本研究旨在探索白藜蘆醇對后肢去負荷大鼠肝臟損傷的保護作用。將30只2月齡SD雄性大鼠隨機分為正常組（Control）、后肢去負荷模型組（Model）和后肢去負荷+白藜蘆醇給藥組（Model+Res）。Model+Res組腹腔注射白藜蘆醇30 mg·kg?1，Control組和Model組腹腔注射等體積0.9% NaCl。28天后取肝臟組織，檢測氧化應激、炎癥因子、能量代謝指標、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活力，并通過蘇木精-伊紅染色觀察形態學變化。使用Western blotting檢測Bax、Bcl-2、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白表達水平。與Control組相比，Model組肝細胞出現腫脹、形態異常、細胞核固縮及細胞膜破壞。白藜蘆醇處理組的肝細胞形態有所恢復。Model組肝臟組織的氧化應激、炎癥因子水平升高，肝糖原蓄積，能量代謝紊亂，而白藜蘆醇處理可顯著逆轉這些變化。Western blotting結果顯示，白藜蘆醇可顯著降低Bax表達，提高Bcl-2及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT表達水平。實驗提示28天的后肢去負荷處理可導致大鼠肝臟組織損傷，表現為氧化應激、炎癥反應、能量代謝紊亂和凋亡水平升高，而白藜蘆醇對此有一定的緩解作用。
引用本文： 軒瑩瑩, 楊玉田, 唐漢琴, 馬智慧, 李亮, 申棟帥, 張梅, 陳克明. 白藜蘆醇對后肢去負荷大鼠肝臟的保護作用研究. 生物醫學工程學雜志, 2024, 41(6): 1250-1256. doi: 10.7507/1001-5515.202405011 復制
版權信息： ?四川大學華西醫院華西期刊社《生物醫學工程學雜志》版權所有，未經授權不得轉載、改編
0 引言
隨著人類對太空探索的深入，微重力環境對生物體健康的影響成為熱點話題。長時間的太空飛行可能導致宇航員出現骨密度降低、肌肉萎縮、心血管系統變化及器官功能改變等問題[1]。肝臟在新陳代謝、解毒、免疫調節等方面發揮著關鍵作用[1-2]，然而已有研究發現，在微重力條件下，肝臟細胞的結構和功能會出現異常，導致代謝紊亂和相關疾病的發生[3-5]。
白藜蘆醇（resveratrol，Res）是一種存在于葡萄、紅酒和某些漿果中的多酚化合物，已被證明具有抗氧化、抗炎和抗衰老等多種生物活性。近年的研究發現，白藜蘆醇對酒精依賴[6-7]、運動性疲勞[8-9]和野百合堿[10]等多種原因所致的肝損傷均有明顯的保護作用。
為解決航天員在太空飛行時所面臨的肝臟損傷難題，本次實驗使用大鼠后肢去負荷所模擬的失重模型探究白藜蘆醇對失重所致肝臟損傷是否具有保護作用。
1 動物、材料與方法
1.1 動物
SPF級SD雄性大鼠30只，鼠齡8周，體質量（180 ± 20）g，購自空軍軍醫大學實驗動物中心，許可證編號SCXK(陜)2019-001，本實驗經中國人民解放軍聯勤保障部隊第940醫院科研管理倫理委員會批準（倫理審批號：2023KYLL337）。
1.2 材料
白藜蘆醇（阿拉丁，中國）；比色法測試盒（南京建成，中國）；酶聯免疫吸附實驗試劑盒（泉州睿信，中國）；B細胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）單克隆抗體（北京博奧森，中國）；Bcl2關聯X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）單克隆抗體、蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）多克隆抗體、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）單克隆抗體（Abcam，英國）；磷酸化蛋白激酶B（phospho-protein kinase B，p-AKT）多克隆抗體、磷酸化磷脂肌醇3激酶（phosphorylation phosphotylinosital 3 kinase，p-PI3K）多克隆抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（recombinant glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）多克隆抗體、HRP標記山羊抗兔二抗（Affinity，美國）；Epoch酶標儀（伯騰，美國）；電泳儀、電泳槽（Bio-Rad，美國）
