引用本文： 陳致潤, 陳林, 何振華, 劉莎, 文星雅, 肖玉蓉. ZFP36/ZFP36L1在慢性阻塞性肺疾病患者外周血中的表達及意義. 中國呼吸與危重監護雜志, 2024, 23(8): 537-545. doi: 10.7507/1671-6205.202403023 復制
版權信息： ?四川大學華西醫院華西期刊社《中國呼吸與危重監護雜志》版權所有，未經授權不得轉載、改編
慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）是一種氣流阻塞逐漸加重的疾病[1]，給健康和經濟造成巨大損失[2]。慢阻肺急性加重通常是由感染、污染或氣道損傷引起的呼吸道炎癥加劇所致，進而導致痰液增多和氣體滯留。炎癥反應會促使趨化因子的釋放，從而引起炎癥細胞的聚集，并增加黏液分泌。這種相互作用會形成惡性循環，最終增加患者死亡的風險[3]。白細胞介素8（interleukin-8，IL-8）/黏蛋白5B（mucin-5 subtype B，MUC5B）通路與這一惡性循環過程密切相關[4-5]。鋅指蛋白36（zinc finger protein 36，ZFP36）家族蛋白是一類參與信使RNA（mRNA）代謝途徑的RNA結合蛋白。該家族包括ZFP36（也稱為tristetraprolin，TTP）、ZFP36L1、ZFP36L2和ZFP36L3[6]。它們通過結合mRNA 3'UTR中特定元件調節mRNA穩定性，參與基因表達調控[7]。在炎癥疾病中，ZFP36家族蛋白調節T細胞反應和促炎細胞因子產生，缺失可能導致早期死亡[8]。ZFP36在多種疾病中發揮抗炎作用，但在慢阻肺方面還處于細胞和動物研究階段，臨床研究目前未見報道，ZFP36L1在炎癥方面的生理靶點研究較少。這可能與ZFP36L1的表型具有早期致死性相關，ZFP36L1的種系缺失會導致絨毛膜尿囊融合缺陷、造血失敗等嚴重先天性致死疾病發生[9-10]。ZFP36L1被認為與酒精性肝炎、銀屑病、骨關節炎等疾病的慢性炎癥相關[11-12]。因此本研究通過探究ZFP36家族中ZFP36、ZFP36L1在健康人群、慢阻肺穩定期、慢阻肺急性加重三組患者之間的表達差異，并與肺功能、炎癥因子、呼吸困難評分等其他反映慢阻肺急性加重嚴重程度指標相結合，明確ZFP36/ZFP36L1在慢阻肺穩定期和急性加重期中的臨床意義，以及在評估病情程度、近期預后中的臨床價值。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選取從2023年6月1日—2023年12月1日在南華大學附屬第二醫院呼吸與危重癥醫學科就診的慢阻肺患者共63例，以及同期體檢中心健康對照人群18例作為研究對象。納入標準：① 年齡大于45歲；② 慢阻肺急性加重、慢阻肺的診斷均符合《慢性阻塞性肺疾病診治指南（2021）》[13]。③ 入院前未接受抗菌藥物、全身糖皮質激素治療。排除標準：① 心、肝、腎和其他疾病嚴重的并發癥，以及其他需要干預的活動性或慢性呼吸道疾病，如支氣管擴張、活動性肺結核、肺栓塞、間質性肺病、哮喘等；② 合并有其他慢性炎癥性疾病，包括慢性肝炎、銀屑病、骨關節炎；③ 合并各系統惡性腫瘤，包括肺癌、胃癌、前列腺癌等；④ 無法獨立進行肺功能測試或改良英國醫學研究委員會呼吸困難問卷（modified Medical Research Council，mMRC）。脫落標準：各種原因造成慢阻肺急性加重患者無法完成所需病例資料，包括住院期間或者出院后3個月內死亡、各種原因失訪（拒絕電話回訪、預留聯系方式有誤等）視為脫落。本研究經南華大學衡陽醫學院附屬第二醫院倫理委員會批準［倫審快（2024013）］，已進行臨床試驗注冊（注冊號ChiCTR1900026502）。
1.2 方法
1.2.1 資料收集
記錄入組患者的年齡、性別、體重指數（body mass index，BMI）、吸煙情況、白細胞計數（white blood cell count，WBC）、中性粒細胞淋巴細胞比值（neutrophil to lymphocyte ratio，NLR）、C反應蛋白（C-reactive protein，CRP）、mMRC評分、住院事件等資料。肺功能由我院肺功能室專業技術人員采用耶格肺功能儀（MasterScreen）嚴格按照肺活量測定指南進行測量。每個患者測量3～5次，記錄每次第1秒用力呼氣容積占預計值百分比（forced expiratory volume in the first second as a percentage of predicted value，FEV1%pred）和第1秒用力呼氣容積與用力肺活量比值（forced expiratory volume in the first second/forced vital capacity，FEV1/FVC），以確保存在3個合理的結果。對慢阻肺急性加重患者進行電話隨訪，追蹤并記錄出院后3個月內的加重次數，以及總住院次數。
1.2.2 ZFP36、ZFP36L1、IL-8表達檢測
