引用本文： 李瑩, 肖文彪, 林曉. LncRNA SNHG14調控miR-223-3p減輕大鼠膿毒癥相關性肺損傷的機制探討. 中國呼吸與危重監護雜志, 2025, 24(1): 18-25. doi: 10.7507/1671-6205.202405026 復制
版權信息： ?四川大學華西醫院華西期刊社《中國呼吸與危重監護雜志》版權所有，未經授權不得轉載、改編
膿毒癥是一種炎癥反應失調引起的器官功能障礙綜合征，可發展為嚴重膿毒癥與膿毒性休克，致死率高。膿毒癥相關性肺損傷是膿毒癥常見的并發癥，調查發現在膿毒癥中肺損傷發生率約40.2%，病死率30%～85%[1]，提示膿毒癥患者肺損傷發生及相關死亡風險均處于高水平。目前臨床上對于膿毒癥相關性肺損傷多采用基礎支持治療，但收效并不理想[2]。多種長鏈非編碼核糖核酸（long chain non-coding ribonucleic acid，LncRNA）與微小核糖核酸（microribonucleic acid，miR）被發現參與膿毒癥的發生與進展，且調控其表達可控制病情及相關靶器官損害，與抑制炎癥反應有緊密關系[3-5]。研究發現LncRNA核內小RNA宿主基因14（long chain non coding ribonucleic acid small nucleolar RNA host gene 14，LncRNA SNHG14）可參與氧-糖剝奪/復氧誘導的神經細胞損傷，與炎癥反應調控密切相關[6]；在膿毒癥中miR-223-3p表達下降，并能負反饋調控人NOD樣受體家族蛋白3（NOD like receptor family protein 3，NLPR3）通路、增加NLPR3、胱天蛋白酶半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（Cysteine-requiring aspartate protease 1，Caspase-1）、1-氨基環丙烷-1-羧酸合酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase，ACS）表達，參與炎癥因子的剪切活化，引起肺損傷[7]。Hong等[8]研究發現LncRNA SNHG14可負反饋靶向miR-223-3p介導膿毒癥急性肺損傷細胞自噬。然而LncRNA SNHG14是否可靶向miR-223-3p調控NLPR3通路減輕膿毒癥相關性肺損傷尚需要進一步研究驗證，基于此，本研究設計開展大鼠實驗探討該問題，旨在為減輕膿毒癥相關性肺損傷新藥的研發提供方向。
1 材料與方法
1.1 材料
SD大鼠80只，7～9周齡，清潔級，雌雄均半，體質量180～220 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號SCXK（滬）2017-0005。本研究經福建醫科大學實驗動物倫理委員會批準通過（審批號：FJMU IACUC 2021-J-0080）。實驗動物中心資質號：SYXK（閩）2022-0004。
pcDNA-SNHG14、pcDNA、si-SNHG14、si-DNA、miR-223-3p mimic、miR mimic-NC、miR-223-3p inhibitor、miR inhibitor-NC質粒（均由深圳晶美生物有限公司合成）；腺病毒（杭州創試生物科技有限公司，貨號CS4008X）；Lipofectamine 2000脂質體（美國Invitrogen公司，貨號
醫用離心機（德國Eppendorf公司，5424R型）；聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀（美國Thermo Fisher公司，QuantStudio3型）；光學顯微鏡（德國OPTO公司，100-MC-075型）；凝膠電泳儀（美國ProteinSimple公司，AlphaImager Mini型）；雙熒光素酶報告基因系統（美國Promega公司，E1960型）。
1.2 方法
1.2.1 建模方法
取72只大鼠盲腸結扎穿孔法建立膿毒癥相關性肺損傷模型。常規腹腔麻醉后固定、皮膚消毒，沿腹正中線剪開約2 cm，分離腸系膜，用絲線結扎回盲腸瓣下方盲腸根部。取針頭穿透結扎端的盲腸，將糞便與腸內容物擠出至腹腔，將腸管回納，縫合、消毒。大鼠造模后6 h若有豎毛、腹瀉、呼吸困難、躁動、萎靡、爪趾青紫等認為造模成功。若有造模不成功或干預期間死亡大鼠則按照同等操作補齊。剩余9只大鼠僅剪開腹正中線、分離腸系膜并回納腸管，縫合、消毒，不進行絲線結扎和針頭穿孔，記為假手術組。
1.2.2 干預方法
