引用本文： 劉凱, 史凌云, 王蘇龍, 艾尼孜爾·亞力坤, 伊木讓·哈米提, 艾合買提江·玉素甫. “手風琴”技術與去鐵胺促進牽張成骨區骨再生效果的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2024, 38(8): 1001-1009. doi: 10.7507/1002-1892.202404073 復制
版權信息： ?四川大學華西醫院華西期刊社《中國修復重建外科雜志》版權所有，未經授權不得轉載、改編
隨著對牽張成骨（distraction osteogenesis，DO）的不斷驗證和探索，研究發現“手風琴”技術（accordion technique，AT）是促進血管化成骨并縮短DO礦化期的有效方法[1-3]，其通過外部循環軸向壓縮-牽拉應力刺激誘導內源性骨再生。我們前期研究發現，在DO礦化中期通過施加循環應力刺激可誘導牽張區局部低氧，激活缺氧誘導因子1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）/VEGF信號通路，有效增強牽張區骨再生與重建[4-5]。然而，漫長的治療周期、復雜的干預方法和高昂的費用仍制約著上述技術的發展及應用[6-8]。
近年來，誘導骨再生區域微血管形成的相關調控機制逐漸成為研究熱點，豐富的血管長入除能提供有助于骨再生和重建的營養物質外，還能與新骨形成中的多種復雜機制形成時間和空間上的相互依賴。組織缺氧已被證實是微血管生成的關鍵驅動力，并受HIF-1α/VEGF信號通路的調控[9]。該通路激活后可刺激前成骨細胞簇的募集，如BMSCs、巨噬細胞及多種生長因子，并調節再生骨骼的功能。去鐵胺（deferoxamine，DFO）是缺氧模擬物的一種鐵螯合劑，已被證明可間接穩定HIF-1α的活性并使其積累，從而激活HIF-1α/VEGF信號通路誘導微血管生成，加速牽張區骨再生[2, 10-11]。
但對于AT技術以及DFO，哪種更有利于牽張區骨再生與重建且易于臨床應用仍未明確。為此，我們通過建立大鼠股骨DO模型，比較DO礦化中期給予牽張區灌注DFO或采用AT技術的促成骨效果，動態觀察牽張區骨再生過程，為驗證激活HIF-1α/VEGF信號通路促進牽張區骨重建提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
45只SPF級成年雄性SD大鼠，體質量（400.0±20.7）g，由新疆醫科大學實驗動物中心提供。
1.5%異氟烷（上海雅培制藥有限公司）；2%戊巴比妥鈉、DFO（Sigma公司，美國）；HIF-1α抗體、VEGF抗體、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）抗體、骨鈣素（osteocalcin，OCN）抗體、羊抗小鼠/兔二抗（Abcam公司，英國)；HIF-1α、VEGF、CD31及成骨相關轉錄因子（Osterix） ELISA試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）。
自制微型延長型外固定架（50.0 mm×12.0 mm×12.0 mm）；光鏡（Olympus公司，日本）；電子分析天平（Sartorius公司，德國）；三點彎曲力學試驗機（深圳瑞格爾儀器有限公司）；數字X線機（Toshiba公司，日本）；Micro-CT機（Bruker公司，德國）；病理切片機（Leica公司，德國）。
1.2 實驗分組及方法
參考本團隊前期研究方法制備大鼠右側股骨DO模型[4-5]。45只大鼠經腹腔注射2%戊巴比妥鈉（3 mg/100 g）麻醉后，于右后大腿中段外側作一縱切口，逐層切開皮膚、皮下組織，在股外側肌與股直肌間隙進入，暴露股骨中段，以此為截骨平面，在其近、遠端各打入2枚克氏針（直徑1.2 mm，長度250 mm），安裝自制微型延長型外固定架；微型擺鋸截骨，組裝并調試外固定架。生理鹽水沖洗術區、止血，依次縫合筋膜和皮膚。術后單籠飼養大鼠，每天腹腔注射青霉素20萬U/kg，持續7 d。