用含EDTA抗凝管采取所有患者空腹肘靜脈血2 mL，以1 000 g離心15 min后，取上清（即血漿）?80℃保存待測。同時，用不含EDTA無酶抗凝管同意取血4 mL，室溫靜置2 h后，4℃ 1 000 g離心20 min，取上清（血清）?80℃保存待測。通過酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbnent assay，ELISA）檢測血漿標本ZFP36、ZFP36L1、IL-8蛋白表達水平，試劑盒購自上海茁彩生物科技有限公司，并嚴格按照說明書操作。通過定量聚合酶鏈反應（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qPCR）檢測血清標本ZFP36、ZFP36L1 mRNA表達水平，同徐鋒等[14]PCR實驗步驟，采用逆轉錄試劑盒（貨號G3330），引物由上海茁彩生物科技有限公司提供（表1）。
表1
qPCR引物序列
1.3 統計學方法
運用SPSS26.0軟件進行統計分析。呈正態分布的計量資料用均數±標準差（x±s）表示，行One Way ANOVA檢驗；不成正態分布的計量資料用中位數（四分位數）［M（P25，P75）］表示，行Kruskal-Wallis檢驗。以例數和構成比［例（%）］描述計數資料，行χ2檢驗，若不滿足χ2條件，用Fisher確切概率法。Bonferroni法進行三組間的兩兩比較。斯皮爾曼（Spearman）秩、點二列（Pearson）確定ZFP36、ZFP36L1與各指標的相關性。診斷及預測價值采用受試者操作特征曲線（receiver operator characteristic curve，ROC曲線）評估。曲線下面積（area under ROC curve，AUC）越大，診斷/預測價值越高。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 臨床特征比較
本研究共收集了21份慢阻肺穩定期患者、42份慢阻肺急性加重患者以及18份體檢中心的健康對照人群的血液標本；脫落0例。三組年齡、BMI、性別差異無統計學意義，吸煙情況三組差異具有統計學意義。進行兩兩比較，健康組與慢阻肺穩定組（χ2=5.37，P=0.04）、健康組與慢阻肺急性加重組（χ2=18.37，P=0.00）差異有統計學意義；而慢阻肺穩定組與慢阻肺急性加重組差異無統計學意義（χ2=3.66，P=0.08）。吸煙指數定義為每天吸煙支數×吸煙年數，三組差異有統計學意義。進行兩兩比較，健康組與慢阻肺穩定組（H=2.64，P=0.01）、健康組慢阻肺急性加重組（H=?4.28，P=0.00）差異有統計學意義；而慢阻肺穩定組與慢阻肺急性加重組（H=?1.34，P=0.18）差異無統計學意義。mMRC評分比較，慢阻肺穩定組與慢阻肺急性加重組差異有統計學意義。慢阻肺急性加重組和穩定期組的FEV1%pred、FEV1/FVC差異有統計學意義。三組WBC、NLR、CRP差異有統計學意義，兩兩比較后發現慢阻肺急性加重組WBC、NLR大于健康組和穩定組（P<0.05），健康人CRP小于慢阻肺穩定組和慢阻肺急性加重組，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見表2。
表2
三組臨床特征比較［例（%）/（x±s）/M（P25，P75）］
2.2 三組ZFP36、ZFP36L1、IL-8比較
慢阻肺急性加重組、慢阻肺穩定組患者和健康對照組三組間ZFP36、ZFP36L1和IL-8差異有統計學意義。進行兩兩比較，慢阻肺急性加重組血漿中ZFP36水平低于健康對照組（H=48.23，P=0.00）和慢阻肺穩定組（H=32.21，P=0.00），健康對照組血漿中ZFP36L1水平高于于慢阻肺穩定組（H=?38.36，P=0.00）和慢阻肺急性加重組（H=37.17，P=0.00）的。慢阻肺急性加重組的血漿IL-8水平高于健康對照組（H=?44.20，P=0.00）和慢阻肺穩定組（H=?15.19，P=0.04），而慢阻肺穩定組IL-8水平高于健康對照組（H=29.01，P=0.00）。結果見表3。
表3
三組ZFP36、ZFP36L1、IL-8比較［M（P25，P75），pg/mL］
2.3 ZFP36與ZFP36L1、IL-8等指標進行相關性分析
ZFP36水平與ZFP36L1、肺功能（FEV1%pred、FEV1/FVC）呈正相關，與IL-8、炎癥指標、吸煙指數、mMRC評分、發生呼吸衰竭、3個月內再加重次數、總住院次數呈負相關，與住院時長、總住院費無相關性。結果見表4。
表4
ZFP36與各指標的相關性
2.4 ZFP36L1與炎癥指標、肺功能等指標的相關性分析
ZFP36L1水平與IL-8水平、炎癥指標（WBC、NLR、CRP）呈負相關，與吸煙指數、住院時長、總住院費、3個月內加重次數、總住院次數、發生呼吸衰竭、靜脈使用激素、入住ICU、FEV1%pred、FEV1/FVC、mMRC評分無顯著相關性。結果見表5。
表5
P36L1與炎癥指標、肺功能等指標的相關性
2.5 ZFP36、ZFP36L1等指標在慢阻肺急性加重診斷中的價值
