引用本文： 盧存存, 王海博, 柯立鑫, 張強. 基于網絡藥理學與分子對接探討舒肝寧注射液治療非酒精性脂肪性肝病的潛在作用機制. 華西醫學, 2024, 39(12): 1911-1916. doi: 10.7507/1002-0179.202406206 復制
版權信息： ?四川大學華西醫院華西期刊社《華西醫學》版權所有，未經授權不得轉載、改編
非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD）是目前全球最常見的慢性肝病，其患病率約為 32.4%[1-2]。NAFLD 疾病譜包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎及相關的肝硬化，部分患者可能發展為肝細胞癌[1-2]。除美國食品藥品監督管理局近期批準的瑞美替羅（resmetirom）外，該病尚無其他特效治療藥物，故目前主要的治療手段仍是改變生活方式、使用胰島素增敏劑以及緩解肝臟炎癥與纖維化等對癥藥物[1, 3]。中草藥因多成分、多靶點、多通路的特性，在治療 NAFLD 及其相關并發癥方面備受關注[4]。舒肝寧注射液基于中醫經典方劑“茵陳蒿湯”研發，含有茵陳、梔子、板藍根、靈芝等中藥提取物和黃芩苷，具有清熱解毒、利濕退黃、益氣扶正、保肝護肝的功效，臨床上常用于治療急、慢性病毒性肝炎[5]。作為一門新興的交叉學科研究方法，網絡藥理學近年來已被廣泛應用于研究各種中藥方劑的作用機制[6-8]。因此，為了探索舒肝寧注射液治療 NAFLD 的分子機制，并為其臨床應用提供證據支持，本研究利用網絡藥理學和分子對接技術，分析與探討了舒肝寧注射液治療 NAFLD 的關鍵活性成分與潛在作用機制。
1 資料與方法
1.1 舒肝寧注射液的活性成分信息收集
2024 年 5 月 23 日—28 日 在 TCMSP 中藥系統藥理學平臺[8]檢索“茵陳”“梔子”“板藍根”“靈芝”和“黃芩苷”，收集舒肝寧注射液的活性成分信息。活性成分的篩選標準為口服生物利用度≥30%和類藥性≥0.18。同時，通過閱讀相關文獻對篩選結果進行補充，確保盡可能全面地納入相關活性成分[7]。
1.2 活性成分的作用靶點及疾病靶點信息收集
利用收集到的活性成分名稱分別檢索 TCMSID 數據庫[9]和 STITCH 5.0 數據庫（物種設定為“Homo sapiens”）[10]，獲取活性成分的相關作用靶點。將 TCMSID 數據庫檢索結果中“SwissTargetPrediction”部分的靶點與 STITCH 數據庫中獲得的靶點取并集，作為舒肝寧注射液活性成分的潛在作用靶點。此外，利用“Non-alcoholic Fatty Liver Disease”檢索 DisGeNET 數據庫[11]，以收集與 NAFLD 相關的疾病靶點。
1.3 舒肝寧注射液治療 NAFLD 的靶點及蛋白相互作用網絡分析
使用 Venny 2.1 在線工具繪制韋恩圖，將舒肝寧注射液主要活性成分的作用靶點與 NAFLD 相關靶點取交集得到的共有靶點作為潛在作用靶點。借助 UniProt 數據庫對靶點名稱進行校準和確認。隨后，將作用靶點上傳至 STRING 數據庫（物種設定為“Homo sapiens”），建立舒肝寧注射液治療 NAFLD 靶點的蛋白相互作用網絡。下載 tsv 格式數據并導入 Cytoscape 3.9.1 進行網絡拓撲結構分析，利用“Analyze Network”功能統計并分析網絡的拓撲參數[12]。
1.4 核心作用靶點的篩選及其基因富集分析
使用 Cytoscape 的 cytoHubba 插件基于最大團中心性、度中心性和中介中心性這 3 種算法分別篩選排名前 10 位的作用靶點，將篩選結果取并集作為核心作用靶點。隨后，為進一步探究舒肝寧注射液治療 NAFLD 的潛在分子作用機制，將核心作用靶點的基因上傳至 DAVID 數據庫進行基因本體（gene ontology, GO）和京都基因與基因組數據庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路富集分析，并使用R軟件可視化錯誤發現率最小的通路。
