引用本文： 于倩, 趙福榮, 賈興旺, 王爽, 李瑩, 劉馨. 基于膽汁酸譜的不穩定型心絞痛與急性心肌梗死診斷模型研究. 華西醫學, 2024, 39(9): 1406-1412. doi: 10.7507/1002-0179.202407283 復制
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冠狀動脈疾病可引起急性心力衰竭和心源性休克等嚴重并發癥，全球每年估計有 814 萬人（16.8%）因冠狀動脈疾病死亡[1-3]。其中不穩定型心絞痛（unstable angina, UA）是冠狀動脈部分阻塞，導致心肌缺血但無壞死；急性心肌梗死（acute myocardial infarction, AMI）是冠狀動脈完全阻塞，導致心肌壞死。UA 是急性冠脈綜合征的一個不穩定階段，可能預示著即將發生 AMI。早期識別和處理 UA 可以阻止其進展為 AMI。臨床上主要通過胸痛和異常心電圖來診斷 AMI，而 UA 患者會出現類似的表現，區分 AMI 和 UA 具有挑戰性。近幾十年來，心肌損傷的生物標志物已用于診斷 AMI。Karmen 等[4]首次報道了 AMI 患者中天冬氨酸轉氨酶水平顯著升高，可用作診斷 AMI。隨著研究的深入，肌酸激酶和乳酸脫氫酶被用于 AMI 的早期診斷[5]。然而，目前臨床上常用的心肌損傷標志物肌鈣蛋白對診斷 AMI 的特異性和敏感性高于肌酸激酶和乳酸脫氫酶[6]，但肌鈣蛋白只在心肌損傷后的急性期可檢出，因此我們致力于尋找一種可在心肌細胞損傷前診斷 AMI 的生物標志物。研究表明，血清總膽汁酸水平與急性冠脈綜合征患者尤其是 AMI 患者的冠狀動脈病變、心肌損傷的嚴重程度高度相關[7-8]。某些膽汁酸可以通過抑制泡沫細胞的形成來維持膽固醇穩態，從而抑制動脈粥樣硬化[9]，這些提示膽汁酸可能成為一種區分 UA 和 AMI 的生物標志物。本研究旨在通過系統分析 UA 和 AMI 患者的血清膽汁酸譜，探索其作為生物標志物的潛力，并構建相應的診斷模型，為 UA 和 AMI 的早期診斷提供新的思路和方法，進而改善患者的預后和治療效果。
1 對象與方法
1.1 研究對象
連續隨機選取 2023 年 8 月—2024 年 2 月在葫蘆島市中心醫院連山院區和龍灣院區心內科就診的 180 例急性冠脈綜合征患者，其中 UA 患者 117 例，AMI 患者 63 例。本研究已獲得葫蘆島市中心醫院倫理委員會批準（批準號：202319），所有入組研究對象均簽署了知情同意書。
1.1.1 納入標準
因胸部不適或胸痛入院，有心血管危險因素、心電圖缺血性改變或心肌酶升高，需要冠狀動脈 CT 或冠狀動脈造影術來確認診斷。
1.1.2 排除標準
① 患有自身免疫性疾病、惡性腫瘤、血管疾病、肝臟疾病、腎臟疾病、甲狀腺疾病、血液傳播疾病或嚴重感染性疾病；② 6 個月內曾進行外科手術或遭遇創傷；③ 嚴重心力衰竭伴左心室射血分數<20%。
1.1.3 診斷標準
急性冠脈綜合征：符合我國《急性冠脈綜合征急診快速診療指南》中的診斷標準[10]。UA：具有心絞痛史（1 個月內），在靜息或輕微活動時出現不規則心絞痛，但肌鈣蛋白未見升高[11]。AMI：表現為缺血性胸痛、心肌酶升高和肌鈣蛋白水平升高，以及心電圖 ST-T 改變。
1.2 試劑與儀器
1.2.1 試劑
膽汁酸標準品：膽酸（純度 98%）、鵝脫氧膽酸（純度 97%）、脫氧膽酸（純度 97%）、石膽酸（純度 97%）、熊脫氧膽酸（純度 99%）、甘氨膽酸（純度 97%）、甘氨鵝脫氧膽酸（純度 97%）、甘氨脫氧膽酸（純度 97%）、甘氨熊脫氧膽酸（純度 96%）、牛磺膽酸（純度 95%）、牛磺脫氧膽酸（純度 95%）、牛磺石膽酸（純度 95%）、牛磺鵝脫氧膽酸（純度 95%）、牛磺熊脫氧膽酸（純度 95%）購自美國 Sigma 公司，甘氨石膽酸（純度 97%）購自加拿大 Trc 公司。內標標準品：氘代牛磺石膽酸、氘代膽酸、氘代牛磺熊脫氧膽酸購自美國劍橋同位素實驗室。甲醇、乙腈和碳酸氫銨均為色譜級試劑，分別購自德國 Merck 公司、美國 Fisher Scientific 公司和美國 Fluka 公司，蒸餾水來自中國香港屈臣氏公司。