1.3 方法
1.3.1 動物分組與給藥方法
所有動物在實驗開始前在實驗室環境適應性飼養1周，然后隨機分為正常組（Control）、后肢去負荷模型組（Model）和后肢去負荷+白藜蘆醇給藥組（Model+Res）,每組10只。Model+Res組腹腔注射Res 30 mg·kg?1，Control組和Model組均腹腔注射等體積0.9% NaCl。隔天給藥，持續給藥28天，給藥共14次。每周稱取大鼠體質量并記錄。
1.3.2 后肢去負荷模型構建
本實驗中，按照Wronski和Morey-Holton的方法建立后肢去負荷模型[11]。Control組大鼠正常飼養，而Model組和Model+Res組大鼠通過尾部懸吊，保持身體30 °傾斜，后肢離地，前肢自由，確保正常進食和飲水。每天尾吊24 h，共28天。
1.3.3 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色法觀察大鼠肝臟組織病理學形態變化
大鼠肝臟組織經磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗凈后于4%的多聚甲醛固定液中保存，隨后進行脫水、透明、石蠟包埋、切片，最后做HE染色處理，于光學顯微鏡下觀察各組大鼠肝臟組織的病理學變化。
1.3.4 比色法檢測肝臟組織氧化應激和能量代謝水平
取部分肝臟組織，按照各試劑盒說明書進行超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX)、過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、一氧化氮(NO)、糖原、腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）、Na+K+-ATP酶（Na+K+-ATPase）、Ca2+Mg2+-ATP酶（Ca2+Mg2+-ATPase）含量/酶活力檢測。
1.3.5 ELISA法檢測肝臟組織炎癥因子水平
取部分肝臟組織，按照1∶9的比例加入預冷的裂解液機械勻漿，離心30 min后取上清，采用酶聯免疫吸附法（ELISA）進行白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）和白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）水平檢測，具體操作按照試劑盒說明書進行。
1.3.6 蛋白質印跡法檢測肝臟組織內Bax、Bcl-2、p-AKT、AKT、p-PI3K、PI3K和GAPDH蛋白的表達水平
取部分肝臟組織，按照1∶9的比例加入預冷的裂解液機械勻漿，隨后依次進行離心、測蛋白濃度、蛋白定量、高溫變性。隨后置于?80 ℃冰箱中待用。待測樣品利用10% SDS-PAGE分離膠進行電泳分離，濕法轉膜，5%脫脂奶粉封閉，再分別置于放有一抗Bax、Bcl-2、p-AKT、AKT、p-PI3K、PI3K和GAPDH的自封袋中4 ℃孵育過夜，二抗孵育，曝光檢測各蛋白表達量。
1.3.7 統計學分析
實驗數據通過SPSS 26.0進行均值±標準差（x ± s）的統計學分析。多組別比較采用單因素方差分析（ANOVA），隨后用LSD法進行組間比較，檢驗水準為0.05。
2 結果
2.1 白藜蘆醇對后肢去負荷大鼠肝臟組織病理變化的影響
普通光學顯微鏡下觀察可見（見圖1），Control組大鼠肝細胞形態結構正常，細胞核呈橢圓形，細胞間隙清晰，排列規則且緊密，肝細胞索排列整齊；Model組大鼠肝臟組織則出現了明顯的病理變化，表現為肝細胞腫脹且形態異常，細胞核固縮，細胞膜完整性被破壞，肝細胞質內出現圓形空泡，細胞間隙模糊，排列無規則，肝細胞索紊亂，狄氏隙顯現；Model+Res組大鼠肝臟組織的損傷有明顯緩解，表現為肝細胞形態恢復正常，細胞腫脹程度明顯降低，細胞間隙清晰，排列有序，肝細胞索排列較整齊。結果表明白藜蘆醇能有效減輕后肢去負荷大鼠肝細胞受損程度。
圖1
白藜蘆醇對后肢去負荷大鼠肝臟組織病理變化的影響
Figure1.
