引用本文: 樊家梅, 李金徽, 解友邦, 李文倩. 原發性干燥綜合征中 ERdj5 和 XBP1 的表達及意義. 華西醫學, 2024, 39(4): 594-598. doi: 10.7507/1002-0179.202402074 復制
版權信息: ?四川大學華西醫院華西期刊社《華西醫學》版權所有,未經授權不得轉載、改編
原發性干燥綜合征(primary Sj?gren syndrome, pSS)是一種淋巴細胞浸潤外分泌腺體的系統性自身免疫性疾病,主要導致口眼干燥,嚴重者引起黏膜相關淋巴組織淋巴瘤[1]。pSS 的特征是由唾液腺上皮細胞的內在激活引發的慢性炎癥,唾液腺上皮細胞通過異常表達促炎分子和新抗原來激發或觸發免疫細胞[2],從而啟動自身免疫反應。在 pSS 疾病進展過程中,持久或強烈的內質網應激可引起唾液腺上皮細胞發生凋亡細胞自噬和自身抗原的差異分布[3],最終導致自身抗原暴露和唾液腺功能障礙。ERdj5 是促進內質網相關降解中錯誤折疊的膜蛋白底物被定位到泛素連接酶復合物上的二硫鍵還原酶,可形成、異構化和還原二硫鍵,內質網應激可以誘導其在細胞中的轉錄過程[4]。X 盒結合蛋白 1(X-box binding protein-1, XBP1)屬于堿性亮氨酸拉鏈結構蛋白的一種,作為關鍵的細胞保護性分子調節細胞的多種生理功能[5]。XBP1s 是 XBP1 的活性形式,通過進入細胞核內與未折疊蛋白反應元件結合激活目的基因 ERdj5 表達[6],有利于唾液蛋白的正確折疊。由于 ERdj5 和 XBP1 的表達與 pSS 患者唾液腺損傷程度和口腔癥狀的具體相關性未明確證實,故本研究通過檢測 pSS 患者 ERdj5 和 XBP1 的表達水平,分析其與 pSS 相關指標的相關性,為進一步探究 PSS 的發病機制、未來尋找新的靶向治療藥物及疾病防治提供基礎數據和新思路。
1 對象與方法
1.1 研究對象
選取 2020 年 1 月—2021 年 6 月西安市紅會醫院風濕免疫科住院部初治 pSS 患者 20 例和青海省人民醫院風濕免疫科住院初治 pSS 患者 40 例,合計 60 例作為病例組。入組患者符合 2020 年由中國醫師協會風濕免疫科醫師分會制定的 pSS 分類診斷標準[7],嚴格排除頭頸部放療史、活動性丙型肝炎病毒感染、艾滋病、結節病、淀粉樣變性、移植物抗宿主病、免疫球蛋白 G4 相關性疾病。選取青海省人民醫院醫學美容門診行唇部美容手術的健康者 20 例納入對照組(無口干、眼干,排除心、肝、肺、腎等臟器功能異常情況以及全身免疫性疾病)。本研究在開展前獲得青海省人民醫院倫理審查(批件號:2022-95),研究對象簽署知情同意書。
1.2 試劑與儀器
1.2.1 主要試劑
Trizol 細胞裂解液(美國賽默飛世爾科技公司);聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)引物(上海生物工程股份有限公司);重組抗 ERdj5 抗體、重組抗 XBP1 抗體(美國 Abnova 公司);重組抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗體、兔單克隆抗體(上海 Abcam 公司)。
1.2.2 主要儀器
7500 FAST 梯度基因擴增儀 PCR 儀、2000 超微量分光光度計(美國賽默飛世爾科技公司);Mini-PROTEAN-Teetra System 雙板垂直電泳儀、Mini-PROTEAN-Tetra System 蛋白濕電轉膜儀、XRS+全自動凝膠成像分析系統[美國伯樂生命醫學產品(上海)有限公司];Synergy H4 全自動酶標儀、ELx50 全自動洗板機(美國伯騰儀器有限公司)。
