引用本文： 王曦, 黃云超, 周永春, 劉德權, 呂志勇, 葉聯華, 陳穎, 楊加鵬, 成鵬, 王正璽. 雌二醇對乳腺癌假體植入術后表皮葡萄球菌生物膜形成的影響研究. 中國修復重建外科雜志, 2016, 30(7): 876-884. doi: 10.7507/1002-1892.20160178 復制
版權信息： ?四川大學華西醫院華西期刊社《中國修復重建外科雜志》版權所有，未經授權不得轉載、改編
包膜攣縮是乳房假體植入術后最嚴重的并發癥，該并發癥發生與表皮葡萄球菌感染關系密切。細菌在假體表面形成生物膜，持續的亞臨床感染造成纖維包膜形成，隨著纖維包膜變厚、變硬、收縮，最終改變乳房輪廓，導致嚴重疼痛[1-3]；生物膜作為細菌屏障還增加了治療難度。作為激素依賴型腫瘤，體內雌激素水平增高是乳腺癌發病的重要原因之一，如果機體雌二醇水平長期維持在103 pmol/L以上，發生乳腺癌幾率也隨之增高[4]。此外雌激素對細菌的正調控已得到證實，特別在致病菌生物膜形成方面[5-11]。但對于長期具有高水平雌二醇的乳腺癌患者，表皮葡萄球菌生長和生物膜的形成特點尚未明確。因此，本研究通過體外實驗探討雌二醇對表皮葡萄球菌生長和生物膜形成能力的影響，以期為臨床預防假體表面細菌生物膜的形成提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗菌株及主要試劑、儀器
表皮葡萄球菌標準株ATCC35984（生物膜表型陽性）購自美國典型菌種保藏中心，表皮葡萄球菌標準株ATCC12228（生物膜表型陰性）購自中國科學院微生物研究所。一次性硅膠擴張器（廣州萬和整形材料有限公司）。
雌二醇（Sigma公司，美國）；活/死細菌熒光染色劑（Life公司，美國）；結晶紫、DMSO、溶菌肉湯（lysogeny broth，LB）培養基（北京索萊寶科技有限公司）；XTT細菌增殖及細菌毒性檢測試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司）；胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）培養基（廣東環凱微生物科技有限公司）。
S-30000N掃描電鏡（Hitachi公司，日本）；激光共聚焦顯微鏡（Olympus公司，日本）；紫外分光光度計（Bio-Rad公司，美國）；全波段多功能酶標儀（Thermo公司，美國）。
1.2 細菌懸液實驗濃度選擇
1.2.1 細菌懸液制備
常規復蘇凍存的ATCC35984菌株，接種至LB瓊脂平板，于37℃培養24 h。挑取單個菌落轉移至TSB培養基中，置于恒溫振蕩器，以37℃、250 r/min培養16～18 h，使細菌細胞生長至對數生長期，調整細菌懸液濃度為1×107 CFU/mL或1×108 CFU/mL，備用。
1.2.2 雌二醇懸液制備
取0.027?2?g雌二醇置于無水乙醇中溶解，然后加入蒸餾水制成濃度為1×10-2?mol/L的雌二醇原液，避光置于—?20℃備用。實驗前取雌二醇原液，利用TSB培養基稀釋，制備終濃度為125 pmol/L的雌二醇懸液。
1.2.3 硅膠材料表面細菌生物膜體外模型制備
取一次性硅膠擴張器制成大小為1 cm×1 cm的方形硅膠片，環氧乙烷熏蒸滅菌后備用。取24孔板，每孔加入濃度為1×107 CFU/mL或1×108 CFU/mL的細菌懸液400μL、125 pmol/L雌二醇懸液40μL以及1片硅膠片。置于37°C恒溫箱培養，于培養后4、6、12、24、48、72?h進行觀測。
1.2.4 觀測指標
①結晶紫染色半定量檢測硅膠材料表面細菌生物膜形成能力：各時間點兩濃度組各取6孔硅膠片，PBS清洗、風干后加入2%結晶紫100?μL染色30 min；取出硅膠片漂洗、風干，加入DMSO脫色15 min；各孔取100μL脫色液至96孔板，用酶標儀測定波長490 nm處吸光度（A）值，以單純TSB培養基作為空白對照。各孔測量A值與空白對照A值的差值作為生物膜厚度，表示細菌生物膜形成能力，差值> 0.12為生物膜形成陽性。
②XTT法檢測硅膠材料表面細菌生長動力：各時間點兩濃度組各取6孔硅膠片，PBS清洗、風干后加入100μL TSB培養基和20μL XTT溶液，37℃避光孵育2 h。以添加LB培養基和XTT溶液的無細菌混合液作為空白對照。采用酶標儀測定波長450?nm處A值，以各孔測量A值與空白對照A值的差值表示細菌生長動力。
根據硅膠材料表面細菌生物膜形成能力及細菌生長動力檢測結果，選擇細菌懸液實驗濃度。
1.3 實驗分組及方法
參照1.2.2方法制備終濃度為50、125、250、500?pmol/L的雌二醇懸液。取實驗濃度ATCC35984菌株懸液以及以上終濃度雌二醇懸液，參照1.2.3方法分別制備硅膠材料表面生物膜體外模型；并以未添加雌二醇懸液（0 pmol/L）作為對照。另取實驗濃度ATCC12228菌株懸液同法制備模型，作為陰性對照。
1.4 觀測指標
1.4.1 XTT法檢測硅膠材料表面細菌生長動力
于培養后4、6、12、24、48、72 h，各組取6孔硅膠片，同1.2.4方法進行檢測。
1.4.2 結晶紫染色半定量檢測硅膠材料表面細菌生物膜形成能力
于培養后4、6、12、24、48、72 h，各組取6孔硅膠片，同1.2.4方法進行檢測。
1.4.3 激光共聚焦顯微鏡觀察硅膠材料表面細菌生物膜厚度
