臨床中使用接觸血液的生物材料進行治療時，材料表面血栓的形成將影響生物材料的使用壽命及患者的生存預后。而抗凝、抗血小板等藥物的使用則增加了患者全身出血的風險。構建出具備抗凝血性能的生物材料，在材料局部實現抗凝，有助于解決上述問題。基于材料表面血栓形成的主要機制，抗凝血生物材料的研發策略可大致分為改變材料理化性質、構建固定/釋放活性物質的涂層、材料表面內皮化三大類。由于材料表面血栓形成的機制復雜且相互影響，單一機制構建的抗凝血生物材料往往性能并不理想。多機制協同干預有助于構建出抗凝血性能更優越的生物材料。
引用本文： 劉晨, 張凌, 付平, 劉壯. 生物材料抗凝血策略的研究進展. 華西醫學, 2024, 39(7): 1028-1035. doi: 10.7507/1002-0179.202406160 復制
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直接接觸血液的生物材料在血液凈化、體外膜肺氧合、心臟支架及起搏器植入等多種醫療場景中有著廣泛應用。盡管臨床中使用了抗凝藥物（如肝素、華法林等）和/或抗血小板聚集藥物（如阿司匹林、氯吡格雷等）進行干預，血栓仍會在生物材料表面形成[1-2]。以中心靜脈導管為例，在住院患者人群中，留置中心靜脈導管相關的血栓事件發生率可高達 15%[3]。血栓形成不僅縮短了生物材料的使用壽命，還降低了患者的生活質量，影響患者的生存預后。同時，系統性抗凝和抗血小板治療可引起血小板減少、凝血功能異常等不良反應，增加了患者的全身出血風險，嚴重時可危及患者生命[4-5]。具備抗凝血性能的生物材料可實現材料局部抗凝，這在減少了材料表面血栓形成的同時，還避免了對患者凝血系統造成不利影響。因此，抗凝血生物材料的研發具有重要意義。近幾十年來，科技工作者致力于改善生物材料的血液相容性，期望在降低臨床應用風險的同時，實現材料局部優異的抗凝性能。本文綜述了抗凝血生物材料的研究進展，旨在為生物材料血液相容性的改良策略提供參考。
1 生物材料表面血栓形成的機制
生物材料接觸血液后將激活一系列復雜而又相互關聯的途徑導致血栓形成。這些過程主要包括材料表面蛋白質的吸附、血細胞黏附激活與聚集、內源性凝血途徑激活以及補體的激活等[6]。其中蛋白質吸附、血小板黏附激活、內源性凝血途徑激活被認為在其中起著主要作用（圖1）[7]。
圖1
生物材料表面血栓形成的主要機制
FⅫ：凝血因子Ⅻ（即接觸因子）；FⅫa：激活的凝血因子Ⅻ；FⅡ：凝血因子Ⅱ（即凝血酶原）；FⅡa：激活的凝血因子Ⅱ（即凝血酶）；C3：補體 C3；C5：補體 C5；C3a：補體片段 3a；C5a：補體片段 5a。本圖由 Figdraw 繪制
目前研究認為，血漿蛋白在材料表面的吸附是生物材料血栓形成的始動因素[8]。血漿蛋白質的吸附在生物材料接觸血液后的數秒之內便可發生。材料表面所吸附形成的蛋白質層中，占據主導地位的蛋白質主要是纖維蛋白原、白蛋白、載脂蛋白、免疫球蛋白等[9]。其中纖維蛋白原被認為是誘導血小板黏附激活最重要的蛋白質。因為生物材料本身并不具備與血小板直接結合的配體，而纖維蛋白原的吸附及隨后的構象變化可暴露出與血小板糖蛋白Ⅱa/Ⅲb 受體結合的位點，進而介導了血小板的黏附與激活[10]。激活的血小板從致密體中釋放出血栓素 A2、二磷酸腺苷等物質，促進局部更多的血小板黏附、激活與聚集，形成血小板血栓[11]。
生物材料還可活化凝血因子Ⅻ（factor Ⅻ, FⅫ）（即接觸因子），進而激活血漿-接觸系統，導致內源性凝血過程的發生[12]。激活的 FⅫ（activated FⅫ, FⅫa）啟動一系列蛋白水解反應激活凝血因子Ⅱ（factor Ⅱ, FⅡ）（即凝血酶原）生成激活的 FⅡ（activated FⅡ, FⅡa）（即凝血酶）。血漿中的可溶性纖維蛋白原在 FⅡa 的作用下轉換成不可溶的纖維蛋白單體，并促進血小板的進一步激活與聚集[12]。最終纖維蛋白單體相互交聯，穩定聚集的血小板，形成血小板-纖維蛋白血栓。
白細胞與補體的激活同樣是血栓形成的重要驅動因素。FⅫa、FⅡa 可激活補體系統 C1、C5[13]。過敏毒性肽 C3a、C5a 等補體激活產物通過誘導白細胞活化及表達組織因子、纖溶酶原激活物抑制物等方式發揮促凝效應[13]。活化的白細胞還可釋放出血小板活化因子及彈性蛋白酶，形成血小板-白細胞聚集體促進血栓形成[14]。
2 抗凝血生物材料的研發策略