參照隨機數字表法，將大鼠模型分為對照組、DFO組及AT組（n=15）。各組截骨術后5 d內（潛伏期）均不作特殊處理，5 d后開始以0.25 mm/12 h速度持續延長10 d（牽張期），牽張完成后即進入礦化期。其中，對照組礦化期內不作干預。DFO組于礦化第3周開始灌注DFO，具體方法：采用生理鹽水制備DFO溶液（5 μg/100 μL）；使用1.5%異氟烷封閉麻醉技術對大鼠行短效麻醉后，于牽張區局部灌注DFO，每2天1次，每次300 μL ，持續10 d[4]。AT組于礦化第3周開始給予循環應力刺激，速度0.25 mm/12 h，壓縮5 d后牽張5 d[2]。
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
截骨術后觀察各組大鼠存活情況，以及礦化期DFO組及AT組進行相應處理后有無感染、不適等特殊情況發生。
1.3.2 X線片觀察
于牽張期結束及礦化第2、4、6周，各組大鼠攝股骨正位X線片[12]，觀察牽張區鈣化情況。
1.3.3 ELISA檢測
礦化第4、6周，3組各取5只大鼠，同上法腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉后，于心臟穿刺抽血2 mL。室溫下，以離心半徑10.2 cm，1 500 r/min離心15 min；取血清標本，按HIF-1α、VEGF、CD31及Osterix ELISA試劑盒檢測標準步驟，測量450 nm波長處吸光度（A）值并計算各樣本濃度值。
1.3.4 大體觀察
礦化第4、6周，5只取血后大鼠給予過量麻醉安樂死，按照原切口入路取股骨標本，觀察牽張區骨皮質外形及連續性。
1.3.5 Micro-CT觀測
礦化第6周大體觀察后，各組取3只大鼠實驗側股骨標本行Micro-CT掃描，使用CT機配套Skyscan CTAn定量分析軟件測量牽張區新生骨骨密度（bone mineral density，BMD）、骨體積/組織體積（bone volume/tissue volume，BV/TV）、骨小梁疏密度（trabecular separation，Tb.Sp）、骨小梁數量（trabecular number，Tb.N）及骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）。
1.3.6 生物力學測試
礦化第6周，各組取5只大鼠雙側股骨標本行三點彎曲生物力學測試。將股骨水平放置于三點彎曲力學試驗機跨距為18 mm的兩支點上，以0.5 mm/min加載速度在股骨正中施加垂直向下的壓力載荷直至股骨標本斷裂，記錄載荷、變形數據并計算極限載荷、彈性模量、斷裂能量及剛度，以實驗側與正常側比值行組間比較。
1.3.7 組織學及免疫組織化學染色觀察
將礦化第4周大體觀察后及第6周Micro-CT檢測后的股骨標本，置于12%乙二胺四乙酸液脫鈣4周后石蠟包埋。去除石蠟后使用病理切片機制備5 μm厚切片，按照標準操作步驟行組織學染色（HE染色）及免疫組織化學染色（HIF-1α、VEGF、OCN、OPN）。光鏡下免疫組織化學染色陽性表達區域或細胞呈棕褐色，于200倍鏡下切片隨機取3個視野，采用Image Pro Plus 6.0軟件行半定量分析。
1.4 統計學方法
采用SPSS21.0統計軟件進行分析，GraphPad Prism 9.0軟件繪制圖表。計量資料經Shapiro-Wilk檢驗均符合正態分布，數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
截骨術后3組大鼠均存活至實驗完成。礦化期DFO組以及AT組進行相應處理期間無實驗側肢體感染以及大鼠不適等情況發生。
2.2 X線片觀察
牽張期結束時3組截骨線平直，牽張區長度為5 mm。礦化第2周，3組牽張區均可見云霧狀低密度鈣化影，組間無顯著差異。礦化第4周，3組牽張區均可見大量新骨生成及高密度鈣化影，但DFO組、AT組間隙內新骨鈣化影密度優于對照組；與DFO組相比，AT組牽張區可見雙側骨皮質形成，連續性更好。礦化第6周， DFO組和AT組牽張區兩側均存在骨皮質并連接兩端截骨線，AT組髓腔重建優于DFO組；而對照組牽張區中央區呈現不連接。見圖1。
2.3 ELISA檢測
礦化第4、6周，AT組血清中HIF-1α、VEGF、CD31及Osterix含量均高于DFO組、對照組，DFO組高于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表1、2。
表表 1
3組結局指標組間比較（x±s）
Table表 1.