于培養后6、12、24 h，各組取6孔硅膠片，洗去浮游菌，加入熒光染色劑，常溫下避光染色20?min后沖洗，激光共聚焦顯微鏡下以氬離子激光為光源（綠色熒光激發光波長488 nm，紅色熒光激發光波長559 nm），觀察細菌菌群分布并測量細菌生物膜厚度。
1.4.4 掃描電鏡觀察硅膠材料表面細菌生物膜超微結構
于培養后4、6、12、24、48、72 h，各組取2孔硅膠片。PBS洗滌，2%戊二酸固定，乙醇梯度脫水、CO2臨界點干燥，真空鍍金，掃描電鏡下觀察。根據生物膜特征和結構，對生物膜成熟情況進行分級[12]。Ⅰ級，可見自由浮動的浮游細胞，細胞黏附于生物膜；Ⅱ級，形成小菌落和細胞群；Ⅲ級，通過細胞外基質纖維使小菌落之間相互聯系，形成蜘蛛網外觀的微菌落（塔）；Ⅳ級，形成具有地下通道和無定形細胞外物質的塔樓，呈蜂窩式。
1.5 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組內比較采用t檢驗；組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細菌懸液實驗濃度選擇
2.1.1 結晶紫染色半定量檢測
各時間點，兩濃度組細菌懸液均在硅膠材料表面形成生物膜。1×107 ?CFU/mL組培養24 h生物膜厚度達峰值，1×108 ?CFU/mL組培養48 h達峰值，之后生物膜厚度均降低。培養4、6 h時，1×108 CFU/mL組生物膜厚度明顯大于1×107 CFU/mL組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；而12～72 h 1×107 CFU/mL組生物膜厚度明顯大于1×108 CFU/mL組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）。見表 1及圖 1。
表1
1×107 CFU/mL與1×108 CFU/mL組細菌懸液培養后各時間點生物膜厚度比較（n=6，
圖1
1×107 CFU/mL與1×108 CFU/mL組細菌懸液各時間點生物膜厚度比較??圖 2?1×107 CFU/mL與1×108 CFU/mL組細菌懸液各時間點細菌生長動力比較??圖 3?XTT法檢測不同雌二醇濃度組細菌生長動力?ATCC12228菌株?ATCC35984菌株??圖 4?結晶紫染色半定量檢測不同雌二醇濃度組細菌生物膜厚度?ATCC12228菌株?ATCC35984菌株
Figure1.
Comparison of biofilm between 1×107 CFU/mL and 1×108 CFU/mL ATCC35984 at different time points??Fig. 2?Comparison of growth kinetics between 1×107 CFU/mL and 1×108 CFU/mL ATCC35984 at different time points??Fig. 3?The growth kinetics of Staphylococcus epidermidis ATCC12228 and ATCC35984 in different concentrations of estradiol by XTT ?ATCC12228 ?ATCC35984??Fig. 4?The biofilm thickness of Staphylococcus epidermidis ATCC12228 and ATCC35984 in different concentrations of estradiol by crystal violet staining ?ATCC12228 ?ATCC35984
2.1.2 XTT法檢測
與1×107 ?CFU/mL組相比，1×108 ?CFU/mL組細菌總體生長動力較快。各時間點，1×108 ?CFU/mL組A值均高于1×107 ?CFU/ mL組；其中4、24 h組間比較差異有統計學意義（P < 0.05），其余各時間點組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見表 2及圖 2。
表2
1×107 CFU/mL與1×108 CFU/mL組細菌懸液培養后各時間點細菌生長動力比較（n=6，根據以上檢測結果，本實驗選擇1×107 CFU/mL為實驗濃度進行下一步研究。
2.2 不同濃度雌二醇對細菌生物膜形成及生長動力的影響
2.2.1 XTT法檢測
①同一時間點，ATCC12228和ATCC35984菌株的細菌生長速度均隨雌二醇濃度增加而增加。兩種菌株分別在4、6、12、24、72 h和4、6、24、72 h時，125、250、500 pmol/L組A值均高于0、50 pmol/L組，4、6、72 h時500 pmol/L組均高于125、250 pmol/L組，72 h時250 pmol/L組均高于125?pmol/L組，組間比較差異有統計學意義（P < 0.05）；其余各時間點組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。②同一時間點，兩種菌株相同雌二醇濃度組A值比較，差異均無統計學意義（P > 0. 05）。見表 3及圖 3。
表3