基于已探明的生物材料表面血栓形成機制，調節蛋白質與血細胞在材料表面的吸附行為、抑制凝血途徑的激活成為了抗凝血生物材料研發的主要方向。研發的具體策略可簡要概括為改變材料理化性質、構建固定/釋放活性物質的涂層、材料表面內皮化三大類（圖2）[15]。第 1 種策略通過改造生物材料表面的微納結構、化學性質，調整材料的親疏水性能以構建抵抗蛋白質與血細胞吸附的表面，來降低血栓形成風險。第 2 種策略則借助不同的活性物質，靶向作用于血小板聚集、凝血途徑激活、微型纖維蛋白凝塊溶解等不同的途徑來實現抗凝。由于人體血管內皮細胞擁有硫酸乙酰肝素-抗凝血酶系統和血栓調節-蛋白 C 兩大抗凝系統，可合成并釋放一氧化氮、前列環素、抗凝血酶Ⅲ、纖溶酶原活化劑等多種天然活性物質，阻止血管內血栓的形成[16]。因此，第 3 種策略材料表面內皮化，被認為是最理想的血液相容性生物材料的構建方式。
圖2
抗凝血生物材料主要的研發策略
3 抗凝血生物材料理化性質的改變
3.1 材料表面親疏水改性
早在 1987 年，Elwing 等[17]便探討了材料表面親疏水性能與蛋白質黏附多寡的關系，其使用二甲基二氯硅烷在平整的二氧化硅上構建了水接觸角從 10° 到 85° 不等的梯度表面，并測試了該梯度表面對人 γ 球蛋白、人纖維蛋白原及蛋清溶菌酶的吸附性能，結果表明，3 種蛋白質的吸附量均隨著表面疏水性能的增加而增加。現有研究結果認為，疏水性表面較親水性表面更容易吸附蛋白質[18]。
生物材料接觸血液后，水分子最先吸附到材料表面，這一過程在數納秒之內發生。由于親水材料具備更低的材料-水界面能，水分子通過氫鍵或離子誘導等方式與親水材料表面緊密結合實現表面水合。親水性越強，則血漿中蛋白質取代水合層所需的能量越高，吸附到材料表面的難度越大[18]。隨著材料疏水性的增加，蛋白質的吸附容易程度及吸附量均增加。然而，當材料疏水性能進一步增加并展現出超疏水（水接觸角>150°）性能時，蛋白質的吸附量將降至極低水平[18]。Stallard 等[19]通過改變單體沉積流速，利用等離子體噴射系統在硅晶片基底表面構建出了疏水（水接觸角 106°）及超疏水（水接觸角 156°）氟化硅氧烷涂層，評估了二者的蛋白質吸附性能，結果表明，超疏水表面的牛血清白蛋白及牛纖維蛋白原顯著低于疏水表面，這是由于超疏水材料表面的氣體層阻止了血液成分與材料表面的直接接觸的緣故。現有研究認為對材料進行超親水（水接觸角<10°）或超疏水改性均可有效減少表面蛋白質及細胞成分的吸附[18]。
3.1.1 超親水改性
材料表面特定的物理形貌可賦予材料超親水性能。Wang 等[20]使用多巴胺與鋅氨絡合物通過一步法在聚氨酯基材表面構建了聚多巴胺-鋅涂層，結果顯示：在鋅氨絡合物溶液濃度低于 0.08 mol/L 時，涂層可呈現納米蜂窩狀孔隙結構；這種結構利于水在材料表面迅速鋪展滲透，展現出超親水性能（水接觸角 7.4°）；在體外試驗中，該涂層顯著降低了材料表面牛血清白蛋白及血小板的黏附。
親水性聚合物常被用于生物材料表面超親水涂層的構建。這類聚合物可通過分子中存在的離子型（如磺酸基、羧酸基、季銨基等）或非離子型（如聚氧乙烯基、羥基、醚鍵等）親水基團在材料表面形成水合層，賦予材料超親水性能。已有大量的研究報道了聚乙二醇、聚甲基丙烯酸羥乙酯、羧基甜菜堿、黃基甜菜堿等親水性聚合物構建的超親水涂層，這些涂層在體外試驗中降低了材料表面蛋白質及血細胞的黏附，減少了血栓形成[21-24]。聚乙二醇涂層是經典的超親水涂層，在體外試驗中顯著減少了血細胞與蛋白質的黏附，然而，Perrino 等[25]指出，聚乙二醇在活體內并未能展現出與體外試驗一致的效果，這可能與聚乙二醇在體內發生氧化及降解有關。相較于聚乙二醇，兩性離子聚合物修飾的表面可展現出更優異的抗生物黏附性能。Yang 等[26]指出接枝聚羧基甜菜堿的表面血漿纖維蛋白原吸附量可低于 1 ng/cm2，這遠低于誘導血小板黏附所需的纖維蛋白原下限值 5ng/ cm2 [27]。Yao 等[28]在聚氯乙烯基材表面構建了聚羧基甜菜堿微凝膠與聚磺酸甜菜堿的復合涂層，并在家兔動靜脈分流模型中測試了其抗血栓性能，研究發現在無系統性抗凝藥物使用的情況下，聚羧基甜菜堿微凝膠/聚磺酸甜菜堿水凝膠涂層管路在 2 h 的體外循環過程中，管路中的血流速率仍可保持為初始數值的（91.8±3.1）%，而無涂層聚氯乙烯管路已形成大量血栓，血流速率僅為初始的（38.9±6.2）%。超親水涂層的構建在減少材料表面血栓形成中展現了良好的應用前景。
3.1.2 超疏水改性
人體血管內膜表面并非絕對平坦光滑，相反，血管內表面是由眾多沿著血流方向分布的規律微米級凹槽與納米凸起所構成的微納尺寸形貌[29]。表面微納結構的構建被認為在血液相容性生物材料的制備中占據重要地位，低表面能與微納結構是材料表面超疏水性能得以實現的 2 個重要的原理[30]。考慮到血小板足突大小約為 50 nm，而血小板的大小為 2～3 μm，有研究者指出，在材料表面構建出間距尺寸在 50 nm～2 μm 的粗糙微納結構，可最大程度減少材料表面與血小板的接觸面積，進而降低血小板的黏附與活化風險，從而減少血栓的形成[31]。
