本研究旨在搭建一套可測量血管應變的光學相干層析成像（OCT）系統。首先，利用搭建的 OCT 系統測量豬冠狀動脈結構，并與血管組織切片對比，以確定系統的可靠性；然后，在灌流系統中，對豬冠狀動脈施加不同壓力，測量不同壓力下血管的 OCT 圖像，并使用互相關算法計算血管應變。結果表明，血管的 OCT 圖像呈明暗分層，可以清晰地觀察到血管的中膜和內膜，與血管組織切片結果一致。計算得到了不同壓力下中膜和內膜的位移和應變，發現中膜應變大于內膜應變。該OCT系統不僅可以測量血管組織形態，還可以測量血管微觀尺度的應變。
引用本文： 吳琨, 彭遠來, 盛廣濟, 李昂, 劉肖, 鄧小燕, 樊瑜波. 一種可測量血管應變的光學相干成像系統. 生物醫學工程學雜志, 2017, 34(5): 772-777. doi: 10.7507/1001-5515.201607011 復制
版權信息： ?四川大學華西醫院華西期刊社《生物醫學工程學雜志》版權所有，未經授權不得轉載、改編
引言
正常血管呈多層結構[1]，且其成分隨著血管的狀態動態變化，導致血管的力學特性呈不均勻分布，使得同樣的力學作用下血管的局部力學環境具有較大差異。研究表明，局部力學環境不僅影響血管的生長發育[2-3]，還會影響血管疾病的發生和治療，比如，動脈粥樣硬化斑塊的形成和破裂，與血管局部力學環境密切相關[4-7]；支架植入后力學環境的改變，也被認為是血管再狹窄和晚期血栓的關鍵因素[8-9]。因此，需要較為準確地描述在體血管的力學性質。
目前較為常見的研究手段為彈性成像技術[10]，其中以基于超聲和磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）的血管彈性成像為主，然而超聲和 MRI 的成像分辨率較低，無法描述血管的精細力學性質。近年來，光學相干層析成像（optical coherence tomography，OCT）開始應用于光學彈性成像[11]。這種技術通過測量散射或反射的彈道光子的光程，對生物組織的表面和內部結構進行橫斷面層析成像。其成像深度為 1～3 mm，空間分辨率可達 1～20 μm[12-13]。因此，基于 OCT 的彈性成像（optical coherence elastography，OCE）可能可以觀測到組織的微觀結構和生物力學性質。
本文介紹了一種可以測量血管應變的 OCT 系統，對比蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色組織切片，表明該系統能夠分辨血管內膜和中膜。此外，基于該系統，初步分析了靜態壓力環境下的血管應變，為進一步分析血管的精細力學性質提供了依據。
1 系統和實驗方法
1.1 系統結構
本光學相干成像系統的構架如圖 1 所示，在頻域 OCT 光學平臺上，搭建血管灌流系統，并配套血管掃描系統，使用 Morie Software（Version 0.956b）軟件（http://www.Opticist.org），處理血管 OCT 原始圖片，計算得到血管位移分布和血管應變，進而得到內膜和中膜 x 方向和 y 方向的應變分布。
圖1
本光學相干成像系統
Figure1.
