引用本文： 吳俊峰, 孔祥東, 呂強. 絲蛋白生物材料用于周圍神經修復的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2024, 38(9): 1149-1156. doi: 10.7507/1002-1892.202402071 復制
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絲蛋白作為功能化的材料平臺可實現仿生結構的多重設計和多種活性成分加載，為神經再生提供適宜微環境，促進神經組織功能恢復。結合多種神經再生的優化策略，拓展絲蛋白支架在神經組織修復中的應用范圍，實現大尺寸周圍神經損傷的有效治療是未來重要發展方向。
創傷是導致周圍神經損傷的主要原因，通常導致肢體功能障礙、感覺遲鈍和神經性疼痛[1-3]。小間隙神經損傷通過手術可直接縫合，但超過5 mm的大間隙神經損傷需要其他醫療手段干預[4-6]。自體神經移植是治療大間隙神經損傷的“金標準”，腓腸神經、淺表神經和前臂神經都已被用作移植神經來源，但自體神經有限以及存在供區并發癥等問題限制了自體神經移植的廣泛應用。目前，人工神經移植物逐漸成為自體神經移植的有效替代方案，多種天然和合成聚合物（如膠原、殼聚糖、聚乙醇酸和導電聚吡咯等）被用于制造人工神經移植物，并通過構建有利于神經再生的微環境實現神經組織修復[7-12]。隨著材料結構和性能的優化，再生神經組織的功能不斷改善，提示人工神經移植物具有良好應用前景[13-17]。
在現有神經修復材料中，天然可降解材料因細胞相容性好、降解產物對神經組織副作用低，逐漸成為本領域的研究重點[18-20]。蠶絲是具有中國特色的纖維材料，近年來在再生醫學領域獲得普遍關注。蠶絲主要由內部的絲蛋白和外部的絲膠蛋白組成，兩種蛋白均具有良好的生物相容性和促進細胞增殖、組織再生能力，可應用于皮膚、血管、骨、神經等組織的再生。在實際應用中，通過碳酸鈉等鹽溶液溶解去除絲膠蛋白即可獲得絲蛋白纖維，純化工藝簡單，便于規模化生產和處理；而絲膠蛋白在鹽溶液中濃度低，提純困難，因此與絲膠蛋白相比，絲蛋白在再生醫學領域更受研究者青睞[21-23]。絲蛋白不僅可以設計加工成類似于天然周圍神經的多種仿生結構[24-25]，同時可作為載體加載不同活性成分，并通過對不同活性成分的控釋實現炎癥反應、抗氧化性能以及促血管化能力的調節，以創造更有利于神經再生的微環境，在神經組織工程領域備受關注。考慮到絲蛋白在神經組織工程中的廣泛應用，本文將著重介紹絲蛋白在周圍神經再生的最新研究進展，特別是以絲蛋白為基質引入不同誘導信號主動刺激周圍神經修復的研究成果，評估它們在治療周圍神經損傷方面的臨床應用前景。
1 絲蛋白神經修復材料的基本特征
盡管聚氨酯和膠原蛋白等生物材料已被批準用于臨床周圍神經組織損傷修復治療，但兩者存在臨床效果一般或成本較高的問題，限制其廣泛應用。與膠原相比，絲蛋白來源豐富、成本低廉且更易加工，其良好的生物相容性、力學性能以及合適的滲透性等特點使其在周圍神經修復中具有顯著優勢[26-27]。
受損的周圍神經通常會出現微環境變化，引發炎癥反應和氧化應激，導致巨噬細胞浸潤、神經細胞死亡以及遠端神經節段脫髓鞘等，最終受損部分形成瘢痕，在物理上阻礙神經通路重建[28-30]。在周圍神經組織修復中，植入人工支架旨在通過構筑物理屏障避免瘢痕組織浸潤，提供有利于神經再生的微環境，支架自身應具有合適的生物相容性和生物活性，盡可能避免對神經修復的不良影響[3，31]。神經導管是人工植入支架的常見類型，理想的神經導管應具有優異的生物相容性以及與天然神經相似的滲透性和機械特性[32-33]。大量研究表明，不同神經細胞在絲蛋白材料上均表現出良好的黏附和增殖行為。Yang等[34]利用絲蛋白提取液和普通培養基分別培養大鼠雪旺細胞，他們發現細胞在絲蛋白提取液中的活力、增殖和生長因子分泌行為與在普通培養基中培養的細胞相似。