Comparison of outcome indicators between groups (x±s)
表表 2
3組結局指標兩兩比較
Table表 2.
Pairwise comparison of outcome indicators in 3 groups
2.4 大體觀察
礦化第4周，AT組牽張區形成連續骨皮質和少量不成熟新生骨痂且髓腔開始重建；DFO組及對照組牽張區存在不連續骨皮質和不成熟新生骨痂，髓腔未開始重建。礦化第6周，DFO組和AT組牽張區兩側可見完整骨皮質連接，而對照組間隙兩側未形成成熟骨皮質且中央區存在斷裂線；AT組髓腔部分再通，DFO組和對照組髓腔未通且仍存在纖維結締組織。見圖2。
2.5 Micro-CT及生物力學測試
礦化第6周，股骨Micro-CT掃描示AT組髓腔再通，牽張區骨皮質連續；DFO組及對照組未見完全再通髓腔。AT組牽張區新生骨BMD、BV/TV、Tb.Sp、Tb.N及Tb.Th均高于DFO組和對照組，DFO組高于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。生物力學測試示AT組極限載荷、彈性模量、斷裂能量和剛度均優于DFO組和對照組，DFO組優于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖3及表1、2。
2.6 組織學觀察
礦化第4周，AT組牽張區可見成纖維細胞和前成骨細胞增生活躍，微血管爬行擴張，形成豐富的新生骨痂。DFO組雖然可見增殖的前成骨細胞，但微血管爬行區域少于AT組。對照組牽張區前成骨細胞及微血管分布較DFO組和AT組稀疏。見圖4a。
礦化第6周，AT組牽張區骨髓腔重建且完全再通，DFO組髓腔部分再通，而對照組牽張區仍觀察到成纖維細胞及前成骨細胞分布，髓腔未再通。見圖4b。
2.7 免疫組織化學染色觀察
礦化第4周，牽張區HIF-1α、VEGF、OCN、OPN陽性染色區域AT組最多，其次為DFO組，對照組最少。礦化第6周，AT組及DFO組牽張區因新生骨痂礦化及髓腔重建，上述指標陽性染色區域減少；對照組牽張區新生骨痂礦化及髓腔重建緩慢，上述陽性染色區域仍較多。見圖5。
礦化第4周，AT組牽張區HIF-1α、VEGF、OCN、OPN表達量均高于DFO組和對照組， DFO組高于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。而礦化第6周，AT組上述指標表達量均低于DFO組和對照組；DFO組僅HIF-1α表達量低于對照組，而VEGF、OCN、OPN更高；但組間差異均無統計學意義（P>0.05）。見表1、2。
3 討論
牽張區再生骨痂組織中的微血管生成、爬行及連接成網是DO過程中骨再生成功的關鍵[12]。目前，國內外大量研究在DO過程中使用缺氧模擬物增強機械力刺激骨再生，但缺氧模擬物種類、用量仍缺乏統一標準，造成該干預措施適用性仍未明確[13]。DFO為鐵螯合劑，可與人體內鐵離子結合促使鐵排泄，常為鐵超負荷疾病治療的主要措施。Zhu等[14]采用DFO治療大鼠肺損傷的研究發現，DFO通過螯合鐵離子、抑制黃嘌呤氧化酶活性途徑，減少活性氧生成，提示其能抑制氧化應激反應。此外，DFO也可通過鐵螯合間接穩定HIF-1α活性，促進HIF-1α表達增多的同時驅使其進入細胞核形成復合物，并與HIF-1β結合形成具有活性的HIF-1復合物，通過HIF響應元件（HRE）啟動一系列成血管基因的轉錄，包括血管生成素1、VEGF、TGF-β等。本課題組前期研究發現，在大鼠DO礦化中期局部給予DFO，每2天1次，每次15 μg，有利于骨再生[4]。本次研究結果顯示，通過在礦化期給予牽張區局部注射DFO后，骨再生區域形成更多的微血管及骨小梁，再生骨質量也顯著優于對照組，表明DFO可有效促進骨再生區域低氧環境形成，并激活成血管-成骨耦聯加速骨重建。盡管DFO干預可獲得滿意的骨再生結果，但需解決有創操作、多次干預、缺乏標準劑量等問題，以便于臨床應用。
