引用本文： 曾琴, 謝榕城, 馬杰飛, 陳斌. 基于生物信息學分析鐵死亡調控基因與膿毒癥誘導肺損傷的關系. 中國呼吸與危重監護雜志, 2024, 23(9): 617-624. doi: 10.7507/1671-6205.202403042 復制
版權信息： ?四川大學華西醫院華西期刊社《中國呼吸與危重監護雜志》版權所有，未經授權不得轉載、改編
膿毒癥作為一種嚴重的臨床綜合征，由炎癥反應失調和隨后的多器官功能障礙引起[1]，其發病機制異常復雜，不僅涉及全身性炎癥反應和免疫紊亂[2]，還紊亂了多個器官的功能[3]。在重度膿毒癥或膿毒性休克患者中，各種器官功能受損[4]，其中肺部是最容易受損的器官之一[5]。據報道，約40%的急性肺損傷與膿毒癥有關[6]。急性呼吸窘迫綜合征是一種常見的膿毒癥誘導的急性肺損傷，由肺內外多種因素引起的急性彌漫性炎癥性損傷[7]。在膿毒癥誘發的急性呼吸窘迫綜合征患者中[8]，疾病進展迅速，死亡率極高[9]。然而，目前尚無針對膿毒癥誘導的急性呼吸窘迫綜合征的特異性治療方法。因此，深入探究其機制有助于尋找早期識別可能發展為急性呼損傷的膿毒癥的生物標志物，并確定潛在的治療靶點。
近年來，鐵死亡作為一種可調控的細胞死亡方式受到了廣泛關注，其主要特征在于細胞內鐵離子超載[10]，抑制了抗氧化系統[11]，導致脂質過氧化物積累[12]，從而破壞了細胞膜的結構和功能，進而誘發細胞死亡[13]。研究發現，在膿毒癥誘發的急性呼吸窘迫綜合征患者中，肺組織中的鐵死亡相關基因的表達水平發生明顯變化[14]，脂質過氧化水平升高，然而使用Ferrostatin-1 （Fer-1）可逆轉上述結果，這證實了鐵死亡的發生[15]。因此，鐵死亡有望成為膿毒癥誘發急性肺損傷治療的新靶點[16]。然而，目前鐵死亡與膿毒癥誘發急性肺損傷的相關性研究仍然較少見。
本研究擬通過生物信息學手段探究鐵死亡相關基因在膿毒癥導致的急性肺損傷中的作用，并預測與之密切相關的基因。我們從基因表達數據庫中下載了數據集，再根據|log2 FC|>1且P.adj<0.05的條件，篩選出表達差異基因。接著，將這些差異基因與從鐵死亡數據庫中下載的鐵死亡驅動和抑制基因取交集，得到了膿毒癥鐵死亡相關的差異基因。我們利用R語言、DAVID和STRING等線上工具對Fe-DEGs進行了GO-KEGG功能及通路富集分析，構建了PPI網絡。通過構建的PPI網絡，我們可以篩選出膿毒癥鐵死亡相關的差異基因，這些基因的功能及相互作用網絡的進一步分析可能為膿毒癥的治療提供新的分子靶點。我們希望通過這一研究，為膿毒癥患者的治療提供新的治療靶點和策略。在此研究中，我們強調了生物信息學在揭示疾病發病機制中的潛力，這些發現可能為膿毒癥的治療提供新的治療靶點和策略。
1 材料和方法
1.1 公共數據集獲取及差異基因篩選
從美國國家生物技術信息中心GEO數據庫（
通過FerrDb（v2.0）平臺（
1.2 Fe-DEGs的功能富集分析
我們將1.1所篩選的53個Fe-DEGs利用在線工具DAVID數據庫（
1.3 構建蛋白互作網絡（PPI）及篩選關鍵基因
我們將53個Fe-DEGs導入在線工具STRING數據庫（
1.4 關鍵基因篩選
我們利用cytohubba插件進行關鍵基因的篩選，根據最大團中心性（Maximal Clique Centrality，MCC）算法、最大鄰域組件密度（Density of Maximum Neighborhood Component，DMNC）算法、介數中心性（Betweenness Centrality，BETWEENNESS）算法、Degree算法、邊滲透組件（Edge Percolated Component，EPC）算法這五種算法篩選出排名前10的基因取交集作為關鍵基因，并利用Venn軟件進行可視化。隨后，我們利用在線工具GeneMania（
2 結果
2.1 基于公共數據庫篩選DEGs和Fe-DEGs
