引用本文： 曾海文, 陳巧莉, 丁志榮. LncRNA-NORAD調節miR-155-5p/TLR6分子軸對膿毒癥大鼠急性肺損傷的影響. 中國呼吸與危重監護雜志, 2025, 24(1): 26-32. doi: 10.7507/1671-6205.202402017 復制
版權信息： ?四川大學華西醫院華西期刊社《中國呼吸與危重監護雜志》版權所有，未經授權不得轉載、改編
膿毒癥是對感染反應失調而導致的器官功能障礙綜合征，而肺部是最先受到損傷的器官之一，急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是膿毒癥患者死亡的常見病因[1]。ALI患者臨床主要表現為低氧血癥、呼吸困難等，發病時危及患者生命[2]。近年來隨著分子生物學的發展，從分子水平干預治療ALI逐漸成為研究熱點[3]。已證實長鏈非編碼核糖核酸（long non-coding RNA，lncRNA）參與調控細胞多種疾病的發生發展過程[4]。Zhou等[5]研究表明沉默DNA損傷激活的非編碼RNA（non-coding RNA activated by DNA damage，NORAD）可有效減輕LPS誘導的肺內皮細胞損傷。Lei等[6]研究表明NORAD在潰瘍性結腸炎大鼠結腸黏膜組織中過表達，沉默NORAD表達可降低大鼠炎癥反應、氧化應激，降低細胞凋亡。LncRNA發揮生物學作用一般是通過調控miRNA表達來實現的，miRNA在調控細胞生物學過程中發揮重要作用[7]。Lin等[8]研究表明過表達miR-155-5p可減輕呼吸機誘導肺損傷小鼠細胞凋亡和自噬，減輕肺損傷。推測miR-155-5p可降低肺損傷，而miRNA可通過與其靶基因mRNA結合來調控細胞生物學過程。Toll樣受體6（Toll-like receptor 6，TLR6）具有促進炎癥發生的作用，Wang等[9]研究表明TLR6在膿毒癥患者血液中高表達，降低TLR6表達可減輕膿毒癥誘導的炎癥反應。生物信息學顯示miR-155-5p與NORAD和TLR6存在靶向關系。因此，本研究就NORAD是否可通過調節miR-155-5p/TLR6軸來影響膿毒癥大鼠ALI進行探討。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
1.1.1 實驗動物和細胞
選取SPF級200～230 g雄性SD大鼠60只，購自福建醫科大學［合格證號SCXK（閩）2022-0001］。小鼠肺微血管內皮細胞MHC細胞購自上海一研生物科技有限公司。本研究經福建醫科大學動物實驗中心倫理委員會審核通過（批號2022-08912）。
1.1.2 主要試劑與儀器
白細胞介素（interleukin，IL）-8、IL-1β、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒購自河南閔翰生物科技有限公司；Trizol試劑購自上海科澄維生物科技有限公司；實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒購自上海威奧生物科技有限公司；胰蛋白酶購自上海莼試生物技術有限公司；CX41顯微鏡購自上海蒼茂實業有限公司；TLR6、Bax、Bcl-2、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Cleaved-caspase-3）、β-actin一抗和二抗均購自英國Abcam公司。
1.2 方法
1.2.1 造模與分組
取50只大鼠于大鼠腹腔內注射10 mg/kg的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）以建立膿毒癥ALI大鼠模型[10]，將建模后的大鼠隨機分為模型組、NORAD低表達空載組（LV-sh-NC組）、NORAD低表達組（LV-sh-NORAD組）、NORAD低表達+miR-155-5p低表達空載組（LV-sh-NORAD+NC antagomir）、NORAD低表達+miR-155-5p低表達組（LV-sh-NORAD+miR-155-5p antagomir），另取10只腹腔內注射生理鹽水做為對照組。LV-sh-NC組和LV-sh-NORAD組大鼠尾靜脈注射200 μL sh-NORAD慢病毒空載體（6×106 TU/mL）和200 μL sh-NORAD慢病毒載體（6×106 TU/mL），LV-sh-NORAD+NC antagomir組和LV-sh-NORAD+miR-155-5p antagomir組大鼠尾靜脈注射200 μL sh-NORAD慢病毒載體（6×106 TU/ml）后再尾靜脈注射200 μL NC antagomir和miR-155-5p antagomir質粒，對照組和模型組同等方式注射等量生理鹽水。
