見的細胞團作為計數集落的標準。集落的計數和計算：集落數=n孔中細胞集落數總和/n；集落形成率(%)=集落數/接種培養細胞總數×100%。
1.5 細胞凋亡的檢測
將轉染siRNA(siRNA 30、siRNA 382、siRNA 1244、siRNA1246、siRNA1690、NC siRNA，50nmol/L，24 h和48 h)后培養的NB4細胞離心(1 000 g，5 min)棄培養基上清。調NB4細胞密度為1×106細胞/mL，冷PBS洗滌3次(1 000 g，5 min)，400 μL Binding Buffer懸浮。加入5 μL Annexin V-FITC染液于2~8 ℃避光孵育5 min。加入5 μL PI于2~8 ℃避光孵育5 min，流式細胞儀檢測(加入兩種染色液1 h內)。Annexin V、PI染色都為陰性的NB4細胞鑒定為活細胞，Annexin V陰性、PI染色檢測陽性的NB4細胞為機械損傷細胞，而Annexin V染色顯示陽性、PI染色陰性的NB4細胞是早期凋亡的細胞，Annexin V、PI染色均陽性的NB4細胞為晚期凋亡細胞。細胞的特異性凋亡率(%)=(實驗組凋亡率－自發凋亡率)/(1－自發凋亡率)×100% 。
1.6 統計學處理
實驗結果用SPSS 18.0統計軟件分析處理。IC50采用加權直線線性回歸法求得，兩樣本均數采用t檢驗，多樣本間比較用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統計學意義。
2 結果
2.1 不同濃度siRNA對NB4細胞的增殖抑制作用
結果顯示：siRNA382、siRNA1244、siRNA1246和siRNA1690在不同濃度下均對NB4細胞的增殖有不同程度的抑制作用，并且在0~50 nmol/L濃度范圍內，濃度越大，對細胞的增殖抑制效率越高;siRNA30只有濃度在50.0 nmol/L時抑制了NB4細胞的增殖(見圖 1)。將siRNA30、siRNA382、siRNA1244、siRNA1246和siRNA1690轉染NB4細胞24 h和48 h，siRNA1244對NB4細胞的增殖抑制效果最明顯。當siRNA1244濃度為50.0 nmol/L，轉染24 h后NB4細胞的抑制率為53.73%±6.41%(P＜0.01)。siRNA1244、siRNA1246、siRNA1690在濃度為12.5、25.0、50.0 nmol/L轉染24、48、72 h的情況下均明顯地抑制NB4細胞增殖。將siRNA382、siRNA1244、siRNA1246和siRNA1690轉染NB4細胞24 h，對siRNA的轉染濃度和增殖抑制率進行雙變量相關性分析，相關系數R值分別為0.678、0.885、0.886和0.587(siRNA382和siRNA1690為中度正相關，siRNA1244和siRNA1246為高度正相關)，再進行線性回歸分析，一元線性相關系數分別為0.678、0.885、0.886和0.587。siRNA1244、siRNA1246、siRNA1690 24 h IC50 分別為46.578、59.324和62.620 nmol/L；48 h IC50 分別65.668、76.549和74.430 nmol/L。
圖1
siRNAs對NB4細胞增殖的影響
(a)作用24 h;(b)作用48 h;(c)作用72 h。與NC siRNA組比較：*
(a) 24 h after transfection; (b) 48 h after transfection; (c) 72 h after transfection. Compared to NC siRNA control: *
2.2 細胞集落形成實驗
NB4細胞集落形成實驗顯示：軟瓊脂培養14 d后計數集落形成數，實驗組(siRNA1244、siRNA1246、siRNA1690)轉染細胞形成的集落數目較NC siRNA組明顯減少(P＜0.05)(見表 2)。如圖 2所示，NB4細胞集落邊緣有大片細胞伸出，游離的單細胞向遠處轉移，呈菜花樣向周圍浸潤，而實驗組(siRNA1244轉染)細胞形成的集落明顯小于陰性對照組(NC siRNA轉染)。
表2
不同siRNA作用下NB4細胞集落形成數
Table2.
Colony formation efficiency of NB4 cell in soft agar
圖2
NB4細胞集落圖
Figure2.
Colony size of NB4 cells in soft agar
2.3 siRNA對細胞凋亡的影響
NB4細胞凋亡檢測結果顯示：siRNAs(siRNA382、siRNA1244、siRNA1246、siRNA1690，50 nmol/L)轉染NB4細胞與NC siRNA組相比24 h和48 h特異性凋亡率顯著增加，晚期凋亡率比早期凋亡率差異更大(見表 3)。siRNA30轉染NB4細胞24 h和48 h對細胞的凋亡沒有顯著的影響。siRNA1244轉染組對細胞凋亡的影響最為顯著，特異性凋亡率高達64.50%。
表3
siRNAs作用24 h和48 h后NB4細胞凋亡情況(%)
Table3.