Effect of resveratrol on pathological changes in liver tissue of hindlimb unloading rats
2.2 白藜蘆醇對后肢去負荷大鼠肝臟組織抗氧化酶活性的影響
如圖2所示，與Control組相比，Model組大鼠肝臟組織抗氧化酶CAT、SOD、GSH-PX的酶活力顯著下降（P < 0.01，P < 0.05，P < 0.01）；經白藜蘆醇處理后，與Model組相比，CAT、SOD、GSH-PX的酶活力顯著上升（P < 0.05，P < 0.01，P < 0.01），其中GSH-PX活性與Control組相比無顯著差異（P > 0.05）。以上結果表明，白藜蘆醇能明顯緩解因后肢去負荷所致大鼠肝臟組織的氧化損傷，并有可能在一定程度上基本恢復肝臟異常狀態。
圖2
白藜蘆醇對后肢去負荷大鼠肝臟組織抗氧化酶活性的影響
*
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2.3 白藜蘆醇對后肢去負荷大鼠肝臟組織氧化損傷指標的影響
如圖3所示，與Control組相比，Model組大鼠肝臟氧化損傷指標H2O2、LDH、MDA和NO的酶活力/含量均顯著升高（P < 0.05，P < 0.01，P < 0.05，P < 0.01）；經白藜蘆醇給藥處理后，與Model組相比，Model+Res組大鼠肝臟組織上述指標均顯著下降（P < 0.01，P < 0.01，P < 0.01，P < 0.01），與Control組相比無顯著差異（P > 0.05，P > 0.05，P > 0.05，P > 0.05）。這說明白藜蘆醇能夠顯著降低后肢去負荷大鼠肝臟組織的氧化損傷，并可恢復至正常水平，顯示出白藜蘆醇強大的抗氧化應激的作用。
圖3
白藜蘆醇對后肢去負荷大鼠肝臟組織氧化損傷指標的影響
*
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2.4 白藜蘆醇對后肢去負荷大鼠肝臟組織炎癥因子水平的影響
Elisa結果顯示（見圖4），與Control組相比，Model組大鼠肝臟組織IL-6和IL-1β相對含量顯著升高（P < 0.01，P < 0.05）；Model+Res組大鼠肝臟組織IL-6和IL-1β相對含量明顯低于Model組（P < 0.01，P < 0.01），且與Control組之間無顯著差異（P > 0.05，P > 0.05）。這說明白藜蘆醇對由后肢去負荷引起的大鼠肝臟炎癥因子水平的升高有一定的緩解作用。
圖4
白藜蘆醇對后肢去負荷大鼠肝臟組織炎癥因子水平的影響
*
*
2.5 白藜蘆醇對后肢去負荷大鼠肝臟組織能量代謝指標的影響
如圖5所示，與Control組相比，Model組大鼠肝臟組織糖原含量明顯升高（P < 0.05），ATP含量、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活力顯著降低（P < 0.01，P < 0.01，P < 0.01），發生了肝糖原蓄積、能量代謝紊亂現象；而經白藜蘆醇給藥后，肝糖原含量明顯下降（P < 0.05），能夠恢復至正常水平，且ATP含量、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活力均有一定程度的上升（P < 0.01，P < 0.05，P < 0.01）。這說明白藜蘆醇能夠一定程度上改善因后肢去負荷引起的肝臟能量代謝紊亂的現象。
圖5
白藜蘆醇對后肢去負荷大鼠肝臟組織能量代謝指標的影響
*
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2.6 白藜蘆醇對后肢去負荷大鼠肝臟組織凋亡蛋白表達的影響