在臨界值>402.61 pg/mL時，ZFP36診斷慢阻肺急性加重的AUC為0.980［95%置信區間（confidential interval，CI）0.950～1.000］，其敏感性和特異性分別為95.2%和90.5%，約登指數85.7%。在臨界值>154.28 pg/mL時，IL-8診斷慢阻肺急性加重的AUC為0.740（95%CI 0.610～0.860），其敏感性和特異性分別為61.9%和81.0%，約登指數42.9%。在臨界值>6.25×109/L時，WBC診斷慢阻肺急性加重的AUC為0.704（95%CI 0.570～0.837），其敏感性和特異性分別為81.0%和52.4%，約登指數33.4%。在臨界值>34.3%時，FEV1%pred診斷慢阻肺急性加重的AUC為0.854（95%CI 0.762～0.947），其敏感性和特異性分別為73.8%和90.5%，約登指數64.3%。在臨界值>3.231時，NLR診斷慢阻肺急性加重的AUC為0.810（95%CI 0.707～0.919），其敏感性和特異性分別為76.2%和76.2%，約登指數52.4%。ZFP36聯合FEV1%pred診斷慢阻肺急性加重的AUC為0.985（95%CI：0.962～1.000）、敏感性92.9%，特異性100%，約登指數92.8%。結果見表6和圖1。
表6
不同指標對慢阻肺急性加重的診斷效價
圖1
不同指標對慢阻肺急性加重診斷的ROC曲線
2.6 ZFP36、ZFP36L1等指標與慢阻肺近期頻繁加重的關系
以“出院后3個月內加重次數≥2次”為條件將慢阻肺急性加重患者分成≥2次的近期頻繁加重組、<2次的非頻繁加重組。在臨界值>340.88 pg/mL時，ZFP36診斷慢阻肺急性加重頻繁加重的AUC為0.730（95%CI：0.568-0.892），其敏感性和特異性分別為60.0%和81.5%，約登指數41.5%。在臨界值>10.18×109/L時，WBC診斷慢阻肺急性加重頻繁加重的AUC為0.706（95%CI： 0.545～0.868），其敏感性和特異性分別為53.3%和81.5%，約登指數34.8%。在臨界值>3.37時，NLR診斷慢阻肺急性加重頻繁加重的AUC為0.694（95%CI：0.535～0.853），其敏感性和特異性分別為100%和40.7%，約登指數40.7%。進一步繪制聯合診斷的ROC曲線后發現，WBC聯合NLR和ZFP36聯合NLR的P值分別為0.04、0.01，AUC分別為0.696、0.748，95%CI分別為（0.531~0.862）、（0.586~0.910），敏感性分別為66.7%、66.7%，特異性分別為74.1%、88.9%，約登指數分別為64.3%、52.4%。然而，ZFP36L1、IL-8、CRP、FEV1%pred、FEV1/FVC對慢阻肺急性加重患者出院后近期頻繁加重沒有預測價值（均P>0.05）。結果見表7和圖2。
表7
不同指標對慢阻肺近期頻繁加重的預測效價
圖2
不同指標對慢阻肺近期頻繁加重預測的ROC曲線
2.7 ZFP36、ZFP36L1、IL-8診斷慢阻肺的價值
在臨界值>502.93 pg/mL時，ZFP36診斷慢阻肺的AUC為0.889（95%CI： 0.791～0.987），其敏感性和特異性分別為61.9%和100%，約登指數為61.9%。在臨界值>97.69 pg/mL時，ZFP36L1診斷慢阻肺的AUC為0.989（95%CI 0.968～1.000），其敏感性和特異性分別為90.5%和100%，約登指數為90.5%。在臨界值>133.44 pg/mL時，IL-8診斷慢阻肺的AUC為0.981（95%CI：0.949～1.000），其敏感性和特異性分別為95.2%和94.4%，約登指數為89.6%。結果見表8和圖3。
表8
ZFP36、ZFP36L1、IL-8診斷慢阻肺的價值
圖3
不同指標對慢阻肺診斷的ROC曲線
2.8 三組血清ZFP36、ZPF36L1的mRNA表達水平
通過qPCR檢測血清樣本mRNA的表達，結果顯示慢阻肺外周血ZFP36水平三組差異有統計學意義（P<0.05）。兩兩比較發現，慢阻肺急性加重組中ZFP36 mRNA表達水平比慢阻肺穩定組低（0.68±0.29比1.14±0.17，P=0.00）。而ZFP36L1在健康組中mRNA表達水平比慢阻肺穩定組高（15.22±8.22比5.06±5.68，P=0.00），慢阻肺穩定期組和急性加重期組之間差異無統計學意義（P=0.69）。結果見表9。
表9
不同組ZFP36、ZFP36L1的mRNA表達水平（x±s）
3 討論
慢性氣道炎癥是導致慢阻肺患者氣道黏液分泌增加、氣道壁增厚、彈性減弱，最終導致氣道狹窄和阻塞，影響氣體交換和呼吸功能的主要原因[15]。此病理生理過程與IL-8/MUC5B通路密切相關。因此，深入研究IL-8在慢阻肺中的作用機制，發現更多IL-8可能的上游靶點，能為慢阻肺的治療提供一定的思路。慢阻肺急性加重是導致慢阻肺患者疾病負擔加重的直接原因。慢阻肺急性加重的診斷和預測生物標志物分別以中性粒細胞計數[16]和嗜酸性粒細胞計數[17]為主，但其診斷和預測準確度較低。因此，發現更為精準的生物標志物任重道遠。