膨體聚四氟乙烯（expanded polytetrafluoroethylene, ePTFE）是經典的借助超低表面能物質氟構建的超疏水材料。ePTFE 在體外試驗中，顯著減少了血小板的黏附與激活，然而，Toes 等[32]指出，在體內試驗中，小孔徑的 ePTFE 血管移植物在 15 min 以內均有血栓形成并阻塞管腔。在臨床應用中，Betz 等[33]指出聚四氟乙烯血管移植物 1、3 年的一期、二期通暢率均顯著低于自體靜脈；接枝肝素的 ePTFE 血管移植物 1 年內通暢率雖與自體靜脈相當，但其長期（3、5 年）通暢率仍顯著低于自體靜脈。
氣相沉積法、等離子刻蝕技術、光刻技術、飛秒激光加工技術等方法已被用于在材料表面構建出規整的微納結構。Milner 等[34]使用軟光刻技術在聚（脲-氨酯）表面構建了有序排列的寬度 400 nm、間距 400 nm 和寬度 700 nm、間距 700 nm 的 2 種方柱結構，并指出，這種亞微米級陣列結構的表面具備超疏水性能，與光滑的表面相比，陣列結構表面黏附的血小板數量顯著減少，且附著的血小板形狀為完整圓盤形，未發生明顯的變形與活化。其他的研究報道了類似的納米花、納米微通道等微納結構賦予了材料超疏水性能，并不同程度提升了生物材料表面抵抗血小板黏附與激活的性能[35-36]。然而，這些研究的測試均局限于體外試驗，且材料與血液接觸時間有限。
目前，超疏水表面最大的挑戰在于血液中的水分子層可緩慢突破并溶解材料表面的空氣層。此外，人體血液中的油脂、蛋白質可降低材料-水界面的相互作用能，并最終突破空氣層，吸附在超疏水材料表面。因此，微納結構的表面并不能完全避免血小板與材料的接觸，同樣也不能完全阻止纖維蛋白原、凝血因子、脂類等其他血液成分的吸附[30]。因此在植入人體內真實血液環境中時，超疏水表面所展現的實際抗凝性能與體外存在差異。構建更規則的納米級別仿生凹角結構，提升超疏水表面對水、蛋白質及油脂類物質的抵抗性能，或可進一步提升超疏水材料的血液相容性[37]。
3.1.3 超滑表面
Leslie 等[38]將低表面能惰性液態全氟萘烷滴注在聚碳酸酯、聚砜、聚氯乙烯等多種多孔粗糙的生物材料表面，構建出了疏水、疏油的超滑表面，并建立了家豬股動脈動-靜脈分流模型，測試了該超滑表面的抗血栓性能，結果表明，在不使用抗凝劑的情況下，這種超滑涂層至少可維持 8 h 內體外循環管路的通暢。這是首個體內體外試驗均減少了管腔內部血栓形成的非肝素涂層，同樣也是首個可耐受高剪切速率且無需使用抗凝劑的抗血栓涂層。然而，Roberts 等[39]設計了家豬體外膜肺氧合試驗，對比了全氟萘烷涂層管路和使用肝素抗凝普通管路的通暢性，結果表明：全氟萘烷涂層組血栓并發癥發生率與對照組無差異，體外循環管路閉塞發生率卻高于對照組；治療過程中，全氟萘烷涂層組還出現了氣體交換受損事件[39]。此外，液態全氟萘烷與材料表面的結合穩定性欠佳，在血液沖刷過程中，全氟萘烷液體層可脫落入血，在人體內有蓄積風險。且隨著時間的推移，材料表面的潤滑液體將消耗減少。上述問題都限制了全氟萘烷及類似的低表面能潤滑液體在生物材料表面的應用。
3.2 白蛋白的優先吸附
由于血漿白蛋白缺乏能與血小板和凝血酶直接結合的位點，因此被認為并不參與凝血系統的激活過程，是一種“鈍化蛋白”[40]。將白蛋白優先吸附在材料表面，在競爭性減少其他蛋白質的吸附的同時，抑制生物材料與血液之間的相互作用。不同的研究者使用乙二醇自組裝單層、小分子凝血酶抑制肽、線性肽等方式，實現了材料表面對白蛋白的優先吸附[41-43]。Freitas 等[43]指出，使用小分子凝血酶抑制肽在材料表面選擇性地實現了血漿白蛋白的可逆吸附，提升了材料的血液相容性，所有接枝了凝血酶抑制肽的表面均避免了基底材料對凝血系統的激活，具備了與陰性對照組聚苯乙烯相似的凝血時長。
然而，Sivaraman 等[44]指出，隨著時間的延長，材料表面吸附的白蛋白可發生變性并產生構象改變，這種構象的變化可誘導血小板的黏附與激活。此外，血漿蛋白質在材料表面的吸附是一個連續變化的過程，低表面活性的蛋白質可不斷被高表面活性的蛋白質取代[6]。多種血漿蛋白質在材料表面的這種競爭吸附、吸附與解吸附的動態過程極為復雜，具體機制尚不明確，因此在體內試驗中，白蛋白涂層對生物材料血液相容性的改善情況不如預期顯著。涂覆有白蛋白涂層的滌綸移植物在體外試驗中降低了血小板、白細胞的黏附以及纖維蛋白的形成，然而，在狗的胸腹分流模型中并未展現出優于無涂層移植物的性能[45]。Kudo 等[46]在 50 例患者中使用了白蛋白涂層的滌綸移植物進行腹主動脈瘤的修補，術后 2 周時患者炎癥反應未出現顯著的增加，展現了良好的生物相容性，然而研究并未觀察及報道白蛋白涂層減少移植物血栓形成的性能。目前尚缺乏足夠的研究數據來支撐證實白蛋白涂層對生物材料抗凝血性能的改善。