如圖6所示，與Control組相比，Model組大鼠肝臟組織Bax促凋亡蛋白相對表達水平顯著升高（P < 0.05），Bcl-2抗凋亡蛋白相對表達水平顯著下降（P < 0.01）；與Model組相比，Model+Res組大鼠肝臟組織Bax蛋白相對表達水平顯著下降（P < 0.05）并恢復至正常水平，Bcl-2蛋白相對表達水平顯著上升（P < 0.05）。結果說明，白藜蘆醇能夠抑制后肢去負荷引起的大鼠肝臟組織的凋亡。
圖6
白藜蘆醇對后肢去負荷大鼠肝臟組織凋亡蛋白表達的影響
*
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2.7 白藜蘆醇對后肢去負荷大鼠肝臟組織PI3K/AKT信號通路活性的影響
如圖7所示，Model組大鼠肝臟組織的PI3K和AKT蛋白磷酸化相對水平與Control組相比顯著下降（P < 0.01，P < 0.01）；與Model組相比，Model+Res組大鼠肝臟組織的PI3K和AKT蛋白磷酸化相對水平顯著上升（P < 0.05，P < 0.05）。以上結果提示，白藜蘆醇可能通過激活PI3K/AKT信號通路調節后肢去負荷大鼠肝臟組織的氧化應激和凋亡水平。
圖7
白藜蘆醇對后肢去負荷大鼠肝臟組織PI3K/AKT信號通路活性的影響
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3 討論與結論
隨著太空探索活動的增多，微重力環境對生物體特別是肝臟的影響成為研究熱點。研究顯示，微重力條件下肝臟面臨組織形態變化、氧化應激、炎癥反應和能量代謝失調等多重壓力，而白藜蘆醇通過綜合調節這些因素，可為肝臟健康提供保護作用。
肝臟組織正常形態對于維持其功能至關重要，而在微重力環境下，肝臟組織常出現明顯的形態學變化，如細胞腫脹、結構異常和細胞膜損傷，這些變化通常與肝臟的功能障礙和代謝失調相關[12]。本研究表明，白藜蘆醇能夠有效改善后肢去負荷大鼠的肝臟組織形態，減輕細胞損傷和形態異常，體現出對肝臟的保護作用。
肝臟作為機體主要的解毒器官，負責代謝各種化合物，但當自由基的生成量超過內源性抗氧化系統的能力時，肝臟的穩態就會遭受損害[13]。氧化應激作為微重力環境中導致肝損傷的主要機制之一，能夠增加自由基的產生，導致細胞膜脂質過度氧化，進而損傷細胞結構和功能[14]。研究結果顯示，白藜蘆醇能顯著增強肝臟中的抗氧化酶活性（如CAT、SOD、GSH-PX），并降低氧化損傷標志物（如MDA、H2O2和NO）的水平。
此外，研究發現，氧化應激和炎癥在肝臟損傷中存在著密切的相互關系，它們通常相互影響并相互促進，導致肝臟疾病的發生和發展。炎癥因子的過度釋放是微重力環境下肝損傷的另一關鍵因素[15]，而本研究發現，白藜蘆醇能夠顯著降低由于后肢去負荷引起的炎癥因子水平，表明它在抑制炎癥反應方面具有良好的效果。而炎癥和氧化應激通常相互作用，加劇肝臟損傷，因此白藜蘆醇通過減輕炎癥水平，也間接減輕了氧化應激的負面影響。
同時，肝臟在調節糖代謝和能量代謝方面也起著至關重要的作用，尤其體現在維持血糖水平的平衡上，通過合成和分解糖原，肝臟可動態調控血糖水平。它也是ATP酶的主要合成場所，直接影響著細胞內的能量代謝，此外，ATP酶的活力水平也通常被視為評估機體代謝狀態的關鍵指標[16]。本次研究發現，在后肢去負荷模擬的微重力環境下，大鼠肝臟出現異常的糖原累積現象，這與先前Abraham等[17]和Merrill等[18]在真實太空飛行條件下所觀察到的現象一致。本研究也同時發現Model組大鼠肝臟組織中Na+K+-ATP酶和Ca2+Mg2+-ATP酶活力顯著降低，而經白藜蘆醇處理后，糖原含量恢復至正常水平，同時ATP含量和酶活力顯著升高。
為了探究白藜蘆醇發揮調節作用的具體作用機制，研究特別針對PI3K/AKT信號通路的潛在影響開展實驗。結果提示，Model組大鼠肝臟組織中PI3K和AKT磷酸化水平顯著降低，而白藜蘆醇則顯著升高了PI3K和AKT的磷酸化水平，提示白藜蘆醇可能通過激活PI3K/AKT信號途徑來發揮其保護作用，但具體是否通過激活PI3K/AKT信號通路來減輕大鼠肝臟組織的凋亡、氧化應激、炎癥反應以及調節能量代謝，仍需進一步深入研究以確認。