將建模成功的72只大鼠采用隨機數字表分9組，即SNHG14上調組（注射攜帶pcDNA-SNHG14的腺病毒）、SNHG14上調對照組（注射攜帶pcDNA的腺病毒）、SNHG14下調組（靜脈注射攜帶si-SNHG14的腺病毒）、SNHG14下調對照組（脈注射攜帶si-DNA的腺病毒）、miR-223-3p上調組（注射攜帶miR-223-3p mimic的腺病毒）、miR-223-3p上調對照組（注射攜帶miR mimic-NC的腺病毒）、miR-223-3p下調組（注射攜帶miR inhibitor-NC的腺病毒）、miR-223-3p下調對照組（注射攜帶miR inhibitor-NC的腺病毒）、模型組（注射無菌生理鹽水）。假手術組同樣注射無菌生理鹽水。均經尾靜脈給藥。其中質粒轉染腺病毒載體、制備腺病毒液均參照說明書，注射劑量均為200 μL/只。
1.2.3 檢測指標及取樣方法
48 h后，各組均取尾靜脈血檢測血清炎癥因子水平；斷頭法處死，每組各取4只剝離左肺和右肺組織檢測LncRNA SNHG14、miR-223-3p和NLPR3、Caspase-1、ACS表達，肺組織濕/干重比值（wet weight/dry weight，W/D），肺組織病理改變，并制備膿毒癥相關性肺損傷細胞用以雙熒光素酶報告基因實驗；各組剩余4只均分離出全部氣管、肺臟及心臟檢測肺泡液體清除率（alveolar fluid clearance rate，AFC）。
LncRNA SNHG14、miR-223-3p表達檢測：采用實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應（realtime-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）進行檢測。取肺組織勻漿離心（12 000 r/min、15 min），取上清。提取總RNA，逆轉錄。制備反應體系（共20 μL），引物信息見表1，前者內參為GAPDH，后者內參為U6。反應程序：95℃ 5 min，40個循環：95℃ 15 s、60℃ 34 s，最終75℃ 5 min。計算2–△△Ct。
表1
引物信息
血清炎癥因子水平檢測：將經抗凝處理的血液樣本3 500 r/min離心10min，取上清液按照ELISA試劑盒說明書測定血清TNF-α、IL-1β、IL-18水平。
肺組織W/D和AFC測定：（1）肺組織W/D：用電子天平稱量肺組織濕質量（wet weight，W），置于60℃烘箱中烘干1 h再次測量肺組織干質量（dry weight，D），計算W/D。（2）AFC：取氣管導管插入右肺下部，5%白蛋白（0.15 mg Evans藍標記）制成等滲生理鹽水灌注液按照4 mL/kg滴入右肺下葉，給氧2 mL。維持氣道壓650～700 Pa，持續全氧通氣1 h。取0.2 mL右下肺液體，測定620 nm的吸光度值。AFC%=灌入肺泡內液體量–肺泡內液體量。
肺組織病理改變觀察：HE染色。4%多聚甲醛固定24 h，常規石蠟包埋，制成切片（4 μm厚），HE然后封片并在光學顯微鏡下觀察。肺組織病理改變量化評分細則見表2。
表2
肺組織病理改變量化評分細則
肺組織NLPR3、Caspase-1、ACS基因表達檢測：采用RT-qPCR法。操作同LncRNA SNHG14、miR-223-3p表達檢測，引物信息見表1，內參為GAPDH。
肺組織NLPR3、Caspase-1、ACS蛋白表達檢測：采用免疫印跡法（Western blot，WB）。向肺組織中加入蛋白裂解液，離心（12 000 r/min，15 min），提取總蛋白并測其濃度。電泳將目標蛋白分離，轉至聚偏二氟乙烯膜，5%牛血清蛋白封閉。加入一抗（1∶1 000），室溫下，24 h后洗滌；加入免疫球蛋白G/辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶2 000、1∶2 000、1∶5 000），4℃，2 h后顯色、曝光顯影。
LncRNA SNHG14對miR-223-3p的靶向調控驗證：采用雙熒光素酶報告基因實驗。首先取肺組織采用組織塊分離法獲得細胞。將野生型（wild type，WT）和突變型（mutation type，MUT）SNHG14熒光素酶載體與miR-223-3p mimic、miR-NC轉染至細胞，所用方法為脂質體轉染法。以熒光素酶活性測定試劑盒檢測，每組3個復孔。
1.3 統計學方法
利用SPSS21.0軟件中單因素分析和SNK-q檢驗多樣本計量資料，獨立樣本t檢驗檢驗兩樣本計量資料，計量資料均經Kolmogorov-Smirnov法檢驗服從正態分布，以均數±標準差（x±s）表示。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 LncRNA SNHG14、miR-223-3p表達