GEO2R是一種基于網絡的工具，用于GEO數據庫中表達譜芯片差異表達分析[21]。通過“GEO2R”在線工具比較GSE154653數據集中兩組基因集，我們發現，箱線圖中，各樣本的標準化數據分布較為集中，顯示出較好的數據穩定性和一致性（圖1a）。此外，UMAP分析結果顯示，正常組和LPS誘導膿毒癥組的大鼠肺組織樣本在二維平面上形成了明顯的聚類，且兩組樣本之間有明顯的分離（圖1b）。并以|log2 FC|≥1且P.adj<0.05作為入選標準，我們共篩選出表達差異基因
圖1
膿毒癥差異基因的初期篩選
a.GSE154653基因芯片UMAP分析圖；b. GSE154653數據歸一化圖
圖2
膿毒癥差異基因的篩選結果
a. GSE154653基因芯片的火山圖，紫點和藍點代表差異表達基因（紫點代表上調基因，藍點代表下調基因）；b.GSE154653基因芯片的層次聚類熱圖（紅色表示基因表達相對上調，藍色表示基因表達相對下調；Type中T代表正常組，N代表LPS組）
通過FerrDb數據庫獲取包含抑制型、驅動型以及標記型共484個基因的數據集，并將其與DEGs相交集得到53個Fe-DEGs，利用在線工具Venn軟件可視化Fe-DEGs的Venn圖（圖3a），熱圖（圖3b）展示出Fe-DEGs的表達情況，并對篩選出來的Fe-DEGs進行分類。結果見表1。
圖3
Fe-DEGs篩選結果圖
a.Venn圖（紅色表示鐵死亡相關基因，藍色表示GSE154653差異表達基因，交集部分表示鐵死亡相關的差異基因）；b.熱圖（紅色表示上調基因，藍色表示下調基因，Type中T代表正常組，N代表LPS組）
表1
Fe-DEGs 基因所屬的基因調節類別
2.2 Fe-DEGs的功能富集分析
2.2.1 GO功能富集分析結果
為了探索Fe-DEGs的GO功能富集分析，我們將2.1中所篩選得到的53個Fe-DEGs通過在線工具DAVID庫分別從生物過程、分子功能和細胞組分3個層面進行注釋，并根據P<0.05為原則，按富集倍數取各層面的前5條繪制氣泡圖，見圖4a。為了更好地展示Fe-DEGs與功能富集之間的關系，繪制的圈圖可見圖4b。這些基因在生物過程中主要涉及轉錄的正向調節、RNA聚合酶II啟動子轉錄的正向調節、細胞因子介導的信號通路以及血管生成的正向調節等。分子功能主要涉及相同的蛋白質結合、轉錄激活活性以及氧化還原酶活性等。細胞組分主要涉及頂端質膜、線粒體外膜以及細胞外泌體等。此外，這些鐵死亡相關基因的表達大部分發生上調。
圖4
GO功能富集分析結果
a.GO功能富集分析的氣泡圖，圓點大小表示富集數目，顏色深淺程度表示富集結果顯著性。b.GO功能分析的圓圖。圈圖的外圈綠色代表生物過程、橙色代表分子功能、藍色代表細胞成分；中圈表示富集結果中基因數目，顏色與富集程度顯著性相對應；內環表示每個富集結果中差異基因數目；GO:0045893表示轉錄的正向調節，GO:0045944表示RNA聚合酶II啟動子轉錄的正向調節，GO:0019221表示細胞因子介導的信號通路，GO:0045766表示血管生成的正向調節，GO:0042802表示相同的蛋白質結合，GO:0001228表示轉錄激活活性，GO:0016491表示氧化還原酶活性，GO:0016324表示頂端質膜，GO:0005741表示線粒體外膜，GO:0070062表示細胞外泌體。
2.2.2 KEGG富集分析結果
通過對膿毒癥中的Fe-DEGs進行KEGG通路富集分析，按富集倍數大小取排名前10的通路（P<0.05）。如圖5a所示，Fe-DEGs的通路主要富集在鐵死亡、低氧誘導因子-1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）信號通路和高級糖基化終末產物-受體（Advanced glycosylation end products–receptors，AGE-RAGE）信號通路等。此外，繪制的弦圖更詳細地展示Fe-DEGs與通路富集之間的關系（圖5b）。
圖5
KEGG富集分析結果
a.KEGG功能分析的氣泡圖，圓點大小表示富集數目，顏色深淺程度表示富集結果顯著性。b.KEGG功能分析的弦圖，左側字母代表Fe-DEGs，顏色越紅代表上調越顯著，右側代表通路。
2.3 構建PPI網絡
