年齡相關性黃斑變性（AMD）是我國主要的不可逆致盲性疾病。目前AMD的發病機制尚不完全明確。在各種應激下，細胞衰老被激活，端粒縮短、線粒體功能障礙、DNA損傷等，并釋放多種衰老相關分泌表型因子。細胞衰老通過多種途徑與AMD的發病機制有關，并促進慢性炎癥和AMD的發生和發展。氧化應激、脂褐素、β-淀粉樣蛋白、膜攻擊復合物等相關的發病機制是目前的研究熱點。環磷酸鳥苷-腺苷合成酶-干擾素刺激因子通路是早期AMD發生和發展的重要信號通路，為AMD的治療提供了研究方向。目前選擇性靶向誘導衰老細胞凋亡的抗衰老藥物在AMD的治療中表現出巨大潛能，新技術與細胞衰老的結合可以為AMD的治療提供新的切入點，通過抗細胞衰老途徑干預AMD的治療具有廣闊的應用前景。
引用本文： 李雨晨, 許譯丹, 趙峰, 陳力迅. 細胞衰老和衰老相關分泌表型在年齡相關性黃斑變性發病和治療中的研究進展. 中華眼底病雜志, 2024, 40(3): 233-238. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20230508-00208 復制
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年齡相關性黃斑變性（AMD）是一種復雜的視網膜退行性疾病，是引起全球50歲以上人群中心視力損害的主要原因。全球AMD患者數量將從2020年的1.96億上升至2040年的2.88億[1]。中國大約3千萬AMD患者，AMD是我國主要的不可逆性致盲性疾病。AMD分為萎縮型和滲出型AMD，分別表現為“地圖樣”萎縮和脈絡膜新生血管，約10%～15%的萎縮型AMD發展成滲出型AMD[2]。目前AMD的發病機制尚不完全明確，盡管抗血管內皮生長因子（VEGF）藥物在濕性AMD治療上取得了重大進展，但大多數患者多年后病情仍進行性加重。另外，由于缺乏退行性病變的有效治療手段，部分AMD患者最終會導致嚴重的視力損害或失明。細胞衰老與AMD發生和發展關系密切，各種視網膜和脈絡膜組織細胞的衰老變化，如視網膜色素上皮（RPE）細胞、小膠質細胞、神經元和微血管內皮細胞等，及先天性和適應性免疫細胞的衰老可通過多種途徑參與AMD發生和發展[3]。細胞衰老是有絲分裂和有絲分裂后細胞對有害刺激的適應性過程，通過分泌衰老相關分泌表型（SASP），包括促炎因子、生長因子、趨化因子和蛋白酶類等，介導細胞慢性炎癥及鄰近細胞的衰老特異性微環境，而靶向干預SASP抗衰老治療也是目前的研究熱點[4]。現就細胞衰老和SASP在AMD發病和治療中的研究進展作一綜述。
1 細胞衰老和SASP
20世紀60年代，細胞衰老定義為細胞分裂不可逆轉的停止狀態，細胞復制停滯在DNA合成前期[5]。如今，細胞衰老被定義為對各種應激的反應，如端粒縮短、線粒體功能障礙、DNA損傷等，最終通過激活腫瘤抑制通路p53/p21和p16INK4A/視網膜母細胞瘤蛋白（Rb）啟動和誘導細胞衰老。細胞衰老分為三種類型：復制性衰老（RS）、發育性程序性衰老、應激誘發的過早衰老（SIPS）[6]，而暴露于不同類型的亞致死性應激，可以在較短時間內誘導SIPS。細胞衰老可以維持正常的組織穩態，包括組織修復、腫瘤抑制。其保護作用依賴于對異常分子信號迅速產生應激反應并形成衰老細胞，通過介導細胞凋亡或免疫過程及時地清除衰老細胞。然而，過度產生的病理性衰老細胞或清除機制損傷，都將導致有害的衰老細胞累積，稱為慢性衰老。
早期衰老細胞體積增大，細胞內染色質重塑，端粒功能障礙及衰老相關異染色質灶（SAHF）形成，同時細胞內線粒體氧化代謝增強，衰老相關-β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性增強，衰老標記蛋白，如p38絲裂原活化蛋白激酶（p38-MAPK）、腫瘤抑制蛋白p53、細胞周期負調控因子p21CIP1及Rb等表達水平增加[7]。同時這些衰老細胞通過p38-MAPK、核因子（NF）-κB、Notch和（或）哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路釋放大量SASP，如趨化因子、細胞因子、基質蛋白酶、生長因子和細胞外囊泡（EV），以自分泌和旁分泌的方式介導細胞炎癥及鄰近細胞的衰老特異性微環境。而晚期衰老細胞持續分泌SASP，導致細胞持續低水平的慢性炎癥。
2 AMD與細胞衰老
細胞中與年齡相關的變化，如端粒縮短、DNA損傷、活性氧（ROS）產生和代謝紊亂都是可能誘導病理性衰老的有效觸發器。慢性應激介導的衰老細胞持續積累也是AMD的主要驅動因素。研究報道，對3月齡和18月齡的OXYS大鼠模型和對照Wistar大鼠模型進行高通量RNA測序技術分析，發現衰老加速的OXYS大鼠模型中視網膜內與免疫炎癥、細胞凋亡、氧化應激等相關的基因表達水平顯著增加，并發生類似于人類AMD的病理變化[8]。