1.2.2 儀器
主要包括 AB Sciex 4000 Q TRAP 質譜儀（美國 AB SCIEX 公司）、LC-30AD 高效液相色譜儀（日本 Shimadzu 公司）、Analyst1.6 software 分析軟件（美國 AB SCIEX 公司）、H1750R 高速冷凍離心機（中國湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司），S0200-230V-EU 多管渦旋振蕩器（美國 Labnet 公司）、XB220A 電子天平（瑞士 Precisa Gravimetrics 公司）、MD200-1 氮吹儀（中國 Allsheng 公司）。
1.3 樣本采集
收集所有患者疾病確診后 48 h 內的血清樣本，抽取其空腹 12～14 h 后的前臂靜脈血 2～3 mL 至含有促凝劑的真空采血管中，顛倒混勻，室溫靜置 1 h 后以半徑 13.5 cm、轉速
1.4 血清樣本前處理
取血清樣品 150 μL 至 1.5 mL 離心管中，加入同位素標記內標工作液 10 μL，渦旋震蕩 30 s，加入 600 μL 甲醇進行蛋白沉淀，渦旋震蕩 5 min，于 4℃環境中以半徑 13.5 cm、轉速
1.5 檢測方法
色譜條件：采用 Acquity UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm，美國沃特世科技有限公司）色譜柱進行膽汁酸亞型的色譜分離，流動相 A 為 5 mmol/L 碳酸氫銨水溶液，流動相 B 為甲醇-乙腈（體積比 7∶3）溶液，梯度洗脫（流動相 B 起始比例為 50%，0.70 min 升至 65%，4.20 min 升至 85%，4.21 min 降至 50%，并維持至 5.20 min），流速為 0.8 mL/min，柱溫為 40℃，進樣器溫度為 10℃。
質譜條件：電噴霧離子源，多反應離子監測，負離子掃描模式，氣簾氣壓力 10 psi（1 psi=6.895 kPa），碰撞氣壓力 9 psi，電噴霧壓力?
表1
15 種膽汁酸及同位素內標的優化質譜參數
1.6 統計學方法
使用 SIMCA 16.0.2 軟件進行正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA），計算 R2X、R2Y 和 Q2 值評估模型的有效性，并進行 200 次置換檢驗評估模型的可靠性。選擇變量重要性投影（variable importance in projection, VIP）值>1 的變量用于進一步的單變量分析。使用 SPSS 25.0 軟件進行單變量分析，通過 Shapiro-Wilk 檢驗評估連續數據的正態性。正態分布數據以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；非正態分布數據以中位數（下四分位數，上四分位數）表示，兩組間比較采用 Mann-Whitney U 檢驗。計數資料以頻數形式表示，組間比較采用 χ2 檢驗或 Fisher 確切概率法。采用 VIP 值>1 且 P<0.05 的標準篩選膽汁酸差異標志物。將篩選出來的膽汁酸差異標志物與臨床基線資料中 P<0.05 的指標共同納入多因素 logistic 逐步回歸分析，并繪制受試者操作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲線評估模型的診斷價值。采用 R 4.3.2 軟件中 boot-strap 法重復抽樣
2 結果
2.1 UA 與 AMI 患者臨床基線資料