將所篩選的53個Fe-DEGs導入至STRING數據庫中，設置最低交互分數為0.4，獲取蛋白-蛋白相互作用的原始數據。隨后通過Cytoscape軟件將PPI網絡進行可視化，所構建的網絡如圖6a所示。該網絡共包含了40個節點蛋白以及117對相互作用。有13個蛋白由于與其他蛋白未存在相互作用而未被納入網絡。在PPI網絡中，一般存在比較密集作用區域。接下來，我們通過Cytoscape的MCODE插件進行網絡模塊構建，最終篩選出9個與膿毒癥相關的鐵死亡基因，其中8個基因HSPB1、SNCA、HMOX1、CP、IL6、SOCS1、STAT3和IL1B表達上調，1個基因MUC1表達下調（見圖3b），可見圖6b。
圖6
Fe-DEGs的PPI網絡
a: Cytoscape構建Fe-DEGs的PPI網絡。節點的顏色和大小代表度值，節點顏色越紅和尺寸越大表示度值越高。邊緣的顏色和粗細代表相互關系，邊緣顏色越紅和交互線越粗代表相互關系得分越高。b: 通過Cytoscape中的MCODE插件獲取到的9個基因。
2.4 關鍵基因的篩選
通過Cytoscape軟件cytohubba插件中的MCC、DMNC、MNC、Degree和EPC這5種算法，分別篩選出排名前10個hub基因（表2），并通過Venn圖獲取了這5種算法中重疊的基因，并將它們視為關鍵基因（圖7a），包括CYBB、LCN2、HMOX1、TIMP1和CDKN1A。為了探究關鍵基因功能及相互作用網絡，我們將5個關鍵基因導入“GeneMania”在線工具中，構建了1個由25個基因、461條鏈組成的假定蛋白-蛋白相互作用網絡（圖7b）。該網絡的GO分析表明，這些關鍵基因的功能主要參與對NAD（P）H的氧化還原酶活性、對氧化應激的反應、細胞對化學應激的反應、細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶活性的調節以及有絲分裂細胞周期G1/S轉變的調控等。
表2
5種算法獲得的前10個hub基因
圖7
關鍵基因的篩選與假定PPI網絡的預測
a.5種算法中重疊的關鍵基因；b.通過GeneMania預測關鍵基因的功能相似的基因PPI網絡
3 討論
在本研究中，我們運用生物信息學方法深入探討了鐵死亡相關基因在膿毒癥引起的肺損傷中的作用，并預測了與之密切相關的基因。通過分析GSE154653數據集，我們篩選出了
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突
膿毒癥作為一種嚴重的臨床綜合征，由炎癥反應失調和隨后的多器官功能障礙引起[1]，其發病機制異常復雜，不僅涉及全身性炎癥反應和免疫紊亂[2]，還紊亂了多個器官的功能[3]。在重度膿毒癥或膿毒性休克患者中，各種器官功能受損[4]，其中肺部是最容易受損的器官之一[5]。據報道，約40%的急性肺損傷與膿毒癥有關[6]。急性呼吸窘迫綜合征是一種常見的膿毒癥誘導的急性肺損傷，由肺內外多種因素引起的急性彌漫性炎癥性損傷[7]。在膿毒癥誘發的急性呼吸窘迫綜合征患者中[8]，疾病進展迅速，死亡率極高[9]。然而，目前尚無針對膿毒癥誘導的急性呼吸窘迫綜合征的特異性治療方法。因此，深入探究其機制有助于尋找早期識別可能發展為急性呼損傷的膿毒癥的生物標志物，并確定潛在的治療靶點。
近年來，鐵死亡作為一種可調控的細胞死亡方式受到了廣泛關注，其主要特征在于細胞內鐵離子超載[10]，抑制了抗氧化系統[11]，導致脂質過氧化物積累[12]，從而破壞了細胞膜的結構和功能，進而誘發細胞死亡[13]。研究發現，在膿毒癥誘發的急性呼吸窘迫綜合征患者中，肺組織中的鐵死亡相關基因的表達水平發生明顯變化[14]，脂質過氧化水平升高，然而使用Ferrostatin-1 （Fer-1）可逆轉上述結果，這證實了鐵死亡的發生[15]。因此，鐵死亡有望成為膿毒癥誘發急性肺損傷治療的新靶點[16]。然而，目前鐵死亡與膿毒癥誘發急性肺損傷的相關性研究仍然較少見。
本研究擬通過生物信息學手段探究鐵死亡相關基因在膿毒癥導致的急性肺損傷中的作用，并預測與之密切相關的基因。我們從基因表達數據庫中下載了數據集，再根據|log2 FC|>1且P.adj<0.05的條件，篩選出表達差異基因。接著，將這些差異基因與從鐵死亡數據庫中下載的鐵死亡驅動和抑制基因取交集，得到了膿毒癥鐵死亡相關的差異基因。我們利用R語言、DAVID和STRING等線上工具對Fe-DEGs進行了GO-KEGG功能及通路富集分析，構建了PPI網絡。通過構建的PPI網絡，我們可以篩選出膿毒癥鐵死亡相關的差異基因，這些基因的功能及相互作用網絡的進一步分析可能為膿毒癥的治療提供新的分子靶點。我們希望通過這一研究，為膿毒癥患者的治療提供新的治療靶點和策略。在此研究中，我們強調了生物信息學在揭示疾病發病機制中的潛力，這些發現可能為膿毒癥的治療提供新的治療靶點和策略。