AMD患者供體眼中RPE細胞的衰老特征基因，如p16INK4A、p21CIP1、p53和骨形態發生蛋白4（BMP4）基因的表達水平增加。通過人類AMD-RPE表觀遺傳轉錄組測序，發現表觀遺傳失調介導RPE發生SIPS，SA-β-gal和p21CIP1基因表達水平升高、SASP分泌增加，并促進RPE的上皮-間充質轉化，導致其分化異常和功能受損[9]。此外，在人衰老的視網膜中，神經節細胞、水平細胞和視桿細胞等神經和光感受器細胞中均發現了與視網膜老化或AMD相關發病機制的衰老改變。López-Luppo等[10]研究發現，在老年非糖尿病供體的視網膜中，視桿細胞的衰老比視錐細胞的衰老更明顯。這說明在AMD發生和發展的過程中，視桿細胞光感受器的損傷較視錐細胞更為嚴重。研究發現，恒河猴視網膜及脈絡膜血管內皮細胞與年齡相關的SA-β-gal基因表達增加，這提示細胞衰老介導血管功能障礙也可能在AMD中起重要作用[11]。研究發現，衰老加速的OXYS大鼠模型中視網膜內與免疫反應、炎癥、細胞凋亡、氧化應激等相關的基因均出現顯著地差異性表達，并發生了類似于人類AMD的病理變化[9]。
視網膜是免疫赦免組織，有維持正常細胞形態和功能的免疫細胞網絡[11]。而衰老的視網膜不僅各層細胞受損，并伴有免疫系統的失調和衰退，主要涉及小膠質細胞形態及遷移功能改變、先天免疫細胞如中性粒細胞、單核/巨噬細胞、樹突狀細胞、自然殺傷細胞等浸潤。小膠質細胞為駐留巨噬細胞，是區域免疫監測和組織修復的第一級監護[12-13]。小膠質細胞可以被激活，根據功能的不同分為促炎的M1型和抗炎的M2型，M1和（或）M2型小膠質細胞的平衡共同維持著視網膜微環境穩態。Xu等[14]研究發現，衰老的小膠質細胞表型發生轉化，導致視網膜中小膠質細胞的分布紊亂。小膠質細胞的平衡被打破，促炎介質表達增加，從而導致視網膜持續的慢性炎癥和組織穩態降低，最終導致AMD發生和發展。Ma等[15]研究發現，小膠質細胞涉及免疫功能調節、血管生成和神經營養素信號轉導功能的基因表達隨AMD患者年齡的增長而發生改變，與AMD相關的補體因子C3和補體因子B的表達顯著上升，這表明衰老的小膠質細胞可能介導AMD補體失調。研究證實，衰老的巨噬細胞和嗜中性粒細胞的細胞活性和清除能力下降[16]。Lin等[17]研究發現，衰老的巨噬細胞通過微RNA調控基因轉錄水平，誘導老年小鼠視網膜的脂質代謝異常和慢性炎癥。衰老的免疫細胞在視網膜退行病變的炎癥和代謝途徑中有重要影響。
3 AMD與SASP
SASP可以通過自分泌和旁分泌的方式影響鄰近結構和細胞的改變，是AMD衰老進程中慢性炎癥的主要和長期來源，在AMD病理生理過程中發揮關鍵作用[18]。SASP可分為細胞因子，包括白細胞介素（IL）-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-17、腫瘤壞死因子（TNF）-α、干擾素（INF）-γ等；生長因子如VEGF、肝細胞生長因子、轉化生長因子（TGF）-β等；趨化因子配體（CCL）-20、趨化因子配體1等；基質蛋白酶（MMP）-1、MMP-9、MMP-10等。Lazzarini等[19]通過體外誘導人RPE干細胞（RPESC）復制細胞衰老過程，發現RPESC分泌IL-6、IL-17、TNF-α，TGF-β1和INF-γ表達水平較年輕細胞更高。同時，衰老細胞分泌MMP參與AMD的發生和發展[20]。目前已知介導旁分泌衰老的SASP主要包括TGF-β家族配體、VEGF、CCL-2、CCL-20等。Acosta等[21]研究發現，NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3炎癥小體介導的IL-1信號通路可以調控SASP分泌。TGFβ配體通過調控p15INK4b和p21CIP1基因通路起主要旁分泌衰老誘導作用。衰老細胞釋放的EV與SASP參與調節受體細胞的表型[22]。Wang等[23]研究發現，AMD供體的玻璃膜疣中含有自噬標志物人自噬相關蛋白5和外泌體標志物CD63，其也存在于老年小鼠的Bruch膜區域。Hitomi等[24]用DNA損傷劑阿霉素（DXR）在體外誘導人胚胎成纖維細胞永生化胚胎成纖維細胞發生SIPS，發現鞘磷脂合成酶2表達水平顯著下降，中性鞘磷脂酶2表達水平顯著上升，這證實在成纖維細胞中具有促進EV生成與釋放的主要作用。同時，用DXR處理人RPE-1細胞誘導衰老，EV表達增加。由于EV通過旁分泌方式與其微環境之間進行細胞間通訊，誘導鄰近細胞衰老[25]，該過程與經典核因子（NF）-κB信號通路有關，抑制其轉錄因子p56可能為治療AMD開辟新的研究領域[26]。
4 細胞衰老參與AMD發生和發展的相關機制
4.1 氧化應激促進細胞衰老