1.2.2 樣本采集
48 h后取大鼠外周血3 mL，4℃冰箱保存，斷頭處死大鼠，取出大鼠完整肺組織，–80℃冰箱保存待測。
1.2.3 血清IL-8、IL-β、TNF-α水平檢測
將新鮮血液離心收集血清，根據試劑盒說明書加入相應的反應試劑，終止試劑后檢測IL-8、IL-β、TNF-α水平。
1.2.4 qRT-PCR檢測肺組織中NORAD、miR-155-5p和TLR6 mRNA表達
取部分大鼠左肺組織，提取其總RNA，并逆轉錄為cDNA后，對cDNA進行熒光定量擴增。分別以GAPDH和U6為內參，計算NORAD、miR-155-5p和TLR6 mRNA的相對表達量（2–ΔΔCt方法）。引物：NORAD正向：5?-TCCCATCACCATCTTCCAGG-3?，反向5?-CCGTTGTCGTCAGGACTAGGTAGG-3?；TLR6 mRNA正向：5?-TGCAACATGAGCCAAGACAG-3?，反向5?-TTCTTGGTGGCAGGTCTTTG-3?；miR-155-5p正向：5?-GGGGTTAATGCTAATCGTGA-3?，反向5?-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3?；GAPDH正向：5'-CAAGGACCTCTACGCCAAC-3'，反向：5'-TGGAGGCGCGATGATCTT-3'。U6正向：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。
1.2.5 肺水腫評估
取大鼠右肺，清除表面水分，稱量記為濕重（wet weight，W），之后置于80℃干燥箱中烘干至恒重，稱量記為干重（dry weight，D），計算W/D值。
1.2.6 HE染色觀察肺組織形態變化
取左肺組織切片，多聚甲醛進行固定，石蠟包埋切片（4 μm），脫蠟，清洗，然后蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，脫水后進行封片，顯微鏡觀察肺組織形態變化。
1.2.7 TUNEL法檢測肺組織細胞凋亡情況
取1.2.6中固定肺組織，包埋，切片，脫蠟，酒精梯度脫水，然后按照原位末端標記法（terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling，TUNEL）試劑盒說明書進行后續操作，觀察細胞凋亡情況。凋亡率=TUNEL陽性細胞數/總細胞數×100%。
1.2.8 免疫印跡法（Western blot）檢測大鼠肺組織中相關蛋白表達
取大鼠左肺組織低溫研磨勻漿，提取蛋白后熱水浴將其變性，電泳分離蛋白并轉移至PVDF膜上，封閉液封閉2 h，加入一抗TLR6、Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase-3、β-actin稀釋液4℃孵育過夜，加入二抗，ECL顯色后用Image J軟件分析蛋白。
1.2.9 雙熒光素酶報告基因檢測
采用雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-155-5p與NORAD和TLR6的關系。構建NORAD野生型和突變型載體（NORAD-WT和NORAD-MUT），將NORAD-WT分別與miR-155-5p空載和過表達質粒共轉染于MHC細胞中，在將NORAD-MUT分別與miR-155-5p空載和過表達質粒共轉染于細胞MHC中，48 h后，檢測熒光素酶活性。構建TLR6野生型和突變型載體（TLR6-WT和TLR6-MUT），將TLR6-WT分別與miR-155-5p空載和過表達質粒共轉染于MHC細胞中，再將TLR6-MUT分別與miR-NC和miR-155-5p mimic共轉染于MHC細胞中，48 h后，檢測熒光素酶活性。
1.3 統計學方法
采用GraphPad Prism 8.0.1軟件分析數據。呈正態分布的計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，組內兩兩比較采用SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 各組大鼠血漿炎癥因子表達比較