1 材料和方法
1.1 公共數據集獲取及差異基因篩選
從美國國家生物技術信息中心GEO數據庫（
通過FerrDb（v2.0）平臺（
1.2 Fe-DEGs的功能富集分析
我們將1.1所篩選的53個Fe-DEGs利用在線工具DAVID數據庫（
1.3 構建蛋白互作網絡（PPI）及篩選關鍵基因
我們將53個Fe-DEGs導入在線工具STRING數據庫（
1.4 關鍵基因篩選
我們利用cytohubba插件進行關鍵基因的篩選，根據最大團中心性（Maximal Clique Centrality，MCC）算法、最大鄰域組件密度（Density of Maximum Neighborhood Component，DMNC）算法、介數中心性（Betweenness Centrality，BETWEENNESS）算法、Degree算法、邊滲透組件（Edge Percolated Component，EPC）算法這五種算法篩選出排名前10的基因取交集作為關鍵基因，并利用Venn軟件進行可視化。隨后，我們利用在線工具GeneMania（
2 結果
2.1 基于公共數據庫篩選DEGs和Fe-DEGs
GEO2R是一種基于網絡的工具，用于GEO數據庫中表達譜芯片差異表達分析[21]。通過“GEO2R”在線工具比較GSE154653數據集中兩組基因集，我們發現，箱線圖中，各樣本的標準化數據分布較為集中，顯示出較好的數據穩定性和一致性（圖1a）。此外，UMAP分析結果顯示，正常組和LPS誘導膿毒癥組的大鼠肺組織樣本在二維平面上形成了明顯的聚類，且兩組樣本之間有明顯的分離（圖1b）。并以|log2 FC|≥1且P.adj<0.05作為入選標準，我們共篩選出表達差異基因
圖1
膿毒癥差異基因的初期篩選
a.GSE154653基因芯片UMAP分析圖；b. GSE154653數據歸一化圖
圖2
膿毒癥差異基因的篩選結果
a. GSE154653基因芯片的火山圖，紫點和藍點代表差異表達基因（紫點代表上調基因，藍點代表下調基因）；b.GSE154653基因芯片的層次聚類熱圖（紅色表示基因表達相對上調，藍色表示基因表達相對下調；Type中T代表正常組，N代表LPS組）
通過FerrDb數據庫獲取包含抑制型、驅動型以及標記型共484個基因的數據集，并將其與DEGs相交集得到53個Fe-DEGs，利用在線工具Venn軟件可視化Fe-DEGs的Venn圖（圖3a），熱圖（圖3b）展示出Fe-DEGs的表達情況，并對篩選出來的Fe-DEGs進行分類。結果見表1。
圖3
Fe-DEGs篩選結果圖
a.Venn圖（紅色表示鐵死亡相關基因，藍色表示GSE154653差異表達基因，交集部分表示鐵死亡相關的差異基因）；b.熱圖（紅色表示上調基因，藍色表示下調基因，Type中T代表正常組，N代表LPS組）
表1
Fe-DEGs 基因所屬的基因調節類別
2.2 Fe-DEGs的功能富集分析
2.2.1 GO功能富集分析結果
為了探索Fe-DEGs的GO功能富集分析，我們將2.1中所篩選得到的53個Fe-DEGs通過在線工具DAVID庫分別從生物過程、分子功能和細胞組分3個層面進行注釋，并根據P<0.05為原則，按富集倍數取各層面的前5條繪制氣泡圖，見圖4a。為了更好地展示Fe-DEGs與功能富集之間的關系，繪制的圈圖可見圖4b。這些基因在生物過程中主要涉及轉錄的正向調節、RNA聚合酶II啟動子轉錄的正向調節、細胞因子介導的信號通路以及血管生成的正向調節等。分子功能主要涉及相同的蛋白質結合、轉錄激活活性以及氧化還原酶活性等。細胞組分主要涉及頂端質膜、線粒體外膜以及細胞外泌體等。此外，這些鐵死亡相關基因的表達大部分發生上調。
圖4
GO功能富集分析結果