氧化應激在AMD發病機制中至關重要，可以在較短時間內激活SIPS，導致線粒體功能障礙和產生ROS。體外研究表明，香煙提取物可介導人RPE細胞ARPE-19氧化應激反應及促使ROS表達增加，細胞核DNA損傷，SA-β-gal活性增高，p16INK4a和p21基因表達上調，誘導細胞SIPS。過氧化氫誘導的ARPE-19細胞衰老過程中發現SASP（如IL-6、IL-8和VEGF等）表達增加[27]，經ROS清除劑處理后上述衰老標志物明顯減少。研究證實，氧化應激誘導的細胞衰老過程通過激活NF-κB/信號傳導及轉錄激活蛋白（STAT）3通路產生SASP，持續性SASP表達又可以通過正反饋調節加強局部STAT3信號，進而促進衰老過程。因此，STAT3可能是調節SASP的產生和衰老的發生和發展的關鍵調節因子。而NF-κB和STAT3抑制劑均能減輕氧化應激誘導的細胞衰老和SASP水平。此外，腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）能夠明顯抑制NF-κB/STAT3介導的SASP表達水平[28]。目前已有許多AMPK藥理激活劑被證實其具有治療代謝性、神經退行性和其他年齡相關疾病的潛力，在AMD治療中有重要的應用前景[29]。視網膜中高濃度谷胱甘肽（GSH）是RPE細胞中抗氧化劑。Sun等[30]將ARPE-19細胞進行特殊處理耗盡GSH后，SA-β-Gal表達增多，SAHF表達增加和細胞周期阻滯，SIPS被激活；同時ARPE-19細胞活力減弱，ROS增多伴脂質損傷增強。這些結果均表明氧化應激誘導的SIPS在AMD的發生和發展中起到關鍵作用。
4.2 DNA損傷應答（DDR）
DNA損傷是SIPS的基本特征，隨后激活DDR，而持續性DNA損傷病灶對于維持衰老表型和SASP分泌至關重要[7]。Lin等[31]通過體外培養AMD患者供體眼中的RPE細胞發現，細胞核DNA和線粒體DNA（mtDNA）損傷隨著萎縮性和新生血管性AMD的進展而加重，修復能力逐漸降低，線粒體異質突變增加。研究表明，AMD中的DDR可能受到損害[32]，mtDNA對損傷的敏感性增加[33]。正常情況下，mtDNA的損傷可以被修復或耐受，高度受損的mtDNA可被降解。無效的DDR導致持續的細胞核DNA和mtDNA損傷積累。Barreau等[34]在衰老過程中觀察到人視網膜細胞mtDNA堿基對缺失的積累，但在胎兒的RPE細胞中未觀察到這一現象。研究分析，AMD患者供體眼中黃斑區mtDNA損傷增加，是核DNA損傷的8倍，顯著超過年齡匹配的對照者的表達水平[35]。Kenney等[36]研究報道，AMD受試者的視網膜中具有高水平的mtDNA缺失及重排。這提示mtDNA損傷是AMD重要的發病機制之一。
4.3 環磷酸鳥苷-腺苷合成酶（cGAS）-INF刺激因子（STING）信號通路
cGAS-STING信號通路由第二信使環cGAS激活STING，從而激活兩個獨立的下游通路：激活INF調節因子3導致生成INF，激活NF-κB信號通路誘導產生SASP[37]。Wu等[38]研究發現，cGAS-STING信號通路是早期AMD發生和發展的重要信號通路，與SASP的產生有關。Zou等[39]發現，氧化應激誘導的視網膜變性小鼠視網膜中cGAS-STING信號通路激活，光感受器中受損DNA的細胞質泄漏。異染色質是一種轉錄惰性染色質，呈高度凝聚狀態。Gong等[40]研究報道，異染色質對于保護RPE細胞免受氧化損傷至關重要，通過沉默P53依賴性凋亡基因的轉錄，從而抑制凋亡信號傳導及細胞衰老。而最新研究發現破壞異染色質導致RPE細胞中cGAS-STING信號通路上各種物質表達呈劑量依賴性增加，細胞炎癥反應增強。相反，使用促進異染色質生成藥物甲氨蝶呤，可以抑制cGAS-STING信號通路，減弱RPE細胞變性和炎癥[41]。cGAS-STING通路對RPE細胞衰老至關重要，靶向該關鍵途徑有助于cGAS-STING信號通路誘導的AMD的治療。
4.4 脂褐素和N-亞視黃基-N-視黃基-乙醇胺（A2E）
脂褐素作為RPE應激損傷的主要指標，是AMD中的關鍵生物標志物。K?nig等[42]通過誘導成纖維細胞SIPS，發現在衰老細胞中線粒體自噬受損，線粒體分裂受到抑制，脂褐素形成增加。脂褐素主要的熒光團是A2E，是視黃醛代謝后在RPE細胞內沉積的產物，同時是脂褐素誘導RPE細胞DNA損傷的主要成分。Alaimo等[43]研究發現，負載A2E的細胞中，藍光誘導線粒體融合或裂變失衡，線粒體形成蛋白表達下調，線粒體碎片化，這提示A2E可能介導線粒體質量控制從而參與AMD。此外，Wang等[44]研究發現，A2E的光敏化通過端粒縮短和誘導DNA損傷及RPE細胞衰老，表明了A2E可能以端粒為靶點來靶向誘導細胞衰老，而端粒酶催化端粒亞基易位表達抑制了RPE細胞衰老。同時A2E光敏化誘導的衰老細胞能夠通過激活NF-κB信號通路分泌SASP影響視網膜微環境。因此，脂褐素及A2E在細胞衰老與AMD發生和發展中起重要作用。
