引用本文： 陳小雷, 胡浩磊, 李誼, 岳瑋, 張秀靜, 沈德新, 麻文來, 邢培梅, 張亞戈, 關泰紅. 3D生物打印技術在耳廓修復重建中的應用研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2024, 38(6): 763-768. doi: 10.7507/1002-1892.202403001 復制
版權信息： ?四川大學華西醫院華西期刊社《中國修復重建外科雜志》版權所有，未經授權不得轉載、改編
耳廓畸形是一種常見顱面部畸形，主要由外傷、腫瘤導致以及胚胎發育期環境、遺傳等因素影響造成[1]。耳廓畸形不僅給患者帶來嚴重心理負擔，還伴隨不同程度聽力損失。目前臨床主要采用自體肋軟骨修復重建，存在肺氣腫、感染、植入物暴露和術后瘢痕等并發癥，而且耳廓重建效果與術者軟骨雕刻技術密切相關[2]。高密度多孔聚乙烯（Medpor）也是臨床常用的耳廓重建植入物，能夠縮短手術時間并獲得與對側耳廓尺寸匹配的重建效果[3]。但植入物與宿主組織結合過程中，除了術區感染和血腫發生比例較高外，還存在植入物移位和生物活性不足的問題。
隨著組織工程技術的發展，組織工程耳廓成為耳廓修復重建的一種新方法[4]。傳統3D打印技術制作的耳廓植入物存在機械穩定性不足、軟骨細胞生長空間有限和框架收縮變形等問題[5]。為了解決這些問題并更好地模擬天然耳廓結構和功能，學者們開始采用3D生物打印技術。該技術作為一種特殊的3D打印技術，成功結合了生物技術和3D打印技術，可以精確打印具有復雜結構和功能的耳廓植入物，有望提高重建效果。現就3D生物打印技術在耳廓修復重建中的應用研究進展作一綜述，以期為后續相關研究提供參考。
1 3D生物打印技術概述
3D打印技術是通過逐層堆疊、熔融沉積建模、激光燒結等方式創建三維物體，目前已廣泛應用于醫學領域[6-7]，構建的模型不僅能直觀展現耳廓復雜解剖結構，還能用于術前模擬操作，提高手術成功率。但是傳統3D打印過程中存在高溫、干燥或需要采用有毒化學品等對細胞不利的因素，因此需要先打印支架，然后將體外培養細胞接種至支架來構建組織工程耳廓。該構建方式無法有效利用支架孔隙，而且難以精確控制細胞分布。
3D生物打印技術是一種新興制造技術，可以將細胞混合于生物墨水中，通過控制打印環境，直接打印出含有活細胞的組織工程耳廓。與傳統3D打印技術相比，該技術可以更好地保護細胞，并實現細胞精確分布，通過編程控制和采用多條打印路徑，構建具有多重復雜功能的組織，在組織工程領域具有巨大應用潛力[8]。3D生物打印方式的選擇是組織再生成功的關鍵之一，目前主流打印方式包括擠壓、液滴、光固化和激光輔助打印，各有優勢，需要根據打印材料理化性質和細胞生長環境要求進行選擇[9]。見表1。
表1
3D生物打印方式分類及特點
Table1.