a.GO功能富集分析的氣泡圖，圓點大小表示富集數目，顏色深淺程度表示富集結果顯著性。b.GO功能分析的圓圖。圈圖的外圈綠色代表生物過程、橙色代表分子功能、藍色代表細胞成分；中圈表示富集結果中基因數目，顏色與富集程度顯著性相對應；內環表示每個富集結果中差異基因數目；GO:0045893表示轉錄的正向調節，GO:0045944表示RNA聚合酶II啟動子轉錄的正向調節，GO:0019221表示細胞因子介導的信號通路，GO:0045766表示血管生成的正向調節，GO:0042802表示相同的蛋白質結合，GO:0001228表示轉錄激活活性，GO:0016491表示氧化還原酶活性，GO:0016324表示頂端質膜，GO:0005741表示線粒體外膜，GO:0070062表示細胞外泌體。
2.2.2 KEGG富集分析結果
通過對膿毒癥中的Fe-DEGs進行KEGG通路富集分析，按富集倍數大小取排名前10的通路（P<0.05）。如圖5a所示，Fe-DEGs的通路主要富集在鐵死亡、低氧誘導因子-1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）信號通路和高級糖基化終末產物-受體（Advanced glycosylation end products–receptors，AGE-RAGE）信號通路等。此外，繪制的弦圖更詳細地展示Fe-DEGs與通路富集之間的關系（圖5b）。
圖5
KEGG富集分析結果
a.KEGG功能分析的氣泡圖，圓點大小表示富集數目，顏色深淺程度表示富集結果顯著性。b.KEGG功能分析的弦圖，左側字母代表Fe-DEGs，顏色越紅代表上調越顯著，右側代表通路。
2.3 構建PPI網絡
將所篩選的53個Fe-DEGs導入至STRING數據庫中，設置最低交互分數為0.4，獲取蛋白-蛋白相互作用的原始數據。隨后通過Cytoscape軟件將PPI網絡進行可視化，所構建的網絡如圖6a所示。該網絡共包含了40個節點蛋白以及117對相互作用。有13個蛋白由于與其他蛋白未存在相互作用而未被納入網絡。在PPI網絡中，一般存在比較密集作用區域。接下來，我們通過Cytoscape的MCODE插件進行網絡模塊構建，最終篩選出9個與膿毒癥相關的鐵死亡基因，其中8個基因HSPB1、SNCA、HMOX1、CP、IL6、SOCS1、STAT3和IL1B表達上調，1個基因MUC1表達下調（見圖3b），可見圖6b。
圖6
Fe-DEGs的PPI網絡
a: Cytoscape構建Fe-DEGs的PPI網絡。節點的顏色和大小代表度值，節點顏色越紅和尺寸越大表示度值越高。邊緣的顏色和粗細代表相互關系，邊緣顏色越紅和交互線越粗代表相互關系得分越高。b: 通過Cytoscape中的MCODE插件獲取到的9個基因。
2.4 關鍵基因的篩選
通過Cytoscape軟件cytohubba插件中的MCC、DMNC、MNC、Degree和EPC這5種算法，分別篩選出排名前10個hub基因（表2），并通過Venn圖獲取了這5種算法中重疊的基因，并將它們視為關鍵基因（圖7a），包括CYBB、LCN2、HMOX1、TIMP1和CDKN1A。為了探究關鍵基因功能及相互作用網絡，我們將5個關鍵基因導入“GeneMania”在線工具中，構建了1個由25個基因、461條鏈組成的假定蛋白-蛋白相互作用網絡（圖7b）。該網絡的GO分析表明，這些關鍵基因的功能主要參與對NAD（P）H的氧化還原酶活性、對氧化應激的反應、細胞對化學應激的反應、細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶活性的調節以及有絲分裂細胞周期G1/S轉變的調控等。
表2
5種算法獲得的前10個hub基因
圖7
關鍵基因的篩選與假定PPI網絡的預測
a.5種算法中重疊的關鍵基因；b.通過GeneMania預測關鍵基因的功能相似的基因PPI網絡
3 討論
在本研究中，我們運用生物信息學方法深入探討了鐵死亡相關基因在膿毒癥引起的肺損傷中的作用，并預測了與之密切相關的基因。通過分析GSE154653數據集，我們篩選出了
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突
