本文對水牛角角蛋白材料的力學性能與生物學評價進行了實驗研究。通過單軸拉伸和微米壓痕測試方法,探討取樣位置對水牛角材料力學性能的影響,通過元素分析,研究水牛角材料不同部位的元素含量的變化,并采用掃描電子顯微鏡觀察水牛角材料拉伸斷裂面的微觀結構。此外,通過溶血實驗、紅細胞形態觀察、血液血小板和紅細胞計數以及小鼠植入實驗,對水牛角材料進行了初步的生物學評價。研究結果表明:水牛角材料具有良好的力學性能,沿著水牛角的生長方向,其各項力學特性值逐漸增大,這與水牛角不同部位的C、N、S含量及其微觀結構有密切關系;此外,水牛角材料無毒性,不引起溶血反應,對紅細胞具有良好的親和性以及組織相容性,但水牛角材料可引起血液血小板的黏附、聚集,且并沒有繼續誘導引發大量血小板聚集而導致血液凝固,具有良好的血液相容性。
引用本文： 張全彬, 周群飛, 單光華, 曹蘋, 黃耀熊, 敖寧建. 水牛角材料的力學性能與生物學評價. 生物醫學工程學雜志, 2014, 31(6): 1298-1304. doi: 10.7507/1001-5515.20140246 復制
版權信息： ?四川大學華西醫院華西期刊社《生物醫學工程學雜志》版權所有，未經授權不得轉載、改編
引言
角蛋白材料是一類從納米到厘米尺度上具有分級結構的天然生物復合材料，是脊椎動物的皮膚、毛發、角、羽毛和足的主要構成物質，與其它天然生物材料相比其具有較高的韌性[1]。近年來研究發現，由于角蛋白獨特的分子結構，使得角蛋白材料具有優異的生物學特性和良好的材料力學性能。高分子量的角蛋白具有很強的機械強度，良好的加工性、降解性和生物相容性[2-4]。許多生物類角蛋白材料的力學特性已被廣泛研究，比如盲鰻的胡須[5]、馬蹄[6]、驢蹄[7]、牛蹄[8]、鵝毛[9]、人的頭發和指甲[10]、羊毛[11]，尤其是羚羊類角鞘角蛋白[12]。與羚羊相似，其他牛科動物也有由角質層覆蓋骨心組成的角鞘[13]，其角鞘堅韌、有彈性、具有很高的耐沖擊力。研究發現，天然牛角材料具有良好的組織相容性，可在X射線下顯影，可作為一種骨內固定材料以及骨修補材料使用[14]。
深入了解角蛋白材料的機械性能及其生物學性能，有助于更深入地開發組織相容性好且經濟實用的新材料。由于關于牛科動物角鞘角蛋白材料力學性能的研究仍然很少，特別是對其生物學評價的研究內容仍存在著許多空白，有待進一步的完善。因此，本文旨在對水牛角材料進行力學性能探討及生物學評價，為其在生物醫學領域的應用提供理論指導。本文首先以單軸拉伸試驗和微米壓痕測試，研究取樣位置對水牛角材料力學性能的影響，并通過C、N、S元素含量分析，探討水牛角材料不同部位的元素含量變化與力學性能間的關系。此外，采用掃描電子顯微鏡觀察水牛角材料拉伸斷裂面的微觀結構。同時，通過溶血實驗、紅細胞形態觀察、血液血小板和紅細胞計數以及小鼠植入實驗，對水牛角材料進行初步的生物學評價。
1 實驗部分
1.1 樣品制備
水牛角材料來源于廣州市禾利牛羊定點屠宰場的接近于成年的健康牛科動物，在宰殺后24 h內獲得。采用專業加工用具，將骨心與角外殼分離，而不破壞水牛角的自然結構。將水牛角分割成三個部分，即底部、中部、頂部，如圖 1所示。為了比較水牛角不同部位的力學特性，將水牛角的底部和頂部各切掉15 mm。試件的長度方向與水牛角生長方向平行，而厚度垂直于徑向方向。水牛角的內表面和外表面均被切除約2 mm。在試件銑削過程中，沒有遇到角蛋白過熱現象。樣品水含量為9.0%±0.5%。
1.2 拉伸試驗
使用由計算機控制的DL-D系列多功能電子萬能試驗機(江都新真威試驗機械公司)，加載速率為10 mm/min，力傳感器量程為2 000 N，在室溫下進行準靜態拉伸試驗。每組樣品均取三個試樣進行測量，取數據平均值。為防止試樣在夾持時破壞及打滑，使用環氧樹脂粘合劑在試樣兩端粘貼10 mm×6 mm×1 mm的金屬鋁片，使負載平穩且均勻地輸送到試件兩端。