適宜的力學刺激環境在骨形成過程中也起著至關重要的作用，且機械力刺激可將成骨細胞聚集在受力活躍區域，從而使再生骨可適應該骨質健康狀態下所能承受的力學負荷[15-16]。外部機械應力誘導骨再生過程歸因于張力對牽張區內微血管形成及成骨干細胞募集和增殖的間接低氧環境刺激作用[14]。Wang等[16]比較了AT技術和單純壓縮技術治療兔萎縮性骨折不愈合的效果，發現AT技術干預可促進骨折端大量骨痂形成。Liu等[2]和Xu等[17]研究發現，在DO礦化中期進行高頻率、低幅度的循環應力刺激可激活HIF-1α/VEGF信號通路，有效促進牽張區再生骨形成、礦化和重建。基于前期研究基礎[2]，本次研究選擇AT方案為于礦化中期以壓縮5 d后牽張5 d、速度0.25 mm/12 h進行干預。X線片、Micro-CT掃描、生物力學及組織學染色結果顯示，循環應力刺激可通過激活HIF-1α/VEGF信號通路促進牽張區新骨形成及重建，且其促成骨再生和重建能力優于灌注DFO。究其原因，我們認為是低幅度的循環機械應力刺激過程引起牽張區低氧及增加HIF-1α活性程度強于灌注DFO過程，從而促進VEGF高表達，以增加牽張區新血管密度，改善骨痂組織的氧供應，促進成骨。此外，機械應力刺激遵循先壓縮后牽張順序及高頻率、低幅度牽張強度，也是獲得滿意骨再生關鍵。
在成骨細胞增殖、分化和骨重建過程中，HIF-1α、VEGF、CD31和Sp7/Osterix是成血管標志物，OCN和OPN是成骨標志物[18]。既往DO動物模型研究已發現，成血管及成骨標志物水平在礦化前4周逐漸增加，隨著再生骨礦化和髓腔重建，上述標志物表達水平逐漸下降。本次研究結果示礦化第4周時，AT組血清中HIF-1α、VEGF、CD31和Osterix含量顯著高于DFO組和對照組（P<0.05），免疫組織化學染色半定量分析也顯示HIF-1α、VEGF、OCN和OPN表達量顯著高于DFO組和對照組（P<0.05）。然而隨著牽張區再生骨組織成熟和重建，在礦化第6周時AT組上述成骨標志物逐漸降低，但血清中成血管標志物表達水平仍顯著高于DFO組和對照組（P<0.05），這可能是由于牽張區骨形成逐漸被替代為骨重建，破骨細胞活動增強促使髓腔再通引起。因此，與DFO組相比，AT組干預措施對于提升牽張區成血管及成骨活性更有效，并可更早獲得滿意的骨再生與重建效果。
綜上述，DO礦化中期牽張區局部灌注DFO及采用AT技術循環應力刺激均可激活HIF-1α/VEGF信號通路，加速成血管-成骨耦聯及骨重建，但后者效果更優，且操作簡便更易于臨床應用，提示其有助于縮短患者戴架時間，從而減少并發癥發生。但本研究樣本量有限且為動物實驗，有待大樣本量動物實驗聯合體外細胞實驗研究，驗證不同干預方式促進牽張區骨再生與重建的有效性以及臨床適用性。
志謝 新疆醫科大學第一附屬醫院骨科中心顯微修復外科培訓中心提供實驗平臺及卓菲婭護士長的指導
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 研究方案經新疆醫科大學第一附屬醫院動物實驗醫學倫理委員會批準（IACUC-20200318-82）；實驗動物使用許可證號：SYXK（新）2018-0003
作者貢獻聲明 劉凱、史凌云：研究實施及論文撰寫；王蘇龍、艾尼孜爾·亞力坤、伊木讓·哈米提：數據整理、統計學分析；艾合買提江·玉素甫：研究指導、論文修改及經費支持
隨著對牽張成骨（distraction osteogenesis，DO）的不斷驗證和探索，研究發現“手風琴”技術（accordion technique，AT）是促進血管化成骨并縮短DO礦化期的有效方法[1-3]，其通過外部循環軸向壓縮-牽拉應力刺激誘導內源性骨再生。我們前期研究發現，在DO礦化中期通過施加循環應力刺激可誘導牽張區局部低氧，激活缺氧誘導因子1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）/VEGF信號通路，有效增強牽張區骨再生與重建[4-5]。然而，漫長的治療周期、復雜的干預方法和高昂的費用仍制約著上述技術的發展及應用[6-8]。
