引用本文： 陳儒德, 駱助林, 程龍, 汪濤. 中性粒細胞胞外誘捕網在肝臟缺血再灌注損傷中的研究進展. 中國普外基礎與臨床雜志, 2024, 31(3): 373-378. doi: 10.7507/1007-9424.202310086 復制
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在行肝臟手術過程中，常需要使肝臟在一段時間內處于缺血狀態，以保證手術的順利實施，當血流恢復時，缺血的肝臟不可避免地會發生損傷，甚至可能導致肝功能衰竭和多器官功能衰竭，這種現象被稱為肝臟缺血-再灌注損傷（hepatic ischemia-reperfusion injury，HIRI）。多種因素被認為在HIRI的發病機制中發揮作用，如氧化應激、炎癥級聯反應、細胞因子風暴、庫普弗細胞（Kupffer cells，KCs）、中性粒細胞活化等[1]。在肝臟缺血-再灌注時，肝細胞和KCs會經歷無氧代謝、活性氧產生和隨后的細胞死亡，以及損傷相關分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）的釋放。再灌注血液流動恢復時DAMPs被沖入循環引發促進組織損傷的復雜無菌性炎癥級聯反應，導致進一步的功能障礙和損傷[2]。作為對內源性DAMPs的反應，浸潤性中性粒細胞會在肝臟缺血-再灌注期間在肝竇中形成中性粒細胞胞外誘捕網（neutrophil extracellular traps，NETs）。反過來，NETs被證明會加劇炎癥級聯反應，加劇肝損傷。這種缺血-再灌注的過程顯著增加了肝臟手術后的并發癥。浸潤性中性粒細胞和肝竇內皮細胞（liver sinusoidal endothelial cell，LSEC）都被認為是肝臟缺血-再灌注過程中的關鍵細胞參與者[3]。然而，到目前為止，導致HIRI的潛在機制尚不清楚，將這種損傷降至最低的有效干預措施數量仍然有限。研究HIRI形成的分子病理生理機制對于開發新的靶點和進一步治療策略至關重要。在近些年越來越多的研究表明，中性粒細胞及其產生的NETs 在HIRI過程中起著至關重要的作用[4]，會導致過度的無菌炎癥性肝損傷。然而NETs在HIRI中的作用仍然未知。筆者擬對NETs在HIRI產生中的作用機制及靶向NETs減輕HIRI的研究進展進行綜述，為減輕HIRI提供有價值的參考依據。
1 NETs 參與HIRI過程中的無菌性炎癥反應
中性粒細胞作為人類免疫系統中最豐富的先天免疫效應細胞，是肝臟缺血-再灌注后最早從血液中募集到肝臟的細胞類型之一[5]。中性粒細胞誘導的肝損傷是一個多步驟的過程，在肝臟缺血-再灌注后，受損肝細胞會釋放DAMPs[6]，如白細胞介素（interleukin，IL）-33、熱休克蛋白、高遷移率組蛋白-1（high mobility group box 1，HMGB1）和細胞外組蛋白，促進中性粒細胞從血液遷移募集在缺血損傷的肝葉中過度浸潤，中性粒細胞在缺血肝葉中的浸潤和積聚通過釋放活性氧（reactive oxygen species，ROS）、大量炎癥介質以及各種蛋白水解酶，進一步導致炎癥相關損傷，從而導致肝損傷，并與肝臟內的常駐細胞和其他免疫細胞相互作用[7]。Toll樣受體（Toll like receptor，TLR）9作為先天免疫系統中的主要模式識別受體，在NETs形成、DAMPs和肝損傷之間的惡性循環中起著橋梁作用，DAMPs可以通過TLR9激活中性粒細胞釋放NETs，此外受損肝細胞也會釋放DAMPs，使得NETs的形成與肝損傷之間形成了一個惡性循環[4]，加劇缺血-再灌注過程中的肝損傷，NETs還可以促進肝臟內炎癥相關細胞因子的釋放，并進一步激活免疫系統以放大免疫反應[8]。
NETs 是由多種抗菌蛋白如中性粒細胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、組蛋白、組織蛋白酶、α-防御素、鈣保護蛋白、細胞骨架蛋白等修飾的大型細胞外網狀結構[9]。NETs 的形成，也稱為中性粒細胞外陷阱相關死亡（neutrophil extracellular traps-osis，NETosis），是一種新型的中性粒細胞特異性細胞死亡過程，NETs的形成依賴于蛋白質精氨酸脫亞氨酶4（peptidyl arginine deiminase 4，PAD4）催化的組蛋白瓜氨酸化和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶產生的ROS[10]。