綜上所述，長時間的后肢去負荷可導致大鼠肝臟組織氧化應激、炎癥因子和凋亡水平升高，能量代謝紊亂等，而白藜蘆醇的介入對上述現象具有一定程度的緩解作用。這些發現為白藜蘆醇在太空醫學領域的應用提供了新的機制解釋，并為未來的研究提供了新的方向和希望。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：軒瑩瑩進行了本次實驗的實驗設計、數據處理和論文撰寫，楊玉田和唐漢琴參與了實驗設計和論文撰寫，馬智慧和李亮協助數據采集、處理和分析并參與了文章修訂，申棟帥和張梅提供了實驗設備、技術和資金支持，陳克明對本實驗進行了全程指導并對文章進行了審校。
倫理聲明：本研究通過了中國人民解放軍聯勤保障部隊第940醫院科研管理倫理委員會的審批（批文編號：2023KYLL337）。
0 引言
隨著人類對太空探索的深入，微重力環境對生物體健康的影響成為熱點話題。長時間的太空飛行可能導致宇航員出現骨密度降低、肌肉萎縮、心血管系統變化及器官功能改變等問題[1]。肝臟在新陳代謝、解毒、免疫調節等方面發揮著關鍵作用[1-2]，然而已有研究發現，在微重力條件下，肝臟細胞的結構和功能會出現異常，導致代謝紊亂和相關疾病的發生[3-5]。
白藜蘆醇（resveratrol，Res）是一種存在于葡萄、紅酒和某些漿果中的多酚化合物，已被證明具有抗氧化、抗炎和抗衰老等多種生物活性。近年的研究發現，白藜蘆醇對酒精依賴[6-7]、運動性疲勞[8-9]和野百合堿[10]等多種原因所致的肝損傷均有明顯的保護作用。
為解決航天員在太空飛行時所面臨的肝臟損傷難題，本次實驗使用大鼠后肢去負荷所模擬的失重模型探究白藜蘆醇對失重所致肝臟損傷是否具有保護作用。
1 動物、材料與方法
1.1 動物
SPF級SD雄性大鼠30只，鼠齡8周，體質量（180 ± 20）g，購自空軍軍醫大學實驗動物中心，許可證編號SCXK(陜)2019-001，本實驗經中國人民解放軍聯勤保障部隊第940醫院科研管理倫理委員會批準（倫理審批號：2023KYLL337）。
1.2 材料
白藜蘆醇（阿拉丁，中國）；比色法測試盒（南京建成，中國）；酶聯免疫吸附實驗試劑盒（泉州睿信，中國）；B細胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）單克隆抗體（北京博奧森，中國）；Bcl2關聯X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）單克隆抗體、蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）多克隆抗體、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）單克隆抗體（Abcam，英國）；磷酸化蛋白激酶B（phospho-protein kinase B，p-AKT）多克隆抗體、磷酸化磷脂肌醇3激酶（phosphorylation phosphotylinosital 3 kinase，p-PI3K）多克隆抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（recombinant glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）多克隆抗體、HRP標記山羊抗兔二抗（Affinity，美國）；Epoch酶標儀（伯騰，美國）；電泳儀、電泳槽（Bio-Rad，美國）
1.3 方法
1.3.1 動物分組與給藥方法