1.5 “中藥-成分-靶點-疾病”網絡的構建
使用 Excel 2019 整理中藥、活性成分、核心作用靶點和疾病的網絡關系數據，導入 Cytoscape 3.9.1 進行網絡可視化和拓撲結構分析，構建“中藥-成分-靶點-疾病”多層次網絡，直觀展示舒肝寧注射液治療 NAFLD 的潛在分子作用機制。
1.6 關鍵成分與核心作用靶蛋白的分子對接
首先，構建“核心靶點-活性成分”網絡，并利用 cytoHubba 插件分析得到度中心性算法評分排名前 5 位的活性成分，作為關鍵活性成分；然后，從 TCMSP 數據庫中獲取關鍵活性成分的 mol2 格式文件，同時通過靶點名稱檢索 PDB 數據庫獲取靶點蛋白的 PDB 格式文件，選擇標準為分辨率低、近年發表且期刊影響因子較高；最后，利用 CB Dock2 在線平臺[13]基于“structure-based blind docking”方法對 5 個關鍵活性成分與核心作用靶點蛋白進行對接分析并計算 Vina 評分，以判斷它們之間的親和力（負值評分的絕對值越大表明二者之間的親和力越高）。
2 結果
2.1 舒肝寧注射液的主要活性成分及作用靶點
共獲得舒肝寧注射液的 140 個主要活性成分，將其編號為 C1～C140，主要包括尿苷（C1）、色胺酮（C2）、山奈酚（C34）、綠原酸（C98）、β-谷甾醇（C103）和黃芩苷（C104）等。
2.2 舒肝寧注射液治療 NAFLD 的潛在靶點及核心作用靶點
通過 TCMSID 和 STITCH 數據庫得到舒肝寧注射液 140 個活性成分的 486 個潛在作用靶點，檢索 DisGeNET 數據庫得到 1058 個 NAFLD 相關靶點。利用韋恩圖取交集后得到舒肝寧注射液治療 NAFLD 的 154 個潛在作用靶點。將這 154 個作用靶點上傳至 STRING 數據庫構建蛋白相互作用網絡，網絡圖中共有 154 個節點和 2556 條邊，節點平均度值為 33.20，網絡密度為 0.22。利用 cytoHubba 插件基于最大團中心性、度中心性和中介中心性 3 種算法篩選各自排名前 10 位的作用靶點，取并集得到 16 個核心作用靶點，分別是蛋白激酶 B1 即 Akt 激酶 1（AKT1）、胱天蛋白酶 3（caspase-3, CASP3）、表皮生長因子受體、雌激素受體 1、缺氧誘導因子 1α、熱休克蛋白 90α家族 A 類成員 1、白細胞介素（interleukin, IL）-6、轉錄因子 Jun（JUN）、基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9, MMP-9）、過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator-activated receptor alpha, PPARA）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARG）、甾醇調節元件結合蛋白 1（sterol regulatory element-binding protein 1, SREBF1）、信號轉導與轉錄激活因子 1、信號轉導與轉錄激活因子 3（signal transducer and activator of transcription 3, STAT3）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor, TNF）和細胞腫瘤抗原 p53。
2.3 核心作用靶點的 GO 和 KEGG 通路富集分析