既往研究發現，盡管NETs在免疫防御中起著重要作用，但NETs在許多情況下更可能致病，如癌癥[11]、自身免疫性疾病[12]、炎癥性疾病[13]、靜脈血栓[14]和缺血-再灌注損傷。NETs的形成，其特點是活化的中性粒細胞將NETs釋放到細胞外空間以抵御入侵的病原體，NETs具有中和殺死細菌、真菌和各種病原體的內在能力[12, 15]，除了捕捉殺死各種病原體外，NETs也在各種無菌條件刺激下產生，比如肝臟缺血-再灌注過程中的無菌性炎癥反應，NETs上的細胞毒性分子和蛋白酶會在肝臟缺血-再灌注過程中對肝組織造成嚴重的損傷。Huang等[16]的研究表明，肝臟缺血-再灌注過程中NETs的形成是有害的，然而NETs加重HIRI的確切機制尚不清楚；應激肝細胞釋放的高遷移率族蛋白1（high mobility group box 1，HMGB1）和組蛋白通過TLR4或TLR9依賴性途徑激活中性粒細胞形成NETs，也可能在進一步募集和激活中性粒細胞形成NETs中發揮作用,并加劇缺血-再灌注后的肝損傷。組蛋白和HMGB1除了激活NETs外，也是NETs形成過程中排出的細胞內容物的一部分。NETs中的組蛋白和HMGB1本身可能起到DAMPs的作用，并通過與NETs相互作用來增強炎癥反應。此外，NETs中的其他蛋白質也可能會促進炎癥和器官損傷，如中性粒細胞彈性蛋白酶通過抑制內皮一氧化氮合酶的激活來減少內皮細胞前列環素-2的產生，從而促進缺血-再灌注誘導的肝損傷的發展。此外，NETs也被證明可以激活補體系統，進一步促進炎癥反應的發生。
2 肝臟常駐細胞在中性粒細胞募集和釋放NETs中的作用
再灌注血液流動恢復后無菌炎癥反應的過度激活會導致進一步的功能障礙。導致局部肝細胞損傷的信號事件多種多樣且復雜，涉及肝細胞、LSEC、KCs和肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSC）之間的相互作用，所有這些都會導致中性粒細胞活化和NETs 的形成[7, 17]。在肝臟中， KCs作為肝臟中的常駐巨噬細胞與LSEC協同作用，在HIRI的穩態反應中發揮重要作用。Dai等[18]的一項研究顯示，肝臟缺血-再灌注后ROS和促炎細胞因子的產生和釋放顯著增加。活化的KCs也在中性粒細胞趨化中發揮作用，在KCs釋放的細胞因子中，腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）和IL-1都上調中性粒細胞表面的細胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，IMAC-1），并促進IL-8的合成[19]。TNF-α已被證明可誘導IMAC-1和P-選擇素的管腔內表達，其通過滾動和結合運動促進循環中性粒細胞的黏附，并進一步促進細胞外滲[20]。此外，Su等[21]報道，KCs生成的TNF-α通過核因子（the nuclear factor kB，NF-kB）途徑促進肝細胞趨化因子配體1（C-X-C motif chemokine ligand 1，CXCL1）誘導中性粒細胞向缺血損傷區域運動。
NETs在急性排斥反應的HIRI中起著重要的作用。Liu等[22]在他們的研究中表明，肝移植后的HMGB1有助于急性肝排斥反應的發展， HMGB1通過TLR4和晚期糖基化終末產物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）可以激活中性粒細胞并促進NETs的形成，該研究觀察到移植患者血清中NETs水平升高，且與術后肝功能呈負相關；此外，移植后血清中HMGB1和NETs水平均上升；該研究還進一步表明，肝臟KCs 是HMGB1產生的主要來源，并通過NETs極化為M1表型；此外， TLR4抑制劑和雷帕霉素的組合比單獨使用它們更有效地降低了肝移植后急性排斥反應的破壞作用。體外研究[16]表明，中性粒細胞會增加肝細胞和KCs的死亡，從而促進更多促炎細胞因子和DAMPs的釋放；然后，這些DAMPs通過TLR4和TLR9-MyD88信號通路進一步促進NETs的產生。
3 NETs與血小板的相互作用