近年來，誘導骨再生區域微血管形成的相關調控機制逐漸成為研究熱點，豐富的血管長入除能提供有助于骨再生和重建的營養物質外，還能與新骨形成中的多種復雜機制形成時間和空間上的相互依賴。組織缺氧已被證實是微血管生成的關鍵驅動力，并受HIF-1α/VEGF信號通路的調控[9]。該通路激活后可刺激前成骨細胞簇的募集，如BMSCs、巨噬細胞及多種生長因子，并調節再生骨骼的功能。去鐵胺（deferoxamine，DFO）是缺氧模擬物的一種鐵螯合劑，已被證明可間接穩定HIF-1α的活性并使其積累，從而激活HIF-1α/VEGF信號通路誘導微血管生成，加速牽張區骨再生[2, 10-11]。
但對于AT技術以及DFO，哪種更有利于牽張區骨再生與重建且易于臨床應用仍未明確。為此，我們通過建立大鼠股骨DO模型，比較DO礦化中期給予牽張區灌注DFO或采用AT技術的促成骨效果，動態觀察牽張區骨再生過程，為驗證激活HIF-1α/VEGF信號通路促進牽張區骨重建提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
45只SPF級成年雄性SD大鼠，體質量（400.0±20.7）g，由新疆醫科大學實驗動物中心提供。
1.5%異氟烷（上海雅培制藥有限公司）；2%戊巴比妥鈉、DFO（Sigma公司，美國）；HIF-1α抗體、VEGF抗體、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）抗體、骨鈣素（osteocalcin，OCN）抗體、羊抗小鼠/兔二抗（Abcam公司，英國)；HIF-1α、VEGF、CD31及成骨相關轉錄因子（Osterix） ELISA試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）。
自制微型延長型外固定架（50.0 mm×12.0 mm×12.0 mm）；光鏡（Olympus公司，日本）；電子分析天平（Sartorius公司，德國）；三點彎曲力學試驗機（深圳瑞格爾儀器有限公司）；數字X線機（Toshiba公司，日本）；Micro-CT機（Bruker公司，德國）；病理切片機（Leica公司，德國）。
1.2 實驗分組及方法
參考本團隊前期研究方法制備大鼠右側股骨DO模型[4-5]。45只大鼠經腹腔注射2%戊巴比妥鈉（3 mg/100 g）麻醉后，于右后大腿中段外側作一縱切口，逐層切開皮膚、皮下組織，在股外側肌與股直肌間隙進入，暴露股骨中段，以此為截骨平面，在其近、遠端各打入2枚克氏針（直徑1.2 mm，長度250 mm），安裝自制微型延長型外固定架；微型擺鋸截骨，組裝并調試外固定架。生理鹽水沖洗術區、止血，依次縫合筋膜和皮膚。術后單籠飼養大鼠，每天腹腔注射青霉素20萬U/kg，持續7 d。
參照隨機數字表法，將大鼠模型分為對照組、DFO組及AT組（n=15）。各組截骨術后5 d內（潛伏期）均不作特殊處理，5 d后開始以0.25 mm/12 h速度持續延長10 d（牽張期），牽張完成后即進入礦化期。其中，對照組礦化期內不作干預。DFO組于礦化第3周開始灌注DFO，具體方法：采用生理鹽水制備DFO溶液（5 μg/100 μL）；使用1.5%異氟烷封閉麻醉技術對大鼠行短效麻醉后，于牽張區局部灌注DFO，每2天1次，每次300 μL ，持續10 d[4]。AT組于礦化第3周開始給予循環應力刺激，速度0.25 mm/12 h，壓縮5 d后牽張5 d[2]。
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