與假手術組比較，模型組肺組織LncRNA SNHG14表達升高（P<0.05）、miR-223-3p表達下降（P<0.05）。與模型組及相應對照組比較，SNHG14上調組肺組織LncRNA SNHG14表達及SNHG14下調組、miR-223-3p上調組miR-223-3p表達均升高（P<0.05），而SNHG14下調組肺組織LncRNA SNHG14表達及SNHG14上調組、miR-223-3p下調組miR-223-3p表達均下降（P<0.05）。結果見表3。
表3
各組肺組織LncRNA SNHG14、miR-223-3p表達比較（n=4，x±s）
2.2 血清炎癥因子水平
與假手術組比較，模型組血清TNF-α、IL-1β、IL-18水平均升高（P<0.05）。與模型組和相應對照組比較，SNHG14上調組及miR-223-3p下調組血清TNF-α、IL-1β、IL-18水平均升高（P<0.05），而SNHG14下調組及miR-223-3p上調組血清TNF-α、IL-1β、IL-18水平均下降（P<0.05）。結果見表4。
表4
各組血清炎癥因子以及肺組織W/D、AFC、病理改變量化評分比較（x±s）
2.3 肺組織W/D與AFC
與假手術組比較，模型組W/D升高（P<0.05），而AFC下降（P<0.05）。與模型組及相應對照組比較，SNHG14上調組、miR-223-3p下調組W/D升高（P<0.05），而AFC下降（P<0.05）；SNHG14下調組、miR-223-3p上調組W/D下降（P<0.05），而AFC升高（P<0.05）。結果見表4。
2.4 肺組織病理改變與量化評分
假手術組肺泡完整、飽滿，肺間質正常。模型組與各對照組大部分肺泡完整性受損、萎陷嚴重，肺間質顯著增厚且有明顯水腫，并伴部分炎癥細胞浸潤。SNHG14上調組、miR-223-3p下調組大部分肺泡完整性嚴重受損、萎陷極為嚴重，肺間質顯著增厚且水腫嚴重，并伴有極大量炎癥細胞浸潤。SNHG14下調組、miR-223-3p上調組少部分肺泡完整性受損、萎陷，肺間質輕微增厚和水腫，有少量炎癥細胞浸潤。結果見圖1。
圖1
各組肺組織病理改變（HE×200）
a. 假手術組；b. 模型組；c. SNHG14上調組；d. SNHG14上調對照組；e. SNHG14下調組；f. SNHG14下調對照組；g. miR-223-3p上調組；h. miR-223-3p上調對照組；i. miR-223-3p下調組；j. miR-223-3p下調對照組。
與假手術組比較，模型組病理改變量化評分升高（P<0.05）。與模型組及相應對照組比較，SNHG14上調組、miR-223-3p下調組病理改變量化評分升高（P<0.05），SNHG14下調組、miR-223-3p上調組病理改變量化評分下降（P<0.05）。結果見表5。
表5
各組肺組織NLPR3、Caspase-1、ACS基因和蛋白表達比較（n=4，x±s）
2.5 肺組織NLPR3、Caspase-1、ACS基因表達
與假手術組比較，模型組肺組織NLPR3、Caspase-1、ACS基因表達升高（P<0.05）。與模型組及相應對照組比較，SNHG14上調組、miR-223-3p下調組肺組織NLPR3、Caspase-1、ACS基因表達升高（P<0.05），SNHG14下調組、miR-223-3p上調組肺組織NLPR3、Caspase-1、ACS基因表達下降（P<0.05）。結果見表5。
2.6 肺組織NLPR3、Caspase-1、ACS蛋白表達比較
與假手術組比較，模型組肺組織NLPR3、Caspase-1、ACS蛋白表達升高（P<0.05）；與模型組及相應對照組比較，SNHG14上調組、miR-223-3p下調組肺組織NLPR3、Caspase-1、ACS蛋白表達升高（P<0.05），SNHG14下調組、miR-223-3p上調組肺組織NLPR3、Caspase-1、ACS蛋白表達下降（P<0.05）。結果見表5和圖2。
圖2
各組肺組織NLPR3、Caspase-1、ACS蛋白表達檢測
A：假手術組；B：模型組；C：SNHG14上調組；D：SNHG14上調對照組；E：SNHG14下調組；F：SNHG14下調對照組；G：miR-223-3p上調組；H：miR-223-3p上調對照組；I：miR-223-3p下調組；J：miR-223-3p下調對照組。
2.7 LncRNA SNHG14對miR-223-3p的靶向調控作用驗證
LncRNA SNHG14與miR-223-3p存在結合位點，見圖3。與轉染WT SNHG14的細胞相比，轉染MUT SNHG14的細胞miR-223-3p熒光素酶相對活性增加（P<0.05），而miR-NC的熒光素酶相對活性差異無統計學意義（P>0.05），結果見表6。