本研究納入 180 例急性冠脈綜合征患者，其中 117 例診斷為 UA，63 例診斷為 AMI。兩組患者的性別、年齡、舒張壓、身高、體重、體質量指數、空腹葡萄糖、甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、極低密度脂蛋白膽固醇、尿酸、尿素、肌酐差異均無統計學意義（P>0.05），兩組患者的收縮壓、低密度脂蛋白膽固醇、丙氨酸轉氨酶、天冬氨酸轉氨酶、總膽汁酸、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶 MB 差異有統計學意義（P<0.05），且 AMI 患者的肌酸激酶、肌酸激酶同工酶 MB 高于 UA 患者。見表2。
表2
UA 與 AMI 患者臨床基線資料比較
2.2 血清膽汁酸代謝輪廓
采用 OPLS-DA 模型對 UA 患者和 AMI 患者的血清膽汁酸代謝輪廓進行判別分析，得到模型得分散點圖（圖1a），結果顯示，AMI 組與 UA 組雖有部分重疊，但仍然呈明顯的分離趨勢，AMI 組傾向于向左聚集，而 UA 組傾向于向右聚集，總體分離良好，擬合度 R2Y=0.614 及預測度 Q2=0.585。200 次置換檢驗顯示 R2=（0.0，0.031），Q2=（0.0，?0.186）（圖1b），表明模型沒有過擬合，UA 組與 AMI 組膽汁酸譜代謝輪廓存在明顯的差異。
圖1
通過靶向代謝組學對膽汁酸譜的數據分析
a. 正交偏最小二乘法判別分析得分散點圖，不同顏色和形狀的散點代表不同的分組，包圍散點的橢圓表示 95% 置信區間；b. 200 次置換檢驗。UA：不穩定型心絞痛；AMI：急性心肌梗死
2.3 UA 組與 AMI 組差異代謝物篩選
預先選擇 VIP 值來確定 OPLS-DA 模型的顯著區分指標，VIP>1 的參數被認為對 UA 組和 AMI 組之間的膽汁酸代謝產物譜貢獻最大，并采用 Mann-Whitney U 檢驗驗證差異膽汁酸代謝物的統計學意義，經過篩選，確定 VIP>1 且 P<0.05 的膽汁酸差異代謝物有甘氨脫氧膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸、甘氨膽酸、牛磺脫氧膽酸。見表3。
表3
UA 與 AMI 患者 15 種膽汁酸的比較
2.4 建立二分類 logistic 回歸分析
選擇上述 VIP>1 且 P<0.05 的膽汁酸差異代謝物指標及臨床基線資料中 P<0.05 的變量進行多因素模型研究，均作為連續性變量一同納入，并通過二分類 logistic 向后逐步回歸進行分析（表4），最終確定 3 種膽汁酸指標（甘氨鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸和牛磺脫氧膽酸）與 3 種臨床常用生化檢測指標（天冬氨酸轉氨酶、肌酸激酶和總膽汁酸）可用于區分 UA 和 AMI。Hosmer-Lemeshow 擬合優度檢驗結果為 χ2=1.629，P=0.99，表明模型沒有出現過擬合，診斷模型具有良好的校準度。
表4
區分 UA 與 AMI 的多因素 logistic 回歸分析
2.5 3 種膽汁酸指標區分 UA 與 AMI 的診斷價值
ROC 曲線分析結果顯示，甘氨鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸和牛磺脫氧膽酸曲線下面積（area under the curve, AUC）分別為 0.861、0.790 和 0.799。基于甘氨鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸和牛磺脫氧膽酸進行二分類 logistic 逐步回歸構建模型 1，基于臨床常用生化檢測指標（天冬氨酸轉氨酶、肌酸激酶和總膽汁酸）和膽汁酸代謝標志物（甘氨鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸和牛磺脫氧膽酸）進行二分類 logistic 逐步回歸構建模型 2，基于臨床常用生化檢測指標天冬氨酸轉氨酶、肌酸激酶和總膽汁酸進行二分類 logistic 逐步回歸構建模型 3。模型 1、模型 2 和模型 3 的 AUC 分別為 0.965、0.986 和 0.884。結果表明，將 3 種膽汁酸標志物與 3 種臨床常用生化檢測指標結合診斷效能更具有優勢。詳見表5 和圖2a。決策曲線分析顯示，結合潛在生物標志物與臨床常用生化檢測指標的模型 2 在一定范圍內具有較高的凈收益，尤其是在閾值概率為 0.1～0.8 時，其凈收益高于“全部患者都進行治療”（All）和“無患者進行治療”（None）的情境，進一步證明了其在臨床應用中的價值（圖2b）。