絲蛋白材料還可以通過細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的仿生設計進一步提高生物相容性。以絲蛋白納米纖維為基質制備的仿生材料表現出更好的促進細胞生長、增殖能力，不僅雪旺細胞增殖更快，細胞之間的相互作用和聚集性能也獲得顯著提升[35]。除了優異的生物相容性，絲蛋白材料的可設計性賦予其合適的力學性能和滲透性，更好地滿足周圍神經組織修復要求。研究表明當孔隙直徑為10～20 μm時，導管具有合適的滲透行為，可通過有效清除代謝產物和及時營養供給促進神經再生[36]。絲蛋白周圍神經導管的孔隙可通過濃度和交聯等方式進行主動調控，以優化滲透性能并獲得更好的組織修復效果[37]。賦予導管適當的機械性能可避免其撕裂或塌陷[38-39]。絲蛋白神經導管機械性能可控，利用酶交聯等方法制備的絲蛋白導管拉伸強度可達（7.7±0.8）MPa，類似于豬腓骨和脛骨神經，能夠為周圍神經再生提供適宜的力學環境[40-41]。這些研究表明以絲蛋白為基質制備的神經導管在生物相容性、滲透性以及機械性能等方面均可滿足周圍神經組織修復的要求，絲蛋白是周圍神經修復的理想材料。
2 絲蛋白基神經導管的結構設計
2.1 空心多孔結構
在周圍神經導管的研究中，導管最初為簡單的圓柱形空心管，為神經組織再生提供空間，并避免外周組織侵入。隨著研究深入，在空心多孔導管中更好地引導神經細胞黏附、增殖和遷移成為提高其神經修復性能的有效策略。對空心管的物理結構進行特殊設計，如引入多孔/凹槽、各向異性的表面結構、多通道結構和填充復合結構等，可以主動誘導神經細胞黏附、增殖和遷移，加快神經再生[42]。
2.2 各向異性的多通道結構
表面結構對神經再生有顯著影響[43-44]，取向排列凹槽可以誘導雪旺細胞定向生長和遷移。Gu等[45]通過凹槽模板調節絲蛋白凝膠上的排列凹槽，以改善軸突伸長情況，當凹槽尺寸為30 μm時可實現最佳再生效果。然而，單管狀導管無法模擬神經的神經束結構，中空間隙會導致神經連接錯位，再生神經組織難以實現功能恢復正常。為提高神經修復效果，研究者嘗試利用絲蛋白制備多通道神經導管，以更好地模擬天然神經束結構。有研究通過電紡絲首先制備取向結構的絲蛋白薄膜，隨后通過卷曲技術獲得多通道導管；利用上述多通道導管進行周圍神經組織修復，神經軸突延長性能顯著改善，再生神經組織功能提升，證明上述取向多通道結構能夠有效誘導神經再生[46-48]。溫度響應形狀記憶聚合物（temperature responsive shape memory polymers，TRSMPs）也被用于多通道結構的制備。TRSMPs能夠通過溫度調節形成直徑可調的多通道導管，將其和絲蛋白結合，可制備性能更好的多通道神經導管[49]，獲得比單通道導管更優異的神經修復能力。然而，盡管多通道技術的使用提高了絲蛋白基導管的神經再生能力，但與自體神經修復相比仍存在顯著差距，需要進一步優化材料的仿生設計來獲得與自體神經移植相似的治療效果[50-51]。
2.3 填充物-導管復合結構
ECM可參與多個生化過程，主動影響組織再生[52-53]。ECM的多級三維結構可主動調控細胞生長、遷移、分化和分泌等行為，誘導組織的再生和修復。除了物理信號，神經組織ECM中還存在層粘連蛋白和纖維連接蛋白等不同蛋白質聚集體，同樣可影響細胞的遷移和分化[54]。例如，層粘連蛋白刺激軸突再生并激活雪旺細胞[55-56]，纖維連接蛋白可以促進細胞黏附和生長[57-58]。因此，同時模擬ECM的微結構和組成，可為神經修復提供更友好的微環境。