圖3
LncRNA SNHG14與miR-223-3p的結合位點
表6
不同SNHG14轉染細胞熒光素酶相對活性比較（n=3，x±s）
3 討論
罹患膿毒癥后機體呈現全身性的、劇烈的炎癥反應，損傷肺、肝、腎、腸、心、腦等多個器官的結構與功能，可引起多器官功能障礙綜合癥和休克，甚至死亡[9-10]。肺是膿毒癥狀態下最易受損的靶器官，這與過度的促炎癥因子釋放和劇烈的氧化應激反應均有密切關系[11]。然而目前臨床上常用的抗炎、抗氧化應激等藥物并不能有效減輕膿毒癥相關性肺損傷，這與所用藥物靶點單一而參與炎癥及氧化應激反應的分子眾多有關[12]。因此，探討新的參與膿毒癥相關性肺損傷的基因、探索新的抗炎治療靶點十分必要。
本研究中，與假手術組比較，模型組肺組織LncRNA SNHG14表達、血清炎癥因子水平、W/D、病理改變量化評分均升高，而miR-223-3p表達、AFC均下降，提示LncRNA SNHG14表達升高和miR-223-3p表達表達下降均可能參與膿毒癥相關性肺損傷，且此類疾病不僅存在嚴重的炎癥反應，肺組織也有明顯病理改變，W/D顯著增加，AFC則顯著下降。LncRNA SNHG14高表達可誘發脂多糖誘導的急性肺損傷，下調其表達可靶向miR-34c-3p、調控趨化因子受體1的表達進而減輕急性肺損傷，且與調控信號通道蛋白1的表達也有關[6]。LncRNA SNHG14高表達可參與細胞凋亡，推測這與膿毒癥相關性肺損傷病理改變有關[13]。miR-223-3p是重要的炎癥反應調控分子，可參與調控NLRP3、核轉錄因子κB、絲裂原活化蛋白激酶、核糖體蛋白S6激酶/低氧誘導因子1等多種途徑進而影響炎癥反應，參與靶器官驗證損害及惡性腫瘤等疾病[14-16]。研究發現miR-223-3p低表達可以預測膿毒癥[17]，miR-223-3p低表達可參與新生兒早期膿毒癥的發生及進展[18]。本研究結果與上述報道一致，提示能通過抑制LncRNA SNHG14表達、上調miR-223-3p表達減輕膿毒癥相關性肺損傷，本研究SNHG14下調組、miR-223-3p上調組肺組織病理改變顯著減輕，量化評分與W/D均顯著下降，AFC顯著升高，驗證了上述結論；而SNHG14上調組、miR-223-3p下調組膿毒癥相關性肺損傷均加重，這也說明了LncRNA SNHG14高表達、miR-223-3p低表達可參與膿毒癥相關性肺損傷的發生及加重。
本研究還發現，與假手術組比較，模型組肺組織NLPR3、Caspase-1、ACS表達均升高；與模型組及相應對照組比較，SNHG14下調組與miR-223-3p上調組肺組織NLPR3、Caspase-1、ACS表達均下降，SNHG14上調組與miR-223-3p下調組上述表達則均升高。這表明抑制LncRNA SNHG14、促進miR-223-3p可下調膿毒癥相關性肺損傷NLPR3、Caspase-1、ACS的表達，反之則可增加上述表達。NLPR3屬于炎癥小體傳感器，激活NLPR3可產生Caspase-1、ACS等在內的寡聚體復合物，在眾多炎癥疾病中至關重要。NLPR3激活后可上調核轉錄因子κB，增加相關促炎癥因子的表達，包括炎癥小體傳感器蛋白、TNF-α、IL-1β、IL-18等。另一方面，NLPR3激活還可增加與ASC的結合及Caspase-1的募集，這也是增加IL-1β分泌、導致細胞凋亡的重要原因。Ren等[19]研究顯示NLRP3通路激活在細胞焦亡中也有積極作用，這與炎癥所致的組織損傷有關。朱敏杰等[20]研究發現NLRP3表達升高可增加Caspase-1的表達，增加IL-1β和IL-8的分泌，參與膿毒癥致急性腎損傷這一病理過程。NLRP3上調與肺損傷的關系國內外也不乏相關報道[21-23]。研究證實miR-223-3p可負反饋調節NLRP3通路參與脂多糖誘導的急性腎損傷[24]。本研究也發現，LncRNA SNHG14可負反饋靶向調控miR-223-3p。基于此可以推測，LncRNA SNHG14可靶向調控miR-223-3p，并通過激活NLRP3通路引起炎癥反應，參與膿毒癥相關性肺損傷。而下調LncRNA SNHG14可靶向增加miR-223-3p表達，并抑制NLRP3通路活性，降低促炎癥因子水平，減輕膿毒癥相關性肺損傷。本研究為治療膿毒癥相關性肺損傷提供了一個新方向，但是如何抑制膿毒癥相關性肺損傷的LncRNA SNHG14表達及其在臨床中的適用性尚不可知，且該基因是否可通過其它機制參與膿毒癥相關性肺損傷也不清楚，后續仍需進行大量、深入地探討。
綜上所述，抑制LncRNA SNHG14表達可靶向上調miR-223-3p表達，并抑制NLRP3、Caspase-1、ACS表達，控制炎癥反應，進而減輕膿毒癥相關性肺損傷；反之則可通過下調miR-223-3p表達，并增加NLRP3、Caspase-1、ACS表達，加重炎癥反應和膿毒癥相關性肺損傷。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