1.3 研究方法
1.3.1 標本采集
在局部麻醉下取下唇中線稍偏外的唾液腺(小涎腺)組織 2 塊(單個組織大小不低于 100 mg),置于無 RNA 酶的凍存管中,–80℃保存。收集唾液 1~3 mL,4℃、8000 r/min(離心半徑 13.5 cm)離心 1 min,吸取上清液置于無菌離心管內,–80℃保存。采集外周血液樣品于黃頭管(4~5 mL),4℃、1200 r/min(離心半徑 13.5 cm)離心 8 min,吸取上層血清置于無菌離心管內,–80℃保存。
1.3.2 RNA 提取、逆轉錄 PCR 檢測唾液腺組織 ERdj5 和 XBP1 mRNA 表達
通過 Trizol 液提取組織中的總 RNA,分光光度計測定其濃度和純度,保持吸光度 260/280 在 1.8~2.0。引物序列見表1。根據以下反應體系進行逆轉錄和 PCR 擴增,通過 2?ΔΔCT 法計算 ERdj5 和 XBP1 的相對表達量:40 μL 逆轉錄體系包含 RNA 10 μL、4×dNTP 2.5 μL、Oligo (dT) 2 μL、去 RNA 酶水 14.5 μL、5×Buffer 8 μL,65℃條件下水浴 5 min,迅速轉冰浴 1~2 min;加入 RNA 逆轉錄酶(200 U/μL)2 μL、RNA 酶抑制酶 1 μL,37℃水浴 2 h 后,70℃水浴 10 min,得到互補 DNA。20 μL PCR 擴增體系包含互補 DNA 2 μL、雙蒸水 7 μL、上游引物 0.5 μL、下游引物 0.5 μL、Master Mix 10 μL,設置反應條件為起始變性 50℃、2 min,酶激活 95℃、10 min,變性 95℃、15 s,退火/延伸 60℃、1 min,變性、退火/延伸循環 45 次。

1.3.3 蛋白免疫印跡檢測唾液腺組織 ERdj5 和 XBP1 蛋白表達
通過可溶性蛋白裂解液和苯甲基磺酰氟溶液提取組織中的總蛋白,BCA 法對組織蛋白進行初步定量;按 15 μL/孔將蛋白樣品,預染 Marker 上樣,80 V 穩壓電泳到溴酚藍跑至濃縮膠和分離膠交界處時,調整電壓為 120 V 至電泳結束;250 mA 轉膜 120 min;含 5% 脫脂奶粉的對苯二甲酸丁二醇酯溶液脫色搖床上封閉聚偏二氟乙烯膜 1 h;洗膜 3 次,10 min/次;一抗 4℃冰箱內孵育過夜;洗膜 3 次,10 min/次;二抗脫色搖床上室溫下慢速震蕩孵育 1 h;洗膜 3 次,10 min/次;滴加增強型化學發光液,全自動凝膠成像分析系統檢測唾液腺組織中 ERdj5、XBP1 蛋白的相對含量。
1.4 觀察指標
收集口干程度、唾液流率(mL/15 min)、唇腺組織病理分級、歐洲抗風濕病聯盟干燥綜合征疾病活動指數(European League Against Rheumatism Sjogren’s Syndrome Disease Activity Index, ESSDAI)評分等臨床資料和檢驗指標。分析 ERdj5、XBP1 mRNA 與自身抗體(抗 Ro/SSA 抗體和抗 La/SSB 抗體)、組織病理、唾液流率和口干程度、ESSDAI 評分的相關性。自身抗體通過抗體滴度判定,分為 1 級(1∶100)、2 級(1∶320)、3 級(1∶1000)、4 級(1∶3200)。組織病理通過 Chisholm 分級標準[8],按照超過 50 個淋巴細胞在 4 個腺小葉的區域內(4 mm2)表現為局灶性浸潤作為 1 個浸潤灶,分為 0~4 級:0 級,沒有淋巴細胞浸潤;1 級,輕度的淋巴細胞浸潤;2 級,中度的淋巴細胞浸潤,但不足 1 個灶;3 級,1 個浸潤灶;4 級:大于 1 個浸潤灶。