4.5 β-淀粉樣蛋白（Aβ）
Aβ是玻璃膜疣的成分之一，在AMD的發生和發展中起重要作用。Cao等[45]研究發現，Aβ促進RPE細胞進入衰老狀態，促進SASP（IL-6、IL-8和MMP-9）的分泌。MMP-9導致上皮細胞通透性升高并促進緊密連接蛋白水解，導致衰老RPE細胞上皮屏障的完整性受損。注射Aβ后的小鼠視網膜出現AMD樣退行性病理改變，這提示Aβ所致的細胞衰老與AMD之間的存在潛在聯系[46]。Wu等[47]通過體內和體外實驗發現，Aβ通過P38-MAPK通路誘導小膠質細胞活化，促進SASP（IL-1β和環氧合酶2）分泌，從而介導小鼠光感受器細胞凋亡。自噬可以調節細胞內Aβ的分泌，敲低自噬相關蛋白可以抑制Aβ的清除，提示自噬可能是一種應對Aβ誘導細胞衰老的保護機制[48-49]。
4.6 膜攻擊復合物（MAC）相關的脈絡膜毛細血管（CC）變性
MAC沉積于CC，誘導細胞裂解和細胞膜孔隙增大，導致CC變性。Mullins等[50]研究發現，MAC的表達水平隨患者年齡增長和AMD病程進展顯著增加。在年輕及早期AMD患者供體中，MAC局限于Bruch膜和CC，而晚期可以在RPE層觀察到MAC的標記。年輕健康人眼睛的CC中也存在MAC。Cabrera等[11]誘導猴脈絡膜視網膜內皮細胞（EC）RS，發現與年輕的對照組相比，衰老的EC其細胞僵硬度更高，細胞骨架三磷酸鳥苷結合蛋白（Rho）活性更高，對MAC損傷的敏感性更強。抑制Rho的活性則顯著降低細胞僵硬度和MAC誘導的裂解。這說明衰老可能與MAC相關的CC變性有關，在萎縮型AMD的發病機制中發揮重要作用。
5 抗細胞衰老治療AMD的研究
抗細胞衰老治療AMD的研究主要涉及：預防衰老細胞的累積、消除衰老細胞、抑制SASP的分泌及恢復細胞自噬。目前，已經開發出選擇性靶向誘導衰老細胞凋亡的衰老細胞裂解法[51]。研究表明，抑制細胞凋亡的B淋巴細胞瘤（Bcl）-2蛋白家族在衰老細胞中高表達，而選擇性靶向Bcl-xL蛋白的抑制藥物UBX1325和UBX1967已被證明可以有效減少小鼠的衰老細胞[52]。2020年開展一項評估玻璃體腔注射UBX1325以治療AMD與糖尿病黃斑水腫患者的Ⅱ期臨床試驗，發現單次藥物注射后AMD患者視力與視網膜改善可維持18周[53]。此外靶向P53基因通路的肽也已被證明可有效消除衰老細胞[54]。Fuhrmann-Stroissnigg等[55]研究發現，阿螺旋霉素可以有效延緩小鼠與年齡相關癥狀的發作并降低p16INK4a基因的表達水平，延長了小鼠的健康壽命。目前衰老細胞裂解法已被提議作為二線藥物輔助腫瘤治療[56]，這也提示衰老細胞裂解法用于臨床治療AMD及其他年齡相關性疾病的巨大可能性。
氧化應激誘導的細胞衰老機制是治療AMD的另一個潛在靶點。研究表明，BMP4在萎縮型AMD患者的RPE細胞中表達升高[57]，亞致死性氧化應激也可促進BMP4的表達。Zhu等[58]研究證實，BMP4在氧化應激誘導的衰老中充當介質，通過p53-p21-Rb信號通路、Smad信號通路誘導RPE細胞的衰老。應用BMP4拮抗劑可阻斷該通路。BMP4或許可成為抑制氧化應激誘導和衰老相關AMD機制的潛在靶點。Salovska等[59]研究發現，過氧化還原酶6（PRDX6）是衰老RPE細胞中最重要的抗氧化蛋白，沉默PRDX6會導致衰老細胞中ROS的生成增加，對氧化應激損傷的抵抗力降低，并導致細胞活力受損。同時發現下調虹膜中PRDX6會導致細胞外基質蛋白的表達減少。這表明了PRDX6可能是抗衰老藥物靶向目標。線粒體人體肽（HN）是一種屬于線粒體基因組的24氨基酸多肽[60]，對阿爾茨海默病、亨廷頓病等神經退行性疾病有保護作用。HN可以保護RPE細胞免受氧化應激、內質網應激、線粒體功能障礙及細胞衰老的侵害[61]。Solanki等[62]將包裹HN衍生物AGA-HNG的納米顆粒導入ARPE-19細胞中，其顯著降低細胞毒性并表現出良好的生物相容性。Elovanoids（ELV）是一種生物活性化學信使，在RPE細胞中合成，可以保護光感受器抵御氧化應激的損傷[63]。Do等[64]使用Aβ誘導小鼠RPE細胞的衰老，給予ELV抑制Aβ誘導與炎癥、AMD等相關基因的表達，抑制Aβ誘導的衰老程序保護RPE細胞和光感受器細胞。這提示ELV有可能通過抑制Aβ機制治療AMD。
6 小結和展望