表5
受試者操作曲線分析
圖2
各模型區分 UA 與 AMI 的受試者操作特征曲線和決策曲線
a. 受試者操作特征曲線；b. 決策曲線分析，深紅色曲線代表模型 2 的表現（兩條淺紅色曲線為其 95% 置信區間），顯示隨著閾值增加，凈收益逐漸下降，但整體保持較高水平，灰色線作為基準，顯示所有人都接受（All）或不接受（None）干預時的凈收益
3 討論
本研究通過分析 UA 和 AMI 患者的血清膽汁酸譜，識別出 3 種潛在的生物標志物，包括甘氨鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸和牛磺脫氧膽酸。為了提高心肌梗死的診斷準確性，我們構建了一個二分類 logistic 逐步回歸的聯合診斷模型，結果顯示這 3 種膽汁酸代謝標志物的聯合診斷 AUC 達到 0.965，表現出較好的診斷能力。聯合臨床常用生化指標（天冬氨酸轉氨酶、肌酸激酶和總膽汁酸）和這 3 種膽汁酸標志物后，AUC 進一步提高至 0.986。這表明，聯合膽汁酸生物標志物與這 3 種臨床常用生化指標在區分 UA 與 AMI 方面有意義。
已有研究表明，膽汁酸通過抗炎作用和改善膽固醇代謝在心血管疾病中具有保護作用[12-13]。本研究進一步確認了膽汁酸在 UA 和 AMI 患者中的表達差異，強調了膽汁酸代謝在急性冠脈綜合征中的重要性。具體而言，本研究發現 AMI 患者中脫氧膽酸含量顯著低于 UA 患者，這表明脫氧膽酸在 AMI 中可能具有保護作用。脫氧膽酸是由腸道細菌產生的次級膽汁酸[14]，已被證明是膽汁酸 G 蛋白偶聯受體 5（Takeda G-protein-coupled receptor 5, TGR5）的有效激活劑之一，能夠通過抗炎機制改善心肌梗死后的心臟功能。激活脫氧膽酸-TGR5 信號通路可以減輕炎癥并改善梗死后的心臟功能，從而發揮保護作用[15]。此外，法尼醇 X 受體（farnesoid X receptor, FXR）和 TGR5 的激活也顯示出保護作用，能減少動脈粥樣硬化的發生[16]。Wang 等[17]研究發現，TGR5 通過調節 CD4+ T 細胞功能及其在心臟中分布，在心肌梗死中發揮保護作用。因此，脫氧膽酸通過調節膽汁酸代謝和相關信號轉導以改善炎癥反應的策略，對心肌梗死患者具有重要的臨床意義。與此一致，已有報道指出甘氨鵝脫氧膽酸及牛磺脫氧膽酸在 AMI 患者中的水平降低[15]。早期研究發現，冠狀動脈疾病患者的糞便膽汁酸排泄量低于無冠狀動脈疾病患者[18]。Charach 等[19]通過 20 年隨訪研究發現膽汁酸排泄減少是冠狀動脈疾病的危險因素。最新研究表明，空腹血清總膽汁酸水平與冠狀動脈疾病、心肌梗死以及冠狀動脈病變嚴重程度有關[8]。
傳統的急性冠脈綜合征診斷方法，如心電圖、心臟標志物、負荷試驗和冠狀動脈造影[20-21]，雖然有效，但存在侵入性和高成本等局限性[22]。本研究構建的聯合診斷模型展現出優異的診斷能力[23]，AUC 值達到 0.986，表明其在提高診斷準確性和評估患者風險方面具有巨大潛力。這一模型通過結合膽汁酸和臨床常用生化檢測指標，可更早識別高風險患者，從而采取更積極的預防措施，降低心肌梗死發生率，為臨床決策提供了可靠依據。
綜上所述，本研究通過聯合 3 種膽汁酸標志物（甘氨鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸和牛磺脫氧膽酸）和 3 種臨床常用生化檢測指標（天冬氨酸轉氨酶、肌酸激酶和總膽汁酸），構建了一個有效的診斷模型，能夠準確區分 UA 和 AMI，為膽汁酸在心血管疾病診斷中的潛在應用提供了新的依據，可能為早期識別 AMI 高風險患者提供重要的臨床幫助。未來研究需擴大樣本量，并進行外部驗證，以評估模型在更大人群中的廣泛適用性。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