Classification and characteristics of 3D bioprinting methods
2 傳統3D打印技術在耳廓修復重建中的應用
軟骨是耳廓主要組織，其彈性和柔韌性使耳廓能保持特定外形，承受一定外力且不易變形。但軟骨再生能力有限，臨床上對軟骨缺損的治療效果尚不理想，尤其是耳廓缺損修復重建。充足的細胞與成熟組織形成是耳廓修復重建中耳狀軟骨支架維持良好形態的關鍵。大量研究采用傳統3D打印技術構建支架并接種細胞，以構建組織工程耳廓[21]。3D打印支架表面具有微孔或納米纖維結構，增加了細胞附著和增殖表面積，有利于細胞黏附生長；打印材料主要選擇天然、合成和可生物降解材料，如膠原蛋白、纖維素、聚己內酯及聚乳酸等[22-23]。然而，這些涉及離體培養細胞接種的支架在實踐中存在同樣缺點，例如自體細胞來源有限、細胞擴增過程耗時、存活率低和免疫排斥等[24]。
為了克服這些缺點，近年來學者們在材料設計和細胞環境方面尋求突破，希望能開發出更好的支架構建方法和適合打印的生物材料。Kim等[21]使用3D打印技術采用聚氨酯材料制造了多孔、非多孔兩種微結構支架，聚氨酯材料具有良好生物相容性和彈性力學性能，結果顯示構建的多孔聚氨酯支架具有規則間距和線條的矩形微結構，孔隙率高（56.46%±10.22%），孔徑為200 μm，可以更好地模擬正常耳廓特性。Brennan等[5]采用聚己內酯以激光燒結方法設計構建雙階段支架。該方法將基礎平臺和耳部構件分開制作，并在手術中分兩次植入。動物實驗結果發現雙階段支架相比單階段支架在減少軟組織潰瘍、壞死等并發癥方面具有優勢。Wang等[25]選擇了明膠和海藻酸鈉作為細胞載體，填充到3D打印支架孔隙中，以促使支架與周圍正常耳軟骨結合。他們提出海藻酸鈉具有逐漸被附近細胞及生物流體分解、去除的特性，為軟骨細胞在支架孔隙中的增殖提供了足夠時間和空間；而明膠則含有類似Arg-Gly-Asp序列的肽片段，能夠促進細胞在支架上的附著和遷移。
細胞選擇是構建組織工程耳廓的關鍵環節之一，Otto等[26]選擇人耳軟骨祖細胞（auricular chondrocyte progenitor cells，AuCPCs）負載于3D打印耳廓支架，體外培養結果顯示AuCPCs能持續產生大量軟骨基質成分，對于維持軟骨結構和功能具有重要意義。除選擇單一類型細胞外，學者們還探討多種細胞共培養的可行性，以提高耳廓支架組織再生能力。在軟骨細胞與干細胞共培養方案中，干細胞的存在提高了軟骨細胞的軟骨形成潛力[27]。這種共培養方法可以使干細胞在基因水平表現出與軟骨細胞相似的表達模式，從而促進軟骨細胞增殖，并為軟骨再生奠定基礎[28]。Landau等[29]用小鼠模型檢測了不同來源軟骨細胞與MSCs共培養組合可行性，結果表明70%～80% MSCs和30%～20% 軟骨細胞組合共培養效果最佳，這種比例可以確保細胞均勻分布，并且有助于維持軟骨細胞表型。同時，他們采用3D打印和冷凍干燥成型方式制備支架。大孔徑由3D打印模具形成，小孔徑由冷凍干燥過程形成，這種結構有利于細胞定植以及軟骨組織形成。Jang等[30]運用熔融沉積成型的3D打印技術構建了仿人耳軟骨支架，以藻酸鹽水凝膠和聚己內酯交聯，模擬組織內細胞生長環境，通過共培養脂肪干細胞和軟骨細胞，成功促進軟骨和骨協同生成。研究結果表明通過3D打印技術將細胞搭載于支架上進行培養，可更有效地促進代謝活性。相比于軟骨細胞，MSCs易于擴增，但由于支架的表面性質不同，可能引起細胞朝向肥大分化和軟骨內骨化途徑發展，造成礦物質沉積乃至支架形變[31]。
選擇細胞來源和移植方法時還需要考慮免疫排斥反應、細胞增殖和遷移能力等因素[32]。此外，不同支架材料對細胞的影響也應納入考慮范圍，需要綜合考慮細胞生物學特性和支架材料特性，以確保移植后的細胞能夠有效地促進耳廓重建和組織修復。
