引用本文： 張毅, 劉新梅, 周廣起, 喬衍禮, 胡海洋, 劉宏生. β-氨基丙腈聯合血管緊張素Ⅱ誘導大鼠主動脈夾層模型的建立. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2024, 31(1): 127-134. doi: 10.7507/1007-4848.202203068 復制
版權信息： ?四川大學華西醫院華西期刊社《中國胸心血管外科臨床雜志》版權所有，未經授權不得轉載、改編
主動脈夾層（aortic dissection，AD）是臨床上的一種危急重癥，它是由多種因素造成主動脈內膜與部分中層發生撕裂，而后受到血管內血流的沖擊，并沿著縱軸剝離形成相通或不通的主動脈壁真假兩腔的分離狀態[1]。在出現首發癥狀的AD患者中，治療每延誤1 h死亡率增加1%～2%[2]，24 h死亡率為33%，48 h死亡率可高達50%[1]，因此其診斷和治療均面臨巨大挑戰。
此前對AD的關注多聚焦在主動脈血管壁撕裂后的診斷和治療方面，而對疾病早期階段的發生發展機制仍缺乏明確的認識。因此，探尋簡便、穩定和有效的方法以建立AD動物模型對深入研究AD的發病機制具有重大意義。在本研究中，我們旨在通過β-氨基丙腈（β-aminopropionitrile，BAPN）聯合血管緊張素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ，Ang-Ⅱ）誘導建立大鼠AD模型，并分析不同濃度或劑量的BAPN以及是否聯合Ang-Ⅱ對SD大鼠主動脈或其他組織器官的影響及病理改變，以期尋找簡便、穩定和有效的方法建立大鼠AD模型。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及試劑
選取3周齡SPF級雄性SD大鼠42只，購于濟南朋悅實驗動物有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（魯）20190003。BAPN購于上海易恩化學技術有限公司；Ang-Ⅱ購于Med Chem Express；微滲透壓泵購于美國Alzet。
1.2 實驗分組及干預方法
將大鼠按照完全隨機法分為7組，即A組（0.25% BAPN組）、B組（0.40% BAPN組）、C組（0.80% BAPN組）、D組［1 g/（kg·d）BAPN組］、E組［1 g/（kg·d）BAPN+1 μg/（kg·min）生理鹽水組］、F組［1 g/（kg·d）BAPN+1 μg/（kg·min）Ang-Ⅱ組］、G組（對照組），各組大鼠均經適應性喂養1周后開始干預，A、B、C、D、G組干預周期為4周，E、F組BAPN干預4周后，通過微滲透壓泵分別泵入生理鹽水和Ang-Ⅱ，持續5 d。由于大鼠處于成長期，體重變化較快，故D、E、F組根據其體重和飲水量變化每3 d重新配制BAPN飲用水，各組水瓶均使用錫紙包裹避光以避免BAPN長時間見光分解失效。研究期間各組大鼠均飼養于濟寧醫學院實驗動物飼養中心，室溫維持于25℃左右，每日12 h光照，每日觀察大鼠精神狀態，監測并記錄大鼠飲水量、飲食量、體重，直至干預結束。研究期間各組大鼠均自由飲水，飲食無差別。
1.3 微滲透壓泵的植入
E、F組經BAPN干預4周后，給予微滲透壓泵皮下植入。F組微滲透壓泵內為Ang-Ⅱ，E組為生理鹽水。將Ang-Ⅱ或生理鹽水注入微滲透壓泵時需緩慢，避免產生氣泡。注入完成的微滲透壓泵置入37℃生理鹽水中水浴4～6 h以將其激活。植入方法：使用2%戊巴比妥鈉溶液按40 mg/kg標準以腹腔注射方式麻醉大鼠，后將大鼠俯臥并固定于固定板，選取頸部約4 cm2大小區域備皮，使用碘伏消毒后做一長約0.5 cm縱行切口，使用中彎鉗分離皮下組織，分離出足夠空間并植入微滲透壓泵。植入時勿將微滲透壓泵釋放控制閥門朝向切口，以免造成藥物滲漏。操作過程注意無菌。