模型組和LV-sh-NC組大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-8水平顯著高于對照組（P<0.05）；LV-sh-NORAD組大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-8水平顯著低于LV-sh-NC組（P<0.05）；LV-sh-NORAD+miR-155-5p antagomir組大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-8水平顯著高于LV-sh-NORAD+NC antagomir組（P<0.05）。結果見表1。
表1
各組大鼠血清炎癥因子表達比較（n=10，ng/L，x±s）
2.2 各組大鼠肺組織中NORAD、miR-155-5p和TLR6基因表達比較
模型組和LV-sh-NC組大鼠肺組織中NORAD和TLR6 mRNA表達水平顯著高于對照組，miR-155-5p表達水平低于對照組（P<0.05）；LV-sh-NORAD組大鼠肺組織中NORAD和TLR6 mRNA表達水平低于LV-sh-NC組，miR-155-5p表達水平顯著高于LV-sh-NC組（P<0.05）；LV-sh-NORAD+miR-155-5p antagomir組大鼠肺組織中TLR6 mRNA表達水平高于LV-sh-NORAD+NC antagomir組，miR-155-5p表達水平低于LV-sh-NORAD+NC antagomir組（P<0.05）。結果見表2。
表2
各組大鼠肺組織中NORAD、miR-155-5p和TLR6基因表達比較（n=10，x±s）
2.3 各組大鼠W/D比值比較
模型組和LV-sh-NC組相較于對照組大鼠肺組織W/D比值顯著增大（P<0.05）；LV-sh-NORAD組相較于LV-sh-NC組大鼠肺組織W/D比值顯著減小（P<0.05）；LV-sh-NORAD+miR-155-5p antagomir組相較于LV-sh-NORAD+NC antagomir 組大鼠肺組織W/D比值顯著增大（P<0.05）。結果見表3。
表3
各組大鼠W/D比值比較（n=10，x±s）
2.4 各組大鼠肺組織形態變化比較
由圖1可見，對照組大鼠肺組織形態完好；模型組和LV-sh-NC組大鼠肺組織有明顯損傷，肺泡結構破損，肺泡間隔增大，明顯肺水腫和大量炎性細胞浸潤現象；LV-sh-NORAD組肺組織損傷程度顯著減輕；與LV-sh-NORAD+NC antagomir組比較，LV-sh-NORAD+miR-155-5p antagomir組肺組織損傷程度顯著加重。
圖1
大鼠肺組織病理像（HE×200）
a. 對照組；b. 模型組；c. LV-sh-NC組LV-sh-NORAD組；d. LV-sh-NORAD組；e. LV-sh-NORAD+NC antagomir組；f. LV-sh-NORAD+miR-155-5p antagomir組。
2.5 各組大鼠肺組織細胞凋亡比較
模型組和LV-sh-NC組相較于對照組大鼠肺組織細胞凋亡率顯著升高（P<0.05）；LV-sh-NORAD組相較于LV-sh-NC組大鼠肺組織細胞凋亡率顯著降低（P<0.05）；LV-sh-NORAD+miR-155-5p antagomir組相較于LV-sh-NORAD+NC antagomir組大鼠肺組織細胞凋亡率顯著升高（P<0.05）。結果見圖2和表4。
圖2
肺組織細胞凋亡病理像（TUNEL×400）
a. 對照組；b. 模型組；c. LV-sh-NC組LV-sh-NORAD組；d. LV-sh-NORAD組；e. LV-sh-NORAD+NC antagomir組；f. LV-sh-NORAD+miR-155-5p antagomir組。
表4
各組大鼠肺組織細胞凋亡率比較（n=10，x±s）
2.6 各組大鼠肺組織相關蛋白表達比較
相較于對照組，模型組和LV-sh-NC組大鼠肺組織TLR6、Bax、Cleaved-caspase-3蛋白表達顯著升高，Bcl-2蛋白表達顯著降低（P<0.05）；LV-sh-NORAD組相較于LV-sh-NC組大鼠肺組織TLR6、Bax、Cleaved-caspase-3蛋白表顯著降低，Bcl-2蛋白表達顯著升高（P<0.05）；LV-sh-NORAD+miR-155-5p antagomir組相較于LV-sh-NORAD+NC antagomir組大鼠肺組織TLR6、Bax、Cleaved-caspase-3蛋白表顯著升高，Bcl-2蛋白表達顯著降低（P<0.05）。結果見圖3和表5。
圖3
各組大鼠肺組織相關蛋白表達
A：對照組；B：模型組；C：LV-sh-NC組；D：LV-sh-NORAD組；E：LV-sh-NORAD+NC antagomir組；F：LV-sh-NORAD+miR-155-5p antagomir組。
表5