基于如上策略，研究者嘗試通過在絲蛋白神經導管中同時引入物理仿生信號和生長因子來提高神經再生的速度和質量。為更好模擬神經特殊微環境，有研究者將磁性聚乳酸-羥基乙酸共聚物［poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA］ 微膠囊加載NGF后，填充至絲蛋白/明膠復合神經管中，利用磁場調節微膠囊，實現其在管道內部的梯度和各向異性分布。通過微膠囊的梯度分布結合生長因子的緩慢控釋，成功獲得生長因子梯度分布的絲蛋白基神經導管，為神經再生同時提供梯度和因子誘導信號，修復效果明顯改善[59-61]。
考慮到結構和性能的可調控性，絲蛋白不僅能用于制備神經導管，同時還可設計制備成神經導管的填充物，以更好地模擬ECM的微觀結構[62-63]。Rao等[64]設計了一種填充聚乳酸和絲蛋白納米纖維海綿的殼聚糖神經導管，采用氣體發泡技術制備納米纖維海綿以避免形成薄膜層，保證填充物的通透性，結果顯示填充納米纖維海綿的復合神經導管能夠顯著促進神經再生。為了優化填充物的多級仿生結構，Du等[65]開發了取向纖維蛋白填充的殼聚糖神經導管，雪旺細胞在神經導管中培養3 d可形成排列整齊的聚集體，證明了取向結構的誘導作用。有研究利用大鼠坐骨神經損傷模型對導管性能進行評價發現，導管植入12周后再生神經組織的神經纖維直徑和髓鞘厚度接近自體神經移植，表明取向的納米纖維對神經再生具有促進作用[66-67]。絲蛋白能夠在溶液中自組裝形成高電荷密度的納米纖維，可以在電場力作用下遷移形成取向結構，同樣被用于神經的取向仿生設計[68-69]。Lu等[24]利用電場誘導絲蛋白納米纖維取向形成凝膠，用于周圍神經修復取得了與自體神經移植相近的結果。該方法制備的絲蛋白納米纖維凝膠還可以負載姜黃素和NGF等活性成分，優化誘導神經再生微環境，不斷提高絲蛋白納米纖維神經導管的性能[68，70-71]。
3 加載活性成分的絲蛋白神經導管
3.1 加載神經營養因子的絲蛋白神經導管
神經組織損傷后，損傷部位的神經細胞會應答性分泌各種神經營養因子和生物活性分子啟動再生修復[72]。不同的神經營養因子可分別起到促進神經元存活、誘導軸突再生、刺激雪旺細胞遷移等作用。例如，NGF主要促進感覺神經元的生長，而膠質細胞源性神經因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）主要作用于運動神經元[73-75]。周圍神經再生是一個緩慢過程，需要不同神經營養因子和生物活性分子長期刺激。絲蛋白可以加載不同性質的因子和活性成分，研究者以其作為載體和基質，已開發出多種加載藥物的絲蛋白支架。Carvalho等[76]分別采用絲蛋白溶液中加入神經營養因子再酶交聯形成導管，以及先酶交聯絲蛋白形成導管再浸泡吸附的方法，制備含有神經營養因子的絲蛋白神經導管，成功將GDNF和NGF加載至絲蛋白神經導管。結果顯示，不同方法制備的神經導管表現出不同的藥物釋放行為，其中第1種方法制備的導管僅有微量GDNF和NGF緩慢釋放，而第2種方法由于神經營養因子固定于導管表面，NGF早期突釋，GDNF則緩慢持續釋放。不同的釋放行為使導管具有不同生物活性，動物實驗結果表明，緩慢釋放的GDNF更有利于再生神經的血管化[77]。
與其他天然材料相比，絲蛋白特殊的親疏水嵌段結構有利于保持因子活性。Lu等[78]發現部分生物酶可與絲蛋白氨基酸鏈的疏水區相互作用以保持其活性，固定在絲蛋白膜中的葡萄糖氧化酶在室溫下放置10個月后，仍表現出良好活性。Uebersax等[79]制備了固定NGF的絲蛋白膜，固定于膜上的NGF可持續釋放3周以上，且一直維持優異生物活性。神經源性生物活性分子在水溶液中可與絲蛋白分子作用，從而提高活性分子的穩定性。將添加有神經營養素3的絲蛋白溶液涂覆在PLGA支架上，可制備PLGA-絲蛋白復合支架，在復合支架上共同培養神經干細胞和雪旺細胞能夠主動誘導神經元和髓鞘形成[80]。在此基礎上調整絲蛋白溶液的涂覆時間可以實現活性物的梯度分布，進一步促進神經再生[81]。絲蛋白也可以制備成微球來加載神經營養因子，并通過控制微球的分布實現神經營養因子的梯度緩釋[82]。