1.4 主動脈獲取及病理切片制作
實驗過程中如有大鼠死亡則及時解剖；干預結束后，存活大鼠通過給予戊巴比妥鈉處死并及時解剖。解剖獲取的主動脈置入10%福爾馬林中保存。病理切片制作：主動脈標本經10%福爾馬林固定48 h后使用乙醇溶液梯度脫水，后經二甲苯/無水乙醇混合溶液浸泡透明，將組織標本石蠟包埋、修剪后切片，切片厚度約6 μm，使用溫箱45℃干燥，后使用二甲苯中脫蠟及乙醇溶液梯度水化。使用蘇木精染液浸泡5 min，后使用0.5% 鹽酸酒精溶液分化15 s后清水沖洗15 min，伊紅染色液浸泡1 min后使用清水沖洗2 min，后放入乙醇溶液中梯度脫水，給予二甲苯透明，中性樹膠封片。
1.5 統計學分析
統計學分析采用IBM SPSS 25.0軟件進行。計量資料行正態性檢驗，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（
±s）描述，組間比較采用t檢驗；非正態分布的計量資料以中位數和上下四分位數［M（P25，P75）］描述，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。計數資料用構成比描述，組間比較采用Fisher確切概率法。P≤0.05為差異有統計學意義。
1.6 倫理審查
本研究已通過濟寧醫學院附屬醫院倫理委員會審核批準，審批號：2021C102。
2 結果
2.1 各組生存率和主動脈夾層發生率比較
BAPN干預4周時，A、B、C、D、E、F、G組中大鼠生存率分別為83.3%（5/6）、50.0%（3/6）、100.0%（6/6）、100.0%（6/6）、83.3%（5/6）、100.0%（6/6）、100.0%（6/6），各組生存率差異無統計學意義（P=0.108）；此時各組AD發生率均為0。E、F組植入微滲透壓泵5 d后，生存率分別為83.3%（5/6）、0.0%，差異有統計學意義（P=0.008），AD發生率分別為0.0%、100.0%，差異有統計學意義（P=0.001）。F組83.3%（5/6）的大鼠死亡原因為AD破裂，16.7%（1/6）的大鼠死亡原因為AD形成。各組大鼠生存曲線見圖1。
圖1
各組大鼠生存曲線
a：A、B、C、D、G組大鼠生存曲線；b：E、F組大鼠生存曲線
2.2 各組飲食量、飲水量、體重和攝藥量的比較
以A、B、C、D、G組研究BAPN對飲食量、飲水量和體重的影響。BAPN干預4周后，A、B、C、D組飲食量和飲水量均明顯少于G組。A、B、C、D、G組飲食量分別為8.35 g、2.60 g、19.70 g、6.17 g、27.77 g，飲水量分別為16.25 mL、5.35 mL、28.65 mL、37.73 mL、53.27 mL；見圖2。
圖2
各組大鼠飲水量和飲食量變化趨勢
a：飲水量變化趨勢；b：飲食量變化趨勢
適應性喂養前和BAPN干預前G組與各干預組大鼠體重差異無統計學意義（P＞0.05）。給予BAPN干預后，A、B、C、D組大鼠體重增長速度較G組明顯減緩，其中BAPN對B組影響最大，A、D組次之，對C組影響最小；見圖3a。BAPN干預4周后，G組［（293.90±21.11）g］與A組［105.20（99.45，133.70）g］、B組［（98.93±5.44）g］、C組［（195.43±4.40）g］、D組［133.00（121.35，146.08）g］體重差異有統計學意義（P＜0.05）；見表1。
表1
各實驗節點G組與各干預組體重水平比較［
/M（P25，P75），g］
圖3
各組大鼠體重和攝藥量變化趨勢
a：體重變化趨勢；b：BAPN攝藥量變化趨勢；BAPN：β-氨基丙腈