本研究發現，在慢阻肺急性加重組中平均IL-8水平最高，慢阻肺穩定組次之，健康組最低（分別為159.33、147.41和127.32 pg/mL）。而慢阻肺急性加重組血漿中ZFP36蛋白水平較低，并且與IL-8、炎癥指標（NLR、WBC、CRP）呈負相關。此外，ZFP36與肺功能（FEV1%pred、FEV1/FVC）呈正相關，與吸煙指數呈負相關，與住院期間是否發生呼吸衰竭、出院后3個月內再加重次數、總住院次數呈負相關。IL-8在在轉錄后水平上[18]，調節肺上皮細胞中黏蛋白MUC5AC和MUC5B的表達，最后導致黏液黏稠度的增加，參與慢阻肺急性加重的發展過程[19-20]。感染后p38 MAP激酶及其上游激酶MKK3和下游激酶MK2、CNOT7/hCAF1、蛋白磷酸酶2A（PP2A）、GIGYF1/2的ZNF598上調促進ZFP36的表達[21-23]。ZFP36與IL-8 mRNA 3'非翻譯區中富含AU的二分元素（ARE）相結合，破壞了細胞質蛋白的穩定性和相互作用，降低IL-8 mRNA的穩定性，從而加速IL-8的降解[24-25]。香煙煙霧暴露能降低小鼠ZFP36表達并損害ZFP36功能，在小鼠體內使用藥物促進ZFP36的激活和穩定后，抑制了小鼠中性粒細胞炎癥和氣道重塑[26-27]。因此，我們推測ZFP36參與慢性氣道炎癥的分子信號機制可能為，ZFP36的3'非翻譯區（UTR）富含AU元素（AREs）與IL-8 mRNA的ARE結構相互作用，導致IL-8 mRNA的穩定性降低，加速IL-8 mRNA的降解，在轉錄后水平上下調IL-8的表達水平，進而減少IL-8蛋白的表達水平。當IL-8與其受體結合時，形成異二聚體，激活受體上的JAK2，進而導致受體胞漿區域的酪氨酸殘基磷酸化。這進一步引導STAT6蛋白聚集到受體區域，并通過SH2結構域與之結合。在此過程中，STAT6蛋白上的Y641位點酪氨酸殘基被磷酸化，促使磷酸化的STAT6蛋白形成二聚體并遷移至細胞核，與特定的DNA元件結合，從而啟動下游相關基因，包括MUC5B的轉錄和表達。最終導致氣道黏液分泌減少，氣道炎癥減輕，肺功能改善，以及呼吸衰竭、頻繁加重情況減少。
ZFP36L1 mRNA的水平在急性感染下約為Zfp36的13%，并超過ZFP36L2的3倍[28]。本研究中，在健康對照組血漿中ZFP36L1的水平高于穩定組（P=0.000），但在穩定組與慢阻肺急性加重組之間無顯著差異。且ZFP36L1與IL-8水平和炎癥指標的相關系數絕對值（IrI）沒有ZFP36接近1，相關性較弱。與吸煙指數、住院事件、肺功能、mMRC評分均無顯著相關性。在急性細菌性肺炎中，ZFP36可以完全彌補ZFP36L1的功能，ZFP36L1表達并不起不可或缺的作用[29]。因此，急性炎癥背景下，ZFP36是促炎mRNA水平的主要調節因子，ZFP36L2起到協同調節作用，其本身變化并不明顯。但二者mRNA在慢阻肺穩定組都有相當的水平表達，因此ZFP36L1可能在慢阻肺穩定期的慢性氣道炎癥中具有一定抗炎作用。
ZFP36、ZFP36L1在慢阻肺中的診斷價值暫未見文獻報道。本研究發現ZFP36、ZFP36L1、IL-8均具有較高的慢阻肺診斷價值，其中ZFP36L1（AUC=0.989，95%CI 0.968～1.000）診斷價值最高，敏感性為90.5%，特異性為100%。而ZFP36L1對慢阻肺急性加重診斷及近期預后預測無顯著意義（P>0.05）。
NLR、血小板淋巴細胞比值（platelet to lymphocyte ratio，PLR）、纖維蛋白原是目前診斷慢阻肺急性加重的主要生物標志物[30]。崔莉等[31]研究發現NLR的AUC（95%CI）為0.765（0.684～0.845），在三者中的診斷價值較高，其診斷敏感性為0.565，特異性為0.907。本研究發現ZFP36診斷慢阻肺急性加重的AUC明顯高于NLR（0.98比0.81）。且敏感性、特異性也優于NLR（95.2%比76.2%、90.5%比76.2%），聯合FEV1%pred診斷慢阻肺急性加重的特異性高達100%。因此抗炎因子ZFP36比炎癥因子NLR、PLR更加準確地診斷慢阻肺急性加重，是更好的慢阻肺急性加重診斷指標。進一步繪制ZFP36、NLR預測慢阻肺急性加重患者出院90天內再次加重的ROC曲線，發現NLR預測慢阻肺急性加重患者出院90天內再次加重（AUC=0.694，95%CI 0.535～0.853，P=0.039），而CRP不能預測慢阻肺急性加重患者出院90天內再次加重（P=0.181）。與Feng等[32]的結果（AUC=0.580，95%CI 0.529～0.632，P=0.001）一致；但更重要的是，ZFP36預測90天內再次加重（AUC=0.73，95%CI 0.568～0.892）明顯高于NLR，這可能與ZFP36在慢阻肺急性加重過程中表達增加，減少肺氣腫樣改變和氣道重塑，改善肺功能相關[13]。因此，ZFP36相比于NLR，預測慢阻肺急性加重患者出院90天內再次加重的預測價值更高。
雖然ZFP36、ZFP36L1在慢阻肺診斷和慢阻肺急性加重的診斷、預后評估中具有較好的臨床價值，但本研究仍存在許多局限性。首先，研究的樣本量較小，還存在較大的偶然性，并且隨訪時間短，部分患者頻繁加重期可能不在研究時間段內，所以總住院時長和總住院費與ZFP36無顯著相關性。因此，需進一步增大樣本量，進行多中心、長時間、大樣本的實驗進行驗證。其次，樣本來源相對單一，慢阻肺穩定期患者都來自門診，慢阻肺急性加重患者都來自住院部，最終導致遺漏了一部分門診輕度加重的患者和ICU病重患者的樣本。希望在不久的將來能更加完善對ZFP36、ZFP36L1調控IL-8上下游通路的研究，為慢阻肺治療提供更多的診療思路。