膿毒癥是一種炎癥反應失調引起的器官功能障礙綜合征，可發展為嚴重膿毒癥與膿毒性休克，致死率高。膿毒癥相關性肺損傷是膿毒癥常見的并發癥，調查發現在膿毒癥中肺損傷發生率約40.2%，病死率30%～85%[1]，提示膿毒癥患者肺損傷發生及相關死亡風險均處于高水平。目前臨床上對于膿毒癥相關性肺損傷多采用基礎支持治療，但收效并不理想[2]。多種長鏈非編碼核糖核酸（long chain non-coding ribonucleic acid，LncRNA）與微小核糖核酸（microribonucleic acid，miR）被發現參與膿毒癥的發生與進展，且調控其表達可控制病情及相關靶器官損害，與抑制炎癥反應有緊密關系[3-5]。研究發現LncRNA核內小RNA宿主基因14（long chain non coding ribonucleic acid small nucleolar RNA host gene 14，LncRNA SNHG14）可參與氧-糖剝奪/復氧誘導的神經細胞損傷，與炎癥反應調控密切相關[6]；在膿毒癥中miR-223-3p表達下降，并能負反饋調控人NOD樣受體家族蛋白3（NOD like receptor family protein 3，NLPR3）通路、增加NLPR3、胱天蛋白酶半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（Cysteine-requiring aspartate protease 1，Caspase-1）、1-氨基環丙烷-1-羧酸合酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase，ACS）表達，參與炎癥因子的剪切活化，引起肺損傷[7]。Hong等[8]研究發現LncRNA SNHG14可負反饋靶向miR-223-3p介導膿毒癥急性肺損傷細胞自噬。然而LncRNA SNHG14是否可靶向miR-223-3p調控NLPR3通路減輕膿毒癥相關性肺損傷尚需要進一步研究驗證，基于此，本研究設計開展大鼠實驗探討該問題，旨在為減輕膿毒癥相關性肺損傷新藥的研發提供方向。
1 材料與方法
1.1 材料
SD大鼠80只，7～9周齡，清潔級，雌雄均半，體質量180～220 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號SCXK（滬）2017-0005。本研究經福建醫科大學實驗動物倫理委員會批準通過（審批號：FJMU IACUC 2021-J-0080）。實驗動物中心資質號：SYXK（閩）2022-0004。
pcDNA-SNHG14、pcDNA、si-SNHG14、si-DNA、miR-223-3p mimic、miR mimic-NC、miR-223-3p inhibitor、miR inhibitor-NC質粒（均由深圳晶美生物有限公司合成）；腺病毒（杭州創試生物科技有限公司，貨號CS4008X）；Lipofectamine 2000脂質體（美國Invitrogen公司，貨號
醫用離心機（德國Eppendorf公司，5424R型）；聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀（美國Thermo Fisher公司，QuantStudio3型）；光學顯微鏡（德國OPTO公司，100-MC-075型）；凝膠電泳儀（美國ProteinSimple公司，AlphaImager Mini型）；雙熒光素酶報告基因系統（美國Promega公司，E1960型）。
1.2 方法
1.2.1 建模方法
取72只大鼠盲腸結扎穿孔法建立膿毒癥相關性肺損傷模型。常規腹腔麻醉后固定、皮膚消毒，沿腹正中線剪開約2 cm，分離腸系膜，用絲線結扎回盲腸瓣下方盲腸根部。取針頭穿透結扎端的盲腸，將糞便與腸內容物擠出至腹腔，將腸管回納，縫合、消毒。大鼠造模后6 h若有豎毛、腹瀉、呼吸困難、躁動、萎靡、爪趾青紫等認為造模成功。若有造模不成功或干預期間死亡大鼠則按照同等操作補齊。剩余9只大鼠僅剪開腹正中線、分離腸系膜并回納腸管，縫合、消毒，不進行絲線結扎和針頭穿孔，記為假手術組。
1.2.2 干預方法