4 活性物質
4.1 肝素
肝素是臨床中廣泛使用的抗凝藥物之一。肝素不僅可阻止血小板的聚集活化，還可與抗凝血酶Ⅲ結合使其發生構象變化，顯著強化其抑制 FⅡa、FⅨa、FⅩa、FⅪa、FⅫa 等凝血因子的性能。截至目前，肝素涂層是所有活性物質涂層中最成功且應用最為廣泛的。該涂層在體外試驗中顯著減少了血小板的黏附，延長了部分凝血活酶時長，降低了血栓形成風險[47-49]。目前已有肝素涂層導管進入臨床使用。
然而，現有的多項臨床研究結果對肝素涂層的實際性能提出了質疑。?zdemir 等[50]指出，肝素涂層在臨床應用中雖然顯著減少了透析導管表面纖維蛋白鞘的形成（P=0.017），但并未改善導管的通暢率。Clark 等[51]在一項回顧性研究中同樣指出，肝素涂層與無肝素涂層導管相比，血栓形成率相當（P=0.9），這與 Jain 等[52]的回顧性研究以及 Sobhiyeh 等[53]開展的隨機對照研究結果一致。但是，Jain 等[52]及 Sobhiyeh 等[53]卻發現，肝素涂層顯著降低了導管感染的發生（34% vs. 60%，P<0.001；10% vs. 20%，P=0.001），其具體機制仍不明確。此外，Kasirajan 等[54]指出，生物材料表面固定的肝素同樣可誘發威脅生命的Ⅱ型血小板減少癥。因此，Ⅱ型血小板減少癥患者在使用肝素涂層生物材料時需警惕該風險。
4.2 其他降低凝血風險的活性物質
除肝素外，還有多種其他活性物質也被用于抗凝血涂層的構建。如：釋放一氧化氮的金屬有機框架體系[55]、抑制血小板聚集的磷酸二酯酶抑制劑如雙嘧達莫[56]、直接作用于 FⅡa 的水蛭素及其衍生物比伐蘆定[57-58]、人體內天然抗凝物質如血栓調節蛋白與活化蛋白[59-60]、作用于纖維蛋白溶解系統的藥物如尿激酶[61]等。這些活性物質均被固定于生物材料表面，一定程度改善了材料的血液相容性。然而，這些活性物質涂層的研究幾乎都局限于體外試驗，且均未能展示出優于肝素涂層的抗凝特性。由于生物材料表面蛋白質的吸附在材料接觸血液后數秒的時間內發生，這些活性物質或很快被材料表面吸附的蛋白質層“屏蔽”進而無法與血液中的成分直接接觸并發揮作用[6]。此外，活性物質作用位點的飽和可影響其實際的抗凝性能。活性物質在體內的消耗降解、涂層表面所固定/釋放的一氧化氮等活性物質的量有限等問題，對這一類涂層在體內抗凝效果的持久性提出了挑戰。
5 內皮化
完整的血管內皮細胞是最理想的血液相容性表面[62]。在生物材料表面實現血管內皮化，理論上可最大程度改善材料的血液相容性，減少血栓形成。直接在材料表面種植內皮細胞存在極大的難度。細胞的來源、內皮細胞接種技術難度高、細胞的穩定性及存活率、同種異體細胞的排斥反應等問題都對這種方法提出了巨大的挑戰[63]。內皮細胞在材料表面的原位捕獲生長成為了更為可行的方式。有研究者通過在形狀記憶聚合物表面設計特定的微槽結構來實現對內皮細胞的募集吸附與生長[64]。另有研究者在材料表面涂覆細胞外基質蛋白（如膠原蛋白Ⅰ、纖連蛋白、層粘連蛋白）[65]、可特異性結合內皮細胞的寡肽及外泌體等實現材料表面內皮化[66-67]。還有研究嘗試使用細胞黏附多肽及西格列汀在材料表面原位捕獲內皮細胞或其祖細胞[68]。
然而，內皮細胞被固定到生物材料表面并不意味著其可發揮完美的生理功能并展現出抗凝性能。相反，內皮細胞可在生物材料的刺激作用下轉變為激活狀態。激活狀態的內皮細胞不僅沒有抗血栓的保護作用，反而會呈現出促凝血、促炎癥反應表型。它們通過下調組織因子途徑抑制物、組織纖溶酶原激活物、血栓調節蛋白等物質，同時上調血小板和白細胞黏附的配體，導致凝血途徑的激活[62]。此外，這些原位捕獲的方式對內皮細胞的選擇性及特異性較差，其他類型的細胞可同樣競爭性在材料表面增殖[69]。
如何讓材料表面特異性地捕獲內皮細胞，并讓這些內皮細胞實現接近生理狀態下的生長模式，發揮其完整的生理功能，是目前生物材料表面內皮化所必須要面對和解決的難題。
6 小結與展望
盡管科技工作者在研發抗凝血生物材料上作出了眾多嘗試，但無論是改變材料的理化性、在材料表面固定或釋放活性物質，還是在材料表面嘗試原位構建內皮細胞層，現有生物材料的抗凝血性能仍不理想，僅有極少數實現商用。多數研究仍處于體外試驗階段，缺乏活體內試驗驗證。且現有研究主要聚焦于蛋白質吸附、血小板黏附、凝血涂層激活途徑，白細胞與補體在生物材料相關血栓形成中所起到的作用仍相對考慮不足。
