單細胞測序技術為解析生物組織的細胞異質性提供了強有力的技術支持，現已廣泛應用于生物醫學領域。近年來，關于眼底疾病的研究也有了較可觀的單細胞數據積累。眼底遍布豐富的血管與神經網絡，這導致眼底疾病發病機制紛繁復雜。通過單細胞測序技術能夠獲得疾病環境下某種細胞類型甚至亞型的成千上萬個基因表達情況。單細胞測序技術精準揭示了新生血管性眼病等眼底疾病的致病細胞類型及致病機制，為新型診療靶點的誕生提供了理論基礎。眼底疾病多維組學單細胞數據庫的構建將使得高質量數據能夠得到更加深入的探究，為眼科科研工作者提供分析平臺。
引用本文： 茅希穎, 殷文婕, 徐淼, 袁松濤, 劉慶淮. 單細胞轉錄組學在眼底疾病領域的研究進展. 中華眼底病雜志, 2024, 40(3): 243-246. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20230626-00283 復制
版權信息： ?四川大學華西醫院華西期刊社《中華眼底病雜志》版權所有，未經授權不得轉載、改編
自“雙脫氧終止法”快速測DNA序列的技術首次提出后，生物科學領域迎來了測序時代[1]。隨著下一代測序技術的發展，轉錄組測序技術的應用也越來越廣泛[2]。普通轉錄組測序技術對成千乃至上百萬的細胞大樣本進行分析，對大量細胞測序分析得出平均結果，反映數量占優勢的細胞數據，但該技術會掩蓋部分重要信息，忽略細胞之間或細胞亞型之間的異質性，并不利于生物多樣性的理解和研究[3]。細胞異質性是生物組織的普遍特征，相同類型的細胞受周圍微環境的影響會出現基因表達的差異[4]。為了深入理解復雜組織各種組成細胞轉錄組的表達，2009年，單細胞轉錄組測序技術首次出現，近年來更出現了爆發式的發展和普及，廣泛應用于多個生物學領域[5]。隨著單細胞轉錄組測序成本的降低，近年來已有非常可觀的數據積累，同時衍生出多個單細胞數據平臺，用于對現有的覆蓋各個領域的數據進行匯總[6]。在眼科領域，率先出現的是正常視網膜的單細胞解析，隨之是胚胎及類器官為平臺的視網膜發育單細胞測序研究[7]。近年來，對遺體捐贈的視網膜退行性病變眼球的探討開始了單細胞測序在眼底疾病領域的運用[8]。然而與其他領域相比，尚有許多眼底疾病缺少單細胞方面的研究，同時各類細胞在疾病發生和發展過程中的相互作用亟需揭示。現就單細胞轉錄組學在眼底疾病領域的研究進展作一綜述。
1 單細胞測序技術對眼底疾病研究必要性
眼底疾病通常是不可逆盲的首位病因，其患者占全部致盲眼病患者的54.7%，嚴重威脅人類的健康和生活質量，是世界衛生組織防盲行動中的重點[9]。眼底指眼球全部可見的內表面，主要包括視網膜、黃斑區、視盤、視網膜血管、脈絡膜等。眼底結構復雜，組織類型豐富，細胞種類繁多，眼底疾病的發生和發展往往涉及多種細胞類型的共同作用。由于眼底手術屬于利用光學放大設備和顯微外科器材的精細手術，因此眼底疾病的臨床樣本極其微量且十分珍貴。傳統的分析方法如免疫組織化學染色僅能對組織進行有限的切片并進行數個生物學標記物的定位檢測，其獲得的信息非常局限。蛋白質免疫印跡法、實時定量聚合酶鏈反應和酶聯免疫吸附實驗等可對病理組織進行平均化檢測，但存在空間位置信息和細胞特異性的生物學特征喪失的局限性；視網膜電圖、動物視覺分析儀通過對視覺功能檢測以推斷損傷的細胞類型，但均不能精確檢測到某種細胞類型在疾病情況下的生物學特征。此外，由于大多眼底疾病致病因素的復雜性，例如增生型糖尿病視網膜病變（PDR）、萎縮型老年性黃斑變性（AMD）等尚無理想的動物模型，從而更加依賴于臨床樣本的采集與檢測[10]。因此，充分利用眼底疾病的臨床樣本并進行深度檢測是十分必要的。
在單細胞樣品制備流程中，首先需將組織酶解成單個細胞懸液，其次利用微流控技術將單個細胞分離，分別用單細胞轉錄組測序技術進行測序，最終得到細胞特異性的基因表達譜[11]。由于眼底組織的復雜性和細胞類型的多樣性，通過單細胞測序技術能夠獲得疾病環境下某種細胞類型，甚至亞型的成千上萬個基因表達情況。其次，單細胞測序技術特別適用于眼科臨床樣本微量的組織檢測，能夠在充分利用好珍貴的臨床樣本基礎上體現樣本細胞的異質性。因此，單細胞測序技術在眼底疾病樣本中的應用存在明顯優勢。
2 單細胞測序技術在眼底疾病中的應用價值
2.1 發現新型致病細胞類型