各組大鼠肺組織相關蛋白表達比較（n=5，x±s）
2.7 雙熒光素酶報告基因檢測
miR-155-5p與NORAD、TLR6的靶向結合位點如圖4所示。miR-155-5p mimic+NORAD-WT組熒光素酶活性低于miR-NC+NORAD-WT組（P<0.05）；miR-NC+NORAD-MUT與miR-155-5p mimic+NORAD-MUT組熒光素酶活性差異無統計學意義（P>0.05）。結果見表6。miR-155-5p mimi+TLR6-WT組熒光素酶活性低于miR-NC+TLR6-WT組（P<0.05）；miR-NC+TLR6-MUT組與miR-155-5p mimic+TLR6-MUT組熒光素酶活性差異無統計學意義（P>0.05）。結果見表7。
圖4
miR-155-5p與NORAD、TLR6的靶向結合位點
表6
miR-155-5p與NORAD熒光素酶活性（n=6，x±s）
表7
miR-155-5p與TLR6熒光素酶活性（n=6，x±s）
3 討論
膿毒癥是一種機體感染后引發全身感染性炎癥反應的一種疾病，膿毒癥發生后會造成機體多器官功能障礙，而ALI是膿毒癥常見并發癥[11]。ALI發生后會激活中性粒細胞及趨化因子趨向運動，進而對肺毛細血管內皮和肺泡內皮細胞造成損傷，導致液體及蛋白質滲漏，引起肺水腫，進而損壞肺的換氣功能，造成呼吸功能障礙，治療不及時導致患者死亡[12]。目前ALI的發病機制尚未研究清楚，針對ALI也無較好的治療措施和特效藥物[13]，因此探究ALI的分子發病機制對治療ALI具有重要意義。
研究已證實LncRNA可調節細胞多種生理代謝過程，參與多種疾病的發生發展過程[14]。Xie等[15]研究表明負調控NORAD表達可減輕膿毒癥大鼠急性腎損傷，并降低LPS誘導的HK-3細胞炎癥和細胞凋亡，改善心肌損傷。Zhang等[16]研究表明NORAD在LPS誘導的膿毒癥細胞中高表達，沉默NORAD表達可降低炎癥反應，推測NORAD可降低組織炎癥和細胞凋亡。本研究結果顯示，膿毒癥ALI大鼠肺組織NORAD高表達，血清炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-8水平，W/D比值、細胞凋亡率，肺組織凋亡相關蛋白Bax、Cleaved-caspase-3表達顯著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達顯著降低；沉默NORAD表達后可降低ALI大鼠炎癥反應、肺組織細胞凋亡和肺水腫，減輕肺組織損傷。以上結果提示沉默NORAD表達降低ALI大鼠炎癥，減輕肺損傷，與推測結果一致。
miRNA是一種小RNA，具有調控細胞生理代謝過程的作用。研究已證實miRNA主要通過與LncRNA和mRNA的堿基互補結合參與調控細胞生物學過程[17]。Liu等[17]研究表明外泌體miR-384-5p可減輕ALI大鼠炎癥反應、細胞凋亡和肺組織損傷。Yi等[18]研究表明過表達miR-30b-3p可預防LPS誘導的ALI。本研究結果顯示，ALI大鼠肺組織中miR-155-5p低表達，TLR6高表達，促進肺組織損傷。沉默NORAD表達后，miR-155-5p表達顯著升高，TLR6表達顯著降低，ALI大鼠肺損傷顯著減輕；在沉默NORAD表達的基礎上下調miR-155-5p表達，結果發現下調miR-155-5p表達可減弱沉默NORAD表達對ALI大鼠的改善作用；通過生物信息學發現NORAD與miR-155-5p存在靶向結合位點，熒光素酶活性實驗證實兩組有靶向關系，提示NORAD可能通過海綿化miR-155-5p表達來調控ALI大鼠肺損傷。
TLR6屬于Toll樣受體家族，TLR通過與病原體微生物相關分子模式結合可激活核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路啟動炎癥反應發生[19]。Zou等[20]研究顯示抑制TLR6介導的NF-κB信號通路可減輕敗血支原體誘導的雞肺部炎癥。Khan等[21]研究顯示TLR6過表達可增強膿毒癥誘導的ALI大鼠炎癥反應。本研究結果顯示，ALI大鼠肺組織中TLR6基因和蛋白高表達，下調NORAD表達后，miR-155-5p表達升高，TLR6表達下調。當下調miR-155-5p表達時，TLR6表達上調，熒光素酶活性實驗也證實miR-155-5p與TLR6存在靶向調控關系，提示TLR6表達受miR-155-5p調控。綜合以上結果得出結論，NORAD可能通過下調miR-155-5p表達進而調控TLR6表達來影響ALI大鼠肺損傷。