越來越多的證據表明，接受肝臟手術的患者在術后立即出現高凝狀態[23]。術后這種高凝狀態產生的機制與血小板和中性粒細胞及NETs的形成密切相關。研究[24]發現，血小板衍生的微粒直接促進和增強免疫細胞的炎癥活性，特別是中性粒細胞的炎癥活動，且血小板已被證明可以調節血管內皮的激活，誘導黏附分子的表達，包括E-選擇素、ICAM-1和血管細胞黏附分子-1 （the vascular cellular adhesion molecule-1，VCAM-1）。此外，在損傷或感染部位，活化的血小板通過P-選擇素與中性粒細胞上的P-選擇素糖蛋白配體-1 （P-selectin glycoprotein ligand-1，PSGL-1）結合形成血小板-中性粒細胞復合物，介導并增強了中性粒細胞向炎癥和感染組織的募集[25]，觸發中性粒細胞內的炎癥信號級聯反應，模擬血栓形成前狀態。同時活化的血小板迅速釋放大量趨化因子，導致大量包括中性粒細胞的免疫細胞募集到炎癥部位，加重組織損傷。在肝臟缺血-再灌注無菌炎癥反應的過程中，有研究[26]發現活化的血小板也與中性粒細胞結合，誘導NETs的形成，就像在感染期間觀察到的一樣加重肝組織的損傷。在另外一項研究[27]中還發現，肝臟缺血-再灌注的動物模型中NETs可以引發血小板活化，導致全身免疫血栓形成和遠處器官損傷。血小板與活化中性粒細胞的相互作用同樣會促進NETs的形成，且NETs的成分被認為是肝臟缺血-再灌注后凝血障礙的關鍵激活劑[28]。研究[29]表明，血小板通過直接與中性粒細胞接觸，在血管系統內的NETs形成中發揮著至關重要的作用，除了直接調節免疫反應外，血小板還可以通過在感染部位誘導NETs的產生來參與病原體捕獲和隔離。
Zhang等[30]的研究也證實了HIRI與免疫血栓形成有關，缺血-再灌注可顯著激活血小板并增加血小板和中性粒細胞聚集，這導致HIRI后微血管中富含NETs血小板的微血栓增加，提示NETs對這些富含血小板的微血管血栓的形成至關重要；當脫氧核糖核酸酶1（deoxyribonuclease 1，Dnase1）治療阻斷NETs時，免疫血栓顯著減少，并改善肝臟缺血-再灌注后的促凝血狀態和多器官損傷。此外，該研究還觀察到在TLR4缺失的血小板中，NETs誘導的血小板活化顯著降低，NETs的作用是通過血小板TLR4依賴性途徑介導的。這些發現為應用DNase1靶向NETs提供了一種潛在的治療方法，該方法不僅可以減輕HIRI的局部反應，還可以治療和預防系統性高凝狀態和進一步的遠端器官損傷。
4 NETs靶向預防HIRI
近年來的研究已經驗證了阻斷NETs形成可能是對抗HIRI的潛在治療靶點。有研究[31]發現，炎性細胞因子IL-17 在介導、維持和促進肝臟缺血-再灌注誘導損傷的無菌性炎癥環境中起著核心的作用。在缺血-再灌注損傷發生之前給予IL-17中和抗體時，肝損傷被逆轉； 此外，血清IL-17水平的增加與肝臟內中性粒細胞浸潤和NETs形成的增加直接對應，這表明IL-17是一種有效的NETs誘導劑。類似的，在腎缺血-再灌注損傷的小鼠模型中，同樣觀察到浸潤性中性粒細胞是IL-17產生的主要來源。因此，使用IL-17中和抗體靶向IL-17可以有效減輕肝缺血-再灌注誘導的損傷。氧化應激是HIRI的另一大原因，次黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶產生的超氧化物刺激中性粒細胞通過TLR4/NOX信號通路釋放NETs促進無菌性炎癥。幾項利用抗氧化劑治療的研究表明，在動物模型中可以減少HIRI。二苯基碘鎓（diphenyleneiodonium，DPI）作為一種NADPH氧化抑制劑和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶抑制劑，與NETs形成的調節密切相關。研究發現，用別嘌呤醇（超氧化物抑制劑）和DPI聯合治療小鼠可以減少NETs的形成，并顯著減少肝損傷[32]。在另一項研究[33]中還發現，四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，TMP）通過抑制NADPH氧化酶來抑制NETs的形成，與兩種藥物中的任何一種的單藥治療相比，使用TMP和DPI的聯合治療是治療HIRI一種有前途的方法，驗證了通過DPI治療阻斷NETs形成可能是HIRI潛在治療靶點的假設。血栓調節蛋白（thrombomodulin，TM）是一種由內皮細胞高度表達的糖蛋白。 另一項研究通過在肝移植缺血-再灌注模型之前1 h靜脈注射重組TM（5 mg/kg）預處理大鼠, 實驗觀察到中性粒細胞浸潤和NETs形成顯著減少，表明了重組TM 的使用可以靶向減少中性粒細胞浸潤和NETs形成，并且在小鼠和大鼠模型中都顯示出對HIRI的保護作用。其機制可能為重組TM抑制TLR-4活性及其下游細胞外信號（激酶/c-Jun NH2末端激酶和NADPH/活性氧物種/AD4）信號通路[34]，從而減輕HIRI。