3D打印支架除細胞、生物材料的選擇外，為提升支架軟骨性能，還有必要對支架表面性能進行改進。最近，聚多巴胺（polydopamine，PDA）涂層作為一種表面改性劑因其優異黏附能力受到關注[33]。PDA具有良好涂覆性能，可以在物體表面形成約50 nm厚涂層，當物體被浸泡在水溶液中時，該涂層會形成孔隙結構。同時PDA涂層具有豐富的羧基、氨基和亞氨基等官能團，可以作為生物反應的“橋梁”，提高材料生物相容性[34]。在此基礎上， Yin等[35]研究了一種制備高密度聚乙烯（high density polyethylene，HDPE）多孔耳廓支架的新方法，首先通過擠壓3D打印方法構建支架，然后采用PDA涂層法對支架進行活化，并采用逐層自組裝技術在支架表面構建多層ε-聚賴氨酸和纖維蛋白修飾。與單純3D打印HDPE耳廓支架相比，涂層處理的HDPE耳廓支架能夠促進組織向內生長，并改善由局部應激引起的炎癥反應。3D打印技術和表面修飾技術的結合為開發具有生物功能涂層的個性化植入物提供了一種極具潛力的途徑。
3 3D生物打印技術在耳廓修復重建中的應用
與傳統3D打印技術不同，3D生物打印技術通常采用混合細胞的生物墨水，直接打印出均勻分布細胞的支架。這種支架植入時能夠保持形狀，并以與軟骨形成速度相匹配的速度降解[36]，對于模擬真實的耳廓結構具有重要意義，以獲得滿意的耳廓外觀及功能。3D生物打印目標是利用支架材料模擬細胞外基質，并將細胞精準分布在支架中，從而構建與正常耳廓組成、結構及功能相似的活性組織。根據打印目標組織不同，生物墨水選擇、細胞種類篩選以及支架結構設計均有所差異。目前研究常用于制備生物墨水的生物材料包括甲基丙烯酸明膠（methacrylated gelalin，GelMA）、海藻酸鈉和透明質酸等，其中GelMA因具有優異的力學性能、生物相容性和抗菌能力已獲得廣泛研究[37]。
Zeng等[38]開發了一種形狀精確、力學性能高、軟骨特異性基質豐富的仿生耳廓，并加入0.375%細菌納米纖維素（bacterial nanocellulose，BNC）增強GelMA水凝膠的生物力學性能和可打印性，同時促進了水凝膠中細胞遷移。Bhamare等[39]研究了一種新型生物墨水用于打印軟骨組織，該生物墨水中添加了聚乙烯醇和明膠，其中聚乙烯醇的使用對于平衡可打印性和物理特性起到重要作用，確保了生物墨水在打印過程中的流動性和穩定性；體內實驗顯示這種材料組合促進了軟骨細胞和彈性纖維蛋白在3D打印耳廓中的再生。上述研究表明添加了聚合物的合成生物墨水在3D生物打印技術應用中具有重要價值。Jia等[40]設計了一種基于生物仿生微孔光交聯無細胞軟骨基質生物墨水——甲基丙烯酸酯改性脫細胞軟骨基質（methacrylate-modified acellular cartilage matrix，ACMMA）。他們利用集成多噴嘴的3D生物打印技術，將該生物墨水與GelMA、聚己內酯結合，通過添加聚乙二醇作為孔形成劑，成功地在交聯的ACMMA/GelMA水凝膠中形成了微孔結構。這種微孔結構有助于細胞遷移和營養物質交換，從而促進了軟骨組織形成。類似的，Visscher等[41]對豬耳廓軟骨組織進行脫細胞處理，并將其來源的脫細胞外基質使用甲基丙烯酸酯化方式加工制成生物墨水，在保證支架機械性與結構完整性的同時，成功促進軟骨細胞活性，并構建了特異性三維微環境，從而促進軟骨修復。