為研發出抗凝血性能更優異的生物材料，需考慮到生物材料血栓的形成涉及多條途徑，這些途徑相互關聯、機制復雜。單一途徑的干預很難起到理想的抗血栓形成效果。多途徑、多機制協同干預有望進一步改善生物材料的血液相容性。此外，活體內環境與體外試驗條件差異極大，活體血液成分及血流動力學復雜，體外試驗與體內驗證的結果可能存在顯著差異。在體外展現出優異性能的材料，應進一步完成體內試驗，以評估生物材料在體內環境下的真實抗凝血性能。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
直接接觸血液的生物材料在血液凈化、體外膜肺氧合、心臟支架及起搏器植入等多種醫療場景中有著廣泛應用。盡管臨床中使用了抗凝藥物（如肝素、華法林等）和/或抗血小板聚集藥物（如阿司匹林、氯吡格雷等）進行干預，血栓仍會在生物材料表面形成[1-2]。以中心靜脈導管為例，在住院患者人群中，留置中心靜脈導管相關的血栓事件發生率可高達 15%[3]。血栓形成不僅縮短了生物材料的使用壽命，還降低了患者的生活質量，影響患者的生存預后。同時，系統性抗凝和抗血小板治療可引起血小板減少、凝血功能異常等不良反應，增加了患者的全身出血風險，嚴重時可危及患者生命[4-5]。具備抗凝血性能的生物材料可實現材料局部抗凝，這在減少了材料表面血栓形成的同時，還避免了對患者凝血系統造成不利影響。因此，抗凝血生物材料的研發具有重要意義。近幾十年來，科技工作者致力于改善生物材料的血液相容性，期望在降低臨床應用風險的同時，實現材料局部優異的抗凝性能。本文綜述了抗凝血生物材料的研究進展，旨在為生物材料血液相容性的改良策略提供參考。
1 生物材料表面血栓形成的機制
生物材料接觸血液后將激活一系列復雜而又相互關聯的途徑導致血栓形成。這些過程主要包括材料表面蛋白質的吸附、血細胞黏附激活與聚集、內源性凝血途徑激活以及補體的激活等[6]。其中蛋白質吸附、血小板黏附激活、內源性凝血途徑激活被認為在其中起著主要作用（圖1）[7]。
圖1
生物材料表面血栓形成的主要機制
FⅫ：凝血因子Ⅻ（即接觸因子）；FⅫa：激活的凝血因子Ⅻ；FⅡ：凝血因子Ⅱ（即凝血酶原）；FⅡa：激活的凝血因子Ⅱ（即凝血酶）；C3：補體 C3；C5：補體 C5；C3a：補體片段 3a；C5a：補體片段 5a。本圖由 Figdraw 繪制
目前研究認為，血漿蛋白在材料表面的吸附是生物材料血栓形成的始動因素[8]。血漿蛋白質的吸附在生物材料接觸血液后的數秒之內便可發生。材料表面所吸附形成的蛋白質層中，占據主導地位的蛋白質主要是纖維蛋白原、白蛋白、載脂蛋白、免疫球蛋白等[9]。其中纖維蛋白原被認為是誘導血小板黏附激活最重要的蛋白質。因為生物材料本身并不具備與血小板直接結合的配體，而纖維蛋白原的吸附及隨后的構象變化可暴露出與血小板糖蛋白Ⅱa/Ⅲb 受體結合的位點，進而介導了血小板的黏附與激活[10]。激活的血小板從致密體中釋放出血栓素 A2、二磷酸腺苷等物質，促進局部更多的血小板黏附、激活與聚集，形成血小板血栓[11]。
生物材料還可活化凝血因子Ⅻ（factor Ⅻ, FⅫ）（即接觸因子），進而激活血漿-接觸系統，導致內源性凝血過程的發生[12]。激活的 FⅫ（activated FⅫ, FⅫa）啟動一系列蛋白水解反應激活凝血因子Ⅱ（factor Ⅱ, FⅡ）（即凝血酶原）生成激活的 FⅡ（activated FⅡ, FⅡa）（即凝血酶）。血漿中的可溶性纖維蛋白原在 FⅡa 的作用下轉換成不可溶的纖維蛋白單體，并促進血小板的進一步激活與聚集[12]。最終纖維蛋白單體相互交聯，穩定聚集的血小板，形成血小板-纖維蛋白血栓。
白細胞與補體的激活同樣是血栓形成的重要驅動因素。FⅫa、FⅡa 可激活補體系統 C1、C5[13]。過敏毒性肽 C3a、C5a 等補體激活產物通過誘導白細胞活化及表達組織因子、纖溶酶原激活物抑制物等方式發揮促凝效應[13]。活化的白細胞還可釋放出血小板活化因子及彈性蛋白酶，形成血小板-白細胞聚集體促進血栓形成[14]。
2 抗凝血生物材料的研發策略
基于已探明的生物材料表面血栓形成機制，調節蛋白質與血細胞在材料表面的吸附行為、抑制凝血途徑的激活成為了抗凝血生物材料研發的主要方向。研發的具體策略可簡要概括為改變材料理化性質、構建固定/釋放活性物質的涂層、材料表面內皮化三大類（圖2）[15]。第 1 種策略通過改造生物材料表面的微納結構、化學性質，調整材料的親疏水性能以構建抵抗蛋白質與血細胞吸附的表面，來降低血栓形成風險。第 2 種策略則借助不同的活性物質，靶向作用于血小板聚集、凝血途徑激活、微型纖維蛋白凝塊溶解等不同的途徑來實現抗凝。由于人體血管內皮細胞擁有硫酸乙酰肝素-抗凝血酶系統和血栓調節-蛋白 C 兩大抗凝系統，可合成并釋放一氧化氮、前列環素、抗凝血酶Ⅲ、纖溶酶原活化劑等多種天然活性物質，阻止血管內血栓的形成[16]。因此，第 3 種策略材料表面內皮化，被認為是最理想的血液相容性生物材料的構建方式。