所有動物在實驗開始前在實驗室環境適應性飼養1周，然后隨機分為正常組（Control）、后肢去負荷模型組（Model）和后肢去負荷+白藜蘆醇給藥組（Model+Res）,每組10只。Model+Res組腹腔注射Res 30 mg·kg?1，Control組和Model組均腹腔注射等體積0.9% NaCl。隔天給藥，持續給藥28天，給藥共14次。每周稱取大鼠體質量并記錄。
1.3.2 后肢去負荷模型構建
本實驗中，按照Wronski和Morey-Holton的方法建立后肢去負荷模型[11]。Control組大鼠正常飼養，而Model組和Model+Res組大鼠通過尾部懸吊，保持身體30 °傾斜，后肢離地，前肢自由，確保正常進食和飲水。每天尾吊24 h，共28天。
1.3.3 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色法觀察大鼠肝臟組織病理學形態變化
大鼠肝臟組織經磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗凈后于4%的多聚甲醛固定液中保存，隨后進行脫水、透明、石蠟包埋、切片，最后做HE染色處理，于光學顯微鏡下觀察各組大鼠肝臟組織的病理學變化。
1.3.4 比色法檢測肝臟組織氧化應激和能量代謝水平
取部分肝臟組織，按照各試劑盒說明書進行超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX)、過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、一氧化氮(NO)、糖原、腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）、Na+K+-ATP酶（Na+K+-ATPase）、Ca2+Mg2+-ATP酶（Ca2+Mg2+-ATPase）含量/酶活力檢測。
1.3.5 ELISA法檢測肝臟組織炎癥因子水平
取部分肝臟組織，按照1∶9的比例加入預冷的裂解液機械勻漿，離心30 min后取上清，采用酶聯免疫吸附法（ELISA）進行白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）和白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）水平檢測，具體操作按照試劑盒說明書進行。
1.3.6 蛋白質印跡法檢測肝臟組織內Bax、Bcl-2、p-AKT、AKT、p-PI3K、PI3K和GAPDH蛋白的表達水平
取部分肝臟組織，按照1∶9的比例加入預冷的裂解液機械勻漿，隨后依次進行離心、測蛋白濃度、蛋白定量、高溫變性。隨后置于?80 ℃冰箱中待用。待測樣品利用10% SDS-PAGE分離膠進行電泳分離，濕法轉膜，5%脫脂奶粉封閉，再分別置于放有一抗Bax、Bcl-2、p-AKT、AKT、p-PI3K、PI3K和GAPDH的自封袋中4 ℃孵育過夜，二抗孵育，曝光檢測各蛋白表達量。
1.3.7 統計學分析
實驗數據通過SPSS 26.0進行均值±標準差（x ± s）的統計學分析。多組別比較采用單因素方差分析（ANOVA），隨后用LSD法進行組間比較，檢驗水準為0.05。
2 結果
2.1 白藜蘆醇對后肢去負荷大鼠肝臟組織病理變化的影響
普通光學顯微鏡下觀察可見（見圖1），Control組大鼠肝細胞形態結構正常，細胞核呈橢圓形，細胞間隙清晰，排列規則且緊密，肝細胞索排列整齊；Model組大鼠肝臟組織則出現了明顯的病理變化，表現為肝細胞腫脹且形態異常，細胞核固縮，細胞膜完整性被破壞，肝細胞質內出現圓形空泡，細胞間隙模糊，排列無規則，肝細胞索紊亂，狄氏隙顯現；Model+Res組大鼠肝臟組織的損傷有明顯緩解，表現為肝細胞形態恢復正常，細胞腫脹程度明顯降低，細胞間隙清晰，排列有序，肝細胞索排列較整齊。結果表明白藜蘆醇能有效減輕后肢去負荷大鼠肝細胞受損程度。
圖1
白藜蘆醇對后肢去負荷大鼠肝臟組織病理變化的影響
Figure1.