在3D生物打印過程中，加入活性生物分子（如細胞外基質、細胞外囊泡和TGF-β3等）能促進細胞增殖、分化和受損組織修復。活性生物分子可采用涂覆、浸漬、直接混合于支架材料或包裹在微球、納米顆粒中等方式引入。研究表明MSCs的軟骨修復潛力主要源于細胞外囊泡/外泌體的分泌，這些外泌體是一組脂質結合的納米顆粒，具有將治療分子輸送到特定細胞的能力，表明外泌體可能是一種修復軟骨缺損的新方法[42]。類似的，Guo等[43]研究發現來自耳軟骨細胞的細胞外囊泡能有效促進脂肪干細胞的增殖和遷移能力。此外，細胞外囊泡能夠上調彈性蛋白基因表達，在維持彈性軟骨細胞表型方面比TGF-β3更具優勢。然而，這些外泌體能否促進成熟耳軟骨細胞的軟骨形成尚未明確。傳統二維外泌體提取方式為超速離心法，但在長時間離心過程中，外泌體可能被強力離心力破壞或沉淀不完全。對此，Chen等[44]使用了孔徑100～200 μm的多孔明膠-甲基丙烯酰基（多孔凝膠）水凝膠三維培養人脂肪干細胞，并獲得相應外泌體。與二維平面相比，三維平臺培養的外泌體產量更大，有利于實現更大規模生產；同時外泌體顯示出增強細胞增殖、減少細胞凋亡和促進耳廓軟骨再生的效果。
4 總結及展望
由于軟骨損傷通常呈不規則形狀，因此需要進行個性化定制來減少結構不符引起的相關并發癥。而3D打印支架能夠輕松塑形以填充各種形狀軟骨缺損，并緊密貼合宿主軟骨。目前，3D生物打印技術構建組織工程耳廓面臨的主要挑戰是在尋找合適生物材料和優化支架結構設計之間取得平衡，尋找一種既符合復雜組織的機械性要求，又符合生物要求的生物墨水，以精確構建耳廓是研究技術難點。此外，為了實現良好的軟骨再生，有必要對耳廓支架生物功能進行改進，以吸引更多內源性細胞。目前3D生物打印相關研究主要是動物實驗，臨床研究較少；要將構建的耳廓支架應用于臨床，還需要進行更多臨床前研究，以評估其在人體內的生物相容性和安全性，以期為臨床醫生及患者提供更多選擇。
利益沖突 在文章撰寫過程中不存在利益沖突；基金支持未影響文章觀點及報道
作者貢獻聲明 陳小雷、胡浩磊：綜述設計、文獻檢索和文章撰寫；李誼：文章審閱及指導修改；岳瑋、張秀靜、沈德新、麻文來、邢培梅、張亞戈、關泰紅：參與文獻檢索及文章修改
耳廓畸形是一種常見顱面部畸形，主要由外傷、腫瘤導致以及胚胎發育期環境、遺傳等因素影響造成[1]。耳廓畸形不僅給患者帶來嚴重心理負擔，還伴隨不同程度聽力損失。目前臨床主要采用自體肋軟骨修復重建，存在肺氣腫、感染、植入物暴露和術后瘢痕等并發癥，而且耳廓重建效果與術者軟骨雕刻技術密切相關[2]。高密度多孔聚乙烯（Medpor）也是臨床常用的耳廓重建植入物，能夠縮短手術時間并獲得與對側耳廓尺寸匹配的重建效果[3]。但植入物與宿主組織結合過程中，除了術區感染和血腫發生比例較高外，還存在植入物移位和生物活性不足的問題。
隨著組織工程技術的發展，組織工程耳廓成為耳廓修復重建的一種新方法[4]。傳統3D打印技術制作的耳廓植入物存在機械穩定性不足、軟骨細胞生長空間有限和框架收縮變形等問題[5]。為了解決這些問題并更好地模擬天然耳廓結構和功能，學者們開始采用3D生物打印技術。該技術作為一種特殊的3D打印技術，成功結合了生物技術和3D打印技術，可以精確打印具有復雜結構和功能的耳廓植入物，有望提高重建效果。現就3D生物打印技術在耳廓修復重建中的應用研究進展作一綜述，以期為后續相關研究提供參考。
1 3D生物打印技術概述
3D打印技術是通過逐層堆疊、熔融沉積建模、激光燒結等方式創建三維物體，目前已廣泛應用于醫學領域[6-7]，構建的模型不僅能直觀展現耳廓復雜解剖結構，還能用于術前模擬操作，提高手術成功率。但是傳統3D打印過程中存在高溫、干燥或需要采用有毒化學品等對細胞不利的因素，因此需要先打印支架，然后將體外培養細胞接種至支架來構建組織工程耳廓。該構建方式無法有效利用支架孔隙，而且難以精確控制細胞分布。
3D生物打印技術是一種新興制造技術，可以將細胞混合于生物墨水中，通過控制打印環境，直接打印出含有活細胞的組織工程耳廓。與傳統3D打印技術相比，該技術可以更好地保護細胞，并實現細胞精確分布，通過編程控制和采用多條打印路徑，構建具有多重復雜功能的組織，在組織工程領域具有巨大應用潛力[8]。3D生物打印方式的選擇是組織再生成功的關鍵之一，目前主流打印方式包括擠壓、液滴、光固化和激光輔助打印，各有優勢，需要根據打印材料理化性質和細胞生長環境要求進行選擇[9]。見表1。
表1
3D生物打印方式分類及特點
Table1.