為在神經再生不同階段更好地調控活性成分梯度，研究者將溫度響應性材料和絲蛋白結合，利用溫度響應性主動調控活性成分的分布。Huang等[61]設計了一種明膠-絲蛋白復合神經導管，其中絲蛋白提供機械性能，明膠賦予導管溫度響應性，通過明膠不同溫度下可逆的溶膠-凝膠相轉變，使得復合導管在溫度>20℃時具有一定流動性。將負載有NGF的磁性納米粒子引入復合導管中，在合適溫度下施加磁場刺激誘導磁性粒子遷移，可同時實現各向異性和梯度分布，為神經再生提供主動調節的可控微環境[56]。適當的電信號刺激同樣有利于神經再生，將電刺激同生長因子結合，通過協同作用改善再生性能是神經導管研究的重要方向[83]。Cai等[84]首先利用擴散效應在甲基丙烯酸甲酯改性的絲蛋白水凝膠中實現神經營養因子的梯度分布，隨后涂覆石墨烯納米管獲得導電性，通過石墨烯納米管的電刺激和梯度分布的神經營養因子協同作用，顯著促進雪旺細胞的遷移。
不同種類的神經營養因子可通過協同作用動態調控神經再生，神經再生的不同階段對生長因子的需求存在差異，因此在神經導管內根據神經再生不同階段需求，獨立控制不同生長因子的釋放行為，能夠優化神經再生不同階段的微環境，獲得更好的修復效果[85-87]。Catrina等[88]研究了GDNF和NGF在絲蛋白和膠原中的釋放動力學，通過調整復合支架中絲蛋白和膠原的比例，優化不同因子的釋放行為，獲得最佳的組織修復效果。
3.2 加載天然和合成藥物的絲蛋白神經導管
除神經營養因子外，許多藥物如尿石蛋白A、姜黃素、維甲酸、FK506、褪黑素、阿伐他汀和水飛薊素等同樣可刺激神經再生[89-98]。嚴重的炎癥反應和氧化自由基會導致損傷部位雪旺細胞死亡以及瘢痕形成，因此具有抗氧化和抗炎能力的小分子藥物可以通過減輕炎癥和氧化應激程度，避免神經組織進一步損傷[28，69]。然而，上述藥物中多數為疏水性藥物，如何提高其在水相體系中的溶解和分散是決定其應用效果的關鍵。絲蛋白作為藥物載體已被用于裝載各種疏水性小分子藥物，為上述藥物在神經修復中的應用提供了新的解決思路。Zhang等[68]開發出一種溶劑體系藥物轉移的方法，成功將疏水性藥物加載至絲蛋白納米纖維上并將其分散到水溶液中，將上述加載體系和絲蛋白取向凝膠技術結合，可制備加載姜黃素、維甲酸等活性成分的取向神經導管。Liu等[71]利用該方法將疏水性積雪草苷加載至絲蛋白納米纖維上，有效抑制了瘢痕組織形成。基于該策略，設計加載不同藥物的絲蛋白神經導管，實現周圍神經組織的再生和功能修復將成為本領域富有潛力的研究方向。
4 總結及展望
周圍神經再生受多種物理和生物化學信號的調節，絲蛋白能夠同時調控物理和生物化學信號，是制備神經導管的理想基質。以絲蛋白為基質，通過微米/納米尺度的結構仿生、多通道結構的設計、取向信號的優化，以及不同活性成分的加載控釋和梯度分布，不同團隊已成功制備具有生物活性的神經導管，在周圍神經組織修復領域取得良好效果。
與皮膚、骨等其他組織相比，周圍神經修復更為復雜，需要整合生物、組織工程、材料和臨床醫學等多個學科的知識，構筑有利于組織修復的微環境，主動誘導組織再生。盡管目前已有多個神經導管產品應用于臨床，但是可主動誘導神經修復的生物活性神經導管研究仍多處于動物實驗階段，優化材料的功能設計以期更好地滿足臨床需求，依然存在較大挑戰。與其他材料相比，絲蛋白在多種信號的引入和主動設計方面具有顯著優勢。以絲蛋白為平臺，可通過簡單的物理方法在神經導管內部同時實現取向、力學、多級微結構的仿生設計，避免化學改性以及其他有毒有害物質的使用，獲得兼具生物相容性和生物活性的神經導管。同時，利用絲蛋白可加載控釋不同活性成分的優勢，可根據神經修復具體需求，在實現多維度仿生設計的同時加載調節炎癥、促血管、誘導神經分化的因子和藥物，主動設計不同活性成分的釋放行為，構筑動態變化微環境，更積極主動地誘導神經再生，有望超越自體神經移植，為大尺寸神經損傷修復提供新思路。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突