Effect of resveratrol on pathological changes in liver tissue of hindlimb unloading rats
2.2 白藜蘆醇對后肢去負荷大鼠肝臟組織抗氧化酶活性的影響
如圖2所示，與Control組相比，Model組大鼠肝臟組織抗氧化酶CAT、SOD、GSH-PX的酶活力顯著下降（P < 0.01，P < 0.05，P < 0.01）；經白藜蘆醇處理后，與Model組相比，CAT、SOD、GSH-PX的酶活力顯著上升（P < 0.05，P < 0.01，P < 0.01），其中GSH-PX活性與Control組相比無顯著差異（P > 0.05）。以上結果表明，白藜蘆醇能明顯緩解因后肢去負荷所致大鼠肝臟組織的氧化損傷，并有可能在一定程度上基本恢復肝臟異常狀態。
圖2
白藜蘆醇對后肢去負荷大鼠肝臟組織抗氧化酶活性的影響
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2.3 白藜蘆醇對后肢去負荷大鼠肝臟組織氧化損傷指標的影響
如圖3所示，與Control組相比，Model組大鼠肝臟氧化損傷指標H2O2、LDH、MDA和NO的酶活力/含量均顯著升高（P < 0.05，P < 0.01，P < 0.05，P < 0.01）；經白藜蘆醇給藥處理后，與Model組相比，Model+Res組大鼠肝臟組織上述指標均顯著下降（P < 0.01，P < 0.01，P < 0.01，P < 0.01），與Control組相比無顯著差異（P > 0.05，P > 0.05，P > 0.05，P > 0.05）。這說明白藜蘆醇能夠顯著降低后肢去負荷大鼠肝臟組織的氧化損傷，并可恢復至正常水平，顯示出白藜蘆醇強大的抗氧化應激的作用。
圖3
白藜蘆醇對后肢去負荷大鼠肝臟組織氧化損傷指標的影響
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2.4 白藜蘆醇對后肢去負荷大鼠肝臟組織炎癥因子水平的影響
Elisa結果顯示（見圖4），與Control組相比，Model組大鼠肝臟組織IL-6和IL-1β相對含量顯著升高（P < 0.01，P < 0.05）；Model+Res組大鼠肝臟組織IL-6和IL-1β相對含量明顯低于Model組（P < 0.01，P < 0.01），且與Control組之間無顯著差異（P > 0.05，P > 0.05）。這說明白藜蘆醇對由后肢去負荷引起的大鼠肝臟炎癥因子水平的升高有一定的緩解作用。
圖4
白藜蘆醇對后肢去負荷大鼠肝臟組織炎癥因子水平的影響
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2.5 白藜蘆醇對后肢去負荷大鼠肝臟組織能量代謝指標的影響
如圖5所示，與Control組相比，Model組大鼠肝臟組織糖原含量明顯升高（P < 0.05），ATP含量、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活力顯著降低（P < 0.01，P < 0.01，P < 0.01），發生了肝糖原蓄積、能量代謝紊亂現象；而經白藜蘆醇給藥后，肝糖原含量明顯下降（P < 0.05），能夠恢復至正常水平，且ATP含量、Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活力均有一定程度的上升（P < 0.01，P < 0.05，P < 0.01）。這說明白藜蘆醇能夠一定程度上改善因后肢去負荷引起的肝臟能量代謝紊亂的現象。
圖5
白藜蘆醇對后肢去負荷大鼠肝臟組織能量代謝指標的影響
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2.6 白藜蘆醇對后肢去負荷大鼠肝臟組織凋亡蛋白表達的影響
如圖6所示，與Control組相比，Model組大鼠肝臟組織Bax促凋亡蛋白相對表達水平顯著升高（P < 0.05），Bcl-2抗凋亡蛋白相對表達水平顯著下降（P < 0.01）；與Model組相比，Model+Res組大鼠肝臟組織Bax蛋白相對表達水平顯著下降（P < 0.05）并恢復至正常水平，Bcl-2蛋白相對表達水平顯著上升（P < 0.05）。結果說明，白藜蘆醇能夠抑制后肢去負荷引起的大鼠肝臟組織的凋亡。
圖6
白藜蘆醇對后肢去負荷大鼠肝臟組織凋亡蛋白表達的影響