口干程度通過口干視覺模擬評分,具體分為:正常(0 分);輕度(2.5 分),飲水增多;中度(5 分),頻繁飲水、舌面干燥、齲齒;重度(7.5 分),嚴重齲齒、吞咽費勁、腮腺腫大;極重度(10 分),猖獗齲齒、鏡面舌、吞咽困難。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 22.0 軟件進行數據處理。計量資料經 Shapiro-Wilk 檢驗,若滿足正態分布,采用均數±標準差表示,組間均數比較采用 t 檢驗;若不滿足正態分布,則采用中位數(下四分位數,上四分位數)表示,組間采用 Mann-Whitney U 檢驗。計數資料采用例數和/或百分數表示,組間比較采用 χ2 檢驗。相關性分析中,雙變量不符合正態分布,采用 Spearman 相關分析。雙側檢驗標準 α=0.05。
2 結果
2.1 兩組患者一般基本資料對比
病例組與對照組在年齡、性別上比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.2 兩組患者唾液腺組織中 ERdj5、XBP1 mRNA 和蛋白表達比較及相關性
病例組 ERdj5、XBP1 的 mRNA 和蛋白表達高于對照組,差異有統計學意義(P<0.001),見表3。病例組唾液腺組織中 ERdj5 與 XBP1 mRNA 表達水平呈正相關(rs=0.936,P<0.001)。

2.3 病例組唾液腺組織中 ERdj5 和 XBP1 mRNA 表達與臨床、病理及檢驗指標的相關性
病例組唾液腺組織中 ERdj5 和 XBP1 mRNA 表達分別與抗 Ro/SSA 抗體、抗 La/SSB 抗體、ESSDAI 評分、口干程度、唇腺組織病理分級呈正相關(P<0.001),與唾液流率呈負相關(P<0.001)。見表4。

3 討論
pSS 的組織病理主要表現為大量淋巴細胞浸潤外分泌腺,患者唾液腺中淋巴細胞浸潤導管周圍組織是該疾病的特征之一[9-10],可引起導管上皮細胞增殖、變性、萎縮、凋亡。小血管壁或血管周圍炎癥細胞浸潤致使局部組織供血不足[11-12],在受影響的腺體內,浸潤的淋巴細胞通過促進自身反應性淋巴細胞的激活和維持,破壞組織的正常結構并影響器官功能。幾乎所有 pSS 患者都會出現唾液腺受累,患者常因唾液黏蛋白減少、唾液分泌減少而出現唾液腺病變,臨床上表現為口干、齲齒、腮腺炎、舌痛以及舌乳頭萎縮等癥狀和體征[13]。唾液腺上皮細胞在啟動自身免疫反應過程中,通過異常表達促炎細胞因子維持炎癥反應并建立慢性內質網應激狀態。此外,唾液腺上皮細胞表達凋亡因子引起 T 淋巴細胞活化,誘導干燥綜合征相關特異性抗體形成。既往研究表明缺乏轉錄調節因子 IκB-ζ 的小鼠產生以淋巴細胞浸潤的淚腺炎和干燥綜合征相關自身抗體為特征的干燥綜合征樣炎癥,并且在無淋巴細胞的情況下,IκB-ζ 缺陷小鼠淚腺中上皮細胞凋亡增加[14]。唾液腺的組織病理學可以在腺體功能明顯受損之前識別 pSS 的早期階段[15],對于疾病的診斷和改善患者臨床預后至關重要。故唾液腺中蛋白表達異常在 pSS 發病中發揮很重要的作用,本研究發現 ERdj5 和 XBP1 表達有異常并且和一些臨床指標有一定的相關性。