冠狀動脈疾病可引起急性心力衰竭和心源性休克等嚴重并發癥，全球每年估計有 814 萬人（16.8%）因冠狀動脈疾病死亡[1-3]。其中不穩定型心絞痛（unstable angina, UA）是冠狀動脈部分阻塞，導致心肌缺血但無壞死；急性心肌梗死（acute myocardial infarction, AMI）是冠狀動脈完全阻塞，導致心肌壞死。UA 是急性冠脈綜合征的一個不穩定階段，可能預示著即將發生 AMI。早期識別和處理 UA 可以阻止其進展為 AMI。臨床上主要通過胸痛和異常心電圖來診斷 AMI，而 UA 患者會出現類似的表現，區分 AMI 和 UA 具有挑戰性。近幾十年來，心肌損傷的生物標志物已用于診斷 AMI。Karmen 等[4]首次報道了 AMI 患者中天冬氨酸轉氨酶水平顯著升高，可用作診斷 AMI。隨著研究的深入，肌酸激酶和乳酸脫氫酶被用于 AMI 的早期診斷[5]。然而，目前臨床上常用的心肌損傷標志物肌鈣蛋白對診斷 AMI 的特異性和敏感性高于肌酸激酶和乳酸脫氫酶[6]，但肌鈣蛋白只在心肌損傷后的急性期可檢出，因此我們致力于尋找一種可在心肌細胞損傷前診斷 AMI 的生物標志物。研究表明，血清總膽汁酸水平與急性冠脈綜合征患者尤其是 AMI 患者的冠狀動脈病變、心肌損傷的嚴重程度高度相關[7-8]。某些膽汁酸可以通過抑制泡沫細胞的形成來維持膽固醇穩態，從而抑制動脈粥樣硬化[9]，這些提示膽汁酸可能成為一種區分 UA 和 AMI 的生物標志物。本研究旨在通過系統分析 UA 和 AMI 患者的血清膽汁酸譜，探索其作為生物標志物的潛力，并構建相應的診斷模型，為 UA 和 AMI 的早期診斷提供新的思路和方法，進而改善患者的預后和治療效果。
1 對象與方法
1.1 研究對象
連續隨機選取 2023 年 8 月—2024 年 2 月在葫蘆島市中心醫院連山院區和龍灣院區心內科就診的 180 例急性冠脈綜合征患者，其中 UA 患者 117 例，AMI 患者 63 例。本研究已獲得葫蘆島市中心醫院倫理委員會批準（批準號：202319），所有入組研究對象均簽署了知情同意書。
1.1.1 納入標準
因胸部不適或胸痛入院，有心血管危險因素、心電圖缺血性改變或心肌酶升高，需要冠狀動脈 CT 或冠狀動脈造影術來確認診斷。
1.1.2 排除標準
① 患有自身免疫性疾病、惡性腫瘤、血管疾病、肝臟疾病、腎臟疾病、甲狀腺疾病、血液傳播疾病或嚴重感染性疾病；② 6 個月內曾進行外科手術或遭遇創傷；③ 嚴重心力衰竭伴左心室射血分數<20%。
1.1.3 診斷標準
急性冠脈綜合征：符合我國《急性冠脈綜合征急診快速診療指南》中的診斷標準[10]。UA：具有心絞痛史（1 個月內），在靜息或輕微活動時出現不規則心絞痛，但肌鈣蛋白未見升高[11]。AMI：表現為缺血性胸痛、心肌酶升高和肌鈣蛋白水平升高，以及心電圖 ST-T 改變。
1.2 試劑與儀器
1.2.1 試劑
膽汁酸標準品：膽酸（純度 98%）、鵝脫氧膽酸（純度 97%）、脫氧膽酸（純度 97%）、石膽酸（純度 97%）、熊脫氧膽酸（純度 99%）、甘氨膽酸（純度 97%）、甘氨鵝脫氧膽酸（純度 97%）、甘氨脫氧膽酸（純度 97%）、甘氨熊脫氧膽酸（純度 96%）、牛磺膽酸（純度 95%）、牛磺脫氧膽酸（純度 95%）、牛磺石膽酸（純度 95%）、牛磺鵝脫氧膽酸（純度 95%）、牛磺熊脫氧膽酸（純度 95%）購自美國 Sigma 公司，甘氨石膽酸（純度 97%）購自加拿大 Trc 公司。內標標準品：氘代牛磺石膽酸、氘代膽酸、氘代牛磺熊脫氧膽酸購自美國劍橋同位素實驗室。甲醇、乙腈和碳酸氫銨均為色譜級試劑，分別購自德國 Merck 公司、美國 Fisher Scientific 公司和美國 Fluka 公司，蒸餾水來自中國香港屈臣氏公司。
1.2.2 儀器