在肝缺血-再灌注過程中中性粒細胞和肝臟常駐淋巴細胞之間相互作用加重肝損傷。NETs可以直接促進缺血-再灌注后肝臟內T淋巴細胞的耗竭。NETs含有程序性死亡配體1 （programmed death-ligand 1，PD-L1），它與活化的T細胞上的程序性死亡受體-1（programmed death 1，PD-1）結合，使其失去功能并耗盡。這一發現表明可能通過靶向中性粒細胞和NETs來減輕HIRI的臨床意義[5, 35]。基質金屬蛋白酶-9（matrix Metalloproteinase-9，MMP-9）通過浸潤白細胞大量表達促進HIRI，研究發現，金屬蛋白酶組織抑制劑-1（the tissue inhibitors of metalloproteinase 1，TIMP-1）具有減少NETs形成的能力，從而限制NETs介導的細胞毒性對HIRI的影響，表明了TIMP-1過表達在HIRI中具有肝保護作用[36]，因此，TIMP-1可能代表一種有前途的分子，用于治療HIRI的藥物開發。此外，NETs染色質中含有多種促炎細胞因子和趨化因子。精氨酸脫亞氨酶4（peptidyl arginine deiminase 4，PAD4）是NETs形成的關鍵介質。有研究表明[37-38]，與野生型小鼠相比， PAD4敲除小鼠減少了NETs的產生，在小鼠模型中，靶向中性粒細胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）或使用特異性髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）抑制劑也顯示出類似的效果。用NETs抑制劑進一步處理野生型小鼠，與野生型小鼠相比，用NE抑制劑治療的野生型小鼠中性粒細胞浸潤和NETs較少。提示通過特定的PAD4抑制劑和DNase-1靶向NETs可能成為治療或預防肝臟手術患者HIRI的一種有前途的新方法[39]。
羥氯喹（hydroxychloroquine，HCQ）作為一種抗瘧藥物和免疫調節劑，在臨床應用中具有良好的安全性和多功能性。有研究[40]發現，抗瘧藥物氯喹和HCQ 表現出免疫調節作用，在體外，HCQ在100μg/mL的濃度下抑制中性粒細胞形成NETs，在小鼠肝臟缺血-再灌注模型中也表現出可抑制NETs的形成、減輕HIRI，其機制可能為HCQ通過阻斷TLR9抑制小鼠NETs的形成從而保護肝臟免受缺血-再灌注損傷，HCQ預處理可能成為一種減輕肝臟手術后缺血-再灌注損傷的可行方法。有研究[41]還表明，能夠阻斷TLR9形成的臨床藥物可能具有預防HIRI的潛力。 有研究[42]發現，姜黃素可以通過抑制MEK/ERK途徑抑制NETs的產生來緩解HIRI； 此外，該研究還表明， DNase-1 對于通過減少NETs的產生來緩解HIRI至關重要。姜黃素聯合DNase-1在通過抑制NETs的產生來緩解HIRI方面比單獨給藥的兩種藥物更有效，姜黃素與DNase-1聯合是減輕HIRI的潛在治療策略。
人臍帶來源的間充質干細胞（human umbilical cord mesenchymal stem cell，hUC-MSC）可能有助于減少NETs的形成，從而改善HIRI。在機制上，研究[42]發現人臍帶間充質干細胞來源胞外囊泡（human umbilical cord mesenchymal stem cell-originated extracellular vesicles，hUC-MSC-EVs）含有功能性線粒體，這些線粒體被轉移到肝內中性粒細胞；這種作用觸發線粒體融合，隨后恢復中性粒細胞的線粒體狀態和功能，對抑制局部NETs的形成具有納米治療作用，這突出了hUC-MSC-EVs對HIRI的治療價值。
5 小結與展望
HIRI是臨床實踐中未解決的問題，其特征是缺血期缺氧誘導的細胞損傷和血流恢復后的免疫炎癥引起，缺血損傷使肝細胞暴露于缺氧、ATP耗竭、pH變化以及細胞代謝應激中，所有這些都會導致最初的細胞損傷或死亡；在隨后的再灌注損傷中，肝臟代謝受到干擾，并誘導復雜的炎癥級聯反應，從而進一步加重肝細胞損傷。肝臟缺血-灌注會導致肝酶水平升高、膽管狹窄、肝臟功能障礙，從而直接導致肝細胞壞死，甚至導致肝功能衰竭和多器官功能衰竭，因此成為了肝臟手術后并發癥和死亡率較高的重要原因。如何減輕肝臟缺血-再灌注后的肝損傷是亟待解決的重要議題，隨著對中性粒細胞及NETs 在肝臟缺血-再灌注過程中導致肝損傷機制的大量研究，靶向NETs可能成為治療HIRI的一種新方法。目前已經有一些實驗和臨床研究表明，通過抑制NETs形成或清除已形成的NETs可以減輕HIRI并改善預后。在未來可預見將會有更多關于靶向NETs治療HIRI方面的實驗和臨床試驗的開展，并逐漸建立起更完善、更有效的治療策略，從而為臨床上改善肝臟術后患者的預后提供新途徑。
重要聲明
利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。