BAPN干預伊始，A、B、C、D組攝藥量分別為0.63 g/（kg·d）、0.93 g/（kg·d）、1.97 g/（kg·d）、1 g/（kg·d），C組＞D組＞B組＞A組，隨大鼠的體重和飲水量的變化，A、B、C組攝藥量逐漸下降，BAPN干預結束時，A、B、C、D組的攝藥量分別為0.36 g/（kg·d）、0.22 g/（kg·d）、1.17 g/（kg·d）、1 g/（kg·d），C組＞D組＞A組＞B組；見圖3。
2.3 大鼠主動脈大體解剖及病理改變
對死亡大鼠行正中開胸可見胸腔內充滿血凝塊，血凝塊完全包裹心臟，取出血凝塊后仔細暴露AD破裂處；見圖4。F組中6只（100.0%）大鼠發生AD，死亡時間為Ang-Ⅱ干預后第3～4 d，其中5只死因為AD破裂，其余1只為AD形成。
圖4
大鼠解剖和全程主動脈
a：夾層破裂大鼠胸腔；b：正常大鼠的主動脈；c：因夾層破裂死亡大鼠的主動脈；d：形成夾層未破裂大鼠的主動脈
相較于正常大鼠主動脈，AD破裂大鼠與AD形成未破裂大鼠主動脈病理切片可見主動脈血管壁纖維組織增生伴玻璃樣變、粘液樣變；管壁內可見大量紅細胞浸潤，彈性纖維斷裂、排列紊亂，伴假腔內血栓形成；見圖5。
圖5
大鼠主動脈HE染色
a：正常大鼠；b：夾層破裂大鼠；c：夾層形成未破裂大鼠
2.4 其他改變
精神狀態的改變：A～F組大鼠均于BAPN干預后1周左右逐漸出現精神低落，日常多維持于俯臥位，喜靜，不好動，對外界刺激缺乏敏感。
胃腸道的改變：A、B兩組中分別有1只、2只大鼠發生腸梗阻，死亡時間分別為BAPN干預后第19 d、26 d、18 d，解剖可見腸道內殘存大量糞便，伴部分腸道壞死，空腸、回腸嚴重脹氣，直腸擴張。B組中2只大鼠均伴有直腸破裂，破裂部位分別位于直腸末段的前壁和后壁，可見糞便經直腸破裂處進入腹腔導致嚴重腹膜炎，進而引發嚴重腸粘連；見圖6。破裂直腸病理切片可見腸壁連續性中斷，黏膜層、黏膜下層和肌層可見擴張、充血、出血，伴腸壁全層炎細胞浸潤；見圖7。
圖6
大鼠胃腸道改變
a：可見胃、腸脹氣；b：直腸破裂大鼠可見腹腔內糞便和炎癥；c：直腸前壁破裂；d：直腸后壁破裂
圖7
破裂直腸HE染色
a～d：分別為不同放大倍數下破裂直腸HE染色圖片；HE：蘇木精-伊紅染色
3 討論
AD是心血管領域的危急重癥之一，其發病率逐漸增高，并且近年來呈年輕化趨勢。目前AD發生機制仍未完全明了，其內在的相互作用機制仍需進一步探索，因此需要一種穩定、簡便的AD動物模型來為后續AD發病機制的研究奠定基礎。
BAPN是賴氨酰氧化酶（lysyl oxidase，LOX）的不可逆性抑制劑，它可以抑制彈性蛋白和膠原蛋白的交聯而導致主動脈壁的細胞外基質（extracellular matrix，ECM）溶解，進而破壞主動脈壁結構的完整性而誘發AD[3-5]。自Wawzonek證明BAPN是香豌豆種子中導致AD的毒性因子后，BAPN被廣泛用于AD動物模型的構建，包括火雞、大鼠和小鼠等。Ang-Ⅱ是腎素-血管緊張素-醛固酮系統中的主要效應因子，其不僅在血管生成和維持內皮細胞穩態中扮演了重要角色，還參與了血壓的維持、炎癥反應的觸發，甚至血管損傷的過程[6-8]。極少有研究者單獨應用Ang-Ⅱ誘導建立AD動物模型，而通常是在BAPN干預后加用以提升AD的發生率。
目前，針對SD大鼠AD模型的構建，研究者[9-16]之間對BAPN的給藥方式和劑量甚至是否聯合Ang-Ⅱ均持有不同觀點，甚至相互矛盾；見表2。因此，在本研究中，我們旨在通過BAPN聯合或不聯合Ang-Ⅱ誘導建立SD大鼠AD模型，并分析不同濃度或劑量的BAPN以及是否聯合Ang-Ⅱ對SD大鼠主動脈或其他組織器官的影響及病理改變，以期尋找簡便、穩定和有效的方法建立SD大鼠AD模型。
表2
既往AD動物模型的誘導方式