圖1
水牛角材料
(a)取樣部位;(b)拉伸試件;(c)微米壓痕試件(尺寸單位為mm)
Figure1. Buffalo horn(a) sampling position; (b) tensile test pieces; (c) micron-indentation test pieces (Dimensions in mm)
1.3 硬度試驗
采用HVS-1000型顯微硬度計(上海材料試驗機廠)進行水牛角壓痕硬度試驗。實驗環境為室溫，施加載荷大小為9.8 N，力保持時間為25 s，得到的壓痕尺寸能夠匹配壓痕儀屏幕的大小。從每個水牛角試件分別隨機選取5個部位進行顯微硬度測試，再取其平均值。
1.4 元素分析
采用CHNS/O元素分析儀(美國PE公司)分別測定水牛角底部、中部和頂部的樣品中C、N、H、S元素的含量。
1.5 水牛角拉伸斷裂面的微觀觀察
試件拉伸測試完畢后，取水牛角斷裂面進行表面噴金處理，采用掃描電子顯微鏡(荷蘭飛利浦公司)進行觀測。
1.6 水牛角的溶血實驗
將水牛角材料(40 mm×5 mm×2 mm)于10 mL生理鹽水37 ℃浸提24 h。取新鮮兔血，用生理鹽水按4∶5的比例稀釋，生理鹽水(陰性對照)和雙蒸水(陽性對照)各10 mL、上述浸提液(材料不取出)分別加入稀釋兔血0.2 mL，每組各三份。37 ℃水浴1 h，隨即離心，取上清液，在722型分光光度計(上海棱光技術有限公司)于545 nm處測定吸光度(OD值)，計算溶血率。溶血率(%)＝(樣品吸光度－陰性對照吸光度)/(陽性對照吸光度－陰性對照吸光度)×100%
1.7 水牛角對血液紅細胞形態的影響
取2 mL EDTA抗凝人血，用生理鹽水按4∶5的比例稀釋。將水牛角材料(5 mm×5 mm×1 mm)于生理鹽水浸泡24 h，取出瀝干，加入新鮮稀釋人血，以浸沒材料為準，37 ℃孵育1 h，取出用PBS(0.01 mol/L)輕輕漂洗，用2%戊二醛固定2 h，用一系列酒精進行梯度脫水,干燥，鍍金，在掃描電子顯微鏡下觀察紅細胞的形態。
1.8 血液紅細胞和血小板的計數
將水牛角材料(5 mm×5 mm×1 mm)于生理鹽水浸泡24 h，取出瀝干并放入EDTA抗凝血管中，備用。設置材料與血液混合時間，分別為30、60、90、120、180、240和300 s，三個平衡樣。分別抽取健康成人靜脈血3 mL，逐次注入上述抗凝管中，采用全自動血細胞分析儀對血液中的紅細胞和血小板進行計數。
1.9 水牛角的植入實驗
將水牛角材料(約5 mm×5 mm×1 mm)于生理鹽水浸泡24 h，取出瀝干并高溫高壓消毒，備用。將上述材料在無菌條件下植入小鼠皮下，術后1、2和4周分別取材，每次取材處死三只小鼠，并切取樣品周圍組織，置于10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋切片，進行HE染色。在光學顯微鏡下觀察材料植入部位周圍組織反應情況、形成的纖維囊厚度、炎癥細胞和其他細胞存在情況。
2 實驗結果與討論
2.1 取樣位置對水牛角材料力學特性的影響
由圖 2可以看出，取樣位置對水牛角各項力學特性值均有較大的影響。水牛角的力學特性值由底部向頂部逐漸增大(P＜0.05)。
圖2
水牛角材料的力學特性值
(a)楊氏模量；(b)極限強度；(c)斷裂應變；(d)顯微硬度
Figure2. Mechanical characteristic values of buffalo horn(a) Young’s modulus; (b) tensile strength; (c) fracture strain; (d) micro-hardness