作者貢獻聲明：陳儒德負責收集文獻、論文撰寫；駱助林和程龍負責論文分析及修改；汪濤負責立題、擬定寫作思路、論文修改及最后定稿。
在行肝臟手術過程中，常需要使肝臟在一段時間內處于缺血狀態，以保證手術的順利實施，當血流恢復時，缺血的肝臟不可避免地會發生損傷，甚至可能導致肝功能衰竭和多器官功能衰竭，這種現象被稱為肝臟缺血-再灌注損傷（hepatic ischemia-reperfusion injury，HIRI）。多種因素被認為在HIRI的發病機制中發揮作用，如氧化應激、炎癥級聯反應、細胞因子風暴、庫普弗細胞（Kupffer cells，KCs）、中性粒細胞活化等[1]。在肝臟缺血-再灌注時，肝細胞和KCs會經歷無氧代謝、活性氧產生和隨后的細胞死亡，以及損傷相關分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）的釋放。再灌注血液流動恢復時DAMPs被沖入循環引發促進組織損傷的復雜無菌性炎癥級聯反應，導致進一步的功能障礙和損傷[2]。作為對內源性DAMPs的反應，浸潤性中性粒細胞會在肝臟缺血-再灌注期間在肝竇中形成中性粒細胞胞外誘捕網（neutrophil extracellular traps，NETs）。反過來，NETs被證明會加劇炎癥級聯反應，加劇肝損傷。這種缺血-再灌注的過程顯著增加了肝臟手術后的并發癥。浸潤性中性粒細胞和肝竇內皮細胞（liver sinusoidal endothelial cell，LSEC）都被認為是肝臟缺血-再灌注過程中的關鍵細胞參與者[3]。然而，到目前為止，導致HIRI的潛在機制尚不清楚，將這種損傷降至最低的有效干預措施數量仍然有限。研究HIRI形成的分子病理生理機制對于開發新的靶點和進一步治療策略至關重要。在近些年越來越多的研究表明，中性粒細胞及其產生的NETs 在HIRI過程中起著至關重要的作用[4]，會導致過度的無菌炎癥性肝損傷。然而NETs在HIRI中的作用仍然未知。筆者擬對NETs在HIRI產生中的作用機制及靶向NETs減輕HIRI的研究進展進行綜述，為減輕HIRI提供有價值的參考依據。
1 NETs 參與HIRI過程中的無菌性炎癥反應
中性粒細胞作為人類免疫系統中最豐富的先天免疫效應細胞，是肝臟缺血-再灌注后最早從血液中募集到肝臟的細胞類型之一[5]。中性粒細胞誘導的肝損傷是一個多步驟的過程，在肝臟缺血-再灌注后，受損肝細胞會釋放DAMPs[6]，如白細胞介素（interleukin，IL）-33、熱休克蛋白、高遷移率組蛋白-1（high mobility group box 1，HMGB1）和細胞外組蛋白，促進中性粒細胞從血液遷移募集在缺血損傷的肝葉中過度浸潤，中性粒細胞在缺血肝葉中的浸潤和積聚通過釋放活性氧（reactive oxygen species，ROS）、大量炎癥介質以及各種蛋白水解酶，進一步導致炎癥相關損傷，從而導致肝損傷，并與肝臟內的常駐細胞和其他免疫細胞相互作用[7]。Toll樣受體（Toll like receptor，TLR）9作為先天免疫系統中的主要模式識別受體，在NETs形成、DAMPs和肝損傷之間的惡性循環中起著橋梁作用，DAMPs可以通過TLR9激活中性粒細胞釋放NETs，此外受損肝細胞也會釋放DAMPs，使得NETs的形成與肝損傷之間形成了一個惡性循環[4]，加劇缺血-再灌注過程中的肝損傷，NETs還可以促進肝臟內炎癥相關細胞因子的釋放，并進一步激活免疫系統以放大免疫反應[8]。
NETs 是由多種抗菌蛋白如中性粒細胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、組蛋白、組織蛋白酶、α-防御素、鈣保護蛋白、細胞骨架蛋白等修飾的大型細胞外網狀結構[9]。NETs 的形成，也稱為中性粒細胞外陷阱相關死亡（neutrophil extracellular traps-osis，NETosis），是一種新型的中性粒細胞特異性細胞死亡過程，NETs的形成依賴于蛋白質精氨酸脫亞氨酶4（peptidyl arginine deiminase 4，PAD4）催化的組蛋白瓜氨酸化和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶產生的ROS[10]。既往研究發現，盡管NETs在免疫防御中起著重要作用，但NETs在許多情況下更可能致病，如癌癥[11]、自身免疫性疾病[12]、炎癥性疾病[13]、靜脈血栓[14]和缺血-再灌注損傷。