ERdj5 是處理內質網中錯誤折疊蛋白的關鍵分子,有非常強的二硫鍵還原酶和異構酶活性,有利于唾液蛋白的正確折疊,與自身免疫炎癥反應存在關聯。ERdj5 敲除小鼠的唾液腺中的內質網應激反應激活得更多,在 ERdj5 敲除細胞中外源性 ERdj5 的表達減輕了由 α-淀粉酶過量產生引起的內質網應激[16],表明 ERdj5 敲除干燥綜合征小鼠模型唾液腺中下調的差異蛋白和神經生長因子介導的蛋白降解途徑有關。Apostolou 等[17]通過免疫組織化學發現 ERdj5 與 XBP1 在唾液腺病理組織中的表達增加,ERdj5 的染色強度與抗 Ro/SSA 抗體滴度以及自身的炎癥病變嚴重程度相關。消融 ERdj5 的小鼠表現出干燥綜合征的基本特征,如具有浸潤性 T 和 B 淋巴細胞的唾液腺的自發炎癥、不同的細胞因子特征、過度的細胞死亡、唾液流量減少以及抗 SSA/Ro 和抗 SSB/La 自身抗體的產生[18]。本研究發現 pSS 患者唾液腺組織中 ERdj5、XBP1 的 mRNA 和蛋白的表達增高,ERdj5 mRNA 表達和 XBP1 mRNA 表達正相關,和上述動物模型的結果一致。
內質網應激和未折疊蛋白反應與促炎細胞因子的誘導有關,內質網應激誘導肌醇激酶 1α(inositol-requiring enzyme 1α, IRE1α)通過激活糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)和 XBP1 來差異調節促炎細胞因子基因表達。IL-1β 基因表達受到 IRE1α 介導的 GSK-3β 激活的調節,但不受 XBP1 的調節,IRE1α 介導的 XBP1 剪接調節 TNF-α 基因的表達,GSK-3 抑制劑 SB216763 選擇性抑制 IL-1β 基因表達,增加了 IRE1α 依賴的 XBP1 剪接,IRE1 和核糖核酸酶抑制劑 STF083010 僅抑制 TNF-α 的產生[19]。研究表明唾液腺上皮細胞(salivary gland epithelial cells, SGEC)通過細胞凋亡和自身抗原釋放的增加和/或通過含有自身抗原的外泌體的分泌來介導 Ro/SSA 和 La/SSB 自身抗原暴露于免疫系統,某些先天免疫受體(如 Toll 樣受體 3)的信號傳導似乎與 SGEC 對 Ro/SSA 和 La/SSB 表達的調節有關[20]。IRE1α/XBP1 通路是主要的內質網應激反應介質之一,在異基因造血干細胞移植小鼠模型中誘導慢性移植物抗宿主病(chronic graft-versus-host disease, cGVHD)的 B 細胞致病性中起著關鍵作用,IRE1α 激酶結構域條件敲除小鼠中,通過 IRE1α 依賴性衰變(IRE1α-dependent decay, RIDD)的限制,XBP1 缺陷小鼠的 B 細胞在 cGVHD 中的致病性降低被逆轉,RIDD 是通過靶向 XBP1s 減少 cGVHD 發病機制的重要介質[21],提示 XBP1 在調節自身免疫應答中發揮很重要的作用。我們推測 SGEC 可能通過 ERdj5 和 XBP1 導致自身抗原的暴露介導特異性的抗體產生,產生促炎因子參與干燥綜合征的發病。本研究發現 pSS 患者唾液腺組織中 ERdj5 和 XBP1 mRNA 表達分別與 ESSDAI 評分、抗 Ro/SSA 抗體、抗 La/SSB 抗體、口干程度、唇腺組織病理分級呈正相關,與唾液流率呈負相關,進一步證實了上述推測。上述結果對于該疾病的診斷、治療以及預后評估具有指導意義,為進一步探究 ERdj5 和 XBP1 在 pSS 中的病理生理作用、尋找該疾病的潛在治療靶點提供了基礎數據和新思路。
然而,由于 pSS 在臨床上并不特別常見,且唇腺活檢為有創檢查,唾液腺組織標本留取存在一定困難,因此本研究收集使用的標本數相對較少,導致最終經過統計分析后獲得的結果可能有所偏差,故我們將在今后的研究中通過增加樣本量予以完善。
綜上所述,ERdj5 和 XBP1 在 pSS 患者的唾液腺組織中高表達,可能作為重要的細胞保護性分子參與 pSS 疾病的發生發展過程,其表達量與唾液腺損傷程度和患者口腔癥狀相關,提示 ERdj5 和 XBP1 在未來有望成為 pSS 藥物治療的新靶點,為該疾病的防治提供了基礎數據和新思路。