圖2
抗凝血生物材料主要的研發策略
3 抗凝血生物材料理化性質的改變
3.1 材料表面親疏水改性
早在 1987 年，Elwing 等[17]便探討了材料表面親疏水性能與蛋白質黏附多寡的關系，其使用二甲基二氯硅烷在平整的二氧化硅上構建了水接觸角從 10° 到 85° 不等的梯度表面，并測試了該梯度表面對人 γ 球蛋白、人纖維蛋白原及蛋清溶菌酶的吸附性能，結果表明，3 種蛋白質的吸附量均隨著表面疏水性能的增加而增加。現有研究結果認為，疏水性表面較親水性表面更容易吸附蛋白質[18]。
生物材料接觸血液后，水分子最先吸附到材料表面，這一過程在數納秒之內發生。由于親水材料具備更低的材料-水界面能，水分子通過氫鍵或離子誘導等方式與親水材料表面緊密結合實現表面水合。親水性越強，則血漿中蛋白質取代水合層所需的能量越高，吸附到材料表面的難度越大[18]。隨著材料疏水性的增加，蛋白質的吸附容易程度及吸附量均增加。然而，當材料疏水性能進一步增加并展現出超疏水（水接觸角>150°）性能時，蛋白質的吸附量將降至極低水平[18]。Stallard 等[19]通過改變單體沉積流速，利用等離子體噴射系統在硅晶片基底表面構建出了疏水（水接觸角 106°）及超疏水（水接觸角 156°）氟化硅氧烷涂層，評估了二者的蛋白質吸附性能，結果表明，超疏水表面的牛血清白蛋白及牛纖維蛋白原顯著低于疏水表面，這是由于超疏水材料表面的氣體層阻止了血液成分與材料表面的直接接觸的緣故。現有研究認為對材料進行超親水（水接觸角<10°）或超疏水改性均可有效減少表面蛋白質及細胞成分的吸附[18]。
3.1.1 超親水改性
材料表面特定的物理形貌可賦予材料超親水性能。Wang 等[20]使用多巴胺與鋅氨絡合物通過一步法在聚氨酯基材表面構建了聚多巴胺-鋅涂層，結果顯示：在鋅氨絡合物溶液濃度低于 0.08 mol/L 時，涂層可呈現納米蜂窩狀孔隙結構；這種結構利于水在材料表面迅速鋪展滲透，展現出超親水性能（水接觸角 7.4°）；在體外試驗中，該涂層顯著降低了材料表面牛血清白蛋白及血小板的黏附。
親水性聚合物常被用于生物材料表面超親水涂層的構建。這類聚合物可通過分子中存在的離子型（如磺酸基、羧酸基、季銨基等）或非離子型（如聚氧乙烯基、羥基、醚鍵等）親水基團在材料表面形成水合層，賦予材料超親水性能。已有大量的研究報道了聚乙二醇、聚甲基丙烯酸羥乙酯、羧基甜菜堿、黃基甜菜堿等親水性聚合物構建的超親水涂層，這些涂層在體外試驗中降低了材料表面蛋白質及血細胞的黏附，減少了血栓形成[21-24]。聚乙二醇涂層是經典的超親水涂層，在體外試驗中顯著減少了血細胞與蛋白質的黏附，然而，Perrino 等[25]指出，聚乙二醇在活體內并未能展現出與體外試驗一致的效果，這可能與聚乙二醇在體內發生氧化及降解有關。相較于聚乙二醇，兩性離子聚合物修飾的表面可展現出更優異的抗生物黏附性能。Yang 等[26]指出接枝聚羧基甜菜堿的表面血漿纖維蛋白原吸附量可低于 1 ng/cm2，這遠低于誘導血小板黏附所需的纖維蛋白原下限值 5ng/ cm2 [27]。Yao 等[28]在聚氯乙烯基材表面構建了聚羧基甜菜堿微凝膠與聚磺酸甜菜堿的復合涂層，并在家兔動靜脈分流模型中測試了其抗血栓性能，研究發現在無系統性抗凝藥物使用的情況下，聚羧基甜菜堿微凝膠/聚磺酸甜菜堿水凝膠涂層管路在 2 h 的體外循環過程中，管路中的血流速率仍可保持為初始數值的（91.8±3.1）%，而無涂層聚氯乙烯管路已形成大量血栓，血流速率僅為初始的（38.9±6.2）%。超親水涂層的構建在減少材料表面血栓形成中展現了良好的應用前景。
3.1.2 超疏水改性
人體血管內膜表面并非絕對平坦光滑，相反，血管內表面是由眾多沿著血流方向分布的規律微米級凹槽與納米凸起所構成的微納尺寸形貌[29]。表面微納結構的構建被認為在血液相容性生物材料的制備中占據重要地位，低表面能與微納結構是材料表面超疏水性能得以實現的 2 個重要的原理[30]。考慮到血小板足突大小約為 50 nm，而血小板的大小為 2～3 μm，有研究者指出，在材料表面構建出間距尺寸在 50 nm～2 μm 的粗糙微納結構，可最大程度減少材料表面與血小板的接觸面積，進而降低血小板的黏附與活化風險，從而減少血栓的形成[31]。
膨體聚四氟乙烯（expanded polytetrafluoroethylene, ePTFE）是經典的借助超低表面能物質氟構建的超疏水材料。ePTFE 在體外試驗中，顯著減少了血小板的黏附與激活，然而，Toes 等[32]指出，在體內試驗中，小孔徑的 ePTFE 血管移植物在 15 min 以內均有血栓形成并阻塞管腔。在臨床應用中，Betz 等[33]指出聚四氟乙烯血管移植物 1、3 年的一期、二期通暢率均顯著低于自體靜脈；接枝肝素的 ePTFE 血管移植物 1 年內通暢率雖與自體靜脈相當，但其長期（3、5 年）通暢率仍顯著低于自體靜脈。