NETs的形成，其特點是活化的中性粒細胞將NETs釋放到細胞外空間以抵御入侵的病原體，NETs具有中和殺死細菌、真菌和各種病原體的內在能力[12, 15]，除了捕捉殺死各種病原體外，NETs也在各種無菌條件刺激下產生，比如肝臟缺血-再灌注過程中的無菌性炎癥反應，NETs上的細胞毒性分子和蛋白酶會在肝臟缺血-再灌注過程中對肝組織造成嚴重的損傷。Huang等[16]的研究表明，肝臟缺血-再灌注過程中NETs的形成是有害的，然而NETs加重HIRI的確切機制尚不清楚；應激肝細胞釋放的高遷移率族蛋白1（high mobility group box 1，HMGB1）和組蛋白通過TLR4或TLR9依賴性途徑激活中性粒細胞形成NETs，也可能在進一步募集和激活中性粒細胞形成NETs中發揮作用,并加劇缺血-再灌注后的肝損傷。組蛋白和HMGB1除了激活NETs外，也是NETs形成過程中排出的細胞內容物的一部分。NETs中的組蛋白和HMGB1本身可能起到DAMPs的作用，并通過與NETs相互作用來增強炎癥反應。此外，NETs中的其他蛋白質也可能會促進炎癥和器官損傷，如中性粒細胞彈性蛋白酶通過抑制內皮一氧化氮合酶的激活來減少內皮細胞前列環素-2的產生，從而促進缺血-再灌注誘導的肝損傷的發展。此外，NETs也被證明可以激活補體系統，進一步促進炎癥反應的發生。
2 肝臟常駐細胞在中性粒細胞募集和釋放NETs中的作用
再灌注血液流動恢復后無菌炎癥反應的過度激活會導致進一步的功能障礙。導致局部肝細胞損傷的信號事件多種多樣且復雜，涉及肝細胞、LSEC、KCs和肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSC）之間的相互作用，所有這些都會導致中性粒細胞活化和NETs 的形成[7, 17]。在肝臟中， KCs作為肝臟中的常駐巨噬細胞與LSEC協同作用，在HIRI的穩態反應中發揮重要作用。Dai等[18]的一項研究顯示，肝臟缺血-再灌注后ROS和促炎細胞因子的產生和釋放顯著增加。活化的KCs也在中性粒細胞趨化中發揮作用，在KCs釋放的細胞因子中，腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）和IL-1都上調中性粒細胞表面的細胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，IMAC-1），并促進IL-8的合成[19]。TNF-α已被證明可誘導IMAC-1和P-選擇素的管腔內表達，其通過滾動和結合運動促進循環中性粒細胞的黏附，并進一步促進細胞外滲[20]。此外，Su等[21]報道，KCs生成的TNF-α通過核因子（the nuclear factor kB，NF-kB）途徑促進肝細胞趨化因子配體1（C-X-C motif chemokine ligand 1，CXCL1）誘導中性粒細胞向缺血損傷區域運動。
NETs在急性排斥反應的HIRI中起著重要的作用。Liu等[22]在他們的研究中表明，肝移植后的HMGB1有助于急性肝排斥反應的發展， HMGB1通過TLR4和晚期糖基化終末產物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）可以激活中性粒細胞并促進NETs的形成，該研究觀察到移植患者血清中NETs水平升高，且與術后肝功能呈負相關；此外，移植后血清中HMGB1和NETs水平均上升；該研究還進一步表明，肝臟KCs 是HMGB1產生的主要來源，并通過NETs極化為M1表型；此外， TLR4抑制劑和雷帕霉素的組合比單獨使用它們更有效地降低了肝移植后急性排斥反應的破壞作用。體外研究[16]表明，中性粒細胞會增加肝細胞和KCs的死亡，從而促進更多促炎細胞因子和DAMPs的釋放；然后，這些DAMPs通過TLR4和TLR9-MyD88信號通路進一步促進NETs的產生。
3 NETs與血小板的相互作用
越來越多的證據表明，接受肝臟手術的患者在術后立即出現高凝狀態[23]。術后這種高凝狀態產生的機制與血小板和中性粒細胞及NETs的形成密切相關。研究[24]發現，血小板衍生的微粒直接促進和增強免疫細胞的炎癥活性，特別是中性粒細胞的炎癥活動，且血小板已被證明可以調節血管內皮的激活，誘導黏附分子的表達，包括E-選擇素、ICAM-1和血管細胞黏附分子-1 （the vascular cellular adhesion molecule-1，VCAM-1）。此外，在損傷或感染部位，活化的血小板通過P-選擇素與中性粒細胞上的P-選擇素糖蛋白配體-1 （P-selectin glycoprotein ligand-1，PSGL-1）結合形成血小板-中性粒細胞復合物，介導并增強了中性粒細胞向炎癥和感染組織的募集[25]，觸發中性粒細胞內的炎癥信號級聯反應，模擬血栓形成前狀態。