綜上所述，負調控NORAD可調控miR-155-5p/TLR6分子軸減輕ALI大鼠肺水腫、炎癥反應和細胞凋亡，減輕肺損傷。調控ALI的分子機制復雜，還需要進一步深入研究。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
膿毒癥是對感染反應失調而導致的器官功能障礙綜合征，而肺部是最先受到損傷的器官之一，急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是膿毒癥患者死亡的常見病因[1]。ALI患者臨床主要表現為低氧血癥、呼吸困難等，發病時危及患者生命[2]。近年來隨著分子生物學的發展，從分子水平干預治療ALI逐漸成為研究熱點[3]。已證實長鏈非編碼核糖核酸（long non-coding RNA，lncRNA）參與調控細胞多種疾病的發生發展過程[4]。Zhou等[5]研究表明沉默DNA損傷激活的非編碼RNA（non-coding RNA activated by DNA damage，NORAD）可有效減輕LPS誘導的肺內皮細胞損傷。Lei等[6]研究表明NORAD在潰瘍性結腸炎大鼠結腸黏膜組織中過表達，沉默NORAD表達可降低大鼠炎癥反應、氧化應激，降低細胞凋亡。LncRNA發揮生物學作用一般是通過調控miRNA表達來實現的，miRNA在調控細胞生物學過程中發揮重要作用[7]。Lin等[8]研究表明過表達miR-155-5p可減輕呼吸機誘導肺損傷小鼠細胞凋亡和自噬，減輕肺損傷。推測miR-155-5p可降低肺損傷，而miRNA可通過與其靶基因mRNA結合來調控細胞生物學過程。Toll樣受體6（Toll-like receptor 6，TLR6）具有促進炎癥發生的作用，Wang等[9]研究表明TLR6在膿毒癥患者血液中高表達，降低TLR6表達可減輕膿毒癥誘導的炎癥反應。生物信息學顯示miR-155-5p與NORAD和TLR6存在靶向關系。因此，本研究就NORAD是否可通過調節miR-155-5p/TLR6軸來影響膿毒癥大鼠ALI進行探討。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
1.1.1 實驗動物和細胞
選取SPF級200～230 g雄性SD大鼠60只，購自福建醫科大學［合格證號SCXK（閩）2022-0001］。小鼠肺微血管內皮細胞MHC細胞購自上海一研生物科技有限公司。本研究經福建醫科大學動物實驗中心倫理委員會審核通過（批號2022-08912）。
1.1.2 主要試劑與儀器
白細胞介素（interleukin，IL）-8、IL-1β、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒購自河南閔翰生物科技有限公司；Trizol試劑購自上海科澄維生物科技有限公司；實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒購自上海威奧生物科技有限公司；胰蛋白酶購自上海莼試生物技術有限公司；CX41顯微鏡購自上海蒼茂實業有限公司；TLR6、Bax、Bcl-2、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Cleaved-caspase-3）、β-actin一抗和二抗均購自英國Abcam公司。
1.2 方法
1.2.1 造模與分組
取50只大鼠于大鼠腹腔內注射10 mg/kg的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）以建立膿毒癥ALI大鼠模型[10]，將建模后的大鼠隨機分為模型組、NORAD低表達空載組（LV-sh-NC組）、NORAD低表達組（LV-sh-NORAD組）、NORAD低表達+miR-155-5p低表達空載組（LV-sh-NORAD+NC antagomir）、NORAD低表達+miR-155-5p低表達組（LV-sh-NORAD+miR-155-5p antagomir），另取10只腹腔內注射生理鹽水做為對照組。LV-sh-NC組和LV-sh-NORAD組大鼠尾靜脈注射200 μL sh-NORAD慢病毒空載體（6×106 TU/mL）和200 μL sh-NORAD慢病毒載體（6×106 TU/mL），LV-sh-NORAD+NC antagomir組和LV-sh-NORAD+miR-155-5p antagomir組大鼠尾靜脈注射200 μL sh-NORAD慢病毒載體（6×106 TU/ml）后再尾靜脈注射200 μL NC antagomir和miR-155-5p antagomir質粒，對照組和模型組同等方式注射等量生理鹽水。
1.2.2 樣本采集