氣相沉積法、等離子刻蝕技術、光刻技術、飛秒激光加工技術等方法已被用于在材料表面構建出規整的微納結構。Milner 等[34]使用軟光刻技術在聚（脲-氨酯）表面構建了有序排列的寬度 400 nm、間距 400 nm 和寬度 700 nm、間距 700 nm 的 2 種方柱結構，并指出，這種亞微米級陣列結構的表面具備超疏水性能，與光滑的表面相比，陣列結構表面黏附的血小板數量顯著減少，且附著的血小板形狀為完整圓盤形，未發生明顯的變形與活化。其他的研究報道了類似的納米花、納米微通道等微納結構賦予了材料超疏水性能，并不同程度提升了生物材料表面抵抗血小板黏附與激活的性能[35-36]。然而，這些研究的測試均局限于體外試驗，且材料與血液接觸時間有限。
目前，超疏水表面最大的挑戰在于血液中的水分子層可緩慢突破并溶解材料表面的空氣層。此外，人體血液中的油脂、蛋白質可降低材料-水界面的相互作用能，并最終突破空氣層，吸附在超疏水材料表面。因此，微納結構的表面并不能完全避免血小板與材料的接觸，同樣也不能完全阻止纖維蛋白原、凝血因子、脂類等其他血液成分的吸附[30]。因此在植入人體內真實血液環境中時，超疏水表面所展現的實際抗凝性能與體外存在差異。構建更規則的納米級別仿生凹角結構，提升超疏水表面對水、蛋白質及油脂類物質的抵抗性能，或可進一步提升超疏水材料的血液相容性[37]。
3.1.3 超滑表面
Leslie 等[38]將低表面能惰性液態全氟萘烷滴注在聚碳酸酯、聚砜、聚氯乙烯等多種多孔粗糙的生物材料表面，構建出了疏水、疏油的超滑表面，并建立了家豬股動脈動-靜脈分流模型，測試了該超滑表面的抗血栓性能，結果表明，在不使用抗凝劑的情況下，這種超滑涂層至少可維持 8 h 內體外循環管路的通暢。這是首個體內體外試驗均減少了管腔內部血栓形成的非肝素涂層，同樣也是首個可耐受高剪切速率且無需使用抗凝劑的抗血栓涂層。然而，Roberts 等[39]設計了家豬體外膜肺氧合試驗，對比了全氟萘烷涂層管路和使用肝素抗凝普通管路的通暢性，結果表明：全氟萘烷涂層組血栓并發癥發生率與對照組無差異，體外循環管路閉塞發生率卻高于對照組；治療過程中，全氟萘烷涂層組還出現了氣體交換受損事件[39]。此外，液態全氟萘烷與材料表面的結合穩定性欠佳，在血液沖刷過程中，全氟萘烷液體層可脫落入血，在人體內有蓄積風險。且隨著時間的推移，材料表面的潤滑液體將消耗減少。上述問題都限制了全氟萘烷及類似的低表面能潤滑液體在生物材料表面的應用。
3.2 白蛋白的優先吸附
由于血漿白蛋白缺乏能與血小板和凝血酶直接結合的位點，因此被認為并不參與凝血系統的激活過程，是一種“鈍化蛋白”[40]。將白蛋白優先吸附在材料表面，在競爭性減少其他蛋白質的吸附的同時，抑制生物材料與血液之間的相互作用。不同的研究者使用乙二醇自組裝單層、小分子凝血酶抑制肽、線性肽等方式，實現了材料表面對白蛋白的優先吸附[41-43]。Freitas 等[43]指出，使用小分子凝血酶抑制肽在材料表面選擇性地實現了血漿白蛋白的可逆吸附，提升了材料的血液相容性，所有接枝了凝血酶抑制肽的表面均避免了基底材料對凝血系統的激活，具備了與陰性對照組聚苯乙烯相似的凝血時長。
然而，Sivaraman 等[44]指出，隨著時間的延長，材料表面吸附的白蛋白可發生變性并產生構象改變，這種構象的變化可誘導血小板的黏附與激活。此外，血漿蛋白質在材料表面的吸附是一個連續變化的過程，低表面活性的蛋白質可不斷被高表面活性的蛋白質取代[6]。多種血漿蛋白質在材料表面的這種競爭吸附、吸附與解吸附的動態過程極為復雜，具體機制尚不明確，因此在體內試驗中，白蛋白涂層對生物材料血液相容性的改善情況不如預期顯著。涂覆有白蛋白涂層的滌綸移植物在體外試驗中降低了血小板、白細胞的黏附以及纖維蛋白的形成，然而，在狗的胸腹分流模型中并未展現出優于無涂層移植物的性能[45]。Kudo 等[46]在 50 例患者中使用了白蛋白涂層的滌綸移植物進行腹主動脈瘤的修補，術后 2 周時患者炎癥反應未出現顯著的增加，展現了良好的生物相容性，然而研究并未觀察及報道白蛋白涂層減少移植物血栓形成的性能。目前尚缺乏足夠的研究數據來支撐證實白蛋白涂層對生物材料抗凝血性能的改善。
4 活性物質
4.1 肝素
肝素是臨床中廣泛使用的抗凝藥物之一。肝素不僅可阻止血小板的聚集活化，還可與抗凝血酶Ⅲ結合使其發生構象變化，顯著強化其抑制 FⅡa、FⅨa、FⅩa、FⅪa、FⅫa 等凝血因子的性能。截至目前，肝素涂層是所有活性物質涂層中最成功且應用最為廣泛的。該涂層在體外試驗中顯著減少了血小板的黏附，延長了部分凝血活酶時長，降低了血栓形成風險[47-49]。目前已有肝素涂層導管進入臨床使用。