使用 DAVID 數據庫對 16 個核心作用靶點的富集分析顯示，生物學過程共富集到 179 個條目，主要涉及初級轉錄物的轉錄調控、RNA 聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄調控、對外源性刺激的反應、平滑肌細胞增殖的正向調控、凋亡過程的負向調控和炎癥細胞因子的正向調控等。細胞組分共富集到 13 個條目，主要涉及大分子復合物、染色質、RNA 聚合酶Ⅱ轉錄因子復合體、核質、核仁和常染色質等。分子功能共富集到 48 個條目，主要涉及 DNA 結合轉錄因子活性、酶結合、一氧化氮合酶調節劑活性、轉錄激活因子活性和轉錄輔激活因子結合等。KEGG 分析共富集到 99 條通路，錯誤發現率最小的 25 條通路主要涉及癌癥、脂質與動脈粥樣硬化、乙肝、IL-17 信號通路、NAFLD 和胰島素抵抗等通路；進一步分析發現 SREBF1、IL-6、JUN、CASP3、AKT1、PPARG、PPARA 和 TNF 這 8 個核心基因富集在 NAFLD 通路中，而 SREBF1、IL-6、STAT3、AKT1、PPARA 和 TNF 這 6 個核心基因富集在胰島素抵抗通路中。
2.4 “中藥-成分-靶點-疾病”多層次網絡的構建
“中藥-成分-靶點-疾病”的可視化網絡見圖1。圖中共有 102 個節點，包括 80 個活性成分、16 個核心作用靶點、5 個中藥和 1 個疾病，共 208 條邊。節點的平均度值為 4.08，網絡密度為 0.04。
2.5 關鍵活性成分與核心作用靶點的分子對接結果
篩選出的度中心性算法評分排名前 5 位的活性成分（關鍵活性成分）分別是谷甾醇（C9）、靈芝酸 A（C72）、β-谷甾醇（C103）、黃芩苷（C104）和刺槐黃素（C109）。使用 CB Dock2 在線平臺對這些成分和從 PDB 數據庫獲取的核心靶點蛋白實施分子對接時，由于未檢索到 SREBF1 對應的蛋白結構，僅對 5 個成分和 15 個靶點蛋白分別進行了對接。對接的親和力 Vina 評分結果見圖2。從圖中可以看出，各活性成分與靶點蛋白的親和力均較高，其中黃芩苷與 MMP-9 的親和力最高，其次為黃芩苷與 IL-6，排第 3 位的是刺槐黃素與 MMP-9。此外，整體來看，黃芩苷與各靶點蛋白的親和力較其他活性成分更高。
3 討論
NAFLD 屬于中醫學“肝癖”范疇，已成為當前全球最常見的慢性肝病，也是心血管疾病和慢性腎臟疾病的重要危險因素[14]。既往研究顯示，舒肝寧注射液聯合復方甘草酸苷可有效改善非酒精性脂肪性肝炎患者的脂代謝和肝功能，同時具有良好的臨床安全性[15]。而高文等[16]使用組織工程脂肪肝模型調查了舒肝寧注射液的抗氧化應激機制，結果顯示，舒肝寧注射液減少了組織工程脂肪肝中的丙二醛和活性氧水平，從而抑制氧化應激，減輕了游離脂肪酸誘導的脂肪肝中肝細胞凋亡和線粒體損傷。然而，有關舒肝寧注射液治療 NAFLD 的效果及相關作用機制的研究證據仍然不足[5]，因此，為夯實證據基礎和填補研究空白，本研究利用網絡藥理學方法和分子對接技術探討了舒肝寧注射液治療 NAFLD 的作用機制。基于公共數據庫和有關文獻共發現了舒肝寧注射液的 140 個主要活性成分，經進一步篩選和分析發現，谷甾醇、β-谷甾醇、靈芝酸 A、黃芩苷和刺槐黃素可能是舒肝寧注射液治療 NAFLD 的主要活性成分。