48 h后取大鼠外周血3 mL，4℃冰箱保存，斷頭處死大鼠，取出大鼠完整肺組織，–80℃冰箱保存待測。
1.2.3 血清IL-8、IL-β、TNF-α水平檢測
將新鮮血液離心收集血清，根據試劑盒說明書加入相應的反應試劑，終止試劑后檢測IL-8、IL-β、TNF-α水平。
1.2.4 qRT-PCR檢測肺組織中NORAD、miR-155-5p和TLR6 mRNA表達
取部分大鼠左肺組織，提取其總RNA，并逆轉錄為cDNA后，對cDNA進行熒光定量擴增。分別以GAPDH和U6為內參，計算NORAD、miR-155-5p和TLR6 mRNA的相對表達量（2–ΔΔCt方法）。引物：NORAD正向：5?-TCCCATCACCATCTTCCAGG-3?，反向5?-CCGTTGTCGTCAGGACTAGGTAGG-3?；TLR6 mRNA正向：5?-TGCAACATGAGCCAAGACAG-3?，反向5?-TTCTTGGTGGCAGGTCTTTG-3?；miR-155-5p正向：5?-GGGGTTAATGCTAATCGTGA-3?，反向5?-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3?；GAPDH正向：5'-CAAGGACCTCTACGCCAAC-3'，反向：5'-TGGAGGCGCGATGATCTT-3'。U6正向：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。
1.2.5 肺水腫評估
取大鼠右肺，清除表面水分，稱量記為濕重（wet weight，W），之后置于80℃干燥箱中烘干至恒重，稱量記為干重（dry weight，D），計算W/D值。
1.2.6 HE染色觀察肺組織形態變化
取左肺組織切片，多聚甲醛進行固定，石蠟包埋切片（4 μm），脫蠟，清洗，然后蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，脫水后進行封片，顯微鏡觀察肺組織形態變化。
1.2.7 TUNEL法檢測肺組織細胞凋亡情況
取1.2.6中固定肺組織，包埋，切片，脫蠟，酒精梯度脫水，然后按照原位末端標記法（terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling，TUNEL）試劑盒說明書進行后續操作，觀察細胞凋亡情況。凋亡率=TUNEL陽性細胞數/總細胞數×100%。
1.2.8 免疫印跡法（Western blot）檢測大鼠肺組織中相關蛋白表達
取大鼠左肺組織低溫研磨勻漿，提取蛋白后熱水浴將其變性，電泳分離蛋白并轉移至PVDF膜上，封閉液封閉2 h，加入一抗TLR6、Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase-3、β-actin稀釋液4℃孵育過夜，加入二抗，ECL顯色后用Image J軟件分析蛋白。
1.2.9 雙熒光素酶報告基因檢測
采用雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-155-5p與NORAD和TLR6的關系。構建NORAD野生型和突變型載體（NORAD-WT和NORAD-MUT），將NORAD-WT分別與miR-155-5p空載和過表達質粒共轉染于MHC細胞中，在將NORAD-MUT分別與miR-155-5p空載和過表達質粒共轉染于細胞MHC中，48 h后，檢測熒光素酶活性。構建TLR6野生型和突變型載體（TLR6-WT和TLR6-MUT），將TLR6-WT分別與miR-155-5p空載和過表達質粒共轉染于MHC細胞中，再將TLR6-MUT分別與miR-NC和miR-155-5p mimic共轉染于MHC細胞中，48 h后，檢測熒光素酶活性。
1.3 統計學方法
采用GraphPad Prism 8.0.1軟件分析數據。呈正態分布的計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，組內兩兩比較采用SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 各組大鼠血漿炎癥因子表達比較
模型組和LV-sh-NC組大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-8水平顯著高于對照組（P<0.05）；LV-sh-NORAD組大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-8水平顯著低于LV-sh-NC組（P<0.05）；LV-sh-NORAD+miR-155-5p antagomir組大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-8水平顯著高于LV-sh-NORAD+NC antagomir組（P<0.05）。結果見表1。