本研究采用6種BAPN（和Ang-Ⅱ）干預方式構建SD大鼠AD模型。6個干預組中，僅F組［1 g/（kg·d）BAPN+1 μg/（kg·min）Ang-Ⅱ］成功構建大鼠AD模型，AD發生率高達100.0%（6/6）。我們發現通過BAPN聯合Ang-Ⅱ可穩定構建大鼠AD模型，并通過組織病理學得到證實。本研究發現應用BAPN干預4周無法構建大鼠AD模型，這與先前研究結果不一致。而當對BAPN干預4周后的大鼠加用Ang-Ⅱ時，大鼠可在Ang-Ⅱ干預5 d內死亡，且死亡原因皆為AD破裂或AD形成。Izawa-Ishizawa等[17]發現內皮功能障礙是AD發生過程中的關鍵，并可導致以彈性纖維斷裂為主要特征的主動脈退化。結合BAPN的作用機制，我們懷疑BAPN在構建大鼠AD模型中的作用可能主要以誘導AD形成前的狀態為主，而通過Ang-Ⅱ進一步誘導AD形成。在BAPN干預后應用Ang-Ⅱ可觀察到小鼠的血壓升高，這也與部分AD患者發病時癥狀相類似。但對BAPN干預后的小鼠注射去甲腎上腺素并未顯著增加AD的發生率，因此Ang-Ⅱ在小鼠AD模型構建中的作用可能不僅僅是升高血壓[18]。仍需進一步的研究探索BAPN與Ang-Ⅱ在誘導大鼠AD中的作用機制。
BAPN在理論上可以抑制所有彈性蛋白與膠原蛋白的交聯，并損害其組織器官功能。因此，BAPN在誘導AD的過程中不僅作用于主動脈，還可作用于其他組織器官并誘發相關的并發癥。米色脂肪細胞存在于白色脂肪庫中，在寒冷和腎上腺素的刺激下其可向棕色脂肪組織轉化，增加產熱[19]。BAPN可通過抑制LOX活性刺激腹股溝白色脂肪組織（inguinal white adipose tissue，iWAT）中米色脂肪的生成，并可增強iWAT和附睪白色脂肪組織因冷誘導所致的適應性產熱。我們認為正是由于上述機制，導致本研究中干預組的體重增長顯著少于對照組。Miana等[20]的研究也證實BAPN可以減少經飲食誘導的肥胖大鼠的體重增長并改善其代謝狀態，與本研究發現相似。但BAPN所致的體重增長速度下降的程度似乎并不與BAPN的劑量呈正相關。本研究中A～D組攝藥量為C組＞D組＞B組＞A組，但A～D組體重水平為C組＞D組＞A組＞B組。C組攝藥量最高，但其體重水平同樣最高；B組攝藥量高于A組，其體重水平低于A組。我們猜測隨著BAPN干預量增加，其對體重增長的影響逐漸增大，但到達一定水平后其影響逐漸減小，即存在某一干預量可使其影響達到峰值，但這一猜測還有待進一步研究證實。
膠原纖維的形態、方向、結構和含量在很大程度上決定了生物組織的微觀力學，一旦這些結構遭到破壞，則可能會對相應器官功能造成負面影響。Siri等[21]通過對結直腸腸壁的亞層進行雙軸拉伸試驗，得到了結直腸黏膜下層作為遠端結直腸承重結構的直接生物力學證據。雖然結直腸壁的黏膜下層相對較薄，僅占腸壁厚度的20%左右，但其所富含的膠原纖維是其維持結直腸承載區域的關鍵成分[22]。膠原纖維主要受成纖維細胞的調控，成纖維細胞的數量減少和功能受損可導致膠原纖維合成與分解的紊亂[23]。研究[24]通過對腸標本進行免疫熒光染色發現，LOX在高度分化的成纖維細胞和黏膜下層中均有表達，其中在成纖維細胞中高度表達。因此，我們懷疑本實驗中2只大鼠出現腸破裂與BAPN損害腸黏膜下層有關。但本研究中腸破裂的發生率較低，因此其損傷機制還有待進一步研究。
綜上所述，本研究發現應用1 g/（kg·d）BAPN飲用水給藥聯合1 g/（kg·min）Ang-Ⅱ 微滲透壓泵給藥的方法建立大鼠AD模型是可行的，并且具有簡便、相對穩定、成本較低的特點。BAPN可顯著影響大鼠的飲食量、飲水量和體重，但其影響程度均不與BAPN攝藥量呈正相關，BAPN是否存在某一攝藥量使其對大鼠生長發育的影響達到峰值尚需進一步研究。BAPN（或聯合Ang-Ⅱ）可導致大鼠主動脈血管壁纖維組織增生伴玻璃樣變、粘液樣變；管壁內可見大量紅細胞浸潤，彈性纖維斷裂、排列紊亂，伴假腔內血栓形成。BAPN除可影響大鼠主動脈組織外，還可對大鼠的精神狀態和胃腸道造成影響。這也是SD大鼠AD模型建立過程的一種不穩定因素，如何平衡AD模型建立過程中BAPN對其他器官組織的影響還有待進一步研究。