將建模成功的72只大鼠采用隨機數字表分9組，即SNHG14上調組（注射攜帶pcDNA-SNHG14的腺病毒）、SNHG14上調對照組（注射攜帶pcDNA的腺病毒）、SNHG14下調組（靜脈注射攜帶si-SNHG14的腺病毒）、SNHG14下調對照組（脈注射攜帶si-DNA的腺病毒）、miR-223-3p上調組（注射攜帶miR-223-3p mimic的腺病毒）、miR-223-3p上調對照組（注射攜帶miR mimic-NC的腺病毒）、miR-223-3p下調組（注射攜帶miR inhibitor-NC的腺病毒）、miR-223-3p下調對照組（注射攜帶miR inhibitor-NC的腺病毒）、模型組（注射無菌生理鹽水）。假手術組同樣注射無菌生理鹽水。均經尾靜脈給藥。其中質粒轉染腺病毒載體、制備腺病毒液均參照說明書，注射劑量均為200 μL/只。
1.2.3 檢測指標及取樣方法
48 h后，各組均取尾靜脈血檢測血清炎癥因子水平；斷頭法處死，每組各取4只剝離左肺和右肺組織檢測LncRNA SNHG14、miR-223-3p和NLPR3、Caspase-1、ACS表達，肺組織濕/干重比值（wet weight/dry weight，W/D），肺組織病理改變，并制備膿毒癥相關性肺損傷細胞用以雙熒光素酶報告基因實驗；各組剩余4只均分離出全部氣管、肺臟及心臟檢測肺泡液體清除率（alveolar fluid clearance rate，AFC）。
LncRNA SNHG14、miR-223-3p表達檢測：采用實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應（realtime-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）進行檢測。取肺組織勻漿離心（12 000 r/min、15 min），取上清。提取總RNA，逆轉錄。制備反應體系（共20 μL），引物信息見表1，前者內參為GAPDH，后者內參為U6。反應程序：95℃ 5 min，40個循環：95℃ 15 s、60℃ 34 s，最終75℃ 5 min。計算2–△△Ct。
表1
引物信息
血清炎癥因子水平檢測：將經抗凝處理的血液樣本3 500 r/min離心10min，取上清液按照ELISA試劑盒說明書測定血清TNF-α、IL-1β、IL-18水平。
肺組織W/D和AFC測定：（1）肺組織W/D：用電子天平稱量肺組織濕質量（wet weight，W），置于60℃烘箱中烘干1 h再次測量肺組織干質量（dry weight，D），計算W/D。（2）AFC：取氣管導管插入右肺下部，5%白蛋白（0.15 mg Evans藍標記）制成等滲生理鹽水灌注液按照4 mL/kg滴入右肺下葉，給氧2 mL。維持氣道壓650～700 Pa，持續全氧通氣1 h。取0.2 mL右下肺液體，測定620 nm的吸光度值。AFC%=灌入肺泡內液體量–肺泡內液體量。
肺組織病理改變觀察：HE染色。4%多聚甲醛固定24 h，常規石蠟包埋，制成切片（4 μm厚），HE然后封片并在光學顯微鏡下觀察。肺組織病理改變量化評分細則見表2。
表2
肺組織病理改變量化評分細則
肺組織NLPR3、Caspase-1、ACS基因表達檢測：采用RT-qPCR法。操作同LncRNA SNHG14、miR-223-3p表達檢測，引物信息見表1，內參為GAPDH。
肺組織NLPR3、Caspase-1、ACS蛋白表達檢測：采用免疫印跡法（Western blot，WB）。向肺組織中加入蛋白裂解液，離心（12 000 r/min，15 min），提取總蛋白并測其濃度。電泳將目標蛋白分離，轉至聚偏二氟乙烯膜，5%牛血清蛋白封閉。加入一抗（1∶1 000），室溫下，24 h后洗滌；加入免疫球蛋白G/辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶2 000、1∶2 000、1∶5 000），4℃，2 h后顯色、曝光顯影。
LncRNA SNHG14對miR-223-3p的靶向調控驗證：采用雙熒光素酶報告基因實驗。首先取肺組織采用組織塊分離法獲得細胞。將野生型（wild type，WT）和突變型（mutation type，MUT）SNHG14熒光素酶載體與miR-223-3p mimic、miR-NC轉染至細胞，所用方法為脂質體轉染法。以熒光素酶活性測定試劑盒檢測，每組3個復孔。
1.3 統計學方法
利用SPSS21.0軟件中單因素分析和SNK-q檢驗多樣本計量資料，獨立樣本t檢驗檢驗兩樣本計量資料，計量資料均經Kolmogorov-Smirnov法檢驗服從正態分布，以均數±標準差（x±s）表示。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 LncRNA SNHG14、miR-223-3p表達