然而，現有的多項臨床研究結果對肝素涂層的實際性能提出了質疑。?zdemir 等[50]指出，肝素涂層在臨床應用中雖然顯著減少了透析導管表面纖維蛋白鞘的形成（P=0.017），但并未改善導管的通暢率。Clark 等[51]在一項回顧性研究中同樣指出，肝素涂層與無肝素涂層導管相比，血栓形成率相當（P=0.9），這與 Jain 等[52]的回顧性研究以及 Sobhiyeh 等[53]開展的隨機對照研究結果一致。但是，Jain 等[52]及 Sobhiyeh 等[53]卻發現，肝素涂層顯著降低了導管感染的發生（34% vs. 60%，P<0.001；10% vs. 20%，P=0.001），其具體機制仍不明確。此外，Kasirajan 等[54]指出，生物材料表面固定的肝素同樣可誘發威脅生命的Ⅱ型血小板減少癥。因此，Ⅱ型血小板減少癥患者在使用肝素涂層生物材料時需警惕該風險。
4.2 其他降低凝血風險的活性物質
除肝素外，還有多種其他活性物質也被用于抗凝血涂層的構建。如：釋放一氧化氮的金屬有機框架體系[55]、抑制血小板聚集的磷酸二酯酶抑制劑如雙嘧達莫[56]、直接作用于 FⅡa 的水蛭素及其衍生物比伐蘆定[57-58]、人體內天然抗凝物質如血栓調節蛋白與活化蛋白[59-60]、作用于纖維蛋白溶解系統的藥物如尿激酶[61]等。這些活性物質均被固定于生物材料表面，一定程度改善了材料的血液相容性。然而，這些活性物質涂層的研究幾乎都局限于體外試驗，且均未能展示出優于肝素涂層的抗凝特性。由于生物材料表面蛋白質的吸附在材料接觸血液后數秒的時間內發生，這些活性物質或很快被材料表面吸附的蛋白質層“屏蔽”進而無法與血液中的成分直接接觸并發揮作用[6]。此外，活性物質作用位點的飽和可影響其實際的抗凝性能。活性物質在體內的消耗降解、涂層表面所固定/釋放的一氧化氮等活性物質的量有限等問題，對這一類涂層在體內抗凝效果的持久性提出了挑戰。
5 內皮化
完整的血管內皮細胞是最理想的血液相容性表面[62]。在生物材料表面實現血管內皮化，理論上可最大程度改善材料的血液相容性，減少血栓形成。直接在材料表面種植內皮細胞存在極大的難度。細胞的來源、內皮細胞接種技術難度高、細胞的穩定性及存活率、同種異體細胞的排斥反應等問題都對這種方法提出了巨大的挑戰[63]。內皮細胞在材料表面的原位捕獲生長成為了更為可行的方式。有研究者通過在形狀記憶聚合物表面設計特定的微槽結構來實現對內皮細胞的募集吸附與生長[64]。另有研究者在材料表面涂覆細胞外基質蛋白（如膠原蛋白Ⅰ、纖連蛋白、層粘連蛋白）[65]、可特異性結合內皮細胞的寡肽及外泌體等實現材料表面內皮化[66-67]。還有研究嘗試使用細胞黏附多肽及西格列汀在材料表面原位捕獲內皮細胞或其祖細胞[68]。
然而，內皮細胞被固定到生物材料表面并不意味著其可發揮完美的生理功能并展現出抗凝性能。相反，內皮細胞可在生物材料的刺激作用下轉變為激活狀態。激活狀態的內皮細胞不僅沒有抗血栓的保護作用，反而會呈現出促凝血、促炎癥反應表型。它們通過下調組織因子途徑抑制物、組織纖溶酶原激活物、血栓調節蛋白等物質，同時上調血小板和白細胞黏附的配體，導致凝血途徑的激活[62]。此外，這些原位捕獲的方式對內皮細胞的選擇性及特異性較差，其他類型的細胞可同樣競爭性在材料表面增殖[69]。
如何讓材料表面特異性地捕獲內皮細胞，并讓這些內皮細胞實現接近生理狀態下的生長模式，發揮其完整的生理功能，是目前生物材料表面內皮化所必須要面對和解決的難題。
6 小結與展望
盡管科技工作者在研發抗凝血生物材料上作出了眾多嘗試，但無論是改變材料的理化性、在材料表面固定或釋放活性物質，還是在材料表面嘗試原位構建內皮細胞層，現有生物材料的抗凝血性能仍不理想，僅有極少數實現商用。多數研究仍處于體外試驗階段，缺乏活體內試驗驗證。且現有研究主要聚焦于蛋白質吸附、血小板黏附、凝血涂層激活途徑，白細胞與補體在生物材料相關血栓形成中所起到的作用仍相對考慮不足。
為研發出抗凝血性能更優異的生物材料，需考慮到生物材料血栓的形成涉及多條途徑，這些途徑相互關聯、機制復雜。單一途徑的干預很難起到理想的抗血栓形成效果。多途徑、多機制協同干預有望進一步改善生物材料的血液相容性。此外，活體內環境與體外試驗條件差異極大，活體血液成分及血流動力學復雜，體外試驗與體內驗證的結果可能存在顯著差異。在體外展現出優異性能的材料，應進一步完成體內試驗，以評估生物材料在體內環境下的真實抗凝血性能。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