綜上所述，外周血中ZFP36對慢阻肺急性加重具有良好的診斷價值。聯合FEV1%pred可進一步增加診斷價值。作為慢阻肺患者出院3個月內頻繁加重的預測指標，診斷敏感性、特異性優于NLR等炎癥指標。ZFP36在慢阻肺急性加重中具有抗炎作用。外周血中ZFP36L1具有良好的慢阻肺診斷價值。未來還需要更多大型臨床試驗驗證這些結論。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）是一種氣流阻塞逐漸加重的疾病[1]，給健康和經濟造成巨大損失[2]。慢阻肺急性加重通常是由感染、污染或氣道損傷引起的呼吸道炎癥加劇所致，進而導致痰液增多和氣體滯留。炎癥反應會促使趨化因子的釋放，從而引起炎癥細胞的聚集，并增加黏液分泌。這種相互作用會形成惡性循環，最終增加患者死亡的風險[3]。白細胞介素8（interleukin-8，IL-8）/黏蛋白5B（mucin-5 subtype B，MUC5B）通路與這一惡性循環過程密切相關[4-5]。鋅指蛋白36（zinc finger protein 36，ZFP36）家族蛋白是一類參與信使RNA（mRNA）代謝途徑的RNA結合蛋白。該家族包括ZFP36（也稱為tristetraprolin，TTP）、ZFP36L1、ZFP36L2和ZFP36L3[6]。它們通過結合mRNA 3'UTR中特定元件調節mRNA穩定性，參與基因表達調控[7]。在炎癥疾病中，ZFP36家族蛋白調節T細胞反應和促炎細胞因子產生，缺失可能導致早期死亡[8]。ZFP36在多種疾病中發揮抗炎作用，但在慢阻肺方面還處于細胞和動物研究階段，臨床研究目前未見報道，ZFP36L1在炎癥方面的生理靶點研究較少。這可能與ZFP36L1的表型具有早期致死性相關，ZFP36L1的種系缺失會導致絨毛膜尿囊融合缺陷、造血失敗等嚴重先天性致死疾病發生[9-10]。ZFP36L1被認為與酒精性肝炎、銀屑病、骨關節炎等疾病的慢性炎癥相關[11-12]。因此本研究通過探究ZFP36家族中ZFP36、ZFP36L1在健康人群、慢阻肺穩定期、慢阻肺急性加重三組患者之間的表達差異，并與肺功能、炎癥因子、呼吸困難評分等其他反映慢阻肺急性加重嚴重程度指標相結合，明確ZFP36/ZFP36L1在慢阻肺穩定期和急性加重期中的臨床意義，以及在評估病情程度、近期預后中的臨床價值。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選取從2023年6月1日—2023年12月1日在南華大學附屬第二醫院呼吸與危重癥醫學科就診的慢阻肺患者共63例，以及同期體檢中心健康對照人群18例作為研究對象。納入標準：① 年齡大于45歲；② 慢阻肺急性加重、慢阻肺的診斷均符合《慢性阻塞性肺疾病診治指南（2021）》[13]。③ 入院前未接受抗菌藥物、全身糖皮質激素治療。排除標準：① 心、肝、腎和其他疾病嚴重的并發癥，以及其他需要干預的活動性或慢性呼吸道疾病，如支氣管擴張、活動性肺結核、肺栓塞、間質性肺病、哮喘等；② 合并有其他慢性炎癥性疾病，包括慢性肝炎、銀屑病、骨關節炎；③ 合并各系統惡性腫瘤，包括肺癌、胃癌、前列腺癌等；④ 無法獨立進行肺功能測試或改良英國醫學研究委員會呼吸困難問卷（modified Medical Research Council，mMRC）。脫落標準：各種原因造成慢阻肺急性加重患者無法完成所需病例資料，包括住院期間或者出院后3個月內死亡、各種原因失訪（拒絕電話回訪、預留聯系方式有誤等）視為脫落。本研究經南華大學衡陽醫學院附屬第二醫院倫理委員會批準［倫審快（2024013）］，已進行臨床試驗注冊（注冊號ChiCTR1900026502）。
1.2 方法
1.2.1 資料收集
記錄入組患者的年齡、性別、體重指數（body mass index，BMI）、吸煙情況、白細胞計數（white blood cell count，WBC）、中性粒細胞淋巴細胞比值（neutrophil to lymphocyte ratio，NLR）、C反應蛋白（C-reactive protein，CRP）、mMRC評分、住院事件等資料。肺功能由我院肺功能室專業技術人員采用耶格肺功能儀（MasterScreen）嚴格按照肺活量測定指南進行測量。每個患者測量3～5次，記錄每次第1秒用力呼氣容積占預計值百分比（forced expiratory volume in the first second as a percentage of predicted value，FEV1%pred）和第1秒用力呼氣容積與用力肺活量比值（forced expiratory volume in the first second/forced vital capacity，FEV1/FVC），以確保存在3個合理的結果。對慢阻肺急性加重患者進行電話隨訪，追蹤并記錄出院后3個月內的加重次數，以及總住院次數。
1.2.2 ZFP36、ZFP36L1、IL-8表達檢測
用含EDTA抗凝管采取所有患者空腹肘靜脈血2 mL，以1 000 g離心15 min后，取上清（即血漿）?80℃保存待測。同時，用不含EDTA無酶抗凝管同意取血4 mL，室溫靜置2 h后，4℃ 1 000 g離心20 min，取上清（血清）?80℃保存待測。通過酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbnent assay，ELISA）檢測血漿標本ZFP36、ZFP36L1、IL-8蛋白表達水平，試劑盒購自上海茁彩生物科技有限公司，并嚴格按照說明書操作。通過定量聚合酶鏈反應（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qPCR）檢測血清標本ZFP36、ZFP36L1 mRNA表達水平，同徐鋒等[14]PCR實驗步驟，采用逆轉錄試劑盒（貨號G3330），引物由上海茁彩生物科技有限公司提供（表1）。