不同雌二醇濃度下表皮葡萄球菌ATCC12228和ATCC35984生長動力比較（n=6，2.2.2 結晶紫染色半定量檢測
各時間點，ATCC12228菌株不同濃度雌二醇組A值差值均低于0.12，提示生物膜形成為陰性，不檢測生物膜厚度。而ATCC35984菌株培養4 h即有生物膜形成，隨時間延長逐漸增厚，24 h時達峰值，之后厚度減小。
培養4 h時，0 pmol/L組生物膜厚度大于50、250、500 pmol/L組，125 pmol/L組大于250、500?pmol/L組，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）；其余組間比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。6?h時，0、50 pmol/L組生物膜厚度大于125、250、500?pmol/ L組（P < 0.05），其余組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。12～72 h時，125、250、500 pmol/ L組生物膜厚度均顯著大于0、50 pmol/L組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；且125 pmol/L組生物膜最厚，與250、500 pmol/L組比較差異亦有統計學意義（P < 0.05）；12、72 h時250、500 pmol/L組間比較差異無統計學意義（P > 0.05），24、48 h時500 pmol/L組生物膜厚度明顯低于250 pmol/L組（P < 0.05）；12、24 h時，50 pmol/L組生物膜厚度明顯低于0 pmol/L組，比較差異有統計學意義（P < 0.05），48、72 h時0、50?pmol/L組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見表 4及圖 4。
表4
結晶紫染色半定量檢測不同雌二醇濃度下表皮葡萄球菌ATCC35984生物膜厚度比較（n=6，2.2.3 激光共聚焦顯微鏡觀察
ATCC12228菌株無生物膜形成，激光共聚焦顯微鏡只觀察ATCC35984菌株情況。鏡下觀察示，各雌二醇濃度組隨培養時間延長生物膜逐漸形成并增厚，且50～500 pmol/L組生物膜形成均早于0 pmol/L組。6 h時生物膜內均為大量活細菌；12 h時形成的生物膜出現活、死細菌混合，但以活細菌為主；24 h時出現大量死細菌。同一時間點，不同雌二醇濃度組間比較發現，125、250、500 pmol/L組細菌明顯較0、50?pmol/L組多，其中125 pmol/L組細菌最多。見圖 5。
圖5
激光共聚焦顯微鏡觀察ATCC35984菌株各雌二醇濃度組生物膜形成情況（×200）
ⓐ0 pmol/L組12 h ⓑ50 pmol/L組12 h ⓒ125 pmol/L組12 h ⓓ250 pmol/L組12 h ⓔ500 pmol/L組12 h ⓕ125 pmol/L組12 h三維重建ⓖ0 pmol/L組24 h ⓗ50 pmol/L組24 h ⓘ125 pmol/L組24 h ⓙ250 pmol/L組24 h ⓚ500 pmol/L組24 h ⓛ125 pmol/L組24 h三維重建
Figure5. Bacterial biofilm in different concentrations of estradiol by CLSM (×200)ⓐ0 pmol/L group at 12 hours ⓑ50 pmol/Lgroup at 12 hours ⓒ125 pmol/L group at 12 hours ⓓ250 pmol/L group at 12 hours ⓔ500 pmol/L group at 12 hours ⓕThree-dimensional reconstruction image of 125 pmol/L group at 12 hours ⓖ0 pmol/L group at 24 hours ⓗ50 pmol/L group at 24 hours ⓘ125 pmol/L group at 24 hours ⓙ250 pmol/L group at 24 hours ⓚ500 pmol/L group at 24 hours ⓛThree-dimensional reconstruction image of 125 pmol/L group at 24 hours
測量結果示，培養6 h時，125、250、500 pmol/ L組生物膜厚度小于0、50 pmol/L組，比較差異有統計學意義（P < 0.05），125、250、500 pmol/L組間和0、50?pmol/L組間比較差異均無統計學意義（P > 0.05）。之后各組生物膜逐漸增厚，12、24 h時125 pmol/L組生物膜厚度明顯大于其他濃度組，各組間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見表 5。
表5
激光共聚焦顯微鏡檢測不同雌二醇濃度下表皮葡萄球菌ATCC35984生物膜厚度比較（n=6，μm，2.2.4 掃描電鏡觀察