表1
各組大鼠血清炎癥因子表達比較（n=10，ng/L，x±s）
2.2 各組大鼠肺組織中NORAD、miR-155-5p和TLR6基因表達比較
模型組和LV-sh-NC組大鼠肺組織中NORAD和TLR6 mRNA表達水平顯著高于對照組，miR-155-5p表達水平低于對照組（P<0.05）；LV-sh-NORAD組大鼠肺組織中NORAD和TLR6 mRNA表達水平低于LV-sh-NC組，miR-155-5p表達水平顯著高于LV-sh-NC組（P<0.05）；LV-sh-NORAD+miR-155-5p antagomir組大鼠肺組織中TLR6 mRNA表達水平高于LV-sh-NORAD+NC antagomir組，miR-155-5p表達水平低于LV-sh-NORAD+NC antagomir組（P<0.05）。結果見表2。
表2
各組大鼠肺組織中NORAD、miR-155-5p和TLR6基因表達比較（n=10，x±s）
2.3 各組大鼠W/D比值比較
模型組和LV-sh-NC組相較于對照組大鼠肺組織W/D比值顯著增大（P<0.05）；LV-sh-NORAD組相較于LV-sh-NC組大鼠肺組織W/D比值顯著減小（P<0.05）；LV-sh-NORAD+miR-155-5p antagomir組相較于LV-sh-NORAD+NC antagomir 組大鼠肺組織W/D比值顯著增大（P<0.05）。結果見表3。
表3
各組大鼠W/D比值比較（n=10，x±s）
2.4 各組大鼠肺組織形態變化比較
由圖1可見，對照組大鼠肺組織形態完好；模型組和LV-sh-NC組大鼠肺組織有明顯損傷，肺泡結構破損，肺泡間隔增大，明顯肺水腫和大量炎性細胞浸潤現象；LV-sh-NORAD組肺組織損傷程度顯著減輕；與LV-sh-NORAD+NC antagomir組比較，LV-sh-NORAD+miR-155-5p antagomir組肺組織損傷程度顯著加重。
圖1
大鼠肺組織病理像（HE×200）
a. 對照組；b. 模型組；c. LV-sh-NC組LV-sh-NORAD組；d. LV-sh-NORAD組；e. LV-sh-NORAD+NC antagomir組；f. LV-sh-NORAD+miR-155-5p antagomir組。
2.5 各組大鼠肺組織細胞凋亡比較
模型組和LV-sh-NC組相較于對照組大鼠肺組織細胞凋亡率顯著升高（P<0.05）；LV-sh-NORAD組相較于LV-sh-NC組大鼠肺組織細胞凋亡率顯著降低（P<0.05）；LV-sh-NORAD+miR-155-5p antagomir組相較于LV-sh-NORAD+NC antagomir組大鼠肺組織細胞凋亡率顯著升高（P<0.05）。結果見圖2和表4。
圖2
肺組織細胞凋亡病理像（TUNEL×400）
a. 對照組；b. 模型組；c. LV-sh-NC組LV-sh-NORAD組；d. LV-sh-NORAD組；e. LV-sh-NORAD+NC antagomir組；f. LV-sh-NORAD+miR-155-5p antagomir組。
表4
各組大鼠肺組織細胞凋亡率比較（n=10，x±s）
2.6 各組大鼠肺組織相關蛋白表達比較
相較于對照組，模型組和LV-sh-NC組大鼠肺組織TLR6、Bax、Cleaved-caspase-3蛋白表達顯著升高，Bcl-2蛋白表達顯著降低（P<0.05）；LV-sh-NORAD組相較于LV-sh-NC組大鼠肺組織TLR6、Bax、Cleaved-caspase-3蛋白表顯著降低，Bcl-2蛋白表達顯著升高（P<0.05）；LV-sh-NORAD+miR-155-5p antagomir組相較于LV-sh-NORAD+NC antagomir組大鼠肺組織TLR6、Bax、Cleaved-caspase-3蛋白表顯著升高，Bcl-2蛋白表達顯著降低（P<0.05）。結果見圖3和表5。
圖3
各組大鼠肺組織相關蛋白表達
A：對照組；B：模型組；C：LV-sh-NC組；D：LV-sh-NORAD組；E：LV-sh-NORAD+NC antagomir組；F：LV-sh-NORAD+miR-155-5p antagomir組。
表5
各組大鼠肺組織相關蛋白表達比較（n=5，x±s）
2.7 雙熒光素酶報告基因檢測