The optical coherent imaging system
1.2 硬件平臺
實驗室光學平臺包括自主搭建的 1 300 nm 波段全光纖傅立葉域光學相干層析（Fourier domain optical coherence tomography，FD-OCT）系統，可程控、手動控制的高精度載物平臺，X-Y 位移精度可以達到 1 μm。手動模式下對焦精度可以達到 5 μm。整套 FD-OCT 系統信噪比大于 100 dB，實測深度分辨率在 10 μm 左右，成像深度大于 3 mm。配套掃描系統軟件可以實現系統參數調節、樣本實時觀測和存儲等功能。
血管灌流系統包括觀察腔、水位器、蠕動泵以及儲液池四部分。血管兩端密閉固定在觀測腔內，觀測腔一端通過管道連接水位器，一端輸出到儲液池，系統通過設置水位器的高度完成血管內部壓強的標定。
1.3 測量方法和實驗原理
首先，使用 OCT 系統對血管進行掃描，采集不同靜水壓下血管的 OCT 圖像；然后，使用互相關算法，計算得出血管的位移分布圖[14]。基于應變的定義，將血管的位移分布圖轉換為應變分布圖。
1.4 OCT 掃描血管
設置血管灌流系統和 OCT 系統參數：豬舒張壓為 52～165 mm Hg[15]，分別設定灌流系統水位器液壓高度值為 65、75、85、95 cm，該靜水壓值處于豬血管生理值范圍。同一血管在該四種靜水壓力條件下進行掃描，得到四組圖像（65 cm 組、75 cm 組、85 cm 組和 95 cm 組）。豬冠狀動脈樣本數為 3 例。OCT 掃描頻率為每秒 6 幀，掃描范圍和血管直徑重合，系統成像的動態范圍大于 100 dB，利用上位機 OCT 掃描軟件保存實驗結果。實驗過程中需要保持 OCT 系統參數一致和觀測室靜止不動，防止引起位移噪聲，同時需要保證離體實驗封閉，防止漏水，并且排除通路內氣泡。
1.5 血管位移和應變分布的計算
利用 Image J 處理采集的圖像，圖片尺寸為 500×300，去除底部噪聲，提高信噪比。使用 Moire Software 在 65 cm 組圖像中選擇感興趣區域（region of interest，ROI），選擇數字散斑相關算法（digital image correlation，DIC），以 65 cm 組圖像作為初始位置，分別對 65 cm 組與 75 cm 組、65 cm 組與 85 cm 組、65 cm 組與 95 cm 組計算位移場和應變場的分布。矩形計算模板區域長度設置在 10～20 范圍內比較合適。
分析位移場的分布，通過軟件把實驗結果分割為中膜和內膜兩個部分，再計算內膜和中膜 x 方向及 y 方向的位移和應變分布圖。
1.6 組織切片觀察血管分層
為了驗證 OCT 系統采集的圖像，將用 OCT 測量后的血管進行 HE 染色。其大致過程為，首先用 10% 中性福爾馬林充分固定血管，用酒精在不同的時間內把組織內的水分置換出來，用二甲苯充分透明，然后用石蠟除去組織中的透明劑，用新蠟和舊蠟包埋，而后用蘇木精適當過染色、分化、顯藍[16]，最后使用顯微鏡觀察采集圖像。
2 實驗結果
2.1 OCT 掃描與組織切片對比
OCT 圖像結果顯示，整個血管呈清晰的明暗相間分布（圖 2 左）。由于血管外膜在實驗預處理階段基本剝離完全，因此這種明暗相間結構理論上應該是內膜和中膜。為了驗證該結果，對 OCT 掃描的樣本進行 HE 染色切片觀察（圖 2 右），組織切片中，深紅區域為血管內膜，紅白相間區域為血管中膜（血管切開后內層向上放置觀察），分布情況與 OCT 掃描的明暗相間部位一致，因此可以確定，在 OCT 掃描實驗中觀測到的明暗相間分層結構即為血管內膜和中膜。
圖2
血管 OCT 掃描和組織切片圖
Figure2.
OCT scanning and HE staining images of tissue slices of blood vessels
2.2 OCT 掃描血管結果
圖 3 所示為一個樣品的 OCT 掃描圖像，包括四種不同壓力環境下（灌流系統水位器液壓高度分別為 65、75、85 和 95 cm，即液體壓強大小分別為 48.75、56.25、63.75 和 71.25 mm Hg）的血管成像圖。通過調整圖像灰度值映射的動態范圍可知，系統成像靈敏度超過 100 dB。此外，我們還采用深度分辨色散補償方法[17]，提高血管深度方向的掃描范圍和分辨率。其它樣本的實驗結果相似（未放入本文），表明實驗可重復性強。OCT 的成像灰度值由樣本折射率決定，折射率表征物質的組成成分和微觀結構，因此 OCT 圖像反映了內膜和中膜的組成和性質有差異。本實驗的 OCT 掃描血管方式是，從外部垂直血管軸向方向掃描成像，圖像中中膜在上，內膜在下，可對血管的上半部分進行觀察。
圖3
OCT 原始掃描圖像
Figure3.