這說明在生存防衛與攻擊過程中，細長的角鞘頂部應具有較高的楊氏模量、屈服強度和斷裂韌性以承受更高的外力作用，使得水牛角不易發生破裂。水牛角角蛋白材料的剛度和強度的梯度變化歸因于角鞘在底部、中部和頂部的不同角質化程度。由于水牛角的生長發生在底部的生發層，生發層細胞不斷分裂產生子細胞群，子細胞群不斷成熟和角質化并沿著水牛角軸向移動至角鞘末端。新生細胞比較柔嫩而使彈性模量值較小。細胞不斷沿著角鞘軸向向末端移動，逐漸老化，頂部多為老化細胞，細胞較硬且彈性模量值較大，剛度較高。
2.2 水牛角的元素分析
元素分析表明：水牛角材料在不同部位的C、N、H、S含量并不完全相同，特別是S元素表明半胱氨酸的存在，如表 1所示。水牛角角蛋白材料的結構、品質及力學行為依賴于細胞的角質化過程。在水牛角的底部，新生細胞數量比較多且稚嫩，使得氨基酸含量也相對較多。沿著水牛角的生長方向，新生細胞不斷成熟和角質化并沿著軸向移動至角鞘末端，頂部多為角質化細胞，剛度和硬度較大。而二硫鍵的交聯有利于角蛋白纖維的非螺旋部分和基質中富含半胱氨酸的蛋白質穩定，進而提高角蛋白的剛度和硬度。因此，水牛角頂部需S量相對較多。此外，水牛角頂部的C、N含量有所下降，可能是由于新生細胞的完全角質化，細胞間粘結物質的生化成分及數量發生的改變所引起的。水牛角材料不同部位力學特性的差異性可能與其在不同部位的C、N、H、S含量變化有關。
表1
水牛角材料在底部、中部和頂部的C、N、H、S含量(%)
Table1.
Contents of C,N,H and S in proximal,middle and distal parts of buffalo horn respectively (%)
2.3 水牛角材料拉伸斷裂面的微觀結構
如圖 3所示，水牛角拉伸斷裂面比較光滑、規整，呈波浪形，是一種密實的層狀結構，并可明顯觀察到角蛋白纖維取向平行于水牛角的軸向。這使得水牛角在軸向拉伸時，角蛋白纖維能起增強作用，明顯提高其力學性能[15]。此外，從圖 3的左圖可以看出，水牛角材料具有由薄片細胞堆疊形成的層狀結構，這種結構可有效地增加裂紋擴展的路徑，使裂紋的擴展需要更多的能量，從而大幅度地提高水牛角的力學特性。通過裂紋偏轉來提高材料的韌性，在自然界不是特例，如珍珠母、海綿骨針等高韌度的天然生物材料都具有類似結構[16-18]。
圖3
水牛角材料的拉伸斷裂面
Figure3.
Fracture surface of buffalo horn
2.4 水牛角的溶血性能
生物材料引起的溶血，一方面是材料表面化學物質的毒性，破壞了紅細胞的細胞膜，進而造成溶血；另一方面，由于材料表面與真正血管的差異很大，影響了紅細胞的外環境，使紅細胞代謝產物不能及時排出，這將增加紅細胞內溶質分子數，并增加細胞內滲壓，當細胞膨脹超過臨界體積時，膜結構將被破壞或破裂，細胞內容物滲出，導致溶血[19]。研究中發現，實驗組均無溶血現象。水牛角材料的溶血率為1.34%±0.20%，小于5.00%，符合生物材料溶血試驗要求的標準。其低溶血率可能由于水牛角通過角蛋白分子間的-S-S-鍵形成的穩定空間立體網狀結構，這種結構使得水牛角材料在許多溶劑中不溶解，具有很高的化學穩定性，致使水牛角在浸提過程中無其他小分子物質溶出。因此，水牛角材料溶血程度低，對紅細胞無破壞作用，不會引起溶血現象，初步鑒定具有良好的血液相容性。
2.5 水牛角對紅細胞形態的影響
由圖 4可以看出，紅細胞與水牛角材料表面相互接觸，細胞形態基本不發生改變，仍保持圓潤光滑的凹餅狀。這說明水牛角的密實層片狀結構及其高度交聯的角蛋白不會引起紅細胞變形，對紅細胞的破壞作用較小，與上述研究結果相吻合。
圖4
紅細胞黏附在水牛角表面的形態
Figure4.