利益沖突：無。
作者貢獻：張毅、劉新梅、周廣起、胡海洋負責實驗操作，實驗數據收集分析；張毅、劉新梅負責文章撰寫和修改；喬衍禮、劉宏生負責實驗設計和文章審閱。
主動脈夾層（aortic dissection，AD）是臨床上的一種危急重癥，它是由多種因素造成主動脈內膜與部分中層發生撕裂，而后受到血管內血流的沖擊，并沿著縱軸剝離形成相通或不通的主動脈壁真假兩腔的分離狀態[1]。在出現首發癥狀的AD患者中，治療每延誤1 h死亡率增加1%～2%[2]，24 h死亡率為33%，48 h死亡率可高達50%[1]，因此其診斷和治療均面臨巨大挑戰。
此前對AD的關注多聚焦在主動脈血管壁撕裂后的診斷和治療方面，而對疾病早期階段的發生發展機制仍缺乏明確的認識。因此，探尋簡便、穩定和有效的方法以建立AD動物模型對深入研究AD的發病機制具有重大意義。在本研究中，我們旨在通過β-氨基丙腈（β-aminopropionitrile，BAPN）聯合血管緊張素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ，Ang-Ⅱ）誘導建立大鼠AD模型，并分析不同濃度或劑量的BAPN以及是否聯合Ang-Ⅱ對SD大鼠主動脈或其他組織器官的影響及病理改變，以期尋找簡便、穩定和有效的方法建立大鼠AD模型。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及試劑
選取3周齡SPF級雄性SD大鼠42只，購于濟南朋悅實驗動物有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（魯）20190003。BAPN購于上海易恩化學技術有限公司；Ang-Ⅱ購于Med Chem Express；微滲透壓泵購于美國Alzet。
1.2 實驗分組及干預方法
將大鼠按照完全隨機法分為7組，即A組（0.25% BAPN組）、B組（0.40% BAPN組）、C組（0.80% BAPN組）、D組［1 g/（kg·d）BAPN組］、E組［1 g/（kg·d）BAPN+1 μg/（kg·min）生理鹽水組］、F組［1 g/（kg·d）BAPN+1 μg/（kg·min）Ang-Ⅱ組］、G組（對照組），各組大鼠均經適應性喂養1周后開始干預，A、B、C、D、G組干預周期為4周，E、F組BAPN干預4周后，通過微滲透壓泵分別泵入生理鹽水和Ang-Ⅱ，持續5 d。由于大鼠處于成長期，體重變化較快，故D、E、F組根據其體重和飲水量變化每3 d重新配制BAPN飲用水，各組水瓶均使用錫紙包裹避光以避免BAPN長時間見光分解失效。研究期間各組大鼠均飼養于濟寧醫學院實驗動物飼養中心，室溫維持于25℃左右，每日12 h光照，每日觀察大鼠精神狀態，監測并記錄大鼠飲水量、飲食量、體重，直至干預結束。研究期間各組大鼠均自由飲水，飲食無差別。
1.3 微滲透壓泵的植入
E、F組經BAPN干預4周后，給予微滲透壓泵皮下植入。F組微滲透壓泵內為Ang-Ⅱ，E組為生理鹽水。將Ang-Ⅱ或生理鹽水注入微滲透壓泵時需緩慢，避免產生氣泡。注入完成的微滲透壓泵置入37℃生理鹽水中水浴4～6 h以將其激活。植入方法：使用2%戊巴比妥鈉溶液按40 mg/kg標準以腹腔注射方式麻醉大鼠，后將大鼠俯臥并固定于固定板，選取頸部約4 cm2大小區域備皮，使用碘伏消毒后做一長約0.5 cm縱行切口，使用中彎鉗分離皮下組織，分離出足夠空間并植入微滲透壓泵。植入時勿將微滲透壓泵釋放控制閥門朝向切口，以免造成藥物滲漏。操作過程注意無菌。
1.4 主動脈獲取及病理切片制作