作者貢獻聲明 吳俊峰：內容構思、文獻查找、文章撰寫；孔祥東：文章審閱和修改；呂強：文章設計、統籌、對學術內容進行指導修改
絲蛋白作為功能化的材料平臺可實現仿生結構的多重設計和多種活性成分加載，為神經再生提供適宜微環境，促進神經組織功能恢復。結合多種神經再生的優化策略，拓展絲蛋白支架在神經組織修復中的應用范圍，實現大尺寸周圍神經損傷的有效治療是未來重要發展方向。
創傷是導致周圍神經損傷的主要原因，通常導致肢體功能障礙、感覺遲鈍和神經性疼痛[1-3]。小間隙神經損傷通過手術可直接縫合，但超過5 mm的大間隙神經損傷需要其他醫療手段干預[4-6]。自體神經移植是治療大間隙神經損傷的“金標準”，腓腸神經、淺表神經和前臂神經都已被用作移植神經來源，但自體神經有限以及存在供區并發癥等問題限制了自體神經移植的廣泛應用。目前，人工神經移植物逐漸成為自體神經移植的有效替代方案，多種天然和合成聚合物（如膠原、殼聚糖、聚乙醇酸和導電聚吡咯等）被用于制造人工神經移植物，并通過構建有利于神經再生的微環境實現神經組織修復[7-12]。隨著材料結構和性能的優化，再生神經組織的功能不斷改善，提示人工神經移植物具有良好應用前景[13-17]。
在現有神經修復材料中，天然可降解材料因細胞相容性好、降解產物對神經組織副作用低，逐漸成為本領域的研究重點[18-20]。蠶絲是具有中國特色的纖維材料，近年來在再生醫學領域獲得普遍關注。蠶絲主要由內部的絲蛋白和外部的絲膠蛋白組成，兩種蛋白均具有良好的生物相容性和促進細胞增殖、組織再生能力，可應用于皮膚、血管、骨、神經等組織的再生。在實際應用中，通過碳酸鈉等鹽溶液溶解去除絲膠蛋白即可獲得絲蛋白纖維，純化工藝簡單，便于規模化生產和處理；而絲膠蛋白在鹽溶液中濃度低，提純困難，因此與絲膠蛋白相比，絲蛋白在再生醫學領域更受研究者青睞[21-23]。絲蛋白不僅可以設計加工成類似于天然周圍神經的多種仿生結構[24-25]，同時可作為載體加載不同活性成分，并通過對不同活性成分的控釋實現炎癥反應、抗氧化性能以及促血管化能力的調節，以創造更有利于神經再生的微環境，在神經組織工程領域備受關注。考慮到絲蛋白在神經組織工程中的廣泛應用，本文將著重介紹絲蛋白在周圍神經再生的最新研究進展，特別是以絲蛋白為基質引入不同誘導信號主動刺激周圍神經修復的研究成果，評估它們在治療周圍神經損傷方面的臨床應用前景。
1 絲蛋白神經修復材料的基本特征
盡管聚氨酯和膠原蛋白等生物材料已被批準用于臨床周圍神經組織損傷修復治療，但兩者存在臨床效果一般或成本較高的問題，限制其廣泛應用。與膠原相比，絲蛋白來源豐富、成本低廉且更易加工，其良好的生物相容性、力學性能以及合適的滲透性等特點使其在周圍神經修復中具有顯著優勢[26-27]。
受損的周圍神經通常會出現微環境變化，引發炎癥反應和氧化應激，導致巨噬細胞浸潤、神經細胞死亡以及遠端神經節段脫髓鞘等，最終受損部分形成瘢痕，在物理上阻礙神經通路重建[28-30]。在周圍神經組織修復中，植入人工支架旨在通過構筑物理屏障避免瘢痕組織浸潤，提供有利于神經再生的微環境，支架自身應具有合適的生物相容性和生物活性，盡可能避免對神經修復的不良影響[3，31]。神經導管是人工植入支架的常見類型，理想的神經導管應具有優異的生物相容性以及與天然神經相似的滲透性和機械特性[32-33]。大量研究表明，不同神經細胞在絲蛋白材料上均表現出良好的黏附和增殖行為。Yang等[34]利用絲蛋白提取液和普通培養基分別培養大鼠雪旺細胞，他們發現細胞在絲蛋白提取液中的活力、增殖和生長因子分泌行為與在普通培養基中培養的細胞相似。絲蛋白材料還可以通過細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的仿生設計進一步提高生物相容性。