Morphology of erythrocyte adhering to the surface of buffalo horn
對不同時間點血液中的血小板和紅細胞進行計數，如圖 5所示，兩曲線間的差值分別為水牛角材料表面血小板和紅細胞的黏附量。水牛角材料與血液接觸30 s內就已有血小板黏附，在90 s時黏附數量最多，而后黏附數量則維持在相對不變的水平，但血液紅細胞在水牛角材料表面基本不發生黏附。材料與血液接觸后，血漿蛋白首先黏附于材料表面，促使一部分血小板黏附，血小板在黏附水平達到一定高峰后，大多數血小板通過“接觸活化”迅速激活、黏附、聚集，隨著時間延長，材料表面黏附了大量白蛋白及血小板，使血小板無法與材料表面接觸，血小板黏附數量維持在一個相對穩定的水平。這表明水牛角材料可引發血液血小板的黏附、聚集，而對紅細胞則具有良好的親和性。
圖5
不同時間點的水牛角材料表面粘附血小板和紅細胞的計數
Figure5.
Counts of platelet and erythrocyte adhered to the surface of buffalo horn at different time
2.6 血液紅細胞和血小板計數
有研究發現，低分子量的水牛角水解物，主要成分為小分子多肽，可起快速凝血作用，且凝血時間隨著劑量的增大而縮短，這與其誘導血小板大量聚集有關[20]。但在本實驗中，雖有少量血小板在水牛角材料表面發生黏附，但并沒有進一步誘導血小板大量聚集，引發血液凝固。這可能與水牛角材料的結構及其角蛋白分子量有關。水牛角角蛋白纖維通過-S-S-鍵高度交聯，形成超大分子量的角蛋白，具有穩定的空間立體網狀結構，使得水牛角材料的化學穩定性高，沒有小分子量物質溶出而誘導血小板大量聚集。事實上，血小板聚集和激活機制是兩個不同的過程。有些材料表面雖然沒有血小板黏附，但卻造成血小板持續不斷地釋放，其血液相容性不好；而另一些材科雖然有大量的血小板黏附和釋放，但這些血小板鋪展成薄層，在較長時間里，材料表面被鈍化，因而不再有血小板的釋放，其血液相容性反而較好[19]。實驗結果發現，90 s后血小板黏附數量維持在相對不變的水平，并沒有繼續誘導引發大量血小板聚集，這可能是由于水牛角材料表面吸附的白蛋白和血小板使得其表面被鈍化，進而抑制了血小板的黏附、聚集[19]。
2.7 水牛角材料植入部位的組織切片觀察
材料植入機體后被視為異物，在無其他因素影響的情況下，如材料有毒性，會導致其周圍組織死亡；如材料無毒性，機體組織對植入物的反應主要是無菌性炎癥反應和纖維包膜產生。組織反應在早期呈現異物刺激引起的輕中度的無菌性急性炎癥反應比如水腫、組織充血和中性粒細胞的浸潤等，兩周后轉為慢性炎癥反應包括巨噬細胞、淋巴細胞和纖維母細胞的增生。機體通過吞噬和酶消化方法消除異物，或者通過纖維囊的包裹隔離材料[14]。本研究中，在小鼠皮下植入水牛角材料后，小鼠活動和飲食正常。植入1周后，小鼠解剖肉眼均見皮膚切口大部分已愈合，皮下無血腫、粘連，形成薄纖維囊，如圖 6(a)，HE染色后光鏡下可見大量嗜中性粒細胞浸潤周圍組織，并有少量纖維細胞，炎癥細胞反應程度較大，如圖 7(a)。植入2周后，小鼠解剖后肉眼可見切口愈合良好，HE染色后光鏡下仍可見大量嗜中性粒細胞浸潤周圍組織，如圖 6(b)和圖 7(b)，但炎癥細胞反應程度較植入1周后的炎癥反應小。植入4周后，HE染色后光鏡下可見少量嗜中性粒細胞浸潤和較多的纖維細胞，并有少量的淋巴細胞，炎癥細胞反應程度減小，如圖 6(c)和圖 7(c)。研究結果表明，水牛角材料植入部位的周圍組織沒有發生異常的病變，前期主要為中性粒細胞浸潤的炎癥反應，在動物體內4周內未引起毒性反應，具有良好的組織相容性。由于水牛角材料植入的前2周，由于傷口還沒完全愈合，因此炎癥反應較為嚴重。
圖6
水牛角材料植入小鼠皮下的組織反應
(a)1周;(b)2周;(c)4周
Figure6. Reaction of subcutaneous tissue of mouse after implantation(a) 1 week; (b) 2 weeks; (c) 4 weeks
圖7
水牛角材料植入小鼠皮下的組織HE染色切片
(a)1周;(b)2周;(c)4周