主要包括 AB Sciex 4000 Q TRAP 質譜儀（美國 AB SCIEX 公司）、LC-30AD 高效液相色譜儀（日本 Shimadzu 公司）、Analyst1.6 software 分析軟件（美國 AB SCIEX 公司）、H1750R 高速冷凍離心機（中國湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司），S0200-230V-EU 多管渦旋振蕩器（美國 Labnet 公司）、XB220A 電子天平（瑞士 Precisa Gravimetrics 公司）、MD200-1 氮吹儀（中國 Allsheng 公司）。
1.3 樣本采集
收集所有患者疾病確診后 48 h 內的血清樣本，抽取其空腹 12～14 h 后的前臂靜脈血 2～3 mL 至含有促凝劑的真空采血管中，顛倒混勻，室溫靜置 1 h 后以半徑 13.5 cm、轉速
1.4 血清樣本前處理
取血清樣品 150 μL 至 1.5 mL 離心管中，加入同位素標記內標工作液 10 μL，渦旋震蕩 30 s，加入 600 μL 甲醇進行蛋白沉淀，渦旋震蕩 5 min，于 4℃環境中以半徑 13.5 cm、轉速
1.5 檢測方法
色譜條件：采用 Acquity UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm，美國沃特世科技有限公司）色譜柱進行膽汁酸亞型的色譜分離，流動相 A 為 5 mmol/L 碳酸氫銨水溶液，流動相 B 為甲醇-乙腈（體積比 7∶3）溶液，梯度洗脫（流動相 B 起始比例為 50%，0.70 min 升至 65%，4.20 min 升至 85%，4.21 min 降至 50%，并維持至 5.20 min），流速為 0.8 mL/min，柱溫為 40℃，進樣器溫度為 10℃。
質譜條件：電噴霧離子源，多反應離子監測，負離子掃描模式，氣簾氣壓力 10 psi（1 psi=6.895 kPa），碰撞氣壓力 9 psi，電噴霧壓力?
表1
15 種膽汁酸及同位素內標的優化質譜參數
1.6 統計學方法
使用 SIMCA 16.0.2 軟件進行正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA），計算 R2X、R2Y 和 Q2 值評估模型的有效性，并進行 200 次置換檢驗評估模型的可靠性。選擇變量重要性投影（variable importance in projection, VIP）值>1 的變量用于進一步的單變量分析。使用 SPSS 25.0 軟件進行單變量分析，通過 Shapiro-Wilk 檢驗評估連續數據的正態性。正態分布數據以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；非正態分布數據以中位數（下四分位數，上四分位數）表示，兩組間比較采用 Mann-Whitney U 檢驗。計數資料以頻數形式表示，組間比較采用 χ2 檢驗或 Fisher 確切概率法。采用 VIP 值>1 且 P<0.05 的標準篩選膽汁酸差異標志物。將篩選出來的膽汁酸差異標志物與臨床基線資料中 P<0.05 的指標共同納入多因素 logistic 逐步回歸分析，并繪制受試者操作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲線評估模型的診斷價值。采用 R 4.3.2 軟件中 boot-strap 法重復抽樣
2 結果
2.1 UA 與 AMI 患者臨床基線資料
本研究納入 180 例急性冠脈綜合征患者，其中 117 例診斷為 UA，63 例診斷為 AMI。兩組患者的性別、年齡、舒張壓、身高、體重、體質量指數、空腹葡萄糖、甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、極低密度脂蛋白膽固醇、尿酸、尿素、肌酐差異均無統計學意義（P>0.05），兩組患者的收縮壓、低密度脂蛋白膽固醇、丙氨酸轉氨酶、天冬氨酸轉氨酶、總膽汁酸、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶 MB 差異有統計學意義（P<0.05），且 AMI 患者的肌酸激酶、肌酸激酶同工酶 MB 高于 UA 患者。見表2。