The OCT original scanning images
2.3 血管位移和應變分布
圖 4 顯示的是，以 65 cm 水柱（48.75 mm Hg）壓力下的血管掃描圖為基準，其它三個壓力（75、85 和 95 cm）下血管的位移場和應變場。在 x 方向上，血管由于受到靜水壓力的作用向外膨脹，使得血管左右兩側位移方向相反；在 y 方向上，由于膨脹作用，血管上半部分位移幾乎豎直向上，且具有對稱性。此外，圖 5 結果顯示，不同冠狀動脈的位移測量結果類似，相同壓力下不同血管的掃描結果一致，說明實驗方案正確、可靠。
圖4
Morie Software 計算位移分布圖
Figure4.
The displacement map calculated in Morie Software
圖5
不同冠脈血管位移的測量
Figure5.
Measurement of displacement in different coronary blood vessels
圖 6 顯示的是 75 cm 壓力條件下血管的應變，左圖為 x 方向上的應變場，右圖為 y 方向上的應變場。由內及外血管應變呈逐漸增大的趨勢，x 方向上的應變大體呈左右對稱分布，而 y 方向的應變則較為不均勻。這種非均勻分布表明血管力學性質為非均勻介質。此外，大致可以看出中膜的應變大于內膜。由于在相同的壓力作用下，應變能在一定程度上反映出材料的力學性質，說明內膜的彈性模量比中膜大。
圖6
x 方向和 y 方向上的血管應變分布（65 cm 對比 75 cm 液壓高度）
Figure6.
Vascular strain distributions in the x direction and the y direction (comparison of strains at 65 cm and 75 cm hydraulic heights)
3 討論
本研究利用光學相干層析成像平臺，掃描處于靜水壓下的豬冠狀動脈。成像結果顯示，血管具有明顯分層結構，進而通過對比組織切片和 OCT 掃描切片樣本，驗證該分層結構是血管的內膜和中膜，該結果與文獻中血管 OCT 圖像的分層結構一致[18]。與文獻研究方法不同的是，文獻中將 OCT 探頭置于血管中，而本實驗中 OCT 成像系統采用非侵入掃描方式，將探頭置于血管外。該掃描方式操作簡便，而且能有效防止探頭植入血管中引起的血管運動，使得后續位移場和應變場的分析更加方便、準確。
OCT 作為一種新興的成像技術，在科學研究和醫學臨床實踐中具有廣泛的應用前景。國外研究表明，利用 OCT 測量生物組織在壓縮應力下的微觀變形，可以幫助我們更好地研究生物組織的微觀特性[19]。本研究搭建的 OCT 系統是針對血管微觀力學性質的測量，在 OCT 測量系統的基礎上，設計了血管灌流系統，以配合 OCT 圖像的采集。通過 Morie Software 軟件計算血管位移和應變分布。該軟件基于 DIC 算法，國內外相關研究證實該算法準確性較強，具有較高的重復性[20-21]。從圖 5 結果可以知，在 x 方向上，隨著靜水壓增大，血管左右兩側位移增大，血管頂端的位移減小；在 y 方向上，隨著內壓力增大，向上逐漸增大，且靠近軸線部分位移量最小；上述結果符合理想均質彈性管位移的分布規律。更為重要的是，結果表明血管的位移場呈非均勻分布，為了大體描述這種非均勻性的差異，利用圖像分割把內膜和中膜的應變分布圖提取出來并單獨進行分析比較，發現中膜的應變大于內膜。有研究報道，血管內膜的彈性模量比中膜大三到四倍[22]。因此，在相同應力作用下，中膜的應變會大于內膜的應變，該結果與本實驗的結果一致，印證了本實驗的結論，同時驗證了本系統測量血管應變的可行性。此外，本系統測量得到的血管應變結果相比于其它血管應變測量技術，如高頻超聲和 MRI[23-25]，具有分辨率高的特點（高頻超聲分辨率為 30～70 μm，MRI 分辨率為 120 μm，而 OCT 分辨率為 10 μm 以內），為實驗的準確性和正確性提供了保障。