同時活化的血小板迅速釋放大量趨化因子，導致大量包括中性粒細胞的免疫細胞募集到炎癥部位，加重組織損傷。在肝臟缺血-再灌注無菌炎癥反應的過程中，有研究[26]發現活化的血小板也與中性粒細胞結合，誘導NETs的形成，就像在感染期間觀察到的一樣加重肝組織的損傷。在另外一項研究[27]中還發現，肝臟缺血-再灌注的動物模型中NETs可以引發血小板活化，導致全身免疫血栓形成和遠處器官損傷。血小板與活化中性粒細胞的相互作用同樣會促進NETs的形成，且NETs的成分被認為是肝臟缺血-再灌注后凝血障礙的關鍵激活劑[28]。研究[29]表明，血小板通過直接與中性粒細胞接觸，在血管系統內的NETs形成中發揮著至關重要的作用，除了直接調節免疫反應外，血小板還可以通過在感染部位誘導NETs的產生來參與病原體捕獲和隔離。
Zhang等[30]的研究也證實了HIRI與免疫血栓形成有關，缺血-再灌注可顯著激活血小板并增加血小板和中性粒細胞聚集，這導致HIRI后微血管中富含NETs血小板的微血栓增加，提示NETs對這些富含血小板的微血管血栓的形成至關重要；當脫氧核糖核酸酶1（deoxyribonuclease 1，Dnase1）治療阻斷NETs時，免疫血栓顯著減少，并改善肝臟缺血-再灌注后的促凝血狀態和多器官損傷。此外，該研究還觀察到在TLR4缺失的血小板中，NETs誘導的血小板活化顯著降低，NETs的作用是通過血小板TLR4依賴性途徑介導的。這些發現為應用DNase1靶向NETs提供了一種潛在的治療方法，該方法不僅可以減輕HIRI的局部反應，還可以治療和預防系統性高凝狀態和進一步的遠端器官損傷。
4 NETs靶向預防HIRI
近年來的研究已經驗證了阻斷NETs形成可能是對抗HIRI的潛在治療靶點。有研究[31]發現，炎性細胞因子IL-17 在介導、維持和促進肝臟缺血-再灌注誘導損傷的無菌性炎癥環境中起著核心的作用。在缺血-再灌注損傷發生之前給予IL-17中和抗體時，肝損傷被逆轉； 此外，血清IL-17水平的增加與肝臟內中性粒細胞浸潤和NETs形成的增加直接對應，這表明IL-17是一種有效的NETs誘導劑。類似的，在腎缺血-再灌注損傷的小鼠模型中，同樣觀察到浸潤性中性粒細胞是IL-17產生的主要來源。因此，使用IL-17中和抗體靶向IL-17可以有效減輕肝缺血-再灌注誘導的損傷。氧化應激是HIRI的另一大原因，次黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶產生的超氧化物刺激中性粒細胞通過TLR4/NOX信號通路釋放NETs促進無菌性炎癥。幾項利用抗氧化劑治療的研究表明，在動物模型中可以減少HIRI。二苯基碘鎓（diphenyleneiodonium，DPI）作為一種NADPH氧化抑制劑和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶抑制劑，與NETs形成的調節密切相關。研究發現，用別嘌呤醇（超氧化物抑制劑）和DPI聯合治療小鼠可以減少NETs的形成，并顯著減少肝損傷[32]。在另一項研究[33]中還發現，四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，TMP）通過抑制NADPH氧化酶來抑制NETs的形成，與兩種藥物中的任何一種的單藥治療相比，使用TMP和DPI的聯合治療是治療HIRI一種有前途的方法，驗證了通過DPI治療阻斷NETs形成可能是HIRI潛在治療靶點的假設。血栓調節蛋白（thrombomodulin，TM）是一種由內皮細胞高度表達的糖蛋白。 另一項研究通過在肝移植缺血-再灌注模型之前1 h靜脈注射重組TM（5 mg/kg）預處理大鼠, 實驗觀察到中性粒細胞浸潤和NETs形成顯著減少，表明了重組TM 的使用可以靶向減少中性粒細胞浸潤和NETs形成，并且在小鼠和大鼠模型中都顯示出對HIRI的保護作用。其機制可能為重組TM抑制TLR-4活性及其下游細胞外信號（激酶/c-Jun NH2末端激酶和NADPH/活性氧物種/AD4）信號通路[34]，從而減輕HIRI。