截骨術后觀察各組大鼠存活情況，以及礦化期DFO組及AT組進行相應處理后有無感染、不適等特殊情況發生。
1.3.2 X線片觀察
于牽張期結束及礦化第2、4、6周，各組大鼠攝股骨正位X線片[12]，觀察牽張區鈣化情況。
1.3.3 ELISA檢測
礦化第4、6周，3組各取5只大鼠，同上法腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉后，于心臟穿刺抽血2 mL。室溫下，以離心半徑10.2 cm，1 500 r/min離心15 min；取血清標本，按HIF-1α、VEGF、CD31及Osterix ELISA試劑盒檢測標準步驟，測量450 nm波長處吸光度（A）值并計算各樣本濃度值。
1.3.4 大體觀察
礦化第4、6周，5只取血后大鼠給予過量麻醉安樂死，按照原切口入路取股骨標本，觀察牽張區骨皮質外形及連續性。
1.3.5 Micro-CT觀測
礦化第6周大體觀察后，各組取3只大鼠實驗側股骨標本行Micro-CT掃描，使用CT機配套Skyscan CTAn定量分析軟件測量牽張區新生骨骨密度（bone mineral density，BMD）、骨體積/組織體積（bone volume/tissue volume，BV/TV）、骨小梁疏密度（trabecular separation，Tb.Sp）、骨小梁數量（trabecular number，Tb.N）及骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）。
1.3.6 生物力學測試
礦化第6周，各組取5只大鼠雙側股骨標本行三點彎曲生物力學測試。將股骨水平放置于三點彎曲力學試驗機跨距為18 mm的兩支點上，以0.5 mm/min加載速度在股骨正中施加垂直向下的壓力載荷直至股骨標本斷裂，記錄載荷、變形數據并計算極限載荷、彈性模量、斷裂能量及剛度，以實驗側與正常側比值行組間比較。
1.3.7 組織學及免疫組織化學染色觀察
將礦化第4周大體觀察后及第6周Micro-CT檢測后的股骨標本，置于12%乙二胺四乙酸液脫鈣4周后石蠟包埋。去除石蠟后使用病理切片機制備5 μm厚切片，按照標準操作步驟行組織學染色（HE染色）及免疫組織化學染色（HIF-1α、VEGF、OCN、OPN）。光鏡下免疫組織化學染色陽性表達區域或細胞呈棕褐色，于200倍鏡下切片隨機取3個視野，采用Image Pro Plus 6.0軟件行半定量分析。
1.4 統計學方法
采用SPSS21.0統計軟件進行分析，GraphPad Prism 9.0軟件繪制圖表。計量資料經Shapiro-Wilk檢驗均符合正態分布，數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
截骨術后3組大鼠均存活至實驗完成。礦化期DFO組以及AT組進行相應處理期間無實驗側肢體感染以及大鼠不適等情況發生。
2.2 X線片觀察
牽張期結束時3組截骨線平直，牽張區長度為5 mm。礦化第2周，3組牽張區均可見云霧狀低密度鈣化影，組間無顯著差異。礦化第4周，3組牽張區均可見大量新骨生成及高密度鈣化影，但DFO組、AT組間隙內新骨鈣化影密度優于對照組；與DFO組相比，AT組牽張區可見雙側骨皮質形成，連續性更好。礦化第6周， DFO組和AT組牽張區兩側均存在骨皮質并連接兩端截骨線，AT組髓腔重建優于DFO組；而對照組牽張區中央區呈現不連接。見圖1。
2.3 ELISA檢測
礦化第4、6周，AT組血清中HIF-1α、VEGF、CD31及Osterix含量均高于DFO組、對照組，DFO組高于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表1、2。
表表 1
3組結局指標組間比較（x±s）
Table表 1.