實驗過程中如有大鼠死亡則及時解剖；干預結束后，存活大鼠通過給予戊巴比妥鈉處死并及時解剖。解剖獲取的主動脈置入10%福爾馬林中保存。病理切片制作：主動脈標本經10%福爾馬林固定48 h后使用乙醇溶液梯度脫水，后經二甲苯/無水乙醇混合溶液浸泡透明，將組織標本石蠟包埋、修剪后切片，切片厚度約6 μm，使用溫箱45℃干燥，后使用二甲苯中脫蠟及乙醇溶液梯度水化。使用蘇木精染液浸泡5 min，后使用0.5% 鹽酸酒精溶液分化15 s后清水沖洗15 min，伊紅染色液浸泡1 min后使用清水沖洗2 min，后放入乙醇溶液中梯度脫水，給予二甲苯透明，中性樹膠封片。
1.5 統計學分析
統計學分析采用IBM SPSS 25.0軟件進行。計量資料行正態性檢驗，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）描述，組間比較采用t檢驗；非正態分布的計量資料以中位數和上下四分位數［M（P25，P75）］描述，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。計數資料用構成比描述，組間比較采用Fisher確切概率法。P≤0.05為差異有統計學意義。
1.6 倫理審查
本研究已通過濟寧醫學院附屬醫院倫理委員會審核批準，審批號：2021C102。
2 結果
2.1 各組生存率和主動脈夾層發生率比較
BAPN干預4周時，A、B、C、D、E、F、G組中大鼠生存率分別為83.3%（5/6）、50.0%（3/6）、100.0%（6/6）、100.0%（6/6）、83.3%（5/6）、100.0%（6/6）、100.0%（6/6），各組生存率差異無統計學意義（P=0.108）；此時各組AD發生率均為0。E、F組植入微滲透壓泵5 d后，生存率分別為83.3%（5/6）、0.0%，差異有統計學意義（P=0.008），AD發生率分別為0.0%、100.0%，差異有統計學意義（P=0.001）。F組83.3%（5/6）的大鼠死亡原因為AD破裂，16.7%（1/6）的大鼠死亡原因為AD形成。各組大鼠生存曲線見圖1。
圖1
各組大鼠生存曲線
a：A、B、C、D、G組大鼠生存曲線；b：E、F組大鼠生存曲線
2.2 各組飲食量、飲水量、體重和攝藥量的比較
以A、B、C、D、G組研究BAPN對飲食量、飲水量和體重的影響。BAPN干預4周后，A、B、C、D組飲食量和飲水量均明顯少于G組。A、B、C、D、G組飲食量分別為8.35 g、2.60 g、19.70 g、6.17 g、27.77 g，飲水量分別為16.25 mL、5.35 mL、28.65 mL、37.73 mL、53.27 mL；見圖2。
圖2
各組大鼠飲水量和飲食量變化趨勢
a：飲水量變化趨勢；b：飲食量變化趨勢
適應性喂養前和BAPN干預前G組與各干預組大鼠體重差異無統計學意義（P＞0.05）。給予BAPN干預后，A、B、C、D組大鼠體重增長速度較G組明顯減緩，其中BAPN對B組影響最大，A、D組次之，對C組影響最小；見圖3a。BAPN干預4周后，G組［（293.90±21.11）g］與A組［105.20（99.45，133.70）g］、B組［（98.93±5.44）g］、C組［（195.43±4.40）g］、D組［133.00（121.35，146.08）g］體重差異有統計學意義（P＜0.05）；見表1。
表1
各實驗節點G組與各干預組體重水平比較［/M（P25，P75），g］
圖3
各組大鼠體重和攝藥量變化趨勢
a：體重變化趨勢；b：BAPN攝藥量變化趨勢；BAPN：β-氨基丙腈
BAPN干預伊始，A、B、C、D組攝藥量分別為0.63 g/（kg·d）、0.93 g/（kg·d）、1.97 g/（kg·d）、1 g/（kg·d），C組＞D組＞B組＞A組，隨大鼠的體重和飲水量的變化，A、B、C組攝藥量逐漸下降，BAPN干預結束時，A、B、C、D組的攝藥量分別為0.36 g/（kg·d）、0.22 g/（kg·d）、1.17 g/（kg·d）、1 g/（kg·d），C組＞D組＞A組＞B組；見圖3。