Apoptosis rates of NB4 cells transfected with siRNAs for 24 and 48 hours(%)
3 討論
細胞增殖旺盛或出現凋亡抑制，以及細胞出現分化障礙是腫瘤發生必須具備的兩個條件。在APL細胞中，染色體易位t(15；17)導致能夠調控細胞生長的PML基因與能夠促進細胞分化的RARα基因融合產生特征性的PML-RARα基因，該基因與APL的發病密切相關。反義技術能夠特異地封閉或抑制其靶基因的表達。于文強等[7]曾設計了針對PML-RARα融合位點的18 mer的反義寡核苷酸，在體外成功地抑制了NB4細胞的增殖，抑制細胞增殖的最低濃度為20 μmol/L。陳燁等[8]針對PML-RARα基因(L型)融合位點設計的反義核酸有效地抑制了細胞的增殖(80 μg/mL，4 d，抑制率59.2%)，促進了細胞的凋亡(60 μg/mL，7 d，凋亡率41%)；但當濃度達到80 μg/mL，反義核酸對細胞的正常增殖有一定的影響(增殖抑制率達18.6%)。本研究設計的針對PML-RARα基因(L型)融合點的siRNA1244作用于NB4細胞后，24 h IC50為46.578 nmol/L(0.621 μg/mL)，50 nmol/L(0.667 μg/mL)siRNA1244作用24 h后NB4細胞凋亡率為64.50%。siRNA對NB4細胞的增殖和凋亡的作用與百倍濃度融合位點的反義寡核苷酸相當。本研究中的siRNA對NB4細胞增殖和凋亡影響的效率更高，毒性更小。
目前臨床上多使用ATRA和ATO治療APL，由于它們的單藥或聯合用藥治療都存在復發、耐藥性和毒副作用等難以克服的問題，很多研究試圖通過其他藥物或者其他治療方式來取得更好的療效。與化療、放療等傳統治療方法相比，基因治療具有毒副作用小、療效顯著等優勢,尤其是基因治療中日趨成熟的RNAi技術，可以快速有效并特異地靶向致病基因，或其它一些阻遏細胞分化凋亡的重要基因，作為APL治療的一種新策略，具有極大的應用前景。RNAi是siRNA介導的研究基因功能的重要工具，并且逐步成為病毒性疾病、遺傳性疾病以及腫瘤等基因治療研究的一種手段[9]。在過去的十年中，已有14項RNAi藥物項目進入臨床試驗[10]，其中包括7項局部給藥，分別靶向眼睛(4項)、呼吸道(2項)、皮膚(1項)；7項系統性全身給藥，分別靶向肝臟(2項)、肝臟和肝外腫瘤(3項)、白細胞(1項)和腎臟(1項)[11]。本研究以APL細胞系NB4為研究對象，探討siRNA對APL細胞NB4生長增殖的抑制，以及對NB4細胞凋亡的影響。
本研究設計的siRNAs顯著地抑制了NB4細胞的活性。MTT實驗結果表明siRNA能夠顯著地抑制NB4細胞的增殖，軟瓊脂細胞集落形成實驗進一步證明siRNA可以影響NB4細胞集落的數量和大小，抑制細胞集落形成能力。siRNA1244和siRNA1246在明顯抑制細胞增殖活性的同時，其特異性凋亡率高達50%～60%，特異性凋亡主要體現在早期凋亡和晚期凋亡，與陰性對照NC siRNA轉染組相比，siRNA1244、siRNA1246、和siRNA1690作用細胞的晚期凋亡變化更顯著。由于本研究設計的siRNAs是靶向PML-RARα mRNA不同位點，研究結果顯示不同作用位點的siRNA作用效果也有差異，siRNA1244和siRNA1246對NB4細胞增殖和凋亡的影響都比較顯著，而siRAN30在轉染濃度高達50 nmol/L時對NB4細胞才有增殖抑制作用，轉染24 h和48 h的增殖抑制率不到20%，siRAN30 50 nmol/L轉染24 h和48 h對NB4細胞的凋亡均無顯著影響。這可能與其靶位點序列的結構有較大關系：siRNA1244和siRNA1246靶向PML-RARα mRNA的融合位點，而siRNA30靶向mRNA 5′非翻譯區(5′ UTR)，可能是因為高度結構化的5′ UTR折疊成高度穩定的結構而使siRNA難以結合，或者是因為靶位點在生理狀態下被蛋白結合而封閉，使siRNA30難以接近，導致抑制增殖和誘導凋亡的效果不理想。由此，我們推測很可能是相應的siRNA下調了PML-RARα基因表達水平，從而激活了某些細胞信號通路，抑制了細胞的異常增殖。現在我們已經證實siRNA1244和siRNA1246等對APL細胞NB4增殖和凋亡有較顯著的影響。目前基因治療最大的限制因素就是轉染效率較低，藥物不能持續發揮作用，因此提高轉染效率和siRNA在細胞內的穩定性是我們接下來努力的方向。