Comparison of outcome indicators between groups (x±s)
表表 2
3組結局指標兩兩比較
Table表 2.
Pairwise comparison of outcome indicators in 3 groups
2.4 大體觀察
礦化第4周，AT組牽張區形成連續骨皮質和少量不成熟新生骨痂且髓腔開始重建；DFO組及對照組牽張區存在不連續骨皮質和不成熟新生骨痂，髓腔未開始重建。礦化第6周，DFO組和AT組牽張區兩側可見完整骨皮質連接，而對照組間隙兩側未形成成熟骨皮質且中央區存在斷裂線；AT組髓腔部分再通，DFO組和對照組髓腔未通且仍存在纖維結締組織。見圖2。
2.5 Micro-CT及生物力學測試
礦化第6周，股骨Micro-CT掃描示AT組髓腔再通，牽張區骨皮質連續；DFO組及對照組未見完全再通髓腔。AT組牽張區新生骨BMD、BV/TV、Tb.Sp、Tb.N及Tb.Th均高于DFO組和對照組，DFO組高于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。生物力學測試示AT組極限載荷、彈性模量、斷裂能量和剛度均優于DFO組和對照組，DFO組優于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖3及表1、2。
2.6 組織學觀察
礦化第4周，AT組牽張區可見成纖維細胞和前成骨細胞增生活躍，微血管爬行擴張，形成豐富的新生骨痂。DFO組雖然可見增殖的前成骨細胞，但微血管爬行區域少于AT組。對照組牽張區前成骨細胞及微血管分布較DFO組和AT組稀疏。見圖4a。
礦化第6周，AT組牽張區骨髓腔重建且完全再通，DFO組髓腔部分再通，而對照組牽張區仍觀察到成纖維細胞及前成骨細胞分布，髓腔未再通。見圖4b。
2.7 免疫組織化學染色觀察
礦化第4周，牽張區HIF-1α、VEGF、OCN、OPN陽性染色區域AT組最多，其次為DFO組，對照組最少。礦化第6周，AT組及DFO組牽張區因新生骨痂礦化及髓腔重建，上述指標陽性染色區域減少；對照組牽張區新生骨痂礦化及髓腔重建緩慢，上述陽性染色區域仍較多。見圖5。
礦化第4周，AT組牽張區HIF-1α、VEGF、OCN、OPN表達量均高于DFO組和對照組， DFO組高于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。而礦化第6周，AT組上述指標表達量均低于DFO組和對照組；DFO組僅HIF-1α表達量低于對照組，而VEGF、OCN、OPN更高；但組間差異均無統計學意義（P>0.05）。見表1、2。
3 討論
牽張區再生骨痂組織中的微血管生成、爬行及連接成網是DO過程中骨再生成功的關鍵[12]。目前，國內外大量研究在DO過程中使用缺氧模擬物增強機械力刺激骨再生，但缺氧模擬物種類、用量仍缺乏統一標準，造成該干預措施適用性仍未明確[13]。DFO為鐵螯合劑，可與人體內鐵離子結合促使鐵排泄，常為鐵超負荷疾病治療的主要措施。Zhu等[14]采用DFO治療大鼠肺損傷的研究發現，DFO通過螯合鐵離子、抑制黃嘌呤氧化酶活性途徑，減少活性氧生成，提示其能抑制氧化應激反應。此外，DFO也可通過鐵螯合間接穩定HIF-1α活性，促進HIF-1α表達增多的同時驅使其進入細胞核形成復合物，并與HIF-1β結合形成具有活性的HIF-1復合物，通過HIF響應元件（HRE）啟動一系列成血管基因的轉錄，包括血管生成素1、VEGF、TGF-β等。本課題組前期研究發現，在大鼠DO礦化中期局部給予DFO，每2天1次，每次15 μg，有利于骨再生[4]。本次研究結果顯示，通過在礦化期給予牽張區局部注射DFO后，骨再生區域形成更多的微血管及骨小梁，再生骨質量也顯著優于對照組，表明DFO可有效促進骨再生區域低氧環境形成，并激活成血管-成骨耦聯加速骨重建。盡管DFO干預可獲得滿意的骨再生結果，但需解決有創操作、多次干預、缺乏標準劑量等問題，以便于臨床應用。