視網膜細胞，特別是RPE細胞的變性和微環境改變是AMD主要的病理特征，衰老與AMD的發生和發展關系密切。衰老RPE細胞中EV的生成與釋放及SASP的自分泌與旁分泌作用導致AMD的進展，這可能成為未來研究AMD治療的方向。氧化應激是AMD發病的一個重要因素，多項研究證實抗氧化劑在年齡相關性疾病中的治療潛力，但在AMD中的有效性與安全性仍待進一步探索。cGAS-STING是早期AMD發生和發展的重要信號通路，為AMD更深入的研究提供了方向。脂褐素、Aβ、MAC復合物等相關的發病機制已成為研究熱點。目前已應用于臨床的衰老細胞裂解法在治療AMD方面表現出巨大潛能，隨著研究的進一步深入，許多新技術結合細胞衰老可為AMD的治療提供新的切入點，如基因編輯技術、干細胞治療等。深入研究細胞衰老在AMD發生和發展中的作用機制，有望給AMD患者帶來治愈的希望。因此，通過抗細胞衰老途徑干預AMD的治療具有重要意義，關于衰老與AMD的機制有待進一步的研究與探索。
年齡相關性黃斑變性（AMD）是一種復雜的視網膜退行性疾病，是引起全球50歲以上人群中心視力損害的主要原因。全球AMD患者數量將從2020年的1.96億上升至2040年的2.88億[1]。中國大約3千萬AMD患者，AMD是我國主要的不可逆性致盲性疾病。AMD分為萎縮型和滲出型AMD，分別表現為“地圖樣”萎縮和脈絡膜新生血管，約10%～15%的萎縮型AMD發展成滲出型AMD[2]。目前AMD的發病機制尚不完全明確，盡管抗血管內皮生長因子（VEGF）藥物在濕性AMD治療上取得了重大進展，但大多數患者多年后病情仍進行性加重。另外，由于缺乏退行性病變的有效治療手段，部分AMD患者最終會導致嚴重的視力損害或失明。細胞衰老與AMD發生和發展關系密切，各種視網膜和脈絡膜組織細胞的衰老變化，如視網膜色素上皮（RPE）細胞、小膠質細胞、神經元和微血管內皮細胞等，及先天性和適應性免疫細胞的衰老可通過多種途徑參與AMD發生和發展[3]。細胞衰老是有絲分裂和有絲分裂后細胞對有害刺激的適應性過程，通過分泌衰老相關分泌表型（SASP），包括促炎因子、生長因子、趨化因子和蛋白酶類等，介導細胞慢性炎癥及鄰近細胞的衰老特異性微環境，而靶向干預SASP抗衰老治療也是目前的研究熱點[4]。現就細胞衰老和SASP在AMD發病和治療中的研究進展作一綜述。
1 細胞衰老和SASP
20世紀60年代，細胞衰老定義為細胞分裂不可逆轉的停止狀態，細胞復制停滯在DNA合成前期[5]。如今，細胞衰老被定義為對各種應激的反應，如端粒縮短、線粒體功能障礙、DNA損傷等，最終通過激活腫瘤抑制通路p53/p21和p16INK4A/視網膜母細胞瘤蛋白（Rb）啟動和誘導細胞衰老。細胞衰老分為三種類型：復制性衰老（RS）、發育性程序性衰老、應激誘發的過早衰老（SIPS）[6]，而暴露于不同類型的亞致死性應激，可以在較短時間內誘導SIPS。細胞衰老可以維持正常的組織穩態，包括組織修復、腫瘤抑制。其保護作用依賴于對異常分子信號迅速產生應激反應并形成衰老細胞，通過介導細胞凋亡或免疫過程及時地清除衰老細胞。然而，過度產生的病理性衰老細胞或清除機制損傷，都將導致有害的衰老細胞累積，稱為慢性衰老。
早期衰老細胞體積增大，細胞內染色質重塑，端粒功能障礙及衰老相關異染色質灶（SAHF）形成，同時細胞內線粒體氧化代謝增強，衰老相關-β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性增強，衰老標記蛋白，如p38絲裂原活化蛋白激酶（p38-MAPK）、腫瘤抑制蛋白p53、細胞周期負調控因子p21CIP1及Rb等表達水平增加[7]。同時這些衰老細胞通過p38-MAPK、核因子（NF）-κB、Notch和（或）哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路釋放大量SASP，如趨化因子、細胞因子、基質蛋白酶、生長因子和細胞外囊泡（EV），以自分泌和旁分泌的方式介導細胞炎癥及鄰近細胞的衰老特異性微環境。而晚期衰老細胞持續分泌SASP，導致細胞持續低水平的慢性炎癥。
2 AMD與細胞衰老
細胞中與年齡相關的變化，如端粒縮短、DNA損傷、活性氧（ROS）產生和代謝紊亂都是可能誘導病理性衰老的有效觸發器。慢性應激介導的衰老細胞持續積累也是AMD的主要驅動因素。研究報道，對3月齡和18月齡的OXYS大鼠模型和對照Wistar大鼠模型進行高通量RNA測序技術分析，發現衰老加速的OXYS大鼠模型中視網膜內與免疫炎癥、細胞凋亡、氧化應激等相關的基因表達水平顯著增加，并發生類似于人類AMD的病理變化[8]。
AMD患者供體眼中RPE細胞的衰老特征基因，如p16INK4A、p21CIP1、p53和骨形態發生蛋白4（BMP4）基因的表達水平增加。通過人類AMD-RPE表觀遺傳轉錄組測序，發現表觀遺傳失調介導RPE發生SIPS，SA-β-gal和p21CIP1基因表達水平升高、SASP分泌增加，并促進RPE的上皮-間充質轉化，導致其分化異常和功能受損[9]。此外，在人衰老的視網膜中，神經節細胞、水平細胞和視桿細胞等神經和光感受器細胞中均發現了與視網膜老化或AMD相關發病機制的衰老改變。López-Luppo等[10]研究發現，在老年非糖尿病供體的視網膜中，視桿細胞的衰老比視錐細胞的衰老更明顯。這說明在AMD發生和發展的過程中，視桿細胞光感受器的損傷較視錐細胞更為嚴重。研究發現，恒河猴視網膜及脈絡膜血管內皮細胞與年齡相關的SA-β-gal基因表達增加，這提示細胞衰老介導血管功能障礙也可能在AMD中起重要作用[11]。研究發現，衰老加速的OXYS大鼠模型中視網膜內與免疫反應、炎癥、細胞凋亡、氧化應激等相關的基因均出現顯著地差異性表達，并發生了類似于人類AMD的病理變化[9]。