引言
正常血管呈多層結構[1]，且其成分隨著血管的狀態動態變化，導致血管的力學特性呈不均勻分布，使得同樣的力學作用下血管的局部力學環境具有較大差異。研究表明，局部力學環境不僅影響血管的生長發育[2-3]，還會影響血管疾病的發生和治療，比如，動脈粥樣硬化斑塊的形成和破裂，與血管局部力學環境密切相關[4-7]；支架植入后力學環境的改變，也被認為是血管再狹窄和晚期血栓的關鍵因素[8-9]。因此，需要較為準確地描述在體血管的力學性質。
目前較為常見的研究手段為彈性成像技術[10]，其中以基于超聲和磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）的血管彈性成像為主，然而超聲和 MRI 的成像分辨率較低，無法描述血管的精細力學性質。近年來，光學相干層析成像（optical coherence tomography，OCT）開始應用于光學彈性成像[11]。這種技術通過測量散射或反射的彈道光子的光程，對生物組織的表面和內部結構進行橫斷面層析成像。其成像深度為 1～3 mm，空間分辨率可達 1～20 μm[12-13]。因此，基于 OCT 的彈性成像（optical coherence elastography，OCE）可能可以觀測到組織的微觀結構和生物力學性質。
本文介紹了一種可以測量血管應變的 OCT 系統，對比蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色組織切片，表明該系統能夠分辨血管內膜和中膜。此外，基于該系統，初步分析了靜態壓力環境下的血管應變，為進一步分析血管的精細力學性質提供了依據。
1 系統和實驗方法
1.1 系統結構
本光學相干成像系統的構架如圖 1 所示，在頻域 OCT 光學平臺上，搭建血管灌流系統，并配套血管掃描系統，使用 Morie Software（Version 0.956b）軟件（http://www.Opticist.org），處理血管 OCT 原始圖片，計算得到血管位移分布和血管應變，進而得到內膜和中膜 x 方向和 y 方向的應變分布。
圖1
本光學相干成像系統
Figure1.
The optical coherent imaging system
1.2 硬件平臺
實驗室光學平臺包括自主搭建的 1 300 nm 波段全光纖傅立葉域光學相干層析（Fourier domain optical coherence tomography，FD-OCT）系統，可程控、手動控制的高精度載物平臺，X-Y 位移精度可以達到 1 μm。手動模式下對焦精度可以達到 5 μm。整套 FD-OCT 系統信噪比大于 100 dB，實測深度分辨率在 10 μm 左右，成像深度大于 3 mm。配套掃描系統軟件可以實現系統參數調節、樣本實時觀測和存儲等功能。
血管灌流系統包括觀察腔、水位器、蠕動泵以及儲液池四部分。血管兩端密閉固定在觀測腔內，觀測腔一端通過管道連接水位器，一端輸出到儲液池，系統通過設置水位器的高度完成血管內部壓強的標定。
1.3 測量方法和實驗原理
首先，使用 OCT 系統對血管進行掃描，采集不同靜水壓下血管的 OCT 圖像；然后，使用互相關算法，計算得出血管的位移分布圖[14]。基于應變的定義，將血管的位移分布圖轉換為應變分布圖。