Figure7. HE staining of subcutaneous tissue of mouse(a) 1 week; (b) 2 weeks; (c) 4 weeks
3 結論
水牛角材料具有良好的力學性能。沿著水牛角的生長方向，其各項力學特性值逐漸增大，這可能與水牛角在不同部位的C、N、H、S含量的差異性有關。在掃描電子顯微鏡下，水牛角具有由薄片細胞堆疊而成的層狀結構，可有效提高水牛角的機械性能。此外，水牛角材料無毒性，不引起溶血反應，具有良好的組織相容性，雖可引起血液血小板的黏附、聚集，但并沒有繼續誘導引發大量血小板聚集而導致血液凝固，具有良好的血液相容性。因此，在經過適當的表面修飾后，水牛角材料有望成為一種較為理想的生物材料，應用于生物醫學等領域中。
引言
角蛋白材料是一類從納米到厘米尺度上具有分級結構的天然生物復合材料，是脊椎動物的皮膚、毛發、角、羽毛和足的主要構成物質，與其它天然生物材料相比其具有較高的韌性[1]。近年來研究發現，由于角蛋白獨特的分子結構，使得角蛋白材料具有優異的生物學特性和良好的材料力學性能。高分子量的角蛋白具有很強的機械強度，良好的加工性、降解性和生物相容性[2-4]。許多生物類角蛋白材料的力學特性已被廣泛研究，比如盲鰻的胡須[5]、馬蹄[6]、驢蹄[7]、牛蹄[8]、鵝毛[9]、人的頭發和指甲[10]、羊毛[11]，尤其是羚羊類角鞘角蛋白[12]。與羚羊相似，其他牛科動物也有由角質層覆蓋骨心組成的角鞘[13]，其角鞘堅韌、有彈性、具有很高的耐沖擊力。研究發現，天然牛角材料具有良好的組織相容性，可在X射線下顯影，可作為一種骨內固定材料以及骨修補材料使用[14]。
深入了解角蛋白材料的機械性能及其生物學性能，有助于更深入地開發組織相容性好且經濟實用的新材料。由于關于牛科動物角鞘角蛋白材料力學性能的研究仍然很少，特別是對其生物學評價的研究內容仍存在著許多空白，有待進一步的完善。因此，本文旨在對水牛角材料進行力學性能探討及生物學評價，為其在生物醫學領域的應用提供理論指導。本文首先以單軸拉伸試驗和微米壓痕測試，研究取樣位置對水牛角材料力學性能的影響，并通過C、N、S元素含量分析，探討水牛角材料不同部位的元素含量變化與力學性能間的關系。此外，采用掃描電子顯微鏡觀察水牛角材料拉伸斷裂面的微觀結構。同時，通過溶血實驗、紅細胞形態觀察、血液血小板和紅細胞計數以及小鼠植入實驗，對水牛角材料進行初步的生物學評價。
1 實驗部分
1.1 樣品制備
水牛角材料來源于廣州市禾利牛羊定點屠宰場的接近于成年的健康牛科動物，在宰殺后24 h內獲得。采用專業加工用具，將骨心與角外殼分離，而不破壞水牛角的自然結構。將水牛角分割成三個部分，即底部、中部、頂部，如圖 1所示。為了比較水牛角不同部位的力學特性，將水牛角的底部和頂部各切掉15 mm。試件的長度方向與水牛角生長方向平行，而厚度垂直于徑向方向。水牛角的內表面和外表面均被切除約2 mm。在試件銑削過程中，沒有遇到角蛋白過熱現象。樣品水含量為9.0%±0.5%。
1.2 拉伸試驗
使用由計算機控制的DL-D系列多功能電子萬能試驗機(江都新真威試驗機械公司)，加載速率為10 mm/min，力傳感器量程為2 000 N，在室溫下進行準靜態拉伸試驗。每組樣品均取三個試樣進行測量，取數據平均值。為防止試樣在夾持時破壞及打滑，使用環氧樹脂粘合劑在試樣兩端粘貼10 mm×6 mm×1 mm的金屬鋁片，使負載平穩且均勻地輸送到試件兩端。
圖1
水牛角材料
(a)取樣部位;(b)拉伸試件;(c)微米壓痕試件(尺寸單位為mm)
Figure1. Buffalo horn(a) sampling position; (b) tensile test pieces; (c) micron-indentation test pieces (Dimensions in mm)
1.3 硬度試驗
采用HVS-1000型顯微硬度計(上海材料試驗機廠)進行水牛角壓痕硬度試驗。實驗環境為室溫，施加載荷大小為9.8 N，力保持時間為25 s，得到的壓痕尺寸能夠匹配壓痕儀屏幕的大小。從每個水牛角試件分別隨機選取5個部位進行顯微硬度測試，再取其平均值。
1.4 元素分析
采用CHNS/O元素分析儀(美國PE公司)分別測定水牛角底部、中部和頂部的樣品中C、N、H、S元素的含量。
1.5 水牛角拉伸斷裂面的微觀觀察