適宜的力學刺激環境在骨形成過程中也起著至關重要的作用，且機械力刺激可將成骨細胞聚集在受力活躍區域，從而使再生骨可適應該骨質健康狀態下所能承受的力學負荷[15-16]。外部機械應力誘導骨再生過程歸因于張力對牽張區內微血管形成及成骨干細胞募集和增殖的間接低氧環境刺激作用[14]。Wang等[16]比較了AT技術和單純壓縮技術治療兔萎縮性骨折不愈合的效果，發現AT技術干預可促進骨折端大量骨痂形成。Liu等[2]和Xu等[17]研究發現，在DO礦化中期進行高頻率、低幅度的循環應力刺激可激活HIF-1α/VEGF信號通路，有效促進牽張區再生骨形成、礦化和重建。基于前期研究基礎[2]，本次研究選擇AT方案為于礦化中期以壓縮5 d后牽張5 d、速度0.25 mm/12 h進行干預。X線片、Micro-CT掃描、生物力學及組織學染色結果顯示，循環應力刺激可通過激活HIF-1α/VEGF信號通路促進牽張區新骨形成及重建，且其促成骨再生和重建能力優于灌注DFO。究其原因，我們認為是低幅度的循環機械應力刺激過程引起牽張區低氧及增加HIF-1α活性程度強于灌注DFO過程，從而促進VEGF高表達，以增加牽張區新血管密度，改善骨痂組織的氧供應，促進成骨。此外，機械應力刺激遵循先壓縮后牽張順序及高頻率、低幅度牽張強度，也是獲得滿意骨再生關鍵。
在成骨細胞增殖、分化和骨重建過程中，HIF-1α、VEGF、CD31和Sp7/Osterix是成血管標志物，OCN和OPN是成骨標志物[18]。既往DO動物模型研究已發現，成血管及成骨標志物水平在礦化前4周逐漸增加，隨著再生骨礦化和髓腔重建，上述標志物表達水平逐漸下降。本次研究結果示礦化第4周時，AT組血清中HIF-1α、VEGF、CD31和Osterix含量顯著高于DFO組和對照組（P<0.05），免疫組織化學染色半定量分析也顯示HIF-1α、VEGF、OCN和OPN表達量顯著高于DFO組和對照組（P<0.05）。然而隨著牽張區再生骨組織成熟和重建，在礦化第6周時AT組上述成骨標志物逐漸降低，但血清中成血管標志物表達水平仍顯著高于DFO組和對照組（P<0.05），這可能是由于牽張區骨形成逐漸被替代為骨重建，破骨細胞活動增強促使髓腔再通引起。因此，與DFO組相比，AT組干預措施對于提升牽張區成血管及成骨活性更有效，并可更早獲得滿意的骨再生與重建效果。
綜上述，DO礦化中期牽張區局部灌注DFO及采用AT技術循環應力刺激均可激活HIF-1α/VEGF信號通路，加速成血管-成骨耦聯及骨重建，但后者效果更優，且操作簡便更易于臨床應用，提示其有助于縮短患者戴架時間，從而減少并發癥發生。但本研究樣本量有限且為動物實驗，有待大樣本量動物實驗聯合體外細胞實驗研究，驗證不同干預方式促進牽張區骨再生與重建的有效性以及臨床適用性。
志謝 新疆醫科大學第一附屬醫院骨科中心顯微修復外科培訓中心提供實驗平臺及卓菲婭護士長的指導
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 研究方案經新疆醫科大學第一附屬醫院動物實驗醫學倫理委員會批準（IACUC-20200318-82）；實驗動物使用許可證號：SYXK（新）2018-0003
作者貢獻聲明 劉凱、史凌云：研究實施及論文撰寫；王蘇龍、艾尼孜爾·亞力坤、伊木讓·哈米提：數據整理、統計學分析；艾合買提江·玉素甫：研究指導、論文修改及經費支持