志謝:感謝西安市紅會醫院風濕免疫科住院部老師為本研究提供病例組資料與數據的收集整理。
利益沖突:所有作者聲明不存在利益沖突。
原發性干燥綜合征(primary Sj?gren syndrome, pSS)是一種淋巴細胞浸潤外分泌腺體的系統性自身免疫性疾病,主要導致口眼干燥,嚴重者引起黏膜相關淋巴組織淋巴瘤[1]。pSS 的特征是由唾液腺上皮細胞的內在激活引發的慢性炎癥,唾液腺上皮細胞通過異常表達促炎分子和新抗原來激發或觸發免疫細胞[2],從而啟動自身免疫反應。在 pSS 疾病進展過程中,持久或強烈的內質網應激可引起唾液腺上皮細胞發生凋亡細胞自噬和自身抗原的差異分布[3],最終導致自身抗原暴露和唾液腺功能障礙。ERdj5 是促進內質網相關降解中錯誤折疊的膜蛋白底物被定位到泛素連接酶復合物上的二硫鍵還原酶,可形成、異構化和還原二硫鍵,內質網應激可以誘導其在細胞中的轉錄過程[4]。X 盒結合蛋白 1(X-box binding protein-1, XBP1)屬于堿性亮氨酸拉鏈結構蛋白的一種,作為關鍵的細胞保護性分子調節細胞的多種生理功能[5]。XBP1s 是 XBP1 的活性形式,通過進入細胞核內與未折疊蛋白反應元件結合激活目的基因 ERdj5 表達[6],有利于唾液蛋白的正確折疊。由于 ERdj5 和 XBP1 的表達與 pSS 患者唾液腺損傷程度和口腔癥狀的具體相關性未明確證實,故本研究通過檢測 pSS 患者 ERdj5 和 XBP1 的表達水平,分析其與 pSS 相關指標的相關性,為進一步探究 PSS 的發病機制、未來尋找新的靶向治療藥物及疾病防治提供基礎數據和新思路。
1 對象與方法
1.1 研究對象
選取 2020 年 1 月—2021 年 6 月西安市紅會醫院風濕免疫科住院部初治 pSS 患者 20 例和青海省人民醫院風濕免疫科住院初治 pSS 患者 40 例,合計 60 例作為病例組。入組患者符合 2020 年由中國醫師協會風濕免疫科醫師分會制定的 pSS 分類診斷標準[7],嚴格排除頭頸部放療史、活動性丙型肝炎病毒感染、艾滋病、結節病、淀粉樣變性、移植物抗宿主病、免疫球蛋白 G4 相關性疾病。選取青海省人民醫院醫學美容門診行唇部美容手術的健康者 20 例納入對照組(無口干、眼干,排除心、肝、肺、腎等臟器功能異常情況以及全身免疫性疾病)。本研究在開展前獲得青海省人民醫院倫理審查(批件號:2022-95),研究對象簽署知情同意書。
1.2 試劑與儀器
1.2.1 主要試劑
Trizol 細胞裂解液(美國賽默飛世爾科技公司);聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)引物(上海生物工程股份有限公司);重組抗 ERdj5 抗體、重組抗 XBP1 抗體(美國 Abnova 公司);重組抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗體、兔單克隆抗體(上海 Abcam 公司)。
1.2.2 主要儀器
7500 FAST 梯度基因擴增儀 PCR 儀、2000 超微量分光光度計(美國賽默飛世爾科技公司);Mini-PROTEAN-Teetra System 雙板垂直電泳儀、Mini-PROTEAN-Tetra System 蛋白濕電轉膜儀、XRS+全自動凝膠成像分析系統[美國伯樂生命醫學產品(上海)有限公司];Synergy H4 全自動酶標儀、ELx50 全自動洗板機(美國伯騰儀器有限公司)。
1.3 研究方法
1.3.1 標本采集