視網膜是免疫赦免組織，有維持正常細胞形態和功能的免疫細胞網絡[11]。而衰老的視網膜不僅各層細胞受損，并伴有免疫系統的失調和衰退，主要涉及小膠質細胞形態及遷移功能改變、先天免疫細胞如中性粒細胞、單核/巨噬細胞、樹突狀細胞、自然殺傷細胞等浸潤。小膠質細胞為駐留巨噬細胞，是區域免疫監測和組織修復的第一級監護[12-13]。小膠質細胞可以被激活，根據功能的不同分為促炎的M1型和抗炎的M2型，M1和（或）M2型小膠質細胞的平衡共同維持著視網膜微環境穩態。Xu等[14]研究發現，衰老的小膠質細胞表型發生轉化，導致視網膜中小膠質細胞的分布紊亂。小膠質細胞的平衡被打破，促炎介質表達增加，從而導致視網膜持續的慢性炎癥和組織穩態降低，最終導致AMD發生和發展。Ma等[15]研究發現，小膠質細胞涉及免疫功能調節、血管生成和神經營養素信號轉導功能的基因表達隨AMD患者年齡的增長而發生改變，與AMD相關的補體因子C3和補體因子B的表達顯著上升，這表明衰老的小膠質細胞可能介導AMD補體失調。研究證實，衰老的巨噬細胞和嗜中性粒細胞的細胞活性和清除能力下降[16]。Lin等[17]研究發現，衰老的巨噬細胞通過微RNA調控基因轉錄水平，誘導老年小鼠視網膜的脂質代謝異常和慢性炎癥。衰老的免疫細胞在視網膜退行病變的炎癥和代謝途徑中有重要影響。
3 AMD與SASP
SASP可以通過自分泌和旁分泌的方式影響鄰近結構和細胞的改變，是AMD衰老進程中慢性炎癥的主要和長期來源，在AMD病理生理過程中發揮關鍵作用[18]。SASP可分為細胞因子，包括白細胞介素（IL）-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-17、腫瘤壞死因子（TNF）-α、干擾素（INF）-γ等；生長因子如VEGF、肝細胞生長因子、轉化生長因子（TGF）-β等；趨化因子配體（CCL）-20、趨化因子配體1等；基質蛋白酶（MMP）-1、MMP-9、MMP-10等。Lazzarini等[19]通過體外誘導人RPE干細胞（RPESC）復制細胞衰老過程，發現RPESC分泌IL-6、IL-17、TNF-α，TGF-β1和INF-γ表達水平較年輕細胞更高。同時，衰老細胞分泌MMP參與AMD的發生和發展[20]。目前已知介導旁分泌衰老的SASP主要包括TGF-β家族配體、VEGF、CCL-2、CCL-20等。Acosta等[21]研究發現，NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3炎癥小體介導的IL-1信號通路可以調控SASP分泌。TGFβ配體通過調控p15INK4b和p21CIP1基因通路起主要旁分泌衰老誘導作用。衰老細胞釋放的EV與SASP參與調節受體細胞的表型[22]。Wang等[23]研究發現，AMD供體的玻璃膜疣中含有自噬標志物人自噬相關蛋白5和外泌體標志物CD63，其也存在于老年小鼠的Bruch膜區域。Hitomi等[24]用DNA損傷劑阿霉素（DXR）在體外誘導人胚胎成纖維細胞永生化胚胎成纖維細胞發生SIPS，發現鞘磷脂合成酶2表達水平顯著下降，中性鞘磷脂酶2表達水平顯著上升，這證實在成纖維細胞中具有促進EV生成與釋放的主要作用。同時，用DXR處理人RPE-1細胞誘導衰老，EV表達增加。由于EV通過旁分泌方式與其微環境之間進行細胞間通訊，誘導鄰近細胞衰老[25]，該過程與經典核因子（NF）-κB信號通路有關，抑制其轉錄因子p56可能為治療AMD開辟新的研究領域[26]。
4 細胞衰老參與AMD發生和發展的相關機制
4.1 氧化應激促進細胞衰老