試件拉伸測試完畢后，取水牛角斷裂面進行表面噴金處理，采用掃描電子顯微鏡(荷蘭飛利浦公司)進行觀測。
1.6 水牛角的溶血實驗
將水牛角材料(40 mm×5 mm×2 mm)于10 mL生理鹽水37 ℃浸提24 h。取新鮮兔血，用生理鹽水按4∶5的比例稀釋，生理鹽水(陰性對照)和雙蒸水(陽性對照)各10 mL、上述浸提液(材料不取出)分別加入稀釋兔血0.2 mL，每組各三份。37 ℃水浴1 h，隨即離心，取上清液，在722型分光光度計(上海棱光技術有限公司)于545 nm處測定吸光度(OD值)，計算溶血率。溶血率(%)＝(樣品吸光度－陰性對照吸光度)/(陽性對照吸光度－陰性對照吸光度)×100%
1.7 水牛角對血液紅細胞形態的影響
取2 mL EDTA抗凝人血，用生理鹽水按4∶5的比例稀釋。將水牛角材料(5 mm×5 mm×1 mm)于生理鹽水浸泡24 h，取出瀝干，加入新鮮稀釋人血，以浸沒材料為準，37 ℃孵育1 h，取出用PBS(0.01 mol/L)輕輕漂洗，用2%戊二醛固定2 h，用一系列酒精進行梯度脫水,干燥，鍍金，在掃描電子顯微鏡下觀察紅細胞的形態。
1.8 血液紅細胞和血小板的計數
將水牛角材料(5 mm×5 mm×1 mm)于生理鹽水浸泡24 h，取出瀝干并放入EDTA抗凝血管中，備用。設置材料與血液混合時間，分別為30、60、90、120、180、240和300 s，三個平衡樣。分別抽取健康成人靜脈血3 mL，逐次注入上述抗凝管中，采用全自動血細胞分析儀對血液中的紅細胞和血小板進行計數。
1.9 水牛角的植入實驗
將水牛角材料(約5 mm×5 mm×1 mm)于生理鹽水浸泡24 h，取出瀝干并高溫高壓消毒，備用。將上述材料在無菌條件下植入小鼠皮下，術后1、2和4周分別取材，每次取材處死三只小鼠，并切取樣品周圍組織，置于10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋切片，進行HE染色。在光學顯微鏡下觀察材料植入部位周圍組織反應情況、形成的纖維囊厚度、炎癥細胞和其他細胞存在情況。
2 實驗結果與討論
2.1 取樣位置對水牛角材料力學特性的影響
由圖 2可以看出，取樣位置對水牛角各項力學特性值均有較大的影響。水牛角的力學特性值由底部向頂部逐漸增大(P＜0.05)。
圖2
水牛角材料的力學特性值
(a)楊氏模量；(b)極限強度；(c)斷裂應變；(d)顯微硬度
Figure2. Mechanical characteristic values of buffalo horn(a) Young’s modulus; (b) tensile strength; (c) fracture strain; (d) micro-hardness
這說明在生存防衛與攻擊過程中，細長的角鞘頂部應具有較高的楊氏模量、屈服強度和斷裂韌性以承受更高的外力作用，使得水牛角不易發生破裂。水牛角角蛋白材料的剛度和強度的梯度變化歸因于角鞘在底部、中部和頂部的不同角質化程度。由于水牛角的生長發生在底部的生發層，生發層細胞不斷分裂產生子細胞群，子細胞群不斷成熟和角質化并沿著水牛角軸向移動至角鞘末端。新生細胞比較柔嫩而使彈性模量值較小。細胞不斷沿著角鞘軸向向末端移動，逐漸老化，頂部多為老化細胞，細胞較硬且彈性模量值較大，剛度較高。
2.2 水牛角的元素分析
元素分析表明：水牛角材料在不同部位的C、N、H、S含量并不完全相同，特別是S元素表明半胱氨酸的存在，如表 1所示。水牛角角蛋白材料的結構、品質及力學行為依賴于細胞的角質化過程。在水牛角的底部，新生細胞數量比較多且稚嫩，使得氨基酸含量也相對較多。沿著水牛角的生長方向，新生細胞不斷成熟和角質化并沿著軸向移動至角鞘末端，頂部多為角質化細胞，剛度和硬度較大。而二硫鍵的交聯有利于角蛋白纖維的非螺旋部分和基質中富含半胱氨酸的蛋白質穩定，進而提高角蛋白的剛度和硬度。因此，水牛角頂部需S量相對較多。此外，水牛角頂部的C、N含量有所下降，可能是由于新生細胞的完全角質化，細胞間粘結物質的生化成分及數量發生的改變所引起的。水牛角材料不同部位力學特性的差異性可能與其在不同部位的C、N、H、S含量變化有關。
表1
水牛角材料在底部、中部和頂部的C、N、H、S含量(%)
Table1.