谷甾醇是一種植物甾醇，研究表明其具有抗炎、抗氧化、抗菌、降脂、抗腫瘤等多種作用，能夠增強機體免疫系統、抗動脈粥樣硬化、抗抑郁及抗衰老等[17]。近期，Zhang 等[18]基于高脂飲食誘導的 NAFLD 斑馬魚模型，發現β-谷甾醇能夠通過調節脂質代謝和信號轉導，抑制脂肪生成和脂質儲存，減少斑馬魚模型的脂質累積。而周海玥等[19]的研究表明，豆甾醇與β-谷甾醇能夠改善 NAFLD 肝細胞脂肪變性程度，減輕氧化應激反應。靈芝酸 A 是一種三萜類物質，是靈芝的主要成分之一，具有免疫調節、抗氧化、抗腫瘤、抗炎抑菌等多種藥理作用[20]。Zhu 等[21]近期的研究表明，靈芝酸 A 可以通過抑制高脂高膽固醇飲食誘導的肝臟氧化應激和內質網應激反應，來改善 C57BL/6J 小鼠非酒精性脂肪性肝炎模型的肝臟炎癥和纖維化。黃芩苷是從黃芩中提取的一種黃酮類化合物，具有抑菌抗炎、利膽、利尿、抗過敏及降壓等作用[22]。艾正琳等[23]的研究顯示，黃芩苷能夠減輕非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝臟脂肪變性的程度，通過增加谷胱甘肽還原酶和超氧化物歧化酶的活性，減少炎癥因子 TNF-α、IL-1β和 IL-6 的產生以緩解肝臟的炎癥。刺槐黃素又稱為金合歡素和刺槐素，是一種天然黃酮類物質，具有抗炎抑菌、抗腫瘤、抗病毒和抗肥胖等多種藥理活性[24-25]。甘璐等[25]最近發現刺槐黃素能夠激活 PPARG/核因子κB 通路，改善高糖高脂應激導致的血管內皮細胞功能失調。
目前普遍認為 NAFLD 的發生、進展與炎癥反應、氧化應激、免疫反應以及胰島素抵抗等導致的肝臟脂肪變性與脂質沉積密切相關[26-27]。本研究中，舒肝寧注射液治療 NAFLD 潛在靶點的蛋白相互作用網絡拓撲分析顯示，AKT1、PPARA、PPARG、SREBF1、IL-6 和 MMP-9 等可能是舒肝寧注射液治療 NAFLD 的關鍵作用靶點；進一步通過 KEGG 通路富集分析發現，舒肝寧注射液可能主要是通過調控脂質與動脈粥樣硬化通路、NAFLD 通路和胰島素抵抗通路對 NAFLD 發揮直接或間接治療作用。AKT1 是磷脂酰肌醇 3 激酶/Akt 信號通路中的關鍵蛋白[28]，而磷脂酰肌醇 3 激酶/Akt 信號通路是傳導胰島素信息的主要通路，能夠通過調控胰島素水平參與體內的糖脂代謝，影響肝臟脂質穩態平衡，進而影響 NAFLD 的發生及進展[29]。PPARA、PPARG 均為核受體超家族成員，正常情況下它們在肝臟組織中高表達，廣泛參與肝臟的脂質代謝、氧化應激以及炎癥反應等多種生理病理活動[30]。例如，PPARA 可激活法尼醇 X 受體增加脂肪酸氧化和降低甘油三脂的合成，減少肝臟組織中的脂質沉積[30-31]。SREBF1 作為轉錄因子參與調控膽固醇合成，其表觀調控異常可能導致膽固醇合成增加，影響膽固醇和脂質代謝，進而導致高血脂的發生[32]。IL-6 是一種關鍵的多功能炎癥細胞因子，對肝臟炎癥反應有促進作用，也能促進肝臟再生并保護肝臟免受各種損害[33]。一項 Meta 分析表明，IL-6、IL-1β、TNF-α、C 反應蛋白和細胞間黏附分子-1 水平的增加與 NAFLD 風險增加顯著相關[34]。MMP-9 是基質金屬蛋白酶家族中分子量最大的酶，能夠通過特異性降解Ⅳ型膠原，阻止膠原在肝臟組織中的沉積，減少纖維化形成，促進炎性細胞局部浸潤并影響細胞與基質的相互作用[35]。本研究的分子對接結果顯示，黃芩苷與 IL-6 以及黃芩苷、刺槐黃素與 MMP-9 具有較高的親和力，說明舒肝寧注射液可能通過黃芩苷、刺槐黃素作用于 IL-6 和 MMP-9，對 NAFLD 發揮主要治療作用。
綜上所述，本研究基于網絡藥理學與分子對接技術，發現舒肝寧注射液可能通過多成分、多靶點和多通路的方式對 NAFLD 發揮治療作用，具體而言，舒肝寧注射液可能通過黃芩苷、刺槐黃素、谷甾醇、β-谷甾醇和靈芝酸 A 等主要活性成分作用于 AKT1、PPARA、PPARG、SREBF1、IL-6 和 MMP-9 等關鍵靶點，并參與調控脂質與動脈粥樣硬化、NAFLD 和胰島素抵抗等通路，從而對 NAFLD 發揮治療作用，該結果能夠為后續深入調查其作用機制和臨床推廣應用提供理論依據和證據支持。然而，與其他同類研究[7, 36]類似，本研究尚存在一定的局限性，即研究結果缺少基礎實驗的驗證，故上述結果尚需通過開展實驗研究進行驗證。