Classification and characteristics of 3D bioprinting methods
2 傳統3D打印技術在耳廓修復重建中的應用
軟骨是耳廓主要組織，其彈性和柔韌性使耳廓能保持特定外形，承受一定外力且不易變形。但軟骨再生能力有限，臨床上對軟骨缺損的治療效果尚不理想，尤其是耳廓缺損修復重建。充足的細胞與成熟組織形成是耳廓修復重建中耳狀軟骨支架維持良好形態的關鍵。大量研究采用傳統3D打印技術構建支架并接種細胞，以構建組織工程耳廓[21]。3D打印支架表面具有微孔或納米纖維結構，增加了細胞附著和增殖表面積，有利于細胞黏附生長；打印材料主要選擇天然、合成和可生物降解材料，如膠原蛋白、纖維素、聚己內酯及聚乳酸等[22-23]。然而，這些涉及離體培養細胞接種的支架在實踐中存在同樣缺點，例如自體細胞來源有限、細胞擴增過程耗時、存活率低和免疫排斥等[24]。
為了克服這些缺點，近年來學者們在材料設計和細胞環境方面尋求突破，希望能開發出更好的支架構建方法和適合打印的生物材料。Kim等[21]使用3D打印技術采用聚氨酯材料制造了多孔、非多孔兩種微結構支架，聚氨酯材料具有良好生物相容性和彈性力學性能，結果顯示構建的多孔聚氨酯支架具有規則間距和線條的矩形微結構，孔隙率高（56.46%±10.22%），孔徑為200 μm，可以更好地模擬正常耳廓特性。Brennan等[5]采用聚己內酯以激光燒結方法設計構建雙階段支架。該方法將基礎平臺和耳部構件分開制作，并在手術中分兩次植入。動物實驗結果發現雙階段支架相比單階段支架在減少軟組織潰瘍、壞死等并發癥方面具有優勢。Wang等[25]選擇了明膠和海藻酸鈉作為細胞載體，填充到3D打印支架孔隙中，以促使支架與周圍正常耳軟骨結合。他們提出海藻酸鈉具有逐漸被附近細胞及生物流體分解、去除的特性，為軟骨細胞在支架孔隙中的增殖提供了足夠時間和空間；而明膠則含有類似Arg-Gly-Asp序列的肽片段，能夠促進細胞在支架上的附著和遷移。
細胞選擇是構建組織工程耳廓的關鍵環節之一，Otto等[26]選擇人耳軟骨祖細胞（auricular chondrocyte progenitor cells，AuCPCs）負載于3D打印耳廓支架，體外培養結果顯示AuCPCs能持續產生大量軟骨基質成分，對于維持軟骨結構和功能具有重要意義。除選擇單一類型細胞外，學者們還探討多種細胞共培養的可行性，以提高耳廓支架組織再生能力。在軟骨細胞與干細胞共培養方案中，干細胞的存在提高了軟骨細胞的軟骨形成潛力[27]。這種共培養方法可以使干細胞在基因水平表現出與軟骨細胞相似的表達模式，從而促進軟骨細胞增殖，并為軟骨再生奠定基礎[28]。Landau等[29]用小鼠模型檢測了不同來源軟骨細胞與MSCs共培養組合可行性，結果表明70%～80% MSCs和30%～20% 軟骨細胞組合共培養效果最佳，這種比例可以確保細胞均勻分布，并且有助于維持軟骨細胞表型。同時，他們采用3D打印和冷凍干燥成型方式制備支架。大孔徑由3D打印模具形成，小孔徑由冷凍干燥過程形成，這種結構有利于細胞定植以及軟骨組織形成。Jang等[30]運用熔融沉積成型的3D打印技術構建了仿人耳軟骨支架，以藻酸鹽水凝膠和聚己內酯交聯，模擬組織內細胞生長環境，通過共培養脂肪干細胞和軟骨細胞，成功促進軟骨和骨協同生成。研究結果表明通過3D打印技術將細胞搭載于支架上進行培養，可更有效地促進代謝活性。相比于軟骨細胞，MSCs易于擴增，但由于支架的表面性質不同，可能引起細胞朝向肥大分化和軟骨內骨化途徑發展，造成礦物質沉積乃至支架形變[31]。