2.3 大鼠主動脈大體解剖及病理改變
對死亡大鼠行正中開胸可見胸腔內充滿血凝塊，血凝塊完全包裹心臟，取出血凝塊后仔細暴露AD破裂處；見圖4。F組中6只（100.0%）大鼠發生AD，死亡時間為Ang-Ⅱ干預后第3～4 d，其中5只死因為AD破裂，其余1只為AD形成。
圖4
大鼠解剖和全程主動脈
a：夾層破裂大鼠胸腔；b：正常大鼠的主動脈；c：因夾層破裂死亡大鼠的主動脈；d：形成夾層未破裂大鼠的主動脈
相較于正常大鼠主動脈，AD破裂大鼠與AD形成未破裂大鼠主動脈病理切片可見主動脈血管壁纖維組織增生伴玻璃樣變、粘液樣變；管壁內可見大量紅細胞浸潤，彈性纖維斷裂、排列紊亂，伴假腔內血栓形成；見圖5。
圖5
大鼠主動脈HE染色
a：正常大鼠；b：夾層破裂大鼠；c：夾層形成未破裂大鼠
2.4 其他改變
精神狀態的改變：A～F組大鼠均于BAPN干預后1周左右逐漸出現精神低落，日常多維持于俯臥位，喜靜，不好動，對外界刺激缺乏敏感。
胃腸道的改變：A、B兩組中分別有1只、2只大鼠發生腸梗阻，死亡時間分別為BAPN干預后第19 d、26 d、18 d，解剖可見腸道內殘存大量糞便，伴部分腸道壞死，空腸、回腸嚴重脹氣，直腸擴張。B組中2只大鼠均伴有直腸破裂，破裂部位分別位于直腸末段的前壁和后壁，可見糞便經直腸破裂處進入腹腔導致嚴重腹膜炎，進而引發嚴重腸粘連；見圖6。破裂直腸病理切片可見腸壁連續性中斷，黏膜層、黏膜下層和肌層可見擴張、充血、出血，伴腸壁全層炎細胞浸潤；見圖7。
圖6
大鼠胃腸道改變
a：可見胃、腸脹氣；b：直腸破裂大鼠可見腹腔內糞便和炎癥；c：直腸前壁破裂；d：直腸后壁破裂
圖7
破裂直腸HE染色
a～d：分別為不同放大倍數下破裂直腸HE染色圖片；HE：蘇木精-伊紅染色
3 討論
AD是心血管領域的危急重癥之一，其發病率逐漸增高，并且近年來呈年輕化趨勢。目前AD發生機制仍未完全明了，其內在的相互作用機制仍需進一步探索，因此需要一種穩定、簡便的AD動物模型來為后續AD發病機制的研究奠定基礎。
BAPN是賴氨酰氧化酶（lysyl oxidase，LOX）的不可逆性抑制劑，它可以抑制彈性蛋白和膠原蛋白的交聯而導致主動脈壁的細胞外基質（extracellular matrix，ECM）溶解，進而破壞主動脈壁結構的完整性而誘發AD[3-5]。自Wawzonek證明BAPN是香豌豆種子中導致AD的毒性因子后，BAPN被廣泛用于AD動物模型的構建，包括火雞、大鼠和小鼠等。Ang-Ⅱ是腎素-血管緊張素-醛固酮系統中的主要效應因子，其不僅在血管生成和維持內皮細胞穩態中扮演了重要角色，還參與了血壓的維持、炎癥反應的觸發，甚至血管損傷的過程[6-8]。極少有研究者單獨應用Ang-Ⅱ誘導建立AD動物模型，而通常是在BAPN干預后加用以提升AD的發生率。
目前，針對SD大鼠AD模型的構建，研究者[9-16]之間對BAPN的給藥方式和劑量甚至是否聯合Ang-Ⅱ均持有不同觀點，甚至相互矛盾；見表2。因此，在本研究中，我們旨在通過BAPN聯合或不聯合Ang-Ⅱ誘導建立SD大鼠AD模型，并分析不同濃度或劑量的BAPN以及是否聯合Ang-Ⅱ對SD大鼠主動脈或其他組織器官的影響及病理改變，以期尋找簡便、穩定和有效的方法建立SD大鼠AD模型。
表2
既往AD動物模型的誘導方式