氧化應激在AMD發病機制中至關重要，可以在較短時間內激活SIPS，導致線粒體功能障礙和產生ROS。體外研究表明，香煙提取物可介導人RPE細胞ARPE-19氧化應激反應及促使ROS表達增加，細胞核DNA損傷，SA-β-gal活性增高，p16INK4a和p21基因表達上調，誘導細胞SIPS。過氧化氫誘導的ARPE-19細胞衰老過程中發現SASP（如IL-6、IL-8和VEGF等）表達增加[27]，經ROS清除劑處理后上述衰老標志物明顯減少。研究證實，氧化應激誘導的細胞衰老過程通過激活NF-κB/信號傳導及轉錄激活蛋白（STAT）3通路產生SASP，持續性SASP表達又可以通過正反饋調節加強局部STAT3信號，進而促進衰老過程。因此，STAT3可能是調節SASP的產生和衰老的發生和發展的關鍵調節因子。而NF-κB和STAT3抑制劑均能減輕氧化應激誘導的細胞衰老和SASP水平。此外，腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）能夠明顯抑制NF-κB/STAT3介導的SASP表達水平[28]。目前已有許多AMPK藥理激活劑被證實其具有治療代謝性、神經退行性和其他年齡相關疾病的潛力，在AMD治療中有重要的應用前景[29]。視網膜中高濃度谷胱甘肽（GSH）是RPE細胞中抗氧化劑。Sun等[30]將ARPE-19細胞進行特殊處理耗盡GSH后，SA-β-Gal表達增多，SAHF表達增加和細胞周期阻滯，SIPS被激活；同時ARPE-19細胞活力減弱，ROS增多伴脂質損傷增強。這些結果均表明氧化應激誘導的SIPS在AMD的發生和發展中起到關鍵作用。
4.2 DNA損傷應答（DDR）
DNA損傷是SIPS的基本特征，隨后激活DDR，而持續性DNA損傷病灶對于維持衰老表型和SASP分泌至關重要[7]。Lin等[31]通過體外培養AMD患者供體眼中的RPE細胞發現，細胞核DNA和線粒體DNA（mtDNA）損傷隨著萎縮性和新生血管性AMD的進展而加重，修復能力逐漸降低，線粒體異質突變增加。研究表明，AMD中的DDR可能受到損害[32]，mtDNA對損傷的敏感性增加[33]。正常情況下，mtDNA的損傷可以被修復或耐受，高度受損的mtDNA可被降解。無效的DDR導致持續的細胞核DNA和mtDNA損傷積累。Barreau等[34]在衰老過程中觀察到人視網膜細胞mtDNA堿基對缺失的積累，但在胎兒的RPE細胞中未觀察到這一現象。研究分析，AMD患者供體眼中黃斑區mtDNA損傷增加，是核DNA損傷的8倍，顯著超過年齡匹配的對照者的表達水平[35]。Kenney等[36]研究報道，AMD受試者的視網膜中具有高水平的mtDNA缺失及重排。這提示mtDNA損傷是AMD重要的發病機制之一。
4.3 環磷酸鳥苷-腺苷合成酶（cGAS）-INF刺激因子（STING）信號通路
cGAS-STING信號通路由第二信使環cGAS激活STING，從而激活兩個獨立的下游通路：激活INF調節因子3導致生成INF，激活NF-κB信號通路誘導產生SASP[37]。Wu等[38]研究發現，cGAS-STING信號通路是早期AMD發生和發展的重要信號通路，與SASP的產生有關。Zou等[39]發現，氧化應激誘導的視網膜變性小鼠視網膜中cGAS-STING信號通路激活，光感受器中受損DNA的細胞質泄漏。異染色質是一種轉錄惰性染色質，呈高度凝聚狀態。Gong等[40]研究報道，異染色質對于保護RPE細胞免受氧化損傷至關重要，通過沉默P53依賴性凋亡基因的轉錄，從而抑制凋亡信號傳導及細胞衰老。而最新研究發現破壞異染色質導致RPE細胞中cGAS-STING信號通路上各種物質表達呈劑量依賴性增加，細胞炎癥反應增強。相反，使用促進異染色質生成藥物甲氨蝶呤，可以抑制cGAS-STING信號通路，減弱RPE細胞變性和炎癥[41]。cGAS-STING通路對RPE細胞衰老至關重要，靶向該關鍵途徑有助于cGAS-STING信號通路誘導的AMD的治療。
4.4 脂褐素和N-亞視黃基-N-視黃基-乙醇胺（A2E）
脂褐素作為RPE應激損傷的主要指標，是AMD中的關鍵生物標志物。K?nig等[42]通過誘導成纖維細胞SIPS，發現在衰老細胞中線粒體自噬受損，線粒體分裂受到抑制，脂褐素形成增加。脂褐素主要的熒光團是A2E，是視黃醛代謝后在RPE細胞內沉積的產物，同時是脂褐素誘導RPE細胞DNA損傷的主要成分。Alaimo等[43]研究發現，負載A2E的細胞中，藍光誘導線粒體融合或裂變失衡，線粒體形成蛋白表達下調，線粒體碎片化，這提示A2E可能介導線粒體質量控制從而參與AMD。此外，Wang等[44]研究發現，A2E的光敏化通過端粒縮短和誘導DNA損傷及RPE細胞衰老，表明了A2E可能以端粒為靶點來靶向誘導細胞衰老，而端粒酶催化端粒亞基易位表達抑制了RPE細胞衰老。同時A2E光敏化誘導的衰老細胞能夠通過激活NF-κB信號通路分泌SASP影響視網膜微環境。因此，脂褐素及A2E在細胞衰老與AMD發生和發展中起重要作用。
4.5 β-淀粉樣蛋白（Aβ）
Aβ是玻璃膜疣的成分之一，在AMD的發生和發展中起重要作用。Cao等[45]研究發現，Aβ促進RPE細胞進入衰老狀態，促進SASP（IL-6、IL-8和MMP-9）的分泌。MMP-9導致上皮細胞通透性升高并促進緊密連接蛋白水解，導致衰老RPE細胞上皮屏障的完整性受損。注射Aβ后的小鼠視網膜出現AMD樣退行性病理改變，這提示Aβ所致的細胞衰老與AMD之間的存在潛在聯系[46]。Wu等[47]通過體內和體外實驗發現，Aβ通過P38-MAPK通路誘導小膠質細胞活化，促進SASP（IL-1β和環氧合酶2）分泌，從而介導小鼠光感受器細胞凋亡。自噬可以調節細胞內Aβ的分泌，敲低自噬相關蛋白可以抑制Aβ的清除，提示自噬可能是一種應對Aβ誘導細胞衰老的保護機制[48-49]。