在局部麻醉下取下唇中線稍偏外的唾液腺(小涎腺)組織 2 塊(單個組織大小不低于 100 mg),置于無 RNA 酶的凍存管中,–80℃保存。收集唾液 1~3 mL,4℃、8000 r/min(離心半徑 13.5 cm)離心 1 min,吸取上清液置于無菌離心管內,–80℃保存。采集外周血液樣品于黃頭管(4~5 mL),4℃、1200 r/min(離心半徑 13.5 cm)離心 8 min,吸取上層血清置于無菌離心管內,–80℃保存。
1.3.2 RNA 提取、逆轉錄 PCR 檢測唾液腺組織 ERdj5 和 XBP1 mRNA 表達
通過 Trizol 液提取組織中的總 RNA,分光光度計測定其濃度和純度,保持吸光度 260/280 在 1.8~2.0。引物序列見表1。根據以下反應體系進行逆轉錄和 PCR 擴增,通過 2?ΔΔCT 法計算 ERdj5 和 XBP1 的相對表達量:40 μL 逆轉錄體系包含 RNA 10 μL、4×dNTP 2.5 μL、Oligo (dT) 2 μL、去 RNA 酶水 14.5 μL、5×Buffer 8 μL,65℃條件下水浴 5 min,迅速轉冰浴 1~2 min;加入 RNA 逆轉錄酶(200 U/μL)2 μL、RNA 酶抑制酶 1 μL,37℃水浴 2 h 后,70℃水浴 10 min,得到互補 DNA。20 μL PCR 擴增體系包含互補 DNA 2 μL、雙蒸水 7 μL、上游引物 0.5 μL、下游引物 0.5 μL、Master Mix 10 μL,設置反應條件為起始變性 50℃、2 min,酶激活 95℃、10 min,變性 95℃、15 s,退火/延伸 60℃、1 min,變性、退火/延伸循環 45 次。

1.3.3 蛋白免疫印跡檢測唾液腺組織 ERdj5 和 XBP1 蛋白表達
通過可溶性蛋白裂解液和苯甲基磺酰氟溶液提取組織中的總蛋白,BCA 法對組織蛋白進行初步定量;按 15 μL/孔將蛋白樣品,預染 Marker 上樣,80 V 穩壓電泳到溴酚藍跑至濃縮膠和分離膠交界處時,調整電壓為 120 V 至電泳結束;250 mA 轉膜 120 min;含 5% 脫脂奶粉的對苯二甲酸丁二醇酯溶液脫色搖床上封閉聚偏二氟乙烯膜 1 h;洗膜 3 次,10 min/次;一抗 4℃冰箱內孵育過夜;洗膜 3 次,10 min/次;二抗脫色搖床上室溫下慢速震蕩孵育 1 h;洗膜 3 次,10 min/次;滴加增強型化學發光液,全自動凝膠成像分析系統檢測唾液腺組織中 ERdj5、XBP1 蛋白的相對含量。
1.4 觀察指標
收集口干程度、唾液流率(mL/15 min)、唇腺組織病理分級、歐洲抗風濕病聯盟干燥綜合征疾病活動指數(European League Against Rheumatism Sjogren’s Syndrome Disease Activity Index, ESSDAI)評分等臨床資料和檢驗指標。分析 ERdj5、XBP1 mRNA 與自身抗體(抗 Ro/SSA 抗體和抗 La/SSB 抗體)、組織病理、唾液流率和口干程度、ESSDAI 評分的相關性。自身抗體通過抗體滴度判定,分為 1 級(1∶100)、2 級(1∶320)、3 級(1∶1000)、4 級(1∶3200)。組織病理通過 Chisholm 分級標準[8],按照超過 50 個淋巴細胞在 4 個腺小葉的區域內(4 mm2)表現為局灶性浸潤作為 1 個浸潤灶,分為 0~4 級:0 級,沒有淋巴細胞浸潤;1 級,輕度的淋巴細胞浸潤;2 級,中度的淋巴細胞浸潤,但不足 1 個灶;3 級,1 個浸潤灶;4 級:大于 1 個浸潤灶。口干程度通過口干視覺模擬評分,具體分為:正常(0 分);輕度(2.5 分),飲水增多;中度(5 分),頻繁飲水、舌面干燥、齲齒;重度(7.5 分),嚴重齲齒、吞咽費勁、腮腺腫大;極重度(10 分),猖獗齲齒、鏡面舌、吞咽困難。