以絲蛋白納米纖維為基質制備的仿生材料表現出更好的促進細胞生長、增殖能力，不僅雪旺細胞增殖更快，細胞之間的相互作用和聚集性能也獲得顯著提升[35]。除了優異的生物相容性，絲蛋白材料的可設計性賦予其合適的力學性能和滲透性，更好地滿足周圍神經組織修復要求。研究表明當孔隙直徑為10～20 μm時，導管具有合適的滲透行為，可通過有效清除代謝產物和及時營養供給促進神經再生[36]。絲蛋白周圍神經導管的孔隙可通過濃度和交聯等方式進行主動調控，以優化滲透性能并獲得更好的組織修復效果[37]。賦予導管適當的機械性能可避免其撕裂或塌陷[38-39]。絲蛋白神經導管機械性能可控，利用酶交聯等方法制備的絲蛋白導管拉伸強度可達（7.7±0.8）MPa，類似于豬腓骨和脛骨神經，能夠為周圍神經再生提供適宜的力學環境[40-41]。這些研究表明以絲蛋白為基質制備的神經導管在生物相容性、滲透性以及機械性能等方面均可滿足周圍神經組織修復的要求，絲蛋白是周圍神經修復的理想材料。
2 絲蛋白基神經導管的結構設計
2.1 空心多孔結構
在周圍神經導管的研究中，導管最初為簡單的圓柱形空心管，為神經組織再生提供空間，并避免外周組織侵入。隨著研究深入，在空心多孔導管中更好地引導神經細胞黏附、增殖和遷移成為提高其神經修復性能的有效策略。對空心管的物理結構進行特殊設計，如引入多孔/凹槽、各向異性的表面結構、多通道結構和填充復合結構等，可以主動誘導神經細胞黏附、增殖和遷移，加快神經再生[42]。
2.2 各向異性的多通道結構
表面結構對神經再生有顯著影響[43-44]，取向排列凹槽可以誘導雪旺細胞定向生長和遷移。Gu等[45]通過凹槽模板調節絲蛋白凝膠上的排列凹槽，以改善軸突伸長情況，當凹槽尺寸為30 μm時可實現最佳再生效果。然而，單管狀導管無法模擬神經的神經束結構，中空間隙會導致神經連接錯位，再生神經組織難以實現功能恢復正常。為提高神經修復效果，研究者嘗試利用絲蛋白制備多通道神經導管，以更好地模擬天然神經束結構。有研究通過電紡絲首先制備取向結構的絲蛋白薄膜，隨后通過卷曲技術獲得多通道導管；利用上述多通道導管進行周圍神經組織修復，神經軸突延長性能顯著改善，再生神經組織功能提升，證明上述取向多通道結構能夠有效誘導神經再生[46-48]。溫度響應形狀記憶聚合物（temperature responsive shape memory polymers，TRSMPs）也被用于多通道結構的制備。TRSMPs能夠通過溫度調節形成直徑可調的多通道導管，將其和絲蛋白結合，可制備性能更好的多通道神經導管[49]，獲得比單通道導管更優異的神經修復能力。然而，盡管多通道技術的使用提高了絲蛋白基導管的神經再生能力，但與自體神經修復相比仍存在顯著差距，需要進一步優化材料的仿生設計來獲得與自體神經移植相似的治療效果[50-51]。
2.3 填充物-導管復合結構
ECM可參與多個生化過程，主動影響組織再生[52-53]。ECM的多級三維結構可主動調控細胞生長、遷移、分化和分泌等行為，誘導組織的再生和修復。除了物理信號，神經組織ECM中還存在層粘連蛋白和纖維連接蛋白等不同蛋白質聚集體，同樣可影響細胞的遷移和分化[54]。例如，層粘連蛋白刺激軸突再生并激活雪旺細胞[55-56]，纖維連接蛋白可以促進細胞黏附和生長[57-58]。因此，同時模擬ECM的微結構和組成，可為神經修復提供更友好的微環境。
基于如上策略，研究者嘗試通過在絲蛋白神經導管中同時引入物理仿生信號和生長因子來提高神經再生的速度和質量。為更好模擬神經特殊微環境，有研究者將磁性聚乳酸-羥基乙酸共聚物［poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA］ 微膠囊加載NGF后，填充至絲蛋白/明膠復合神經管中，利用磁場調節微膠囊，實現其在管道內部的梯度和各向異性分布。通過微膠囊的梯度分布結合生長因子的緩慢控釋，成功獲得生長因子梯度分布的絲蛋白基神經導管，為神經再生同時提供梯度和因子誘導信號，修復效果明顯改善[59-61]。