4.6 膜攻擊復合物（MAC）相關的脈絡膜毛細血管（CC）變性
MAC沉積于CC，誘導細胞裂解和細胞膜孔隙增大，導致CC變性。Mullins等[50]研究發現，MAC的表達水平隨患者年齡增長和AMD病程進展顯著增加。在年輕及早期AMD患者供體中，MAC局限于Bruch膜和CC，而晚期可以在RPE層觀察到MAC的標記。年輕健康人眼睛的CC中也存在MAC。Cabrera等[11]誘導猴脈絡膜視網膜內皮細胞（EC）RS，發現與年輕的對照組相比，衰老的EC其細胞僵硬度更高，細胞骨架三磷酸鳥苷結合蛋白（Rho）活性更高，對MAC損傷的敏感性更強。抑制Rho的活性則顯著降低細胞僵硬度和MAC誘導的裂解。這說明衰老可能與MAC相關的CC變性有關，在萎縮型AMD的發病機制中發揮重要作用。
5 抗細胞衰老治療AMD的研究
抗細胞衰老治療AMD的研究主要涉及：預防衰老細胞的累積、消除衰老細胞、抑制SASP的分泌及恢復細胞自噬。目前，已經開發出選擇性靶向誘導衰老細胞凋亡的衰老細胞裂解法[51]。研究表明，抑制細胞凋亡的B淋巴細胞瘤（Bcl）-2蛋白家族在衰老細胞中高表達，而選擇性靶向Bcl-xL蛋白的抑制藥物UBX1325和UBX1967已被證明可以有效減少小鼠的衰老細胞[52]。2020年開展一項評估玻璃體腔注射UBX1325以治療AMD與糖尿病黃斑水腫患者的Ⅱ期臨床試驗，發現單次藥物注射后AMD患者視力與視網膜改善可維持18周[53]。此外靶向P53基因通路的肽也已被證明可有效消除衰老細胞[54]。Fuhrmann-Stroissnigg等[55]研究發現，阿螺旋霉素可以有效延緩小鼠與年齡相關癥狀的發作并降低p16INK4a基因的表達水平，延長了小鼠的健康壽命。目前衰老細胞裂解法已被提議作為二線藥物輔助腫瘤治療[56]，這也提示衰老細胞裂解法用于臨床治療AMD及其他年齡相關性疾病的巨大可能性。
氧化應激誘導的細胞衰老機制是治療AMD的另一個潛在靶點。研究表明，BMP4在萎縮型AMD患者的RPE細胞中表達升高[57]，亞致死性氧化應激也可促進BMP4的表達。Zhu等[58]研究證實，BMP4在氧化應激誘導的衰老中充當介質，通過p53-p21-Rb信號通路、Smad信號通路誘導RPE細胞的衰老。應用BMP4拮抗劑可阻斷該通路。BMP4或許可成為抑制氧化應激誘導和衰老相關AMD機制的潛在靶點。Salovska等[59]研究發現，過氧化還原酶6（PRDX6）是衰老RPE細胞中最重要的抗氧化蛋白，沉默PRDX6會導致衰老細胞中ROS的生成增加，對氧化應激損傷的抵抗力降低，并導致細胞活力受損。同時發現下調虹膜中PRDX6會導致細胞外基質蛋白的表達減少。這表明了PRDX6可能是抗衰老藥物靶向目標。線粒體人體肽（HN）是一種屬于線粒體基因組的24氨基酸多肽[60]，對阿爾茨海默病、亨廷頓病等神經退行性疾病有保護作用。HN可以保護RPE細胞免受氧化應激、內質網應激、線粒體功能障礙及細胞衰老的侵害[61]。Solanki等[62]將包裹HN衍生物AGA-HNG的納米顆粒導入ARPE-19細胞中，其顯著降低細胞毒性并表現出良好的生物相容性。Elovanoids（ELV）是一種生物活性化學信使，在RPE細胞中合成，可以保護光感受器抵御氧化應激的損傷[63]。Do等[64]使用Aβ誘導小鼠RPE細胞的衰老，給予ELV抑制Aβ誘導與炎癥、AMD等相關基因的表達，抑制Aβ誘導的衰老程序保護RPE細胞和光感受器細胞。這提示ELV有可能通過抑制Aβ機制治療AMD。
6 小結和展望
視網膜細胞，特別是RPE細胞的變性和微環境改變是AMD主要的病理特征，衰老與AMD的發生和發展關系密切。衰老RPE細胞中EV的生成與釋放及SASP的自分泌與旁分泌作用導致AMD的進展，這可能成為未來研究AMD治療的方向。氧化應激是AMD發病的一個重要因素，多項研究證實抗氧化劑在年齡相關性疾病中的治療潛力，但在AMD中的有效性與安全性仍待進一步探索。cGAS-STING是早期AMD發生和發展的重要信號通路，為AMD更深入的研究提供了方向。脂褐素、Aβ、MAC復合物等相關的發病機制已成為研究熱點。目前已應用于臨床的衰老細胞裂解法在治療AMD方面表現出巨大潛能，隨著研究的進一步深入，許多新技術結合細胞衰老可為AMD的治療提供新的切入點，如基因編輯技術、干細胞治療等。深入研究細胞衰老在AMD發生和發展中的作用機制，有望給AMD患者帶來治愈的希望。因此，通過抗細胞衰老途徑干預AMD的治療具有重要意義，關于衰老與AMD的機制有待進一步的研究與探索。