與假手術組比較，模型組肺組織LncRNA SNHG14表達升高（P<0.05）、miR-223-3p表達下降（P<0.05）。與模型組及相應對照組比較，SNHG14上調組肺組織LncRNA SNHG14表達及SNHG14下調組、miR-223-3p上調組miR-223-3p表達均升高（P<0.05），而SNHG14下調組肺組織LncRNA SNHG14表達及SNHG14上調組、miR-223-3p下調組miR-223-3p表達均下降（P<0.05）。結果見表3。
表3
各組肺組織LncRNA SNHG14、miR-223-3p表達比較（n=4，x±s）
2.2 血清炎癥因子水平
與假手術組比較，模型組血清TNF-α、IL-1β、IL-18水平均升高（P<0.05）。與模型組和相應對照組比較，SNHG14上調組及miR-223-3p下調組血清TNF-α、IL-1β、IL-18水平均升高（P<0.05），而SNHG14下調組及miR-223-3p上調組血清TNF-α、IL-1β、IL-18水平均下降（P<0.05）。結果見表4。
表4
各組血清炎癥因子以及肺組織W/D、AFC、病理改變量化評分比較（x±s）
2.3 肺組織W/D與AFC
與假手術組比較，模型組W/D升高（P<0.05），而AFC下降（P<0.05）。與模型組及相應對照組比較，SNHG14上調組、miR-223-3p下調組W/D升高（P<0.05），而AFC下降（P<0.05）；SNHG14下調組、miR-223-3p上調組W/D下降（P<0.05），而AFC升高（P<0.05）。結果見表4。
2.4 肺組織病理改變與量化評分
假手術組肺泡完整、飽滿，肺間質正常。模型組與各對照組大部分肺泡完整性受損、萎陷嚴重，肺間質顯著增厚且有明顯水腫，并伴部分炎癥細胞浸潤。SNHG14上調組、miR-223-3p下調組大部分肺泡完整性嚴重受損、萎陷極為嚴重，肺間質顯著增厚且水腫嚴重，并伴有極大量炎癥細胞浸潤。SNHG14下調組、miR-223-3p上調組少部分肺泡完整性受損、萎陷，肺間質輕微增厚和水腫，有少量炎癥細胞浸潤。結果見圖1。
圖1
各組肺組織病理改變（HE×200）
a. 假手術組；b. 模型組；c. SNHG14上調組；d. SNHG14上調對照組；e. SNHG14下調組；f. SNHG14下調對照組；g. miR-223-3p上調組；h. miR-223-3p上調對照組；i. miR-223-3p下調組；j. miR-223-3p下調對照組。
與假手術組比較，模型組病理改變量化評分升高（P<0.05）。與模型組及相應對照組比較，SNHG14上調組、miR-223-3p下調組病理改變量化評分升高（P<0.05），SNHG14下調組、miR-223-3p上調組病理改變量化評分下降（P<0.05）。結果見表5。
表5
各組肺組織NLPR3、Caspase-1、ACS基因和蛋白表達比較（n=4，x±s）
2.5 肺組織NLPR3、Caspase-1、ACS基因表達
與假手術組比較，模型組肺組織NLPR3、Caspase-1、ACS基因表達升高（P<0.05）。與模型組及相應對照組比較，SNHG14上調組、miR-223-3p下調組肺組織NLPR3、Caspase-1、ACS基因表達升高（P<0.05），SNHG14下調組、miR-223-3p上調組肺組織NLPR3、Caspase-1、ACS基因表達下降（P<0.05）。結果見表5。
2.6 肺組織NLPR3、Caspase-1、ACS蛋白表達比較
與假手術組比較，模型組肺組織NLPR3、Caspase-1、ACS蛋白表達升高（P<0.05）；與模型組及相應對照組比較，SNHG14上調組、miR-223-3p下調組肺組織NLPR3、Caspase-1、ACS蛋白表達升高（P<0.05），SNHG14下調組、miR-223-3p上調組肺組織NLPR3、Caspase-1、ACS蛋白表達下降（P<0.05）。結果見表5和圖2。
圖2
各組肺組織NLPR3、Caspase-1、ACS蛋白表達檢測
A：假手術組；B：模型組；C：SNHG14上調組；D：SNHG14上調對照組；E：SNHG14下調組；F：SNHG14下調對照組；G：miR-223-3p上調組；H：miR-223-3p上調對照組；I：miR-223-3p下調組；J：miR-223-3p下調對照組。
2.7 LncRNA SNHG14對miR-223-3p的靶向調控作用驗證
LncRNA SNHG14與miR-223-3p存在結合位點，見圖3。與轉染WT SNHG14的細胞相比，轉染MUT SNHG14的細胞miR-223-3p熒光素酶相對活性增加（P<0.05），而miR-NC的熒光素酶相對活性差異無統計學意義（P>0.05），結果見表6。
圖3
LncRNA SNHG14與miR-223-3p的結合位點
表6
不同SNHG14轉染細胞熒光素酶相對活性比較（n=3，x±s）
3 討論