Contents of C,N,H and S in proximal,middle and distal parts of buffalo horn respectively (%)
2.3 水牛角材料拉伸斷裂面的微觀結構
如圖 3所示，水牛角拉伸斷裂面比較光滑、規整，呈波浪形，是一種密實的層狀結構，并可明顯觀察到角蛋白纖維取向平行于水牛角的軸向。這使得水牛角在軸向拉伸時，角蛋白纖維能起增強作用，明顯提高其力學性能[15]。此外，從圖 3的左圖可以看出，水牛角材料具有由薄片細胞堆疊形成的層狀結構，這種結構可有效地增加裂紋擴展的路徑，使裂紋的擴展需要更多的能量，從而大幅度地提高水牛角的力學特性。通過裂紋偏轉來提高材料的韌性，在自然界不是特例，如珍珠母、海綿骨針等高韌度的天然生物材料都具有類似結構[16-18]。
圖3
水牛角材料的拉伸斷裂面
Figure3.
Fracture surface of buffalo horn
2.4 水牛角的溶血性能
生物材料引起的溶血，一方面是材料表面化學物質的毒性，破壞了紅細胞的細胞膜，進而造成溶血；另一方面，由于材料表面與真正血管的差異很大，影響了紅細胞的外環境，使紅細胞代謝產物不能及時排出，這將增加紅細胞內溶質分子數，并增加細胞內滲壓，當細胞膨脹超過臨界體積時，膜結構將被破壞或破裂，細胞內容物滲出，導致溶血[19]。研究中發現，實驗組均無溶血現象。水牛角材料的溶血率為1.34%±0.20%，小于5.00%，符合生物材料溶血試驗要求的標準。其低溶血率可能由于水牛角通過角蛋白分子間的-S-S-鍵形成的穩定空間立體網狀結構，這種結構使得水牛角材料在許多溶劑中不溶解，具有很高的化學穩定性，致使水牛角在浸提過程中無其他小分子物質溶出。因此，水牛角材料溶血程度低，對紅細胞無破壞作用，不會引起溶血現象，初步鑒定具有良好的血液相容性。
2.5 水牛角對紅細胞形態的影響
由圖 4可以看出，紅細胞與水牛角材料表面相互接觸，細胞形態基本不發生改變，仍保持圓潤光滑的凹餅狀。這說明水牛角的密實層片狀結構及其高度交聯的角蛋白不會引起紅細胞變形，對紅細胞的破壞作用較小，與上述研究結果相吻合。
圖4
紅細胞黏附在水牛角表面的形態
Figure4.
Morphology of erythrocyte adhering to the surface of buffalo horn
對不同時間點血液中的血小板和紅細胞進行計數，如圖 5所示，兩曲線間的差值分別為水牛角材料表面血小板和紅細胞的黏附量。水牛角材料與血液接觸30 s內就已有血小板黏附，在90 s時黏附數量最多，而后黏附數量則維持在相對不變的水平，但血液紅細胞在水牛角材料表面基本不發生黏附。材料與血液接觸后，血漿蛋白首先黏附于材料表面，促使一部分血小板黏附，血小板在黏附水平達到一定高峰后，大多數血小板通過“接觸活化”迅速激活、黏附、聚集，隨著時間延長，材料表面黏附了大量白蛋白及血小板，使血小板無法與材料表面接觸，血小板黏附數量維持在一個相對穩定的水平。這表明水牛角材料可引發血液血小板的黏附、聚集，而對紅細胞則具有良好的親和性。
圖5
不同時間點的水牛角材料表面粘附血小板和紅細胞的計數
Figure5.