在肝缺血-再灌注過程中中性粒細胞和肝臟常駐淋巴細胞之間相互作用加重肝損傷。NETs可以直接促進缺血-再灌注后肝臟內T淋巴細胞的耗竭。NETs含有程序性死亡配體1 （programmed death-ligand 1，PD-L1），它與活化的T細胞上的程序性死亡受體-1（programmed death 1，PD-1）結合，使其失去功能并耗盡。這一發現表明可能通過靶向中性粒細胞和NETs來減輕HIRI的臨床意義[5, 35]。基質金屬蛋白酶-9（matrix Metalloproteinase-9，MMP-9）通過浸潤白細胞大量表達促進HIRI，研究發現，金屬蛋白酶組織抑制劑-1（the tissue inhibitors of metalloproteinase 1，TIMP-1）具有減少NETs形成的能力，從而限制NETs介導的細胞毒性對HIRI的影響，表明了TIMP-1過表達在HIRI中具有肝保護作用[36]，因此，TIMP-1可能代表一種有前途的分子，用于治療HIRI的藥物開發。此外，NETs染色質中含有多種促炎細胞因子和趨化因子。精氨酸脫亞氨酶4（peptidyl arginine deiminase 4，PAD4）是NETs形成的關鍵介質。有研究表明[37-38]，與野生型小鼠相比， PAD4敲除小鼠減少了NETs的產生，在小鼠模型中，靶向中性粒細胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）或使用特異性髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）抑制劑也顯示出類似的效果。用NETs抑制劑進一步處理野生型小鼠，與野生型小鼠相比，用NE抑制劑治療的野生型小鼠中性粒細胞浸潤和NETs較少。提示通過特定的PAD4抑制劑和DNase-1靶向NETs可能成為治療或預防肝臟手術患者HIRI的一種有前途的新方法[39]。
羥氯喹（hydroxychloroquine，HCQ）作為一種抗瘧藥物和免疫調節劑，在臨床應用中具有良好的安全性和多功能性。有研究[40]發現，抗瘧藥物氯喹和HCQ 表現出免疫調節作用，在體外，HCQ在100μg/mL的濃度下抑制中性粒細胞形成NETs，在小鼠肝臟缺血-再灌注模型中也表現出可抑制NETs的形成、減輕HIRI，其機制可能為HCQ通過阻斷TLR9抑制小鼠NETs的形成從而保護肝臟免受缺血-再灌注損傷，HCQ預處理可能成為一種減輕肝臟手術后缺血-再灌注損傷的可行方法。有研究[41]還表明，能夠阻斷TLR9形成的臨床藥物可能具有預防HIRI的潛力。 有研究[42]發現，姜黃素可以通過抑制MEK/ERK途徑抑制NETs的產生來緩解HIRI； 此外，該研究還表明， DNase-1 對于通過減少NETs的產生來緩解HIRI至關重要。姜黃素聯合DNase-1在通過抑制NETs的產生來緩解HIRI方面比單獨給藥的兩種藥物更有效，姜黃素與DNase-1聯合是減輕HIRI的潛在治療策略。
人臍帶來源的間充質干細胞（human umbilical cord mesenchymal stem cell，hUC-MSC）可能有助于減少NETs的形成，從而改善HIRI。在機制上，研究[42]發現人臍帶間充質干細胞來源胞外囊泡（human umbilical cord mesenchymal stem cell-originated extracellular vesicles，hUC-MSC-EVs）含有功能性線粒體，這些線粒體被轉移到肝內中性粒細胞；這種作用觸發線粒體融合，隨后恢復中性粒細胞的線粒體狀態和功能，對抑制局部NETs的形成具有納米治療作用，這突出了hUC-MSC-EVs對HIRI的治療價值。
5 小結與展望
HIRI是臨床實踐中未解決的問題，其特征是缺血期缺氧誘導的細胞損傷和血流恢復后的免疫炎癥引起，缺血損傷使肝細胞暴露于缺氧、ATP耗竭、pH變化以及細胞代謝應激中，所有這些都會導致最初的細胞損傷或死亡；在隨后的再灌注損傷中，肝臟代謝受到干擾，并誘導復雜的炎癥級聯反應，從而進一步加重肝細胞損傷。肝臟缺血-灌注會導致肝酶水平升高、膽管狹窄、肝臟功能障礙，從而直接導致肝細胞壞死，甚至導致肝功能衰竭和多器官功能衰竭，因此成為了肝臟手術后并發癥和死亡率較高的重要原因。如何減輕肝臟缺血-再灌注后的肝損傷是亟待解決的重要議題，隨著對中性粒細胞及NETs 在肝臟缺血-再灌注過程中導致肝損傷機制的大量研究，靶向NETs可能成為治療HIRI的一種新方法。目前已經有一些實驗和臨床研究表明，通過抑制NETs形成或清除已形成的NETs可以減輕HIRI并改善預后。在未來可預見將會有更多關于靶向NETs治療HIRI方面的實驗和臨床試驗的開展，并逐漸建立起更完善、更有效的治療策略，從而為臨床上改善肝臟術后患者的預后提供新途徑。
重要聲明
利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。
作者貢獻聲明：陳儒德負責收集文獻、論文撰寫；駱助林和程龍負責論文分析及修改；汪濤負責立題、擬定寫作思路、論文修改及最后定稿。