表1
qPCR引物序列
1.3 統計學方法
運用SPSS26.0軟件進行統計分析。呈正態分布的計量資料用均數±標準差（x±s）表示，行One Way ANOVA檢驗；不成正態分布的計量資料用中位數（四分位數）［M（P25，P75）］表示，行Kruskal-Wallis檢驗。以例數和構成比［例（%）］描述計數資料，行χ2檢驗，若不滿足χ2條件，用Fisher確切概率法。Bonferroni法進行三組間的兩兩比較。斯皮爾曼（Spearman）秩、點二列（Pearson）確定ZFP36、ZFP36L1與各指標的相關性。診斷及預測價值采用受試者操作特征曲線（receiver operator characteristic curve，ROC曲線）評估。曲線下面積（area under ROC curve，AUC）越大，診斷/預測價值越高。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 臨床特征比較
本研究共收集了21份慢阻肺穩定期患者、42份慢阻肺急性加重患者以及18份體檢中心的健康對照人群的血液標本；脫落0例。三組年齡、BMI、性別差異無統計學意義，吸煙情況三組差異具有統計學意義。進行兩兩比較，健康組與慢阻肺穩定組（χ2=5.37，P=0.04）、健康組與慢阻肺急性加重組（χ2=18.37，P=0.00）差異有統計學意義；而慢阻肺穩定組與慢阻肺急性加重組差異無統計學意義（χ2=3.66，P=0.08）。吸煙指數定義為每天吸煙支數×吸煙年數，三組差異有統計學意義。進行兩兩比較，健康組與慢阻肺穩定組（H=2.64，P=0.01）、健康組慢阻肺急性加重組（H=?4.28，P=0.00）差異有統計學意義；而慢阻肺穩定組與慢阻肺急性加重組（H=?1.34，P=0.18）差異無統計學意義。mMRC評分比較，慢阻肺穩定組與慢阻肺急性加重組差異有統計學意義。慢阻肺急性加重組和穩定期組的FEV1%pred、FEV1/FVC差異有統計學意義。三組WBC、NLR、CRP差異有統計學意義，兩兩比較后發現慢阻肺急性加重組WBC、NLR大于健康組和穩定組（P<0.05），健康人CRP小于慢阻肺穩定組和慢阻肺急性加重組，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見表2。
表2
三組臨床特征比較［例（%）/（x±s）/M（P25，P75）］
2.2 三組ZFP36、ZFP36L1、IL-8比較
慢阻肺急性加重組、慢阻肺穩定組患者和健康對照組三組間ZFP36、ZFP36L1和IL-8差異有統計學意義。進行兩兩比較，慢阻肺急性加重組血漿中ZFP36水平低于健康對照組（H=48.23，P=0.00）和慢阻肺穩定組（H=32.21，P=0.00），健康對照組血漿中ZFP36L1水平高于于慢阻肺穩定組（H=?38.36，P=0.00）和慢阻肺急性加重組（H=37.17，P=0.00）的。慢阻肺急性加重組的血漿IL-8水平高于健康對照組（H=?44.20，P=0.00）和慢阻肺穩定組（H=?15.19，P=0.04），而慢阻肺穩定組IL-8水平高于健康對照組（H=29.01，P=0.00）。結果見表3。
表3
三組ZFP36、ZFP36L1、IL-8比較［M（P25，P75），pg/mL］
2.3 ZFP36與ZFP36L1、IL-8等指標進行相關性分析
ZFP36水平與ZFP36L1、肺功能（FEV1%pred、FEV1/FVC）呈正相關，與IL-8、炎癥指標、吸煙指數、mMRC評分、發生呼吸衰竭、3個月內再加重次數、總住院次數呈負相關，與住院時長、總住院費無相關性。結果見表4。
表4
ZFP36與各指標的相關性
2.4 ZFP36L1與炎癥指標、肺功能等指標的相關性分析
ZFP36L1水平與IL-8水平、炎癥指標（WBC、NLR、CRP）呈負相關，與吸煙指數、住院時長、總住院費、3個月內加重次數、總住院次數、發生呼吸衰竭、靜脈使用激素、入住ICU、FEV1%pred、FEV1/FVC、mMRC評分無顯著相關性。結果見表5。
表5
P36L1與炎癥指標、肺功能等指標的相關性
2.5 ZFP36、ZFP36L1等指標在慢阻肺急性加重診斷中的價值
在臨界值>402.61 pg/mL時，ZFP36診斷慢阻肺急性加重的AUC為0.980［95%置信區間（confidential interval，CI）0.950～1.000］，其敏感性和特異性分別為95.2%和90.5%，約登指數85.7%。在臨界值>154.28 pg/mL時，IL-8診斷慢阻肺急性加重的AUC為0.740（95%CI 0.610～0.860），其敏感性和特異性分別為61.9%和81.0%，約登指數42.9%。在臨界值>6.25×109/L時，WBC診斷慢阻肺急性加重的AUC為0.704（95%CI 0.570～0.837），其敏感性和特異性分別為81.0%和52.4%，約登指數33.4%。在臨界值>34.3%時，FEV1%pred診斷慢阻肺急性加重的AUC為0.854（95%CI 0.762～0.947），其敏感性和特異性分別為73.8%和90.5%，約登指數64.3%。在臨界值>3.231時，NLR診斷慢阻肺急性加重的AUC為0.810（95%CI 0.707～0.919），其敏感性和特異性分別為76.2%和76.2%，約登指數52.4%。ZFP36聯合FEV1%pred診斷慢阻肺急性加重的AUC為0.985（95%CI：0.962～1.000）、敏感性92.9%，特異性100%，約登指數92.8%。結果見表6和圖1。