表2
UA 與 AMI 患者臨床基線資料比較
2.2 血清膽汁酸代謝輪廓
采用 OPLS-DA 模型對 UA 患者和 AMI 患者的血清膽汁酸代謝輪廓進行判別分析，得到模型得分散點圖（圖1a），結果顯示，AMI 組與 UA 組雖有部分重疊，但仍然呈明顯的分離趨勢，AMI 組傾向于向左聚集，而 UA 組傾向于向右聚集，總體分離良好，擬合度 R2Y=0.614 及預測度 Q2=0.585。200 次置換檢驗顯示 R2=（0.0，0.031），Q2=（0.0，?0.186）（圖1b），表明模型沒有過擬合，UA 組與 AMI 組膽汁酸譜代謝輪廓存在明顯的差異。
圖1
通過靶向代謝組學對膽汁酸譜的數據分析
a. 正交偏最小二乘法判別分析得分散點圖，不同顏色和形狀的散點代表不同的分組，包圍散點的橢圓表示 95% 置信區間；b. 200 次置換檢驗。UA：不穩定型心絞痛；AMI：急性心肌梗死
2.3 UA 組與 AMI 組差異代謝物篩選
預先選擇 VIP 值來確定 OPLS-DA 模型的顯著區分指標，VIP>1 的參數被認為對 UA 組和 AMI 組之間的膽汁酸代謝產物譜貢獻最大，并采用 Mann-Whitney U 檢驗驗證差異膽汁酸代謝物的統計學意義，經過篩選，確定 VIP>1 且 P<0.05 的膽汁酸差異代謝物有甘氨脫氧膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸、甘氨膽酸、牛磺脫氧膽酸。見表3。
表3
UA 與 AMI 患者 15 種膽汁酸的比較
2.4 建立二分類 logistic 回歸分析
選擇上述 VIP>1 且 P<0.05 的膽汁酸差異代謝物指標及臨床基線資料中 P<0.05 的變量進行多因素模型研究，均作為連續性變量一同納入，并通過二分類 logistic 向后逐步回歸進行分析（表4），最終確定 3 種膽汁酸指標（甘氨鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸和牛磺脫氧膽酸）與 3 種臨床常用生化檢測指標（天冬氨酸轉氨酶、肌酸激酶和總膽汁酸）可用于區分 UA 和 AMI。Hosmer-Lemeshow 擬合優度檢驗結果為 χ2=1.629，P=0.99，表明模型沒有出現過擬合，診斷模型具有良好的校準度。
表4
區分 UA 與 AMI 的多因素 logistic 回歸分析
2.5 3 種膽汁酸指標區分 UA 與 AMI 的診斷價值
ROC 曲線分析結果顯示，甘氨鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸和牛磺脫氧膽酸曲線下面積（area under the curve, AUC）分別為 0.861、0.790 和 0.799。基于甘氨鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸和牛磺脫氧膽酸進行二分類 logistic 逐步回歸構建模型 1，基于臨床常用生化檢測指標（天冬氨酸轉氨酶、肌酸激酶和總膽汁酸）和膽汁酸代謝標志物（甘氨鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸和牛磺脫氧膽酸）進行二分類 logistic 逐步回歸構建模型 2，基于臨床常用生化檢測指標天冬氨酸轉氨酶、肌酸激酶和總膽汁酸進行二分類 logistic 逐步回歸構建模型 3。模型 1、模型 2 和模型 3 的 AUC 分別為 0.965、0.986 和 0.884。結果表明，將 3 種膽汁酸標志物與 3 種臨床常用生化檢測指標結合診斷效能更具有優勢。詳見表5 和圖2a。決策曲線分析顯示，結合潛在生物標志物與臨床常用生化檢測指標的模型 2 在一定范圍內具有較高的凈收益，尤其是在閾值概率為 0.1～0.8 時，其凈收益高于“全部患者都進行治療”（All）和“無患者進行治療”（None）的情境，進一步證明了其在臨床應用中的價值（圖2b）。