鏡下觀察示，ATCC12228菌株各雌二醇濃度組均無生物膜形成（圖 6）。ATCC35984菌株各雌二醇濃度組培養4 h時，硅膠片表面見單個細菌分裂后形成的細菌團；6 h可見大量細菌團覆蓋在硅膠片表面，部分細菌團向外延伸；12 h即見纖維組織形成，將細菌團相互連接形成塔狀結構；24 h可見成熟的細菌生物膜結構，蜂窩式結構中有大量通道和無定形細胞外物質填充；48、72 h可見生物膜結構，但呈分解狀，周圍有新的細菌正在形成細菌團。各時間點125 pmol/L組形成的生物膜結構范圍最廣，結構最致密、最豐富、層次最多，其次為250 pmol/L組，0、50、500 pmol/L組生物膜相比層次較少，結構較簡單。見圖 7。
圖6
掃描電鏡觀察ATCC12228菌株125?pmol/L雌二醇濃度組培養24 h生物膜結構（×200）??圖 7?掃描電鏡觀察ATCC35984菌株各時間點各雌二醇濃度組生物膜結構（×200）
ⓐ125 pmol/L組4 h ⓑ125 pmol/L組6 h ⓒ 125 pmol/L組12 h ⓓ 125 pmol/L組24 h ⓔ125 pmol/L組48 h ⓕ125 pmol/L組72 h ⓖ0 pmol/L組24 h ⓗ50 pmol/L組24 h ⓘ250 pmol/L組24 h ⓙ500 pmol/L組24 h
Figure6. Bacterial biofilm structure of ATCC12228 on the surface of silica gel in 125 pmol/L estradiol at 24 hours by SEM (×200) ??Fig. 7?Bacterial biofilm structure of ATCC35984 on the surface of silica gel in different concentrations of estradiol at different time points by SEM (×200)ⓐ125 pmol/L group at 4 hours ⓑ125 pmol/L group at 6 hours ⓒ125 pmol/L group at 12 hours ⓓ125 pmol/L group at 24 hours ⓔ125 pmol/L group at 48 hours ⓕ125 pmol/L group at 72 hours ⓖ0 pmol/L group at 24 hours ⓗ50 pmol/L group at 24 hours ⓘ250 pmol/L group at 24 hours ⓙ500 pmol/L group at 24 hours
3 討論
3.1 細菌懸液濃度的選擇
研究發現，不是所有定植細菌的假體都會發生包膜攣縮，只有當表皮葡萄球菌數量≥3×105 ?CFU/ mL時才能最終形成包膜攣縮，但細菌數量≤1×106 ?CFU/mL時存在不能形成生物膜的可能性[12]，動物實驗發現細菌濃度≥1×107 ?CFU/ mL才能穩定形成生物膜[13]。同時Rieger等[14]研究證實假體包膜攣縮程度與細菌濃度成正相關。由于既往研究關于細菌懸液濃度的選擇均不一致，為此我們進行了預實驗。在相關研究基礎上，選擇1×108 ?CFU/mL和1×107 ?CFU/mL兩種濃度進行觀察。結果顯示，不是表皮葡萄球菌數量越多，生物膜形成越好，分析原因可能是實驗用硅膠材料面積有限，若細菌數量較多會導致擁擠，無法取得理想的黏附空間，從而影響生物膜形成。與1×108 ?CFU/mL相比，1×107 ?CFU/mL的細菌懸液表現出較好的實驗觀察效果，隨著時間推移細菌生長能力和生物膜厚度變化均顯著優于1×108 ?CFU/mL組。因此我們選用1×107 ?CFU/mL作為實驗濃度，以便更好地觀察雌二醇對表皮葡萄球菌的影響。
3.2 雌二醇濃度對細菌生物膜形成的影響
作為激素依賴型腫瘤，乳腺癌的發生發展與體內性激素水平成顯著正相關[15-20]。因此，乳腺癌患者無論絕經前、后，其機體一直處于高激素狀態。雖然乳腺癌患者血清中性激素水平均較高，但雌二醇是雌激素最主要和最有效的形式，它可代表雌激素的絕對血清水平，是雌激素活性和效力的指標[19]。因此本實驗選擇雌二醇作為主要影響因子，并參考國內外乳腺癌患者和正常人群的血清雌二醇水平[20-22]，選擇500、250、125、50 pmol/L濃度以模擬這兩類人群的雌二醇水平。
本研究結果顯示，表皮葡萄球菌ATCC35984在高濃度雌二醇（≥125 pmol/L）作用下形成的生物膜顯著增厚，雖然高濃度雌二醇組在4、6 h表現出對生物膜有一定抑制作用，但12 h時表現明顯促進作用，24 h時生物膜厚度達最大值，48、72 h時生物膜厚度均大于低雌二醇（50 pmol/L）組；同時發現低雌二醇組形成的生物膜厚度均小于空白（0 pmol/L）組。提示低濃度雌二醇對生物膜形成有一定抑制作用，且高濃度雌二醇未在生物膜形成初期即表現出促進作用，而是在生物膜形成一定程度基礎上才開始發揮促進作用。通過對比不同雌二醇濃度組檢測結果，我們發現ATCC35984在雌二醇濃度為125?pmol/L時生物膜厚度和細菌生長動力均達最高。
同時掃描電鏡觀察結果提示，雌二醇對生物膜成熟方面有明顯促進作用，各雌二醇濃度組均出現小菌落、塔狀和蜂窩狀外觀，且125?pmol/L雌二醇作用下的生物膜最致密、層次最豐富。此外，雌二醇雖然不能誘導ATCC12228形成生物膜，但其仍能促進細菌生長，提示雌二醇對細菌的生長仍有較強的生物活性，且不會影響細菌自身特定基因的改變。