1.4 OCT 掃描血管
設置血管灌流系統和 OCT 系統參數：豬舒張壓為 52～165 mm Hg[15]，分別設定灌流系統水位器液壓高度值為 65、75、85、95 cm，該靜水壓值處于豬血管生理值范圍。同一血管在該四種靜水壓力條件下進行掃描，得到四組圖像（65 cm 組、75 cm 組、85 cm 組和 95 cm 組）。豬冠狀動脈樣本數為 3 例。OCT 掃描頻率為每秒 6 幀，掃描范圍和血管直徑重合，系統成像的動態范圍大于 100 dB，利用上位機 OCT 掃描軟件保存實驗結果。實驗過程中需要保持 OCT 系統參數一致和觀測室靜止不動，防止引起位移噪聲，同時需要保證離體實驗封閉，防止漏水，并且排除通路內氣泡。
1.5 血管位移和應變分布的計算
利用 Image J 處理采集的圖像，圖片尺寸為 500×300，去除底部噪聲，提高信噪比。使用 Moire Software 在 65 cm 組圖像中選擇感興趣區域（region of interest，ROI），選擇數字散斑相關算法（digital image correlation，DIC），以 65 cm 組圖像作為初始位置，分別對 65 cm 組與 75 cm 組、65 cm 組與 85 cm 組、65 cm 組與 95 cm 組計算位移場和應變場的分布。矩形計算模板區域長度設置在 10～20 范圍內比較合適。
分析位移場的分布，通過軟件把實驗結果分割為中膜和內膜兩個部分，再計算內膜和中膜 x 方向及 y 方向的位移和應變分布圖。
1.6 組織切片觀察血管分層
為了驗證 OCT 系統采集的圖像，將用 OCT 測量后的血管進行 HE 染色。其大致過程為，首先用 10% 中性福爾馬林充分固定血管，用酒精在不同的時間內把組織內的水分置換出來，用二甲苯充分透明，然后用石蠟除去組織中的透明劑，用新蠟和舊蠟包埋，而后用蘇木精適當過染色、分化、顯藍[16]，最后使用顯微鏡觀察采集圖像。
2 實驗結果
2.1 OCT 掃描與組織切片對比
OCT 圖像結果顯示，整個血管呈清晰的明暗相間分布（圖 2 左）。由于血管外膜在實驗預處理階段基本剝離完全，因此這種明暗相間結構理論上應該是內膜和中膜。為了驗證該結果，對 OCT 掃描的樣本進行 HE 染色切片觀察（圖 2 右），組織切片中，深紅區域為血管內膜，紅白相間區域為血管中膜（血管切開后內層向上放置觀察），分布情況與 OCT 掃描的明暗相間部位一致，因此可以確定，在 OCT 掃描實驗中觀測到的明暗相間分層結構即為血管內膜和中膜。
圖2
血管 OCT 掃描和組織切片圖
Figure2.
OCT scanning and HE staining images of tissue slices of blood vessels
2.2 OCT 掃描血管結果
圖 3 所示為一個樣品的 OCT 掃描圖像，包括四種不同壓力環境下（灌流系統水位器液壓高度分別為 65、75、85 和 95 cm，即液體壓強大小分別為 48.75、56.25、63.75 和 71.25 mm Hg）的血管成像圖。通過調整圖像灰度值映射的動態范圍可知，系統成像靈敏度超過 100 dB。此外，我們還采用深度分辨色散補償方法[17]，提高血管深度方向的掃描范圍和分辨率。其它樣本的實驗結果相似（未放入本文），表明實驗可重復性強。OCT 的成像灰度值由樣本折射率決定，折射率表征物質的組成成分和微觀結構，因此 OCT 圖像反映了內膜和中膜的組成和性質有差異。本實驗的 OCT 掃描血管方式是，從外部垂直血管軸向方向掃描成像，圖像中中膜在上，內膜在下，可對血管的上半部分進行觀察。
圖3
OCT 原始掃描圖像
Figure3.