表6
不同指標對慢阻肺急性加重的診斷效價
圖1
不同指標對慢阻肺急性加重診斷的ROC曲線
2.6 ZFP36、ZFP36L1等指標與慢阻肺近期頻繁加重的關系
以“出院后3個月內加重次數≥2次”為條件將慢阻肺急性加重患者分成≥2次的近期頻繁加重組、<2次的非頻繁加重組。在臨界值>340.88 pg/mL時，ZFP36診斷慢阻肺急性加重頻繁加重的AUC為0.730（95%CI：0.568-0.892），其敏感性和特異性分別為60.0%和81.5%，約登指數41.5%。在臨界值>10.18×109/L時，WBC診斷慢阻肺急性加重頻繁加重的AUC為0.706（95%CI： 0.545～0.868），其敏感性和特異性分別為53.3%和81.5%，約登指數34.8%。在臨界值>3.37時，NLR診斷慢阻肺急性加重頻繁加重的AUC為0.694（95%CI：0.535～0.853），其敏感性和特異性分別為100%和40.7%，約登指數40.7%。進一步繪制聯合診斷的ROC曲線后發現，WBC聯合NLR和ZFP36聯合NLR的P值分別為0.04、0.01，AUC分別為0.696、0.748，95%CI分別為（0.531~0.862）、（0.586~0.910），敏感性分別為66.7%、66.7%，特異性分別為74.1%、88.9%，約登指數分別為64.3%、52.4%。然而，ZFP36L1、IL-8、CRP、FEV1%pred、FEV1/FVC對慢阻肺急性加重患者出院后近期頻繁加重沒有預測價值（均P>0.05）。結果見表7和圖2。
表7
不同指標對慢阻肺近期頻繁加重的預測效價
圖2
不同指標對慢阻肺近期頻繁加重預測的ROC曲線
2.7 ZFP36、ZFP36L1、IL-8診斷慢阻肺的價值
在臨界值>502.93 pg/mL時，ZFP36診斷慢阻肺的AUC為0.889（95%CI： 0.791～0.987），其敏感性和特異性分別為61.9%和100%，約登指數為61.9%。在臨界值>97.69 pg/mL時，ZFP36L1診斷慢阻肺的AUC為0.989（95%CI 0.968～1.000），其敏感性和特異性分別為90.5%和100%，約登指數為90.5%。在臨界值>133.44 pg/mL時，IL-8診斷慢阻肺的AUC為0.981（95%CI：0.949～1.000），其敏感性和特異性分別為95.2%和94.4%，約登指數為89.6%。結果見表8和圖3。
表8
ZFP36、ZFP36L1、IL-8診斷慢阻肺的價值
圖3
不同指標對慢阻肺診斷的ROC曲線
2.8 三組血清ZFP36、ZPF36L1的mRNA表達水平
通過qPCR檢測血清樣本mRNA的表達，結果顯示慢阻肺外周血ZFP36水平三組差異有統計學意義（P<0.05）。兩兩比較發現，慢阻肺急性加重組中ZFP36 mRNA表達水平比慢阻肺穩定組低（0.68±0.29比1.14±0.17，P=0.00）。而ZFP36L1在健康組中mRNA表達水平比慢阻肺穩定組高（15.22±8.22比5.06±5.68，P=0.00），慢阻肺穩定期組和急性加重期組之間差異無統計學意義（P=0.69）。結果見表9。
表9
不同組ZFP36、ZFP36L1的mRNA表達水平（x±s）
3 討論
慢性氣道炎癥是導致慢阻肺患者氣道黏液分泌增加、氣道壁增厚、彈性減弱，最終導致氣道狹窄和阻塞，影響氣體交換和呼吸功能的主要原因[15]。此病理生理過程與IL-8/MUC5B通路密切相關。因此，深入研究IL-8在慢阻肺中的作用機制，發現更多IL-8可能的上游靶點，能為慢阻肺的治療提供一定的思路。慢阻肺急性加重是導致慢阻肺患者疾病負擔加重的直接原因。慢阻肺急性加重的診斷和預測生物標志物分別以中性粒細胞計數[16]和嗜酸性粒細胞計數[17]為主，但其診斷和預測準確度較低。因此，發現更為精準的生物標志物任重道遠。
本研究發現，在慢阻肺急性加重組中平均IL-8水平最高，慢阻肺穩定組次之，健康組最低（分別為159.33、147.41和127.32 pg/mL）。而慢阻肺急性加重組血漿中ZFP36蛋白水平較低，并且與IL-8、炎癥指標（NLR、WBC、CRP）呈負相關。此外，ZFP36與肺功能（FEV1%pred、FEV1/FVC）呈正相關，與吸煙指數呈負相關，與住院期間是否發生呼吸衰竭、出院后3個月內再加重次數、總住院次數呈負相關。IL-8在在轉錄后水平上[18]，調節肺上皮細胞中黏蛋白MUC5AC和MUC5B的表達，最后導致黏液黏稠度的增加，參與慢阻肺急性加重的發展過程[19-20]。感染后p38 MAP激酶及其上游激酶MKK3和下游激酶MK2、CNOT7/hCAF1、蛋白磷酸酶2A（PP2A）、GIGYF1/2的ZNF598上調促進ZFP36的表達[21-23]。