考慮到結構和性能的可調控性，絲蛋白不僅能用于制備神經導管，同時還可設計制備成神經導管的填充物，以更好地模擬ECM的微觀結構[62-63]。Rao等[64]設計了一種填充聚乳酸和絲蛋白納米纖維海綿的殼聚糖神經導管，采用氣體發泡技術制備納米纖維海綿以避免形成薄膜層，保證填充物的通透性，結果顯示填充納米纖維海綿的復合神經導管能夠顯著促進神經再生。為了優化填充物的多級仿生結構，Du等[65]開發了取向纖維蛋白填充的殼聚糖神經導管，雪旺細胞在神經導管中培養3 d可形成排列整齊的聚集體，證明了取向結構的誘導作用。有研究利用大鼠坐骨神經損傷模型對導管性能進行評價發現，導管植入12周后再生神經組織的神經纖維直徑和髓鞘厚度接近自體神經移植，表明取向的納米纖維對神經再生具有促進作用[66-67]。絲蛋白能夠在溶液中自組裝形成高電荷密度的納米纖維，可以在電場力作用下遷移形成取向結構，同樣被用于神經的取向仿生設計[68-69]。Lu等[24]利用電場誘導絲蛋白納米纖維取向形成凝膠，用于周圍神經修復取得了與自體神經移植相近的結果。該方法制備的絲蛋白納米纖維凝膠還可以負載姜黃素和NGF等活性成分，優化誘導神經再生微環境，不斷提高絲蛋白納米纖維神經導管的性能[68，70-71]。
3 加載活性成分的絲蛋白神經導管
3.1 加載神經營養因子的絲蛋白神經導管
神經組織損傷后，損傷部位的神經細胞會應答性分泌各種神經營養因子和生物活性分子啟動再生修復[72]。不同的神經營養因子可分別起到促進神經元存活、誘導軸突再生、刺激雪旺細胞遷移等作用。例如，NGF主要促進感覺神經元的生長，而膠質細胞源性神經因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）主要作用于運動神經元[73-75]。周圍神經再生是一個緩慢過程，需要不同神經營養因子和生物活性分子長期刺激。絲蛋白可以加載不同性質的因子和活性成分，研究者以其作為載體和基質，已開發出多種加載藥物的絲蛋白支架。Carvalho等[76]分別采用絲蛋白溶液中加入神經營養因子再酶交聯形成導管，以及先酶交聯絲蛋白形成導管再浸泡吸附的方法，制備含有神經營養因子的絲蛋白神經導管，成功將GDNF和NGF加載至絲蛋白神經導管。結果顯示，不同方法制備的神經導管表現出不同的藥物釋放行為，其中第1種方法制備的導管僅有微量GDNF和NGF緩慢釋放，而第2種方法由于神經營養因子固定于導管表面，NGF早期突釋，GDNF則緩慢持續釋放。不同的釋放行為使導管具有不同生物活性，動物實驗結果表明，緩慢釋放的GDNF更有利于再生神經的血管化[77]。
與其他天然材料相比，絲蛋白特殊的親疏水嵌段結構有利于保持因子活性。Lu等[78]發現部分生物酶可與絲蛋白氨基酸鏈的疏水區相互作用以保持其活性，固定在絲蛋白膜中的葡萄糖氧化酶在室溫下放置10個月后，仍表現出良好活性。Uebersax等[79]制備了固定NGF的絲蛋白膜，固定于膜上的NGF可持續釋放3周以上，且一直維持優異生物活性。神經源性生物活性分子在水溶液中可與絲蛋白分子作用，從而提高活性分子的穩定性。將添加有神經營養素3的絲蛋白溶液涂覆在PLGA支架上，可制備PLGA-絲蛋白復合支架，在復合支架上共同培養神經干細胞和雪旺細胞能夠主動誘導神經元和髓鞘形成[80]。在此基礎上調整絲蛋白溶液的涂覆時間可以實現活性物的梯度分布，進一步促進神經再生[81]。絲蛋白也可以制備成微球來加載神經營養因子，并通過控制微球的分布實現神經營養因子的梯度緩釋[82]。為在神經再生不同階段更好地調控活性成分梯度，研究者將溫度響應性材料和絲蛋白結合，利用溫度響應性主動調控活性成分的分布。Huang等[61]設計了一種明膠-絲蛋白復合神經導管，其中絲蛋白提供機械性能，明膠賦予導管溫度響應性，通過明膠不同溫度下可逆的溶膠-凝膠相轉變，使得復合導管在溫度>20℃時具有一定流動性。