乳腺假體植入為細菌的定植提供了平臺，我們體外實驗發現高濃度雌二醇能加快細菌生長和生物膜形成、促進生物膜的發展，可能促進假體植入術后包膜攣縮的發生，成為臨床中棘手的并發癥。
包膜攣縮是乳房假體植入術后最嚴重的并發癥，該并發癥發生與表皮葡萄球菌感染關系密切。細菌在假體表面形成生物膜，持續的亞臨床感染造成纖維包膜形成，隨著纖維包膜變厚、變硬、收縮，最終改變乳房輪廓，導致嚴重疼痛[1-3]；生物膜作為細菌屏障還增加了治療難度。作為激素依賴型腫瘤，體內雌激素水平增高是乳腺癌發病的重要原因之一，如果機體雌二醇水平長期維持在103 pmol/L以上，發生乳腺癌幾率也隨之增高[4]。此外雌激素對細菌的正調控已得到證實，特別在致病菌生物膜形成方面[5-11]。但對于長期具有高水平雌二醇的乳腺癌患者，表皮葡萄球菌生長和生物膜的形成特點尚未明確。因此，本研究通過體外實驗探討雌二醇對表皮葡萄球菌生長和生物膜形成能力的影響，以期為臨床預防假體表面細菌生物膜的形成提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗菌株及主要試劑、儀器
表皮葡萄球菌標準株ATCC35984（生物膜表型陽性）購自美國典型菌種保藏中心，表皮葡萄球菌標準株ATCC12228（生物膜表型陰性）購自中國科學院微生物研究所。一次性硅膠擴張器（廣州萬和整形材料有限公司）。
雌二醇（Sigma公司，美國）；活/死細菌熒光染色劑（Life公司，美國）；結晶紫、DMSO、溶菌肉湯（lysogeny broth，LB）培養基（北京索萊寶科技有限公司）；XTT細菌增殖及細菌毒性檢測試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司）；胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）培養基（廣東環凱微生物科技有限公司）。
S-30000N掃描電鏡（Hitachi公司，日本）；激光共聚焦顯微鏡（Olympus公司，日本）；紫外分光光度計（Bio-Rad公司，美國）；全波段多功能酶標儀（Thermo公司，美國）。
1.2 細菌懸液實驗濃度選擇
1.2.1 細菌懸液制備
常規復蘇凍存的ATCC35984菌株，接種至LB瓊脂平板，于37℃培養24 h。挑取單個菌落轉移至TSB培養基中，置于恒溫振蕩器，以37℃、250 r/min培養16～18 h，使細菌細胞生長至對數生長期，調整細菌懸液濃度為1×107 CFU/mL或1×108 CFU/mL，備用。
1.2.2 雌二醇懸液制備
取0.027?2?g雌二醇置于無水乙醇中溶解，然后加入蒸餾水制成濃度為1×10-2?mol/L的雌二醇原液，避光置于—?20℃備用。實驗前取雌二醇原液，利用TSB培養基稀釋，制備終濃度為125 pmol/L的雌二醇懸液。
1.2.3 硅膠材料表面細菌生物膜體外模型制備
取一次性硅膠擴張器制成大小為1 cm×1 cm的方形硅膠片，環氧乙烷熏蒸滅菌后備用。取24孔板，每孔加入濃度為1×107 CFU/mL或1×108 CFU/mL的細菌懸液400μL、125 pmol/L雌二醇懸液40μL以及1片硅膠片。置于37°C恒溫箱培養，于培養后4、6、12、24、48、72?h進行觀測。
1.2.4 觀測指標
①結晶紫染色半定量檢測硅膠材料表面細菌生物膜形成能力：各時間點兩濃度組各取6孔硅膠片，PBS清洗、風干后加入2%結晶紫100?μL染色30 min；取出硅膠片漂洗、風干，加入DMSO脫色15 min；各孔取100μL脫色液至96孔板，用酶標儀測定波長490 nm處吸光度（A）值，以單純TSB培養基作為空白對照。各孔測量A值與空白對照A值的差值作為生物膜厚度，表示細菌生物膜形成能力，差值> 0.12為生物膜形成陽性。
②XTT法檢測硅膠材料表面細菌生長動力：各時間點兩濃度組各取6孔硅膠片，PBS清洗、風干后加入100μL TSB培養基和20μL XTT溶液，37℃避光孵育2 h。以添加LB培養基和XTT溶液的無細菌混合液作為空白對照。采用酶標儀測定波長450?nm處A值，以各孔測量A值與空白對照A值的差值表示細菌生長動力。
根據硅膠材料表面細菌生物膜形成能力及細菌生長動力檢測結果，選擇細菌懸液實驗濃度。
1.3 實驗分組及方法
參照1.2.2方法制備終濃度為50、125、250、500?pmol/L的雌二醇懸液。取實驗濃度ATCC35984菌株懸液以及以上終濃度雌二醇懸液，參照1.2.3方法分別制備硅膠材料表面生物膜體外模型；并以未添加雌二醇懸液（0 pmol/L）作為對照。另取實驗濃度ATCC12228菌株懸液同法制備模型，作為陰性對照。
1.4 觀測指標
1.4.1 XTT法檢測硅膠材料表面細菌生長動力
于培養后4、6、12、24、48、72 h，各組取6孔硅膠片，同1.2.4方法進行檢測。
1.4.2 結晶紫染色半定量檢測硅膠材料表面細菌生物膜形成能力
于培養后4、6、12、24、48、72 h，各組取6孔硅膠片，同1.2.4方法進行檢測。
1.4.3 激光共聚焦顯微鏡觀察硅膠材料表面細菌生物膜厚度
于培養后6、12、24 h，各組取6孔硅膠片，洗去浮游菌，加入熒光染色劑，常溫下避光染色20?min后沖洗，激光共聚焦顯微鏡下以氬離子激光為光源（綠色熒光激發光波長488 nm，紅色熒光激發光波長559 nm），觀察細菌菌群分布并測量細菌生物膜厚度。