罹患膿毒癥后機體呈現全身性的、劇烈的炎癥反應，損傷肺、肝、腎、腸、心、腦等多個器官的結構與功能，可引起多器官功能障礙綜合癥和休克，甚至死亡[9-10]。肺是膿毒癥狀態下最易受損的靶器官，這與過度的促炎癥因子釋放和劇烈的氧化應激反應均有密切關系[11]。然而目前臨床上常用的抗炎、抗氧化應激等藥物并不能有效減輕膿毒癥相關性肺損傷，這與所用藥物靶點單一而參與炎癥及氧化應激反應的分子眾多有關[12]。因此，探討新的參與膿毒癥相關性肺損傷的基因、探索新的抗炎治療靶點十分必要。
本研究中，與假手術組比較，模型組肺組織LncRNA SNHG14表達、血清炎癥因子水平、W/D、病理改變量化評分均升高，而miR-223-3p表達、AFC均下降，提示LncRNA SNHG14表達升高和miR-223-3p表達表達下降均可能參與膿毒癥相關性肺損傷，且此類疾病不僅存在嚴重的炎癥反應，肺組織也有明顯病理改變，W/D顯著增加，AFC則顯著下降。LncRNA SNHG14高表達可誘發脂多糖誘導的急性肺損傷，下調其表達可靶向miR-34c-3p、調控趨化因子受體1的表達進而減輕急性肺損傷，且與調控信號通道蛋白1的表達也有關[6]。LncRNA SNHG14高表達可參與細胞凋亡，推測這與膿毒癥相關性肺損傷病理改變有關[13]。miR-223-3p是重要的炎癥反應調控分子，可參與調控NLRP3、核轉錄因子κB、絲裂原活化蛋白激酶、核糖體蛋白S6激酶/低氧誘導因子1等多種途徑進而影響炎癥反應，參與靶器官驗證損害及惡性腫瘤等疾病[14-16]。研究發現miR-223-3p低表達可以預測膿毒癥[17]，miR-223-3p低表達可參與新生兒早期膿毒癥的發生及進展[18]。本研究結果與上述報道一致，提示能通過抑制LncRNA SNHG14表達、上調miR-223-3p表達減輕膿毒癥相關性肺損傷，本研究SNHG14下調組、miR-223-3p上調組肺組織病理改變顯著減輕，量化評分與W/D均顯著下降，AFC顯著升高，驗證了上述結論；而SNHG14上調組、miR-223-3p下調組膿毒癥相關性肺損傷均加重，這也說明了LncRNA SNHG14高表達、miR-223-3p低表達可參與膿毒癥相關性肺損傷的發生及加重。
本研究還發現，與假手術組比較，模型組肺組織NLPR3、Caspase-1、ACS表達均升高；與模型組及相應對照組比較，SNHG14下調組與miR-223-3p上調組肺組織NLPR3、Caspase-1、ACS表達均下降，SNHG14上調組與miR-223-3p下調組上述表達則均升高。這表明抑制LncRNA SNHG14、促進miR-223-3p可下調膿毒癥相關性肺損傷NLPR3、Caspase-1、ACS的表達，反之則可增加上述表達。NLPR3屬于炎癥小體傳感器，激活NLPR3可產生Caspase-1、ACS等在內的寡聚體復合物，在眾多炎癥疾病中至關重要。NLPR3激活后可上調核轉錄因子κB，增加相關促炎癥因子的表達，包括炎癥小體傳感器蛋白、TNF-α、IL-1β、IL-18等。另一方面，NLPR3激活還可增加與ASC的結合及Caspase-1的募集，這也是增加IL-1β分泌、導致細胞凋亡的重要原因。Ren等[19]研究顯示NLRP3通路激活在細胞焦亡中也有積極作用，這與炎癥所致的組織損傷有關。朱敏杰等[20]研究發現NLRP3表達升高可增加Caspase-1的表達，增加IL-1β和IL-8的分泌，參與膿毒癥致急性腎損傷這一病理過程。NLRP3上調與肺損傷的關系國內外也不乏相關報道[21-23]。研究證實miR-223-3p可負反饋調節NLRP3通路參與脂多糖誘導的急性腎損傷[24]。本研究也發現，LncRNA SNHG14可負反饋靶向調控miR-223-3p。基于此可以推測，LncRNA SNHG14可靶向調控miR-223-3p，并通過激活NLRP3通路引起炎癥反應，參與膿毒癥相關性肺損傷。而下調LncRNA SNHG14可靶向增加miR-223-3p表達，并抑制NLRP3通路活性，降低促炎癥因子水平，減輕膿毒癥相關性肺損傷。本研究為治療膿毒癥相關性肺損傷提供了一個新方向，但是如何抑制膿毒癥相關性肺損傷的LncRNA SNHG14表達及其在臨床中的適用性尚不可知，且該基因是否可通過其它機制參與膿毒癥相關性肺損傷也不清楚，后續仍需進行大量、深入地探討。
綜上所述，抑制LncRNA SNHG14表達可靶向上調miR-223-3p表達，并抑制NLRP3、Caspase-1、ACS表達，控制炎癥反應，進而減輕膿毒癥相關性肺損傷；反之則可通過下調miR-223-3p表達，并增加NLRP3、Caspase-1、ACS表達，加重炎癥反應和膿毒癥相關性肺損傷。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