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 22.0 軟件進行數據處理。計量資料經 Shapiro-Wilk 檢驗,若滿足正態分布,采用均數±標準差表示,組間均數比較采用 t 檢驗;若不滿足正態分布,則采用中位數(下四分位數,上四分位數)表示,組間采用 Mann-Whitney U 檢驗。計數資料采用例數和/或百分數表示,組間比較采用 χ2 檢驗。相關性分析中,雙變量不符合正態分布,采用 Spearman 相關分析。雙側檢驗標準 α=0.05。
2 結果
2.1 兩組患者一般基本資料對比
病例組與對照組在年齡、性別上比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.2 兩組患者唾液腺組織中 ERdj5、XBP1 mRNA 和蛋白表達比較及相關性
病例組 ERdj5、XBP1 的 mRNA 和蛋白表達高于對照組,差異有統計學意義(P<0.001),見表3。病例組唾液腺組織中 ERdj5 與 XBP1 mRNA 表達水平呈正相關(rs=0.936,P<0.001)。

2.3 病例組唾液腺組織中 ERdj5 和 XBP1 mRNA 表達與臨床、病理及檢驗指標的相關性
病例組唾液腺組織中 ERdj5 和 XBP1 mRNA 表達分別與抗 Ro/SSA 抗體、抗 La/SSB 抗體、ESSDAI 評分、口干程度、唇腺組織病理分級呈正相關(P<0.001),與唾液流率呈負相關(P<0.001)。見表4。

3 討論
pSS 的組織病理主要表現為大量淋巴細胞浸潤外分泌腺,患者唾液腺中淋巴細胞浸潤導管周圍組織是該疾病的特征之一[9-10],可引起導管上皮細胞增殖、變性、萎縮、凋亡。小血管壁或血管周圍炎癥細胞浸潤致使局部組織供血不足[11-12],在受影響的腺體內,浸潤的淋巴細胞通過促進自身反應性淋巴細胞的激活和維持,破壞組織的正常結構并影響器官功能。幾乎所有 pSS 患者都會出現唾液腺受累,患者常因唾液黏蛋白減少、唾液分泌減少而出現唾液腺病變,臨床上表現為口干、齲齒、腮腺炎、舌痛以及舌乳頭萎縮等癥狀和體征[13]。唾液腺上皮細胞在啟動自身免疫反應過程中,通過異常表達促炎細胞因子維持炎癥反應并建立慢性內質網應激狀態。此外,唾液腺上皮細胞表達凋亡因子引起 T 淋巴細胞活化,誘導干燥綜合征相關特異性抗體形成。既往研究表明缺乏轉錄調節因子 IκB-ζ 的小鼠產生以淋巴細胞浸潤的淚腺炎和干燥綜合征相關自身抗體為特征的干燥綜合征樣炎癥,并且在無淋巴細胞的情況下,IκB-ζ 缺陷小鼠淚腺中上皮細胞凋亡增加[14]。唾液腺的組織病理學可以在腺體功能明顯受損之前識別 pSS 的早期階段[15],對于疾病的診斷和改善患者臨床預后至關重要。故唾液腺中蛋白表達異常在 pSS 發病中發揮很重要的作用,本研究發現 ERdj5 和 XBP1 表達有異常并且和一些臨床指標有一定的相關性。
ERdj5 是處理內質網中錯誤折疊蛋白的關鍵分子,有非常強的二硫鍵還原酶和異構酶活性,有利于唾液蛋白的正確折疊,與自身免疫炎癥反應存在關聯。ERdj5 敲除小鼠的唾液腺中的內質網應激反應激活得更多,在 ERdj5 敲除細胞中外源性 ERdj5 的表達減輕了由 α-淀粉酶過量產生引起的內質網應激[16],表明 ERdj5 敲除干燥綜合征小鼠模型唾液腺中下調的差異蛋白和神經生長因子介導的蛋白降解途徑有關。Apostolou 等[17]通過免疫組織化學發現 ERdj5 與 XBP1 在唾液腺病理組織中的表達增加,ERdj5 的染色強度與抗 Ro/SSA 抗體滴度以及自身的炎癥病變嚴重程度相關。消融 ERdj5 的小鼠表現出干燥綜合征的基本特征,如具有浸潤性 T 和 B 淋巴細胞的唾液腺的自發炎癥、不同的細胞因子特征、過度的細胞死亡、唾液流量減少以及抗 SSA/Ro 和抗 SSB/La 自身抗體的產生[18]。本研究發現 pSS 患者唾液腺組織中 ERdj5、XBP1 的 mRNA 和蛋白的表達增高,ERdj5 mRNA 表達和 XBP1 mRNA 表達正相關,和上述動物模型的結果一致。