The OCT original scanning images
2.3 血管位移和應變分布
圖 4 顯示的是，以 65 cm 水柱（48.75 mm Hg）壓力下的血管掃描圖為基準，其它三個壓力（75、85 和 95 cm）下血管的位移場和應變場。在 x 方向上，血管由于受到靜水壓力的作用向外膨脹，使得血管左右兩側位移方向相反；在 y 方向上，由于膨脹作用，血管上半部分位移幾乎豎直向上，且具有對稱性。此外，圖 5 結果顯示，不同冠狀動脈的位移測量結果類似，相同壓力下不同血管的掃描結果一致，說明實驗方案正確、可靠。
圖4
Morie Software 計算位移分布圖
Figure4.
The displacement map calculated in Morie Software
圖5
不同冠脈血管位移的測量
Figure5.
Measurement of displacement in different coronary blood vessels
圖 6 顯示的是 75 cm 壓力條件下血管的應變，左圖為 x 方向上的應變場，右圖為 y 方向上的應變場。由內及外血管應變呈逐漸增大的趨勢，x 方向上的應變大體呈左右對稱分布，而 y 方向的應變則較為不均勻。這種非均勻分布表明血管力學性質為非均勻介質。此外，大致可以看出中膜的應變大于內膜。由于在相同的壓力作用下，應變能在一定程度上反映出材料的力學性質，說明內膜的彈性模量比中膜大。
圖6
x 方向和 y 方向上的血管應變分布（65 cm 對比 75 cm 液壓高度）
Figure6.
Vascular strain distributions in the x direction and the y direction (comparison of strains at 65 cm and 75 cm hydraulic heights)
3 討論
本研究利用光學相干層析成像平臺，掃描處于靜水壓下的豬冠狀動脈。成像結果顯示，血管具有明顯分層結構，進而通過對比組織切片和 OCT 掃描切片樣本，驗證該分層結構是血管的內膜和中膜，該結果與文獻中血管 OCT 圖像的分層結構一致[18]。與文獻研究方法不同的是，文獻中將 OCT 探頭置于血管中，而本實驗中 OCT 成像系統采用非侵入掃描方式，將探頭置于血管外。該掃描方式操作簡便，而且能有效防止探頭植入血管中引起的血管運動，使得后續位移場和應變場的分析更加方便、準確。
OCT 作為一種新興的成像技術，在科學研究和醫學臨床實踐中具有廣泛的應用前景。國外研究表明，利用 OCT 測量生物組織在壓縮應力下的微觀變形，可以幫助我們更好地研究生物組織的微觀特性[19]。本研究搭建的 OCT 系統是針對血管微觀力學性質的測量，在 OCT 測量系統的基礎上，設計了血管灌流系統，以配合 OCT 圖像的采集。通過 Morie Software 軟件計算血管位移和應變分布。該軟件基于 DIC 算法，國內外相關研究證實該算法準確性較強，具有較高的重復性[20-21]。從圖 5 結果可以知，在 x 方向上，隨著靜水壓增大，血管左右兩側位移增大，血管頂端的位移減小；在 y 方向上，隨著內壓力增大，向上逐漸增大，且靠近軸線部分位移量最小；上述結果符合理想均質彈性管位移的分布規律。更為重要的是，結果表明血管的位移場呈非均勻分布，為了大體描述這種非均勻性的差異，利用圖像分割把內膜和中膜的應變分布圖提取出來并單獨進行分析比較，發現中膜的應變大于內膜。有研究報道，血管內膜的彈性模量比中膜大三到四倍[22]。因此，在相同應力作用下，中膜的應變會大于內膜的應變，該結果與本實驗的結果一致，印證了本實驗的結論，同時驗證了本系統測量血管應變的可行性。此外，本系統測量得到的血管應變結果相比于其它血管應變測量技術，如高頻超聲和 MRI[23-25]，具有分辨率高的特點（高頻超聲分辨率為 30～70 μm，MRI 分辨率為 120 μm，而 OCT 分辨率為 10 μm 以內），為實驗的準確性和正確性提供了保障。