由于本研究發現的作用靶點和機制通路較多，未來尚需進一步對其主要作用機制進行更加深入的研究和驗證。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD）是目前全球最常見的慢性肝病，其患病率約為 32.4%[1-2]。NAFLD 疾病譜包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎及相關的肝硬化，部分患者可能發展為肝細胞癌[1-2]。除美國食品藥品監督管理局近期批準的瑞美替羅（resmetirom）外，該病尚無其他特效治療藥物，故目前主要的治療手段仍是改變生活方式、使用胰島素增敏劑以及緩解肝臟炎癥與纖維化等對癥藥物[1, 3]。中草藥因多成分、多靶點、多通路的特性，在治療 NAFLD 及其相關并發癥方面備受關注[4]。舒肝寧注射液基于中醫經典方劑“茵陳蒿湯”研發，含有茵陳、梔子、板藍根、靈芝等中藥提取物和黃芩苷，具有清熱解毒、利濕退黃、益氣扶正、保肝護肝的功效，臨床上常用于治療急、慢性病毒性肝炎[5]。作為一門新興的交叉學科研究方法，網絡藥理學近年來已被廣泛應用于研究各種中藥方劑的作用機制[6-8]。因此，為了探索舒肝寧注射液治療 NAFLD 的分子機制，并為其臨床應用提供證據支持，本研究利用網絡藥理學和分子對接技術，分析與探討了舒肝寧注射液治療 NAFLD 的關鍵活性成分與潛在作用機制。
1 資料與方法
1.1 舒肝寧注射液的活性成分信息收集
2024 年 5 月 23 日—28 日 在 TCMSP 中藥系統藥理學平臺[8]檢索“茵陳”“梔子”“板藍根”“靈芝”和“黃芩苷”，收集舒肝寧注射液的活性成分信息。活性成分的篩選標準為口服生物利用度≥30%和類藥性≥0.18。同時，通過閱讀相關文獻對篩選結果進行補充，確保盡可能全面地納入相關活性成分[7]。
1.2 活性成分的作用靶點及疾病靶點信息收集
利用收集到的活性成分名稱分別檢索 TCMSID 數據庫[9]和 STITCH 5.0 數據庫（物種設定為“Homo sapiens”）[10]，獲取活性成分的相關作用靶點。將 TCMSID 數據庫檢索結果中“SwissTargetPrediction”部分的靶點與 STITCH 數據庫中獲得的靶點取并集，作為舒肝寧注射液活性成分的潛在作用靶點。此外，利用“Non-alcoholic Fatty Liver Disease”檢索 DisGeNET 數據庫[11]，以收集與 NAFLD 相關的疾病靶點。
1.3 舒肝寧注射液治療 NAFLD 的靶點及蛋白相互作用網絡分析
使用 Venny 2.1 在線工具繪制韋恩圖，將舒肝寧注射液主要活性成分的作用靶點與 NAFLD 相關靶點取交集得到的共有靶點作為潛在作用靶點。借助 UniProt 數據庫對靶點名稱進行校準和確認。隨后，將作用靶點上傳至 STRING 數據庫（物種設定為“Homo sapiens”），建立舒肝寧注射液治療 NAFLD 靶點的蛋白相互作用網絡。下載 tsv 格式數據并導入 Cytoscape 3.9.1 進行網絡拓撲結構分析，利用“Analyze Network”功能統計并分析網絡的拓撲參數[12]。
1.4 核心作用靶點的篩選及其基因富集分析
使用 Cytoscape 的 cytoHubba 插件基于最大團中心性、度中心性和中介中心性這 3 種算法分別篩選排名前 10 位的作用靶點，將篩選結果取并集作為核心作用靶點。隨后，為進一步探究舒肝寧注射液治療 NAFLD 的潛在分子作用機制，將核心作用靶點的基因上傳至 DAVID 數據庫進行基因本體（gene ontology, GO）和京都基因與基因組數據庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路富集分析，并使用R軟件可視化錯誤發現率最小的通路。