miR-155-5p與NORAD、TLR6的靶向結合位點如圖4所示。miR-155-5p mimic+NORAD-WT組熒光素酶活性低于miR-NC+NORAD-WT組（P<0.05）；miR-NC+NORAD-MUT與miR-155-5p mimic+NORAD-MUT組熒光素酶活性差異無統計學意義（P>0.05）。結果見表6。miR-155-5p mimi+TLR6-WT組熒光素酶活性低于miR-NC+TLR6-WT組（P<0.05）；miR-NC+TLR6-MUT組與miR-155-5p mimic+TLR6-MUT組熒光素酶活性差異無統計學意義（P>0.05）。結果見表7。
圖4
miR-155-5p與NORAD、TLR6的靶向結合位點
表6
miR-155-5p與NORAD熒光素酶活性（n=6，x±s）
表7
miR-155-5p與TLR6熒光素酶活性（n=6，x±s）
3 討論
膿毒癥是一種機體感染后引發全身感染性炎癥反應的一種疾病，膿毒癥發生后會造成機體多器官功能障礙，而ALI是膿毒癥常見并發癥[11]。ALI發生后會激活中性粒細胞及趨化因子趨向運動，進而對肺毛細血管內皮和肺泡內皮細胞造成損傷，導致液體及蛋白質滲漏，引起肺水腫，進而損壞肺的換氣功能，造成呼吸功能障礙，治療不及時導致患者死亡[12]。目前ALI的發病機制尚未研究清楚，針對ALI也無較好的治療措施和特效藥物[13]，因此探究ALI的分子發病機制對治療ALI具有重要意義。
研究已證實LncRNA可調節細胞多種生理代謝過程，參與多種疾病的發生發展過程[14]。Xie等[15]研究表明負調控NORAD表達可減輕膿毒癥大鼠急性腎損傷，并降低LPS誘導的HK-3細胞炎癥和細胞凋亡，改善心肌損傷。Zhang等[16]研究表明NORAD在LPS誘導的膿毒癥細胞中高表達，沉默NORAD表達可降低炎癥反應，推測NORAD可降低組織炎癥和細胞凋亡。本研究結果顯示，膿毒癥ALI大鼠肺組織NORAD高表達，血清炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-8水平，W/D比值、細胞凋亡率，肺組織凋亡相關蛋白Bax、Cleaved-caspase-3表達顯著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達顯著降低；沉默NORAD表達后可降低ALI大鼠炎癥反應、肺組織細胞凋亡和肺水腫，減輕肺組織損傷。以上結果提示沉默NORAD表達降低ALI大鼠炎癥，減輕肺損傷，與推測結果一致。
miRNA是一種小RNA，具有調控細胞生理代謝過程的作用。研究已證實miRNA主要通過與LncRNA和mRNA的堿基互補結合參與調控細胞生物學過程[17]。Liu等[17]研究表明外泌體miR-384-5p可減輕ALI大鼠炎癥反應、細胞凋亡和肺組織損傷。Yi等[18]研究表明過表達miR-30b-3p可預防LPS誘導的ALI。本研究結果顯示，ALI大鼠肺組織中miR-155-5p低表達，TLR6高表達，促進肺組織損傷。沉默NORAD表達后，miR-155-5p表達顯著升高，TLR6表達顯著降低，ALI大鼠肺損傷顯著減輕；在沉默NORAD表達的基礎上下調miR-155-5p表達，結果發現下調miR-155-5p表達可減弱沉默NORAD表達對ALI大鼠的改善作用；通過生物信息學發現NORAD與miR-155-5p存在靶向結合位點，熒光素酶活性實驗證實兩組有靶向關系，提示NORAD可能通過海綿化miR-155-5p表達來調控ALI大鼠肺損傷。
TLR6屬于Toll樣受體家族，TLR通過與病原體微生物相關分子模式結合可激活核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路啟動炎癥反應發生[19]。Zou等[20]研究顯示抑制TLR6介導的NF-κB信號通路可減輕敗血支原體誘導的雞肺部炎癥。Khan等[21]研究顯示TLR6過表達可增強膿毒癥誘導的ALI大鼠炎癥反應。本研究結果顯示，ALI大鼠肺組織中TLR6基因和蛋白高表達，下調NORAD表達后，miR-155-5p表達升高，TLR6表達下調。當下調miR-155-5p表達時，TLR6表達上調，熒光素酶活性實驗也證實miR-155-5p與TLR6存在靶向調控關系，提示TLR6表達受miR-155-5p調控。綜合以上結果得出結論，NORAD可能通過下調miR-155-5p表達進而調控TLR6表達來影響ALI大鼠肺損傷。
綜上所述，負調控NORAD可調控miR-155-5p/TLR6分子軸減輕ALI大鼠肺水腫、炎癥反應和細胞凋亡，減輕肺損傷。調控ALI的分子機制復雜，還需要進一步深入研究。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