內質網應激和未折疊蛋白反應與促炎細胞因子的誘導有關,內質網應激誘導肌醇激酶 1α(inositol-requiring enzyme 1α, IRE1α)通過激活糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)和 XBP1 來差異調節促炎細胞因子基因表達。IL-1β 基因表達受到 IRE1α 介導的 GSK-3β 激活的調節,但不受 XBP1 的調節,IRE1α 介導的 XBP1 剪接調節 TNF-α 基因的表達,GSK-3 抑制劑 SB216763 選擇性抑制 IL-1β 基因表達,增加了 IRE1α 依賴的 XBP1 剪接,IRE1 和核糖核酸酶抑制劑 STF083010 僅抑制 TNF-α 的產生[19]。研究表明唾液腺上皮細胞(salivary gland epithelial cells, SGEC)通過細胞凋亡和自身抗原釋放的增加和/或通過含有自身抗原的外泌體的分泌來介導 Ro/SSA 和 La/SSB 自身抗原暴露于免疫系統,某些先天免疫受體(如 Toll 樣受體 3)的信號傳導似乎與 SGEC 對 Ro/SSA 和 La/SSB 表達的調節有關[20]。IRE1α/XBP1 通路是主要的內質網應激反應介質之一,在異基因造血干細胞移植小鼠模型中誘導慢性移植物抗宿主病(chronic graft-versus-host disease, cGVHD)的 B 細胞致病性中起著關鍵作用,IRE1α 激酶結構域條件敲除小鼠中,通過 IRE1α 依賴性衰變(IRE1α-dependent decay, RIDD)的限制,XBP1 缺陷小鼠的 B 細胞在 cGVHD 中的致病性降低被逆轉,RIDD 是通過靶向 XBP1s 減少 cGVHD 發病機制的重要介質[21],提示 XBP1 在調節自身免疫應答中發揮很重要的作用。我們推測 SGEC 可能通過 ERdj5 和 XBP1 導致自身抗原的暴露介導特異性的抗體產生,產生促炎因子參與干燥綜合征的發病。本研究發現 pSS 患者唾液腺組織中 ERdj5 和 XBP1 mRNA 表達分別與 ESSDAI 評分、抗 Ro/SSA 抗體、抗 La/SSB 抗體、口干程度、唇腺組織病理分級呈正相關,與唾液流率呈負相關,進一步證實了上述推測。上述結果對于該疾病的診斷、治療以及預后評估具有指導意義,為進一步探究 ERdj5 和 XBP1 在 pSS 中的病理生理作用、尋找該疾病的潛在治療靶點提供了基礎數據和新思路。
然而,由于 pSS 在臨床上并不特別常見,且唇腺活檢為有創檢查,唾液腺組織標本留取存在一定困難,因此本研究收集使用的標本數相對較少,導致最終經過統計分析后獲得的結果可能有所偏差,故我們將在今后的研究中通過增加樣本量予以完善。
綜上所述,ERdj5 和 XBP1 在 pSS 患者的唾液腺組織中高表達,可能作為重要的細胞保護性分子參與 pSS 疾病的發生發展過程,其表達量與唾液腺損傷程度和患者口腔癥狀相關,提示 ERdj5 和 XBP1 在未來有望成為 pSS 藥物治療的新靶點,為該疾病的防治提供了基礎數據和新思路。
志謝:感謝西安市紅會醫院風濕免疫科住院部老師為本研究提供病例組資料與數據的收集整理。
利益沖突:所有作者聲明不存在利益沖突。