表5
受試者操作曲線分析
圖2
各模型區分 UA 與 AMI 的受試者操作特征曲線和決策曲線
a. 受試者操作特征曲線；b. 決策曲線分析，深紅色曲線代表模型 2 的表現（兩條淺紅色曲線為其 95% 置信區間），顯示隨著閾值增加，凈收益逐漸下降，但整體保持較高水平，灰色線作為基準，顯示所有人都接受（All）或不接受（None）干預時的凈收益
3 討論
本研究通過分析 UA 和 AMI 患者的血清膽汁酸譜，識別出 3 種潛在的生物標志物，包括甘氨鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸和牛磺脫氧膽酸。為了提高心肌梗死的診斷準確性，我們構建了一個二分類 logistic 逐步回歸的聯合診斷模型，結果顯示這 3 種膽汁酸代謝標志物的聯合診斷 AUC 達到 0.965，表現出較好的診斷能力。聯合臨床常用生化指標（天冬氨酸轉氨酶、肌酸激酶和總膽汁酸）和這 3 種膽汁酸標志物后，AUC 進一步提高至 0.986。這表明，聯合膽汁酸生物標志物與這 3 種臨床常用生化指標在區分 UA 與 AMI 方面有意義。
已有研究表明，膽汁酸通過抗炎作用和改善膽固醇代謝在心血管疾病中具有保護作用[12-13]。本研究進一步確認了膽汁酸在 UA 和 AMI 患者中的表達差異，強調了膽汁酸代謝在急性冠脈綜合征中的重要性。具體而言，本研究發現 AMI 患者中脫氧膽酸含量顯著低于 UA 患者，這表明脫氧膽酸在 AMI 中可能具有保護作用。脫氧膽酸是由腸道細菌產生的次級膽汁酸[14]，已被證明是膽汁酸 G 蛋白偶聯受體 5（Takeda G-protein-coupled receptor 5, TGR5）的有效激活劑之一，能夠通過抗炎機制改善心肌梗死后的心臟功能。激活脫氧膽酸-TGR5 信號通路可以減輕炎癥并改善梗死后的心臟功能，從而發揮保護作用[15]。此外，法尼醇 X 受體（farnesoid X receptor, FXR）和 TGR5 的激活也顯示出保護作用，能減少動脈粥樣硬化的發生[16]。Wang 等[17]研究發現，TGR5 通過調節 CD4+ T 細胞功能及其在心臟中分布，在心肌梗死中發揮保護作用。因此，脫氧膽酸通過調節膽汁酸代謝和相關信號轉導以改善炎癥反應的策略，對心肌梗死患者具有重要的臨床意義。與此一致，已有報道指出甘氨鵝脫氧膽酸及牛磺脫氧膽酸在 AMI 患者中的水平降低[15]。早期研究發現，冠狀動脈疾病患者的糞便膽汁酸排泄量低于無冠狀動脈疾病患者[18]。Charach 等[19]通過 20 年隨訪研究發現膽汁酸排泄減少是冠狀動脈疾病的危險因素。最新研究表明，空腹血清總膽汁酸水平與冠狀動脈疾病、心肌梗死以及冠狀動脈病變嚴重程度有關[8]。
傳統的急性冠脈綜合征診斷方法，如心電圖、心臟標志物、負荷試驗和冠狀動脈造影[20-21]，雖然有效，但存在侵入性和高成本等局限性[22]。本研究構建的聯合診斷模型展現出優異的診斷能力[23]，AUC 值達到 0.986，表明其在提高診斷準確性和評估患者風險方面具有巨大潛力。這一模型通過結合膽汁酸和臨床常用生化檢測指標，可更早識別高風險患者，從而采取更積極的預防措施，降低心肌梗死發生率，為臨床決策提供了可靠依據。
綜上所述，本研究通過聯合 3 種膽汁酸標志物（甘氨鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸和牛磺脫氧膽酸）和 3 種臨床常用生化檢測指標（天冬氨酸轉氨酶、肌酸激酶和總膽汁酸），構建了一個有效的診斷模型，能夠準確區分 UA 和 AMI，為膽汁酸在心血管疾病診斷中的潛在應用提供了新的依據，可能為早期識別 AMI 高風險患者提供重要的臨床幫助。未來研究需擴大樣本量，并進行外部驗證，以評估模型在更大人群中的廣泛適用性。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