1.4.4 掃描電鏡觀察硅膠材料表面細菌生物膜超微結構
于培養后4、6、12、24、48、72 h，各組取2孔硅膠片。PBS洗滌，2%戊二酸固定，乙醇梯度脫水、CO2臨界點干燥，真空鍍金，掃描電鏡下觀察。根據生物膜特征和結構，對生物膜成熟情況進行分級[12]。Ⅰ級，可見自由浮動的浮游細胞，細胞黏附于生物膜；Ⅱ級，形成小菌落和細胞群；Ⅲ級，通過細胞外基質纖維使小菌落之間相互聯系，形成蜘蛛網外觀的微菌落（塔）；Ⅳ級，形成具有地下通道和無定形細胞外物質的塔樓，呈蜂窩式。
1.5 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組內比較采用t檢驗；組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細菌懸液實驗濃度選擇
2.1.1 結晶紫染色半定量檢測
各時間點，兩濃度組細菌懸液均在硅膠材料表面形成生物膜。1×107 ?CFU/mL組培養24 h生物膜厚度達峰值，1×108 ?CFU/mL組培養48 h達峰值，之后生物膜厚度均降低。培養4、6 h時，1×108 CFU/mL組生物膜厚度明顯大于1×107 CFU/mL組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；而12～72 h 1×107 CFU/mL組生物膜厚度明顯大于1×108 CFU/mL組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）。見表 1及圖 1。
表1
1×107 CFU/mL與1×108 CFU/mL組細菌懸液培養后各時間點生物膜厚度比較（n=6，
圖1
1×107 CFU/mL與1×108 CFU/mL組細菌懸液各時間點生物膜厚度比較??圖 2?1×107 CFU/mL與1×108 CFU/mL組細菌懸液各時間點細菌生長動力比較??圖 3?XTT法檢測不同雌二醇濃度組細菌生長動力?ATCC12228菌株?ATCC35984菌株??圖 4?結晶紫染色半定量檢測不同雌二醇濃度組細菌生物膜厚度?ATCC12228菌株?ATCC35984菌株
Figure1.
Comparison of biofilm between 1×107 CFU/mL and 1×108 CFU/mL ATCC35984 at different time points??Fig. 2?Comparison of growth kinetics between 1×107 CFU/mL and 1×108 CFU/mL ATCC35984 at different time points??Fig. 3?The growth kinetics of Staphylococcus epidermidis ATCC12228 and ATCC35984 in different concentrations of estradiol by XTT ?ATCC12228 ?ATCC35984??Fig. 4?The biofilm thickness of Staphylococcus epidermidis ATCC12228 and ATCC35984 in different concentrations of estradiol by crystal violet staining ?ATCC12228 ?ATCC35984
2.1.2 XTT法檢測
與1×107 ?CFU/mL組相比，1×108 ?CFU/mL組細菌總體生長動力較快。各時間點，1×108 ?CFU/mL組A值均高于1×107 ?CFU/ mL組；其中4、24 h組間比較差異有統計學意義（P < 0.05），其余各時間點組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見表 2及圖 2。
表2
1×107 CFU/mL與1×108 CFU/mL組細菌懸液培養后各時間點細菌生長動力比較（n=6，根據以上檢測結果，本實驗選擇1×107 CFU/mL為實驗濃度進行下一步研究。
2.2 不同濃度雌二醇對細菌生物膜形成及生長動力的影響
2.2.1 XTT法檢測
①同一時間點，ATCC12228和ATCC35984菌株的細菌生長速度均隨雌二醇濃度增加而增加。兩種菌株分別在4、6、12、24、72 h和4、6、24、72 h時，125、250、500 pmol/L組A值均高于0、50 pmol/L組，4、6、72 h時500 pmol/L組均高于125、250 pmol/L組，72 h時250 pmol/L組均高于125?pmol/L組，組間比較差異有統計學意義（P < 0.05）；其余各時間點組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。②同一時間點，兩種菌株相同雌二醇濃度組A值比較，差異均無統計學意義（P > 0. 05）。見表 3及圖 3。
表3
不同雌二醇濃度下表皮葡萄球菌ATCC12228和ATCC35984生長動力比較（n=6，2.2.2 結晶紫染色半定量檢測