1.5 “中藥-成分-靶點-疾病”網絡的構建
使用 Excel 2019 整理中藥、活性成分、核心作用靶點和疾病的網絡關系數據，導入 Cytoscape 3.9.1 進行網絡可視化和拓撲結構分析，構建“中藥-成分-靶點-疾病”多層次網絡，直觀展示舒肝寧注射液治療 NAFLD 的潛在分子作用機制。
1.6 關鍵成分與核心作用靶蛋白的分子對接
首先，構建“核心靶點-活性成分”網絡，并利用 cytoHubba 插件分析得到度中心性算法評分排名前 5 位的活性成分，作為關鍵活性成分；然后，從 TCMSP 數據庫中獲取關鍵活性成分的 mol2 格式文件，同時通過靶點名稱檢索 PDB 數據庫獲取靶點蛋白的 PDB 格式文件，選擇標準為分辨率低、近年發表且期刊影響因子較高；最后，利用 CB Dock2 在線平臺[13]基于“structure-based blind docking”方法對 5 個關鍵活性成分與核心作用靶點蛋白進行對接分析并計算 Vina 評分，以判斷它們之間的親和力（負值評分的絕對值越大表明二者之間的親和力越高）。
2 結果
2.1 舒肝寧注射液的主要活性成分及作用靶點
共獲得舒肝寧注射液的 140 個主要活性成分，將其編號為 C1～C140，主要包括尿苷（C1）、色胺酮（C2）、山奈酚（C34）、綠原酸（C98）、β-谷甾醇（C103）和黃芩苷（C104）等。
2.2 舒肝寧注射液治療 NAFLD 的潛在靶點及核心作用靶點
通過 TCMSID 和 STITCH 數據庫得到舒肝寧注射液 140 個活性成分的 486 個潛在作用靶點，檢索 DisGeNET 數據庫得到 1058 個 NAFLD 相關靶點。利用韋恩圖取交集后得到舒肝寧注射液治療 NAFLD 的 154 個潛在作用靶點。將這 154 個作用靶點上傳至 STRING 數據庫構建蛋白相互作用網絡，網絡圖中共有 154 個節點和 2556 條邊，節點平均度值為 33.20，網絡密度為 0.22。利用 cytoHubba 插件基于最大團中心性、度中心性和中介中心性 3 種算法篩選各自排名前 10 位的作用靶點，取并集得到 16 個核心作用靶點，分別是蛋白激酶 B1 即 Akt 激酶 1（AKT1）、胱天蛋白酶 3（caspase-3, CASP3）、表皮生長因子受體、雌激素受體 1、缺氧誘導因子 1α、熱休克蛋白 90α家族 A 類成員 1、白細胞介素（interleukin, IL）-6、轉錄因子 Jun（JUN）、基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9, MMP-9）、過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator-activated receptor alpha, PPARA）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARG）、甾醇調節元件結合蛋白 1（sterol regulatory element-binding protein 1, SREBF1）、信號轉導與轉錄激活因子 1、信號轉導與轉錄激活因子 3（signal transducer and activator of transcription 3, STAT3）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor, TNF）和細胞腫瘤抗原 p53。
2.3 核心作用靶點的 GO 和 KEGG 通路富集分析