將負載有NGF的磁性納米粒子引入復合導管中，在合適溫度下施加磁場刺激誘導磁性粒子遷移，可同時實現各向異性和梯度分布，為神經再生提供主動調節的可控微環境[56]。適當的電信號刺激同樣有利于神經再生，將電刺激同生長因子結合，通過協同作用改善再生性能是神經導管研究的重要方向[83]。Cai等[84]首先利用擴散效應在甲基丙烯酸甲酯改性的絲蛋白水凝膠中實現神經營養因子的梯度分布，隨后涂覆石墨烯納米管獲得導電性，通過石墨烯納米管的電刺激和梯度分布的神經營養因子協同作用，顯著促進雪旺細胞的遷移。
不同種類的神經營養因子可通過協同作用動態調控神經再生，神經再生的不同階段對生長因子的需求存在差異，因此在神經導管內根據神經再生不同階段需求，獨立控制不同生長因子的釋放行為，能夠優化神經再生不同階段的微環境，獲得更好的修復效果[85-87]。Catrina等[88]研究了GDNF和NGF在絲蛋白和膠原中的釋放動力學，通過調整復合支架中絲蛋白和膠原的比例，優化不同因子的釋放行為，獲得最佳的組織修復效果。
3.2 加載天然和合成藥物的絲蛋白神經導管
除神經營養因子外，許多藥物如尿石蛋白A、姜黃素、維甲酸、FK506、褪黑素、阿伐他汀和水飛薊素等同樣可刺激神經再生[89-98]。嚴重的炎癥反應和氧化自由基會導致損傷部位雪旺細胞死亡以及瘢痕形成，因此具有抗氧化和抗炎能力的小分子藥物可以通過減輕炎癥和氧化應激程度，避免神經組織進一步損傷[28，69]。然而，上述藥物中多數為疏水性藥物，如何提高其在水相體系中的溶解和分散是決定其應用效果的關鍵。絲蛋白作為藥物載體已被用于裝載各種疏水性小分子藥物，為上述藥物在神經修復中的應用提供了新的解決思路。Zhang等[68]開發出一種溶劑體系藥物轉移的方法，成功將疏水性藥物加載至絲蛋白納米纖維上并將其分散到水溶液中，將上述加載體系和絲蛋白取向凝膠技術結合，可制備加載姜黃素、維甲酸等活性成分的取向神經導管。Liu等[71]利用該方法將疏水性積雪草苷加載至絲蛋白納米纖維上，有效抑制了瘢痕組織形成。基于該策略，設計加載不同藥物的絲蛋白神經導管，實現周圍神經組織的再生和功能修復將成為本領域富有潛力的研究方向。
4 總結及展望
周圍神經再生受多種物理和生物化學信號的調節，絲蛋白能夠同時調控物理和生物化學信號，是制備神經導管的理想基質。以絲蛋白為基質，通過微米/納米尺度的結構仿生、多通道結構的設計、取向信號的優化，以及不同活性成分的加載控釋和梯度分布，不同團隊已成功制備具有生物活性的神經導管，在周圍神經組織修復領域取得良好效果。
與皮膚、骨等其他組織相比，周圍神經修復更為復雜，需要整合生物、組織工程、材料和臨床醫學等多個學科的知識，構筑有利于組織修復的微環境，主動誘導組織再生。盡管目前已有多個神經導管產品應用于臨床，但是可主動誘導神經修復的生物活性神經導管研究仍多處于動物實驗階段，優化材料的功能設計以期更好地滿足臨床需求，依然存在較大挑戰。與其他材料相比，絲蛋白在多種信號的引入和主動設計方面具有顯著優勢。以絲蛋白為平臺，可通過簡單的物理方法在神經導管內部同時實現取向、力學、多級微結構的仿生設計，避免化學改性以及其他有毒有害物質的使用，獲得兼具生物相容性和生物活性的神經導管。同時，利用絲蛋白可加載控釋不同活性成分的優勢，可根據神經修復具體需求，在實現多維度仿生設計的同時加載調節炎癥、促血管、誘導神經分化的因子和藥物，主動設計不同活性成分的釋放行為，構筑動態變化微環境，更積極主動地誘導神經再生，有望超越自體神經移植，為大尺寸神經損傷修復提供新思路。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突
作者貢獻聲明 吳俊峰：內容構思、文獻查找、文章撰寫；孔祥東：文章審閱和修改；呂強：文章設計、統籌、對學術內容進行指導修改