各時間點，ATCC12228菌株不同濃度雌二醇組A值差值均低于0.12，提示生物膜形成為陰性，不檢測生物膜厚度。而ATCC35984菌株培養4 h即有生物膜形成，隨時間延長逐漸增厚，24 h時達峰值，之后厚度減小。
培養4 h時，0 pmol/L組生物膜厚度大于50、250、500 pmol/L組，125 pmol/L組大于250、500?pmol/L組，比較差異均有統計學意義（P < 0.05）；其余組間比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。6?h時，0、50 pmol/L組生物膜厚度大于125、250、500?pmol/ L組（P < 0.05），其余組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。12～72 h時，125、250、500 pmol/ L組生物膜厚度均顯著大于0、50 pmol/L組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；且125 pmol/L組生物膜最厚，與250、500 pmol/L組比較差異亦有統計學意義（P < 0.05）；12、72 h時250、500 pmol/L組間比較差異無統計學意義（P > 0.05），24、48 h時500 pmol/L組生物膜厚度明顯低于250 pmol/L組（P < 0.05）；12、24 h時，50 pmol/L組生物膜厚度明顯低于0 pmol/L組，比較差異有統計學意義（P < 0.05），48、72 h時0、50?pmol/L組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見表 4及圖 4。
表4
結晶紫染色半定量檢測不同雌二醇濃度下表皮葡萄球菌ATCC35984生物膜厚度比較（n=6，2.2.3 激光共聚焦顯微鏡觀察
ATCC12228菌株無生物膜形成，激光共聚焦顯微鏡只觀察ATCC35984菌株情況。鏡下觀察示，各雌二醇濃度組隨培養時間延長生物膜逐漸形成并增厚，且50～500 pmol/L組生物膜形成均早于0 pmol/L組。6 h時生物膜內均為大量活細菌；12 h時形成的生物膜出現活、死細菌混合，但以活細菌為主；24 h時出現大量死細菌。同一時間點，不同雌二醇濃度組間比較發現，125、250、500 pmol/L組細菌明顯較0、50?pmol/L組多，其中125 pmol/L組細菌最多。見圖 5。
圖5
激光共聚焦顯微鏡觀察ATCC35984菌株各雌二醇濃度組生物膜形成情況（×200）
ⓐ0 pmol/L組12 h ⓑ50 pmol/L組12 h ⓒ125 pmol/L組12 h ⓓ250 pmol/L組12 h ⓔ500 pmol/L組12 h ⓕ125 pmol/L組12 h三維重建ⓖ0 pmol/L組24 h ⓗ50 pmol/L組24 h ⓘ125 pmol/L組24 h ⓙ250 pmol/L組24 h ⓚ500 pmol/L組24 h ⓛ125 pmol/L組24 h三維重建
Figure5. Bacterial biofilm in different concentrations of estradiol by CLSM (×200)ⓐ0 pmol/L group at 12 hours ⓑ50 pmol/Lgroup at 12 hours ⓒ125 pmol/L group at 12 hours ⓓ250 pmol/L group at 12 hours ⓔ500 pmol/L group at 12 hours ⓕThree-dimensional reconstruction image of 125 pmol/L group at 12 hours ⓖ0 pmol/L group at 24 hours ⓗ50 pmol/L group at 24 hours ⓘ125 pmol/L group at 24 hours ⓙ250 pmol/L group at 24 hours ⓚ500 pmol/L group at 24 hours ⓛThree-dimensional reconstruction image of 125 pmol/L group at 24 hours
測量結果示，培養6 h時，125、250、500 pmol/ L組生物膜厚度小于0、50 pmol/L組，比較差異有統計學意義（P < 0.05），125、250、500 pmol/L組間和0、50?pmol/L組間比較差異均無統計學意義（P > 0.05）。之后各組生物膜逐漸增厚，12、24 h時125 pmol/L組生物膜厚度明顯大于其他濃度組，各組間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見表 5。
表5
激光共聚焦顯微鏡檢測不同雌二醇濃度下表皮葡萄球菌ATCC35984生物膜厚度比較（n=6，μm，2.2.4 掃描電鏡觀察
鏡下觀察示，ATCC12228菌株各雌二醇濃度組均無生物膜形成（圖 6）。ATCC35984菌株各雌二醇濃度組培養4 h時，硅膠片表面見單個細菌分裂后形成的細菌團；6 h可見大量細菌團覆蓋在硅膠片表面，部分細菌團向外延伸；12 h即見纖維組織形成，將細菌團相互連接形成塔狀結構；24 h可見成熟的細菌生物膜結構，蜂窩式結構中有大量通道和無定形細胞外物質填充；48、72 h可見生物膜結構，但呈分解狀，周圍有新的細菌正在形成細菌團。各時間點125 pmol/L組形成的生物膜結構范圍最廣，結構最致密、最豐富、層次最多，其次為250 pmol/L組，0、50、500 pmol/L組生物膜相比層次較少，結構較簡單。見圖 7。