使用 DAVID 數據庫對 16 個核心作用靶點的富集分析顯示，生物學過程共富集到 179 個條目，主要涉及初級轉錄物的轉錄調控、RNA 聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄調控、對外源性刺激的反應、平滑肌細胞增殖的正向調控、凋亡過程的負向調控和炎癥細胞因子的正向調控等。細胞組分共富集到 13 個條目，主要涉及大分子復合物、染色質、RNA 聚合酶Ⅱ轉錄因子復合體、核質、核仁和常染色質等。分子功能共富集到 48 個條目，主要涉及 DNA 結合轉錄因子活性、酶結合、一氧化氮合酶調節劑活性、轉錄激活因子活性和轉錄輔激活因子結合等。KEGG 分析共富集到 99 條通路，錯誤發現率最小的 25 條通路主要涉及癌癥、脂質與動脈粥樣硬化、乙肝、IL-17 信號通路、NAFLD 和胰島素抵抗等通路；進一步分析發現 SREBF1、IL-6、JUN、CASP3、AKT1、PPARG、PPARA 和 TNF 這 8 個核心基因富集在 NAFLD 通路中，而 SREBF1、IL-6、STAT3、AKT1、PPARA 和 TNF 這 6 個核心基因富集在胰島素抵抗通路中。
2.4 “中藥-成分-靶點-疾病”多層次網絡的構建
“中藥-成分-靶點-疾病”的可視化網絡見圖1。圖中共有 102 個節點，包括 80 個活性成分、16 個核心作用靶點、5 個中藥和 1 個疾病，共 208 條邊。節點的平均度值為 4.08，網絡密度為 0.04。
2.5 關鍵活性成分與核心作用靶點的分子對接結果
篩選出的度中心性算法評分排名前 5 位的活性成分（關鍵活性成分）分別是谷甾醇（C9）、靈芝酸 A（C72）、β-谷甾醇（C103）、黃芩苷（C104）和刺槐黃素（C109）。使用 CB Dock2 在線平臺對這些成分和從 PDB 數據庫獲取的核心靶點蛋白實施分子對接時，由于未檢索到 SREBF1 對應的蛋白結構，僅對 5 個成分和 15 個靶點蛋白分別進行了對接。對接的親和力 Vina 評分結果見圖2。從圖中可以看出，各活性成分與靶點蛋白的親和力均較高，其中黃芩苷與 MMP-9 的親和力最高，其次為黃芩苷與 IL-6，排第 3 位的是刺槐黃素與 MMP-9。此外，整體來看，黃芩苷與各靶點蛋白的親和力較其他活性成分更高。
3 討論
NAFLD 屬于中醫學“肝癖”范疇，已成為當前全球最常見的慢性肝病，也是心血管疾病和慢性腎臟疾病的重要危險因素[14]。既往研究顯示，舒肝寧注射液聯合復方甘草酸苷可有效改善非酒精性脂肪性肝炎患者的脂代謝和肝功能，同時具有良好的臨床安全性[15]。而高文等[16]使用組織工程脂肪肝模型調查了舒肝寧注射液的抗氧化應激機制，結果顯示，舒肝寧注射液減少了組織工程脂肪肝中的丙二醛和活性氧水平，從而抑制氧化應激，減輕了游離脂肪酸誘導的脂肪肝中肝細胞凋亡和線粒體損傷。然而，有關舒肝寧注射液治療 NAFLD 的效果及相關作用機制的研究證據仍然不足[5]，因此，為夯實證據基礎和填補研究空白，本研究利用網絡藥理學方法和分子對接技術探討了舒肝寧注射液治療 NAFLD 的作用機制。基于公共數據庫和有關文獻共發現了舒肝寧注射液的 140 個主要活性成分，經進一步篩選和分析發現，谷甾醇、β-谷甾醇、靈芝酸 A、黃芩苷和刺槐黃素可能是舒肝寧注射液治療 NAFLD 的主要活性成分。
谷甾醇是一種植物甾醇，研究表明其具有抗炎、抗氧化、抗菌、降脂、抗腫瘤等多種作用，能夠增強機體免疫系統、抗動脈粥樣硬化、抗抑郁及抗衰老等[17]。近期，Zhang 等[18]基于高脂飲食誘導的 NAFLD 斑馬魚模型，發現β-谷甾醇能夠通過調節脂質代謝和信號轉導，抑制脂肪生成和脂質儲存，減少斑馬魚模型的脂質累積。而周海玥等[19]的研究表明，豆甾醇與β-谷甾醇能夠改善 NAFLD 肝細胞脂肪變性程度，減輕氧化應激反應。靈芝酸 A 是一種三萜類物質，是靈芝的主要成分之一，具有免疫調節、抗氧化、抗腫瘤、抗炎抑菌等多種藥理作用[20]。Zhu 等[21]近期的研究表明，靈芝酸 A 可以通過抑制高脂高膽固醇飲食誘導的肝臟氧化應激和內質網應激反應，來改善 C57BL/6J 小鼠非酒精性脂肪性肝炎模型的肝臟炎癥和纖維化。