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2.7 白藜蘆醇對后肢去負荷大鼠肝臟組織PI3K/AKT信號通路活性的影響
如圖7所示，Model組大鼠肝臟組織的PI3K和AKT蛋白磷酸化相對水平與Control組相比顯著下降（P < 0.01，P < 0.01）；與Model組相比，Model+Res組大鼠肝臟組織的PI3K和AKT蛋白磷酸化相對水平顯著上升（P < 0.05，P < 0.05）。以上結果提示，白藜蘆醇可能通過激活PI3K/AKT信號通路調節后肢去負荷大鼠肝臟組織的氧化應激和凋亡水平。
圖7
白藜蘆醇對后肢去負荷大鼠肝臟組織PI3K/AKT信號通路活性的影響
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3 討論與結論
隨著太空探索活動的增多，微重力環境對生物體特別是肝臟的影響成為研究熱點。研究顯示，微重力條件下肝臟面臨組織形態變化、氧化應激、炎癥反應和能量代謝失調等多重壓力，而白藜蘆醇通過綜合調節這些因素，可為肝臟健康提供保護作用。
肝臟組織正常形態對于維持其功能至關重要，而在微重力環境下，肝臟組織常出現明顯的形態學變化，如細胞腫脹、結構異常和細胞膜損傷，這些變化通常與肝臟的功能障礙和代謝失調相關[12]。本研究表明，白藜蘆醇能夠有效改善后肢去負荷大鼠的肝臟組織形態，減輕細胞損傷和形態異常，體現出對肝臟的保護作用。
肝臟作為機體主要的解毒器官，負責代謝各種化合物，但當自由基的生成量超過內源性抗氧化系統的能力時，肝臟的穩態就會遭受損害[13]。氧化應激作為微重力環境中導致肝損傷的主要機制之一，能夠增加自由基的產生，導致細胞膜脂質過度氧化，進而損傷細胞結構和功能[14]。研究結果顯示，白藜蘆醇能顯著增強肝臟中的抗氧化酶活性（如CAT、SOD、GSH-PX），并降低氧化損傷標志物（如MDA、H2O2和NO）的水平。
此外，研究發現，氧化應激和炎癥在肝臟損傷中存在著密切的相互關系，它們通常相互影響并相互促進，導致肝臟疾病的發生和發展。炎癥因子的過度釋放是微重力環境下肝損傷的另一關鍵因素[15]，而本研究發現，白藜蘆醇能夠顯著降低由于后肢去負荷引起的炎癥因子水平，表明它在抑制炎癥反應方面具有良好的效果。而炎癥和氧化應激通常相互作用，加劇肝臟損傷，因此白藜蘆醇通過減輕炎癥水平，也間接減輕了氧化應激的負面影響。
同時，肝臟在調節糖代謝和能量代謝方面也起著至關重要的作用，尤其體現在維持血糖水平的平衡上，通過合成和分解糖原，肝臟可動態調控血糖水平。它也是ATP酶的主要合成場所，直接影響著細胞內的能量代謝，此外，ATP酶的活力水平也通常被視為評估機體代謝狀態的關鍵指標[16]。本次研究發現，在后肢去負荷模擬的微重力環境下，大鼠肝臟出現異常的糖原累積現象，這與先前Abraham等[17]和Merrill等[18]在真實太空飛行條件下所觀察到的現象一致。本研究也同時發現Model組大鼠肝臟組織中Na+K+-ATP酶和Ca2+Mg2+-ATP酶活力顯著降低，而經白藜蘆醇處理后，糖原含量恢復至正常水平，同時ATP含量和酶活力顯著升高。
為了探究白藜蘆醇發揮調節作用的具體作用機制，研究特別針對PI3K/AKT信號通路的潛在影響開展實驗。結果提示，Model組大鼠肝臟組織中PI3K和AKT磷酸化水平顯著降低，而白藜蘆醇則顯著升高了PI3K和AKT的磷酸化水平，提示白藜蘆醇可能通過激活PI3K/AKT信號途徑來發揮其保護作用，但具體是否通過激活PI3K/AKT信號通路來減輕大鼠肝臟組織的凋亡、氧化應激、炎癥反應以及調節能量代謝，仍需進一步深入研究以確認。
綜上所述，長時間的后肢去負荷可導致大鼠肝臟組織氧化應激、炎癥因子和凋亡水平升高，能量代謝紊亂等，而白藜蘆醇的介入對上述現象具有一定程度的緩解作用。這些發現為白藜蘆醇在太空醫學領域的應用提供了新的機制解釋，并為未來的研究提供了新的方向和希望。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：軒瑩瑩進行了本次實驗的實驗設計、數據處理和論文撰寫，楊玉田和唐漢琴參與了實驗設計和論文撰寫，馬智慧和李亮協助數據采集、處理和分析并參與了文章修訂，申棟帥和張梅提供了實驗設備、技術和資金支持，陳克明對本實驗進行了全程指導并對文章進行了審校。
倫理聲明：本研究通過了中國人民解放軍聯勤保障部隊第940醫院科研管理倫理委員會的審批（批文編號：2023KYLL337）。