圖6
掃描電鏡觀察ATCC12228菌株125?pmol/L雌二醇濃度組培養24 h生物膜結構（×200）??圖 7?掃描電鏡觀察ATCC35984菌株各時間點各雌二醇濃度組生物膜結構（×200）
ⓐ125 pmol/L組4 h ⓑ125 pmol/L組6 h ⓒ 125 pmol/L組12 h ⓓ 125 pmol/L組24 h ⓔ125 pmol/L組48 h ⓕ125 pmol/L組72 h ⓖ0 pmol/L組24 h ⓗ50 pmol/L組24 h ⓘ250 pmol/L組24 h ⓙ500 pmol/L組24 h
Figure6. Bacterial biofilm structure of ATCC12228 on the surface of silica gel in 125 pmol/L estradiol at 24 hours by SEM (×200) ??Fig. 7?Bacterial biofilm structure of ATCC35984 on the surface of silica gel in different concentrations of estradiol at different time points by SEM (×200)ⓐ125 pmol/L group at 4 hours ⓑ125 pmol/L group at 6 hours ⓒ125 pmol/L group at 12 hours ⓓ125 pmol/L group at 24 hours ⓔ125 pmol/L group at 48 hours ⓕ125 pmol/L group at 72 hours ⓖ0 pmol/L group at 24 hours ⓗ50 pmol/L group at 24 hours ⓘ250 pmol/L group at 24 hours ⓙ500 pmol/L group at 24 hours
3 討論
3.1 細菌懸液濃度的選擇
研究發現，不是所有定植細菌的假體都會發生包膜攣縮，只有當表皮葡萄球菌數量≥3×105 ?CFU/ mL時才能最終形成包膜攣縮，但細菌數量≤1×106 ?CFU/mL時存在不能形成生物膜的可能性[12]，動物實驗發現細菌濃度≥1×107 ?CFU/ mL才能穩定形成生物膜[13]。同時Rieger等[14]研究證實假體包膜攣縮程度與細菌濃度成正相關。由于既往研究關于細菌懸液濃度的選擇均不一致，為此我們進行了預實驗。在相關研究基礎上，選擇1×108 ?CFU/mL和1×107 ?CFU/mL兩種濃度進行觀察。結果顯示，不是表皮葡萄球菌數量越多，生物膜形成越好，分析原因可能是實驗用硅膠材料面積有限，若細菌數量較多會導致擁擠，無法取得理想的黏附空間，從而影響生物膜形成。與1×108 ?CFU/mL相比，1×107 ?CFU/mL的細菌懸液表現出較好的實驗觀察效果，隨著時間推移細菌生長能力和生物膜厚度變化均顯著優于1×108 ?CFU/mL組。因此我們選用1×107 ?CFU/mL作為實驗濃度，以便更好地觀察雌二醇對表皮葡萄球菌的影響。
3.2 雌二醇濃度對細菌生物膜形成的影響
作為激素依賴型腫瘤，乳腺癌的發生發展與體內性激素水平成顯著正相關[15-20]。因此，乳腺癌患者無論絕經前、后，其機體一直處于高激素狀態。雖然乳腺癌患者血清中性激素水平均較高，但雌二醇是雌激素最主要和最有效的形式，它可代表雌激素的絕對血清水平，是雌激素活性和效力的指標[19]。因此本實驗選擇雌二醇作為主要影響因子，并參考國內外乳腺癌患者和正常人群的血清雌二醇水平[20-22]，選擇500、250、125、50 pmol/L濃度以模擬這兩類人群的雌二醇水平。
本研究結果顯示，表皮葡萄球菌ATCC35984在高濃度雌二醇（≥125 pmol/L）作用下形成的生物膜顯著增厚，雖然高濃度雌二醇組在4、6 h表現出對生物膜有一定抑制作用，但12 h時表現明顯促進作用，24 h時生物膜厚度達最大值，48、72 h時生物膜厚度均大于低雌二醇（50 pmol/L）組；同時發現低雌二醇組形成的生物膜厚度均小于空白（0 pmol/L）組。提示低濃度雌二醇對生物膜形成有一定抑制作用，且高濃度雌二醇未在生物膜形成初期即表現出促進作用，而是在生物膜形成一定程度基礎上才開始發揮促進作用。通過對比不同雌二醇濃度組檢測結果，我們發現ATCC35984在雌二醇濃度為125?pmol/L時生物膜厚度和細菌生長動力均達最高。
同時掃描電鏡觀察結果提示，雌二醇對生物膜成熟方面有明顯促進作用，各雌二醇濃度組均出現小菌落、塔狀和蜂窩狀外觀，且125?pmol/L雌二醇作用下的生物膜最致密、層次最豐富。此外，雌二醇雖然不能誘導ATCC12228形成生物膜，但其仍能促進細菌生長，提示雌二醇對細菌的生長仍有較強的生物活性，且不會影響細菌自身特定基因的改變。
乳腺假體植入為細菌的定植提供了平臺，我們體外實驗發現高濃度雌二醇能加快細菌生長和生物膜形成、促進生物膜的發展，可能促進假體植入術后包膜攣縮的發生，成為臨床中棘手的并發癥。