本研究采用6種BAPN（和Ang-Ⅱ）干預方式構建SD大鼠AD模型。6個干預組中，僅F組［1 g/（kg·d）BAPN+1 μg/（kg·min）Ang-Ⅱ］成功構建大鼠AD模型，AD發生率高達100.0%（6/6）。我們發現通過BAPN聯合Ang-Ⅱ可穩定構建大鼠AD模型，并通過組織病理學得到證實。本研究發現應用BAPN干預4周無法構建大鼠AD模型，這與先前研究結果不一致。而當對BAPN干預4周后的大鼠加用Ang-Ⅱ時，大鼠可在Ang-Ⅱ干預5 d內死亡，且死亡原因皆為AD破裂或AD形成。Izawa-Ishizawa等[17]發現內皮功能障礙是AD發生過程中的關鍵，并可導致以彈性纖維斷裂為主要特征的主動脈退化。結合BAPN的作用機制，我們懷疑BAPN在構建大鼠AD模型中的作用可能主要以誘導AD形成前的狀態為主，而通過Ang-Ⅱ進一步誘導AD形成。在BAPN干預后應用Ang-Ⅱ可觀察到小鼠的血壓升高，這也與部分AD患者發病時癥狀相類似。但對BAPN干預后的小鼠注射去甲腎上腺素并未顯著增加AD的發生率，因此Ang-Ⅱ在小鼠AD模型構建中的作用可能不僅僅是升高血壓[18]。仍需進一步的研究探索BAPN與Ang-Ⅱ在誘導大鼠AD中的作用機制。
BAPN在理論上可以抑制所有彈性蛋白與膠原蛋白的交聯，并損害其組織器官功能。因此，BAPN在誘導AD的過程中不僅作用于主動脈，還可作用于其他組織器官并誘發相關的并發癥。米色脂肪細胞存在于白色脂肪庫中，在寒冷和腎上腺素的刺激下其可向棕色脂肪組織轉化，增加產熱[19]。BAPN可通過抑制LOX活性刺激腹股溝白色脂肪組織（inguinal white adipose tissue，iWAT）中米色脂肪的生成，并可增強iWAT和附睪白色脂肪組織因冷誘導所致的適應性產熱。我們認為正是由于上述機制，導致本研究中干預組的體重增長顯著少于對照組。Miana等[20]的研究也證實BAPN可以減少經飲食誘導的肥胖大鼠的體重增長并改善其代謝狀態，與本研究發現相似。但BAPN所致的體重增長速度下降的程度似乎并不與BAPN的劑量呈正相關。本研究中A～D組攝藥量為C組＞D組＞B組＞A組，但A～D組體重水平為C組＞D組＞A組＞B組。C組攝藥量最高，但其體重水平同樣最高；B組攝藥量高于A組，其體重水平低于A組。我們猜測隨著BAPN干預量增加，其對體重增長的影響逐漸增大，但到達一定水平后其影響逐漸減小，即存在某一干預量可使其影響達到峰值，但這一猜測還有待進一步研究證實。
膠原纖維的形態、方向、結構和含量在很大程度上決定了生物組織的微觀力學，一旦這些結構遭到破壞，則可能會對相應器官功能造成負面影響。Siri等[21]通過對結直腸腸壁的亞層進行雙軸拉伸試驗，得到了結直腸黏膜下層作為遠端結直腸承重結構的直接生物力學證據。雖然結直腸壁的黏膜下層相對較薄，僅占腸壁厚度的20%左右，但其所富含的膠原纖維是其維持結直腸承載區域的關鍵成分[22]。膠原纖維主要受成纖維細胞的調控，成纖維細胞的數量減少和功能受損可導致膠原纖維合成與分解的紊亂[23]。研究[24]通過對腸標本進行免疫熒光染色發現，LOX在高度分化的成纖維細胞和黏膜下層中均有表達，其中在成纖維細胞中高度表達。因此，我們懷疑本實驗中2只大鼠出現腸破裂與BAPN損害腸黏膜下層有關。但本研究中腸破裂的發生率較低，因此其損傷機制還有待進一步研究。
綜上所述，本研究發現應用1 g/（kg·d）BAPN飲用水給藥聯合1 g/（kg·min）Ang-Ⅱ 微滲透壓泵給藥的方法建立大鼠AD模型是可行的，并且具有簡便、相對穩定、成本較低的特點。BAPN可顯著影響大鼠的飲食量、飲水量和體重，但其影響程度均不與BAPN攝藥量呈正相關，BAPN是否存在某一攝藥量使其對大鼠生長發育的影響達到峰值尚需進一步研究。BAPN（或聯合Ang-Ⅱ）可導致大鼠主動脈血管壁纖維組織增生伴玻璃樣變、粘液樣變；管壁內可見大量紅細胞浸潤，彈性纖維斷裂、排列紊亂，伴假腔內血栓形成。BAPN除可影響大鼠主動脈組織外，還可對大鼠的精神狀態和胃腸道造成影響。這也是SD大鼠AD模型建立過程的一種不穩定因素，如何平衡AD模型建立過程中BAPN對其他器官組織的影響還有待進一步研究。
利益沖突：無。
作者貢獻：張毅、劉新梅、周廣起、胡海洋負責實驗操作，實驗數據收集分析；張毅、劉新梅負責文章撰寫和修改；喬衍禮、劉宏生負責實驗設計和文章審閱。