選擇細胞來源和移植方法時還需要考慮免疫排斥反應、細胞增殖和遷移能力等因素[32]。此外，不同支架材料對細胞的影響也應納入考慮范圍，需要綜合考慮細胞生物學特性和支架材料特性，以確保移植后的細胞能夠有效地促進耳廓重建和組織修復。
3D打印支架除細胞、生物材料的選擇外，為提升支架軟骨性能，還有必要對支架表面性能進行改進。最近，聚多巴胺（polydopamine，PDA）涂層作為一種表面改性劑因其優異黏附能力受到關注[33]。PDA具有良好涂覆性能，可以在物體表面形成約50 nm厚涂層，當物體被浸泡在水溶液中時，該涂層會形成孔隙結構。同時PDA涂層具有豐富的羧基、氨基和亞氨基等官能團，可以作為生物反應的“橋梁”，提高材料生物相容性[34]。在此基礎上， Yin等[35]研究了一種制備高密度聚乙烯（high density polyethylene，HDPE）多孔耳廓支架的新方法，首先通過擠壓3D打印方法構建支架，然后采用PDA涂層法對支架進行活化，并采用逐層自組裝技術在支架表面構建多層ε-聚賴氨酸和纖維蛋白修飾。與單純3D打印HDPE耳廓支架相比，涂層處理的HDPE耳廓支架能夠促進組織向內生長，并改善由局部應激引起的炎癥反應。3D打印技術和表面修飾技術的結合為開發具有生物功能涂層的個性化植入物提供了一種極具潛力的途徑。
3 3D生物打印技術在耳廓修復重建中的應用
與傳統3D打印技術不同，3D生物打印技術通常采用混合細胞的生物墨水，直接打印出均勻分布細胞的支架。這種支架植入時能夠保持形狀，并以與軟骨形成速度相匹配的速度降解[36]，對于模擬真實的耳廓結構具有重要意義，以獲得滿意的耳廓外觀及功能。3D生物打印目標是利用支架材料模擬細胞外基質，并將細胞精準分布在支架中，從而構建與正常耳廓組成、結構及功能相似的活性組織。根據打印目標組織不同，生物墨水選擇、細胞種類篩選以及支架結構設計均有所差異。目前研究常用于制備生物墨水的生物材料包括甲基丙烯酸明膠（methacrylated gelalin，GelMA）、海藻酸鈉和透明質酸等，其中GelMA因具有優異的力學性能、生物相容性和抗菌能力已獲得廣泛研究[37]。
Zeng等[38]開發了一種形狀精確、力學性能高、軟骨特異性基質豐富的仿生耳廓，并加入0.375%細菌納米纖維素（bacterial nanocellulose，BNC）增強GelMA水凝膠的生物力學性能和可打印性，同時促進了水凝膠中細胞遷移。Bhamare等[39]研究了一種新型生物墨水用于打印軟骨組織，該生物墨水中添加了聚乙烯醇和明膠，其中聚乙烯醇的使用對于平衡可打印性和物理特性起到重要作用，確保了生物墨水在打印過程中的流動性和穩定性；體內實驗顯示這種材料組合促進了軟骨細胞和彈性纖維蛋白在3D打印耳廓中的再生。