黃芩苷是從黃芩中提取的一種黃酮類化合物，具有抑菌抗炎、利膽、利尿、抗過敏及降壓等作用[22]。艾正琳等[23]的研究顯示，黃芩苷能夠減輕非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝臟脂肪變性的程度，通過增加谷胱甘肽還原酶和超氧化物歧化酶的活性，減少炎癥因子 TNF-α、IL-1β和 IL-6 的產生以緩解肝臟的炎癥。刺槐黃素又稱為金合歡素和刺槐素，是一種天然黃酮類物質，具有抗炎抑菌、抗腫瘤、抗病毒和抗肥胖等多種藥理活性[24-25]。甘璐等[25]最近發現刺槐黃素能夠激活 PPARG/核因子κB 通路，改善高糖高脂應激導致的血管內皮細胞功能失調。
目前普遍認為 NAFLD 的發生、進展與炎癥反應、氧化應激、免疫反應以及胰島素抵抗等導致的肝臟脂肪變性與脂質沉積密切相關[26-27]。本研究中，舒肝寧注射液治療 NAFLD 潛在靶點的蛋白相互作用網絡拓撲分析顯示，AKT1、PPARA、PPARG、SREBF1、IL-6 和 MMP-9 等可能是舒肝寧注射液治療 NAFLD 的關鍵作用靶點；進一步通過 KEGG 通路富集分析發現，舒肝寧注射液可能主要是通過調控脂質與動脈粥樣硬化通路、NAFLD 通路和胰島素抵抗通路對 NAFLD 發揮直接或間接治療作用。AKT1 是磷脂酰肌醇 3 激酶/Akt 信號通路中的關鍵蛋白[28]，而磷脂酰肌醇 3 激酶/Akt 信號通路是傳導胰島素信息的主要通路，能夠通過調控胰島素水平參與體內的糖脂代謝，影響肝臟脂質穩態平衡，進而影響 NAFLD 的發生及進展[29]。PPARA、PPARG 均為核受體超家族成員，正常情況下它們在肝臟組織中高表達，廣泛參與肝臟的脂質代謝、氧化應激以及炎癥反應等多種生理病理活動[30]。例如，PPARA 可激活法尼醇 X 受體增加脂肪酸氧化和降低甘油三脂的合成，減少肝臟組織中的脂質沉積[30-31]。SREBF1 作為轉錄因子參與調控膽固醇合成，其表觀調控異常可能導致膽固醇合成增加，影響膽固醇和脂質代謝，進而導致高血脂的發生[32]。IL-6 是一種關鍵的多功能炎癥細胞因子，對肝臟炎癥反應有促進作用，也能促進肝臟再生并保護肝臟免受各種損害[33]。一項 Meta 分析表明，IL-6、IL-1β、TNF-α、C 反應蛋白和細胞間黏附分子-1 水平的增加與 NAFLD 風險增加顯著相關[34]。MMP-9 是基質金屬蛋白酶家族中分子量最大的酶，能夠通過特異性降解Ⅳ型膠原，阻止膠原在肝臟組織中的沉積，減少纖維化形成，促進炎性細胞局部浸潤并影響細胞與基質的相互作用[35]。本研究的分子對接結果顯示，黃芩苷與 IL-6 以及黃芩苷、刺槐黃素與 MMP-9 具有較高的親和力，說明舒肝寧注射液可能通過黃芩苷、刺槐黃素作用于 IL-6 和 MMP-9，對 NAFLD 發揮主要治療作用。
綜上所述，本研究基于網絡藥理學與分子對接技術，發現舒肝寧注射液可能通過多成分、多靶點和多通路的方式對 NAFLD 發揮治療作用，具體而言，舒肝寧注射液可能通過黃芩苷、刺槐黃素、谷甾醇、β-谷甾醇和靈芝酸 A 等主要活性成分作用于 AKT1、PPARA、PPARG、SREBF1、IL-6 和 MMP-9 等關鍵靶點，并參與調控脂質與動脈粥樣硬化、NAFLD 和胰島素抵抗等通路，從而對 NAFLD 發揮治療作用，該結果能夠為后續深入調查其作用機制和臨床推廣應用提供理論依據和證據支持。然而，與其他同類研究[7, 36]類似，本研究尚存在一定的局限性，即研究結果缺少基礎實驗的驗證，故上述結果尚需通過開展實驗研究進行驗證。由于本研究發現的作用靶點和機制通路較多，未來尚需進一步對其主要作用機制進行更加深入的研究和驗證。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。