ZFP36與IL-8 mRNA 3'非翻譯區中富含AU的二分元素（ARE）相結合，破壞了細胞質蛋白的穩定性和相互作用，降低IL-8 mRNA的穩定性，從而加速IL-8的降解[24-25]。香煙煙霧暴露能降低小鼠ZFP36表達并損害ZFP36功能，在小鼠體內使用藥物促進ZFP36的激活和穩定后，抑制了小鼠中性粒細胞炎癥和氣道重塑[26-27]。因此，我們推測ZFP36參與慢性氣道炎癥的分子信號機制可能為，ZFP36的3'非翻譯區（UTR）富含AU元素（AREs）與IL-8 mRNA的ARE結構相互作用，導致IL-8 mRNA的穩定性降低，加速IL-8 mRNA的降解，在轉錄后水平上下調IL-8的表達水平，進而減少IL-8蛋白的表達水平。當IL-8與其受體結合時，形成異二聚體，激活受體上的JAK2，進而導致受體胞漿區域的酪氨酸殘基磷酸化。這進一步引導STAT6蛋白聚集到受體區域，并通過SH2結構域與之結合。在此過程中，STAT6蛋白上的Y641位點酪氨酸殘基被磷酸化，促使磷酸化的STAT6蛋白形成二聚體并遷移至細胞核，與特定的DNA元件結合，從而啟動下游相關基因，包括MUC5B的轉錄和表達。最終導致氣道黏液分泌減少，氣道炎癥減輕，肺功能改善，以及呼吸衰竭、頻繁加重情況減少。
ZFP36L1 mRNA的水平在急性感染下約為Zfp36的13%，并超過ZFP36L2的3倍[28]。本研究中，在健康對照組血漿中ZFP36L1的水平高于穩定組（P=0.000），但在穩定組與慢阻肺急性加重組之間無顯著差異。且ZFP36L1與IL-8水平和炎癥指標的相關系數絕對值（IrI）沒有ZFP36接近1，相關性較弱。與吸煙指數、住院事件、肺功能、mMRC評分均無顯著相關性。在急性細菌性肺炎中，ZFP36可以完全彌補ZFP36L1的功能，ZFP36L1表達并不起不可或缺的作用[29]。因此，急性炎癥背景下，ZFP36是促炎mRNA水平的主要調節因子，ZFP36L2起到協同調節作用，其本身變化并不明顯。但二者mRNA在慢阻肺穩定組都有相當的水平表達，因此ZFP36L1可能在慢阻肺穩定期的慢性氣道炎癥中具有一定抗炎作用。
ZFP36、ZFP36L1在慢阻肺中的診斷價值暫未見文獻報道。本研究發現ZFP36、ZFP36L1、IL-8均具有較高的慢阻肺診斷價值，其中ZFP36L1（AUC=0.989，95%CI 0.968～1.000）診斷價值最高，敏感性為90.5%，特異性為100%。而ZFP36L1對慢阻肺急性加重診斷及近期預后預測無顯著意義（P>0.05）。
NLR、血小板淋巴細胞比值（platelet to lymphocyte ratio，PLR）、纖維蛋白原是目前診斷慢阻肺急性加重的主要生物標志物[30]。崔莉等[31]研究發現NLR的AUC（95%CI）為0.765（0.684～0.845），在三者中的診斷價值較高，其診斷敏感性為0.565，特異性為0.907。本研究發現ZFP36診斷慢阻肺急性加重的AUC明顯高于NLR（0.98比0.81）。且敏感性、特異性也優于NLR（95.2%比76.2%、90.5%比76.2%），聯合FEV1%pred診斷慢阻肺急性加重的特異性高達100%。因此抗炎因子ZFP36比炎癥因子NLR、PLR更加準確地診斷慢阻肺急性加重，是更好的慢阻肺急性加重診斷指標。進一步繪制ZFP36、NLR預測慢阻肺急性加重患者出院90天內再次加重的ROC曲線，發現NLR預測慢阻肺急性加重患者出院90天內再次加重（AUC=0.694，95%CI 0.535～0.853，P=0.039），而CRP不能預測慢阻肺急性加重患者出院90天內再次加重（P=0.181）。與Feng等[32]的結果（AUC=0.580，95%CI 0.529～0.632，P=0.001）一致；但更重要的是，ZFP36預測90天內再次加重（AUC=0.73，95%CI 0.568～0.892）明顯高于NLR，這可能與ZFP36在慢阻肺急性加重過程中表達增加，減少肺氣腫樣改變和氣道重塑，改善肺功能相關[13]。因此，ZFP36相比于NLR，預測慢阻肺急性加重患者出院90天內再次加重的預測價值更高。
雖然ZFP36、ZFP36L1在慢阻肺診斷和慢阻肺急性加重的診斷、預后評估中具有較好的臨床價值，但本研究仍存在許多局限性。首先，研究的樣本量較小，還存在較大的偶然性，并且隨訪時間短，部分患者頻繁加重期可能不在研究時間段內，所以總住院時長和總住院費與ZFP36無顯著相關性。因此，需進一步增大樣本量，進行多中心、長時間、大樣本的實驗進行驗證。其次，樣本來源相對單一，慢阻肺穩定期患者都來自門診，慢阻肺急性加重患者都來自住院部，最終導致遺漏了一部分門診輕度加重的患者和ICU病重患者的樣本。希望在不久的將來能更加完善對ZFP36、ZFP36L1調控IL-8上下游通路的研究，為慢阻肺治療提供更多的診療思路。
綜上所述，外周血中ZFP36對慢阻肺急性加重具有良好的診斷價值。聯合FEV1%pred可進一步增加診斷價值。作為慢阻肺患者出院3個月內頻繁加重的預測指標，診斷敏感性、特異性優于NLR等炎癥指標。ZFP36在慢阻肺急性加重中具有抗炎作用。外周血中ZFP36L1具有良好的慢阻肺診斷價值。未來還需要更多大型臨床試驗驗證這些結論。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