上述研究表明添加了聚合物的合成生物墨水在3D生物打印技術應用中具有重要價值。Jia等[40]設計了一種基于生物仿生微孔光交聯無細胞軟骨基質生物墨水——甲基丙烯酸酯改性脫細胞軟骨基質（methacrylate-modified acellular cartilage matrix，ACMMA）。他們利用集成多噴嘴的3D生物打印技術，將該生物墨水與GelMA、聚己內酯結合，通過添加聚乙二醇作為孔形成劑，成功地在交聯的ACMMA/GelMA水凝膠中形成了微孔結構。這種微孔結構有助于細胞遷移和營養物質交換，從而促進了軟骨組織形成。類似的，Visscher等[41]對豬耳廓軟骨組織進行脫細胞處理，并將其來源的脫細胞外基質使用甲基丙烯酸酯化方式加工制成生物墨水，在保證支架機械性與結構完整性的同時，成功促進軟骨細胞活性，并構建了特異性三維微環境，從而促進軟骨修復。
在3D生物打印過程中，加入活性生物分子（如細胞外基質、細胞外囊泡和TGF-β3等）能促進細胞增殖、分化和受損組織修復。活性生物分子可采用涂覆、浸漬、直接混合于支架材料或包裹在微球、納米顆粒中等方式引入。研究表明MSCs的軟骨修復潛力主要源于細胞外囊泡/外泌體的分泌，這些外泌體是一組脂質結合的納米顆粒，具有將治療分子輸送到特定細胞的能力，表明外泌體可能是一種修復軟骨缺損的新方法[42]。類似的，Guo等[43]研究發現來自耳軟骨細胞的細胞外囊泡能有效促進脂肪干細胞的增殖和遷移能力。此外，細胞外囊泡能夠上調彈性蛋白基因表達，在維持彈性軟骨細胞表型方面比TGF-β3更具優勢。然而，這些外泌體能否促進成熟耳軟骨細胞的軟骨形成尚未明確。傳統二維外泌體提取方式為超速離心法，但在長時間離心過程中，外泌體可能被強力離心力破壞或沉淀不完全。對此，Chen等[44]使用了孔徑100～200 μm的多孔明膠-甲基丙烯酰基（多孔凝膠）水凝膠三維培養人脂肪干細胞，并獲得相應外泌體。與二維平面相比，三維平臺培養的外泌體產量更大，有利于實現更大規模生產；同時外泌體顯示出增強細胞增殖、減少細胞凋亡和促進耳廓軟骨再生的效果。
4 總結及展望
由于軟骨損傷通常呈不規則形狀，因此需要進行個性化定制來減少結構不符引起的相關并發癥。而3D打印支架能夠輕松塑形以填充各種形狀軟骨缺損，并緊密貼合宿主軟骨。目前，3D生物打印技術構建組織工程耳廓面臨的主要挑戰是在尋找合適生物材料和優化支架結構設計之間取得平衡，尋找一種既符合復雜組織的機械性要求，又符合生物要求的生物墨水，以精確構建耳廓是研究技術難點。此外，為了實現良好的軟骨再生，有必要對耳廓支架生物功能進行改進，以吸引更多內源性細胞。目前3D生物打印相關研究主要是動物實驗，臨床研究較少；要將構建的耳廓支架應用于臨床，還需要進行更多臨床前研究，以評估其在人體內的生物相容性和安全性，以期為臨床醫生及患者提供更多選擇。
利益沖突 在文章撰寫過程中不存在利益沖突；基金支持未影響文章觀點及報道
作者貢獻聲明 陳小雷、胡浩磊：綜述設計、文獻檢索和文章撰寫；李誼：文章審閱及指導修改；岳瑋、張秀靜、沈德新、麻文來、邢培梅、張亞戈、關泰紅：參與文獻檢索及文章修改