Counts of platelet and erythrocyte adhered to the surface of buffalo horn at different time
2.6 血液紅細胞和血小板計數
有研究發現，低分子量的水牛角水解物，主要成分為小分子多肽，可起快速凝血作用，且凝血時間隨著劑量的增大而縮短，這與其誘導血小板大量聚集有關[20]。但在本實驗中，雖有少量血小板在水牛角材料表面發生黏附，但并沒有進一步誘導血小板大量聚集，引發血液凝固。這可能與水牛角材料的結構及其角蛋白分子量有關。水牛角角蛋白纖維通過-S-S-鍵高度交聯，形成超大分子量的角蛋白，具有穩定的空間立體網狀結構，使得水牛角材料的化學穩定性高，沒有小分子量物質溶出而誘導血小板大量聚集。事實上，血小板聚集和激活機制是兩個不同的過程。有些材料表面雖然沒有血小板黏附，但卻造成血小板持續不斷地釋放，其血液相容性不好；而另一些材科雖然有大量的血小板黏附和釋放，但這些血小板鋪展成薄層，在較長時間里，材料表面被鈍化，因而不再有血小板的釋放，其血液相容性反而較好[19]。實驗結果發現，90 s后血小板黏附數量維持在相對不變的水平，并沒有繼續誘導引發大量血小板聚集，這可能是由于水牛角材料表面吸附的白蛋白和血小板使得其表面被鈍化，進而抑制了血小板的黏附、聚集[19]。
2.7 水牛角材料植入部位的組織切片觀察
材料植入機體后被視為異物，在無其他因素影響的情況下，如材料有毒性，會導致其周圍組織死亡；如材料無毒性，機體組織對植入物的反應主要是無菌性炎癥反應和纖維包膜產生。組織反應在早期呈現異物刺激引起的輕中度的無菌性急性炎癥反應比如水腫、組織充血和中性粒細胞的浸潤等，兩周后轉為慢性炎癥反應包括巨噬細胞、淋巴細胞和纖維母細胞的增生。機體通過吞噬和酶消化方法消除異物，或者通過纖維囊的包裹隔離材料[14]。本研究中，在小鼠皮下植入水牛角材料后，小鼠活動和飲食正常。植入1周后，小鼠解剖肉眼均見皮膚切口大部分已愈合，皮下無血腫、粘連，形成薄纖維囊，如圖 6(a)，HE染色后光鏡下可見大量嗜中性粒細胞浸潤周圍組織，并有少量纖維細胞，炎癥細胞反應程度較大，如圖 7(a)。植入2周后，小鼠解剖后肉眼可見切口愈合良好，HE染色后光鏡下仍可見大量嗜中性粒細胞浸潤周圍組織，如圖 6(b)和圖 7(b)，但炎癥細胞反應程度較植入1周后的炎癥反應小。植入4周后，HE染色后光鏡下可見少量嗜中性粒細胞浸潤和較多的纖維細胞，并有少量的淋巴細胞，炎癥細胞反應程度減小，如圖 6(c)和圖 7(c)。研究結果表明，水牛角材料植入部位的周圍組織沒有發生異常的病變，前期主要為中性粒細胞浸潤的炎癥反應，在動物體內4周內未引起毒性反應，具有良好的組織相容性。由于水牛角材料植入的前2周，由于傷口還沒完全愈合，因此炎癥反應較為嚴重。
圖6
水牛角材料植入小鼠皮下的組織反應
(a)1周;(b)2周;(c)4周
Figure6. Reaction of subcutaneous tissue of mouse after implantation(a) 1 week; (b) 2 weeks; (c) 4 weeks
圖7
水牛角材料植入小鼠皮下的組織HE染色切片
(a)1周;(b)2周;(c)4周
Figure7. HE staining of subcutaneous tissue of mouse(a) 1 week; (b) 2 weeks; (c) 4 weeks
3 結論
水牛角材料具有良好的力學性能。沿著水牛角的生長方向，其各項力學特性值逐漸增大，這可能與水牛角在不同部位的C、N、H、S含量的差異性有關。在掃描電子顯微鏡下，水牛角具有由薄片細胞堆疊而成的層狀結構，可有效提高水牛角的機械性能。此外，水牛角材料無毒性，不引起溶血反應，具有良好的組織相容性，雖可引起血液血小板的黏附、聚集，但并沒有繼續誘導引發大量血小板聚集而導致血液凝固，具有良好的血液相容性。因此，在經過適當的表面修飾后，水牛角材料有望成為一種較為理想的生物材料，應用于生物醫學等領域中。