PDR是糖尿病視網膜病變（DR）晚期疾病階段，以視網膜病理性新生血管和纖維血管增生膜形成為特征，兩者常常相伴而生，被稱為纖維血管膜（FVM）[12]。FVM的增生、收縮進一步并發玻璃體積血和牽拉性視網膜脫離，造成患者視力的嚴重受損或致盲[13]。既往認為，FVM的細胞組成與增生性玻璃體視網膜病變的視網膜前膜較為一致，包括視網膜色素上皮（RPE）細胞、膠質細胞、成纖維細胞。因此，在無合適的動物模型的前提下，FVM體外模型可借鑒RPE細胞的間質化作為發病模型[14]。多種針對RPE間質化的靶點在FVM的預防和治療效果上甚微。時至今日，FVM的治療仍然局限于手術治療，藥物研發舉步維艱。
2022年，筆者團隊通過對PDR患者的FVM進行手術剝離取樣，成功獲得首例眼底病變組織的單細胞轉錄組測序數據。數據發現，FVM細胞的基因譜包括小膠質細胞、單核細胞、成纖維細胞、內皮細胞、周細胞和樹突狀細胞。其中，構成FVM的最主要細胞類型是小膠質細胞。通過基因功能分析進一步發現，此類新型的小膠質細胞有同時促纖維化和纖維合成的雙重作用[15]。該研究首次證明免疫細胞在眼底纖維化病變中的重要作用，通過臨床證據的直接支持，糾正或規范動物/細胞模型的造模偏差，為FVM的靶向治療提供了理論基礎。
越來越多的研究表明，小膠質細胞參與DR發生和發展的多個環節，致病作用涉及血視網膜屏障的破壞、神經元凋亡等多個環節。因此，調控小膠質細胞的激活是目前DR治療的新型研究方向[16]。為了達到DR不同疾病分期的精準治療，細化小膠質細胞病理屬性的分類則是制定小膠質細胞精準干預策略的第一步；而在此研究目標的實現過程中，單細胞測序技術將成為強有力的手段。
2.2 發現經典致病細胞的新致病機制
眼底新生血管是眼底病變的一大疾病譜，包括AMD、DR、病理性近視和早產兒視網膜病變等。當新生血管侵犯脈絡膜血管、視網膜光感受器細胞層等眼底組織，患眼視功能嚴重受損。目前，玻璃體腔注射抗血管內皮生長因子（VEGF）藥物是目前臨床治療新生血管性疾病的普適方法[17-18]。但遺憾的是，抗VEGF藥物需頻繁注射，往往停止用藥后眼底新生血管復發；另外，部分患者存在耐藥性，反復用藥可能導致患者眼底萎縮性改變[19]。VEGF是內皮細胞賴以存活的細胞因子，廣譜阻斷VEGF存在潛在的血管風險。因此，特異性靶向致病性細胞是未來眼底新生血管性疾病精準治療的發展方向。
內皮細胞是視網膜/脈絡膜中的微量細胞類型，是新生血管性眼病的主要效應細胞。然而，如何在微量細胞類型中鑒別出主要致病細胞亞型，從而進行靶向治療是非常困難的。最近，科學家利用單細胞測序技術對內皮細胞致病亞型的鑒定進行嘗試。對正常小鼠脈絡膜內皮細胞和脈絡膜新生血管模型的內皮細胞進行單細胞測序分析，對脈絡膜內皮細胞進行細致的分群，包括靜脈內皮細胞、動脈內皮細胞、毛細血管內皮細胞和新生血管相關內皮細胞（CNV-EC）[20]。將CNV-EC單獨提取后行單細胞軌跡分析，首次鑒定出毛細血管后微靜脈內皮細胞向CNV-EC轉變的轉錄組動態變化過程，以及此過程中蘊藏著的代謝可塑性改變[21]。該發現提示內皮細胞的代謝調控在脈絡膜新生血管形成中抗血管生成治療的潛在價值。
研究報道，通過單細胞測序技術發現小膠質細胞中存在一簇特異性出現的小膠質細胞亞型，聚集于新生血管芽周圍。其差異基因中富集著大量與糖酵解相關的基因，如PFKFB3、PKM2基因等，其表達差異預示著異常升高的糖酵解水平。小膠質細胞中特異性敲除PFKFB3基因可顯著降低內皮細胞新生血管表型并抑制氧誘導視網膜病變（OIR）小鼠新生血管[22]。該研究進一步闡釋了代謝異質性在眼底新生血管發病中的重要性，靶向特異代謝通路將成為治療新生血管的新思路。單細胞測序對細胞類型的精準界定促進致病機制的精準化認知，筑建了治療精準化的基石。
目前，異常新生血管產生的機制研究通常局限于對某一細胞類型的病理性改變或調控，但異常血管所處的疾病微環境卻很少有研究報道。對前期OIR小鼠視網膜單細胞測序的分析，發現除了內皮細胞外，Müller細胞、星形膠質細胞、周細胞的細胞衰老特征明顯，PDR及OIR小鼠視網膜p16INK4A陽性的衰老細胞數量顯著升高[23]。靶向消除p16INK4A陽性細胞可明顯減少病理性新生血管數量，而并不影響野生型小鼠的新生血管再生；及時清除視網膜中衰老細胞來治療病理性新生血管是另一種特異性治療手段。凋亡抑制基因BCL-xL靶向的小分子抑制劑，現已作為眼底新生血管性疾病治療藥物正在進行Ⅲ期臨床試驗[23]。
研究報道，通過單細胞測序技術發現生理性血管再生過程中存在一種靶向清除衰老血管系統的生理機制即中性粒細胞胞外陷阱。中性粒細胞胞外陷阱的抑制作用可阻止衰老血管的退化和血管修復[24]。單細胞數據蘊藏著極為豐富的信息，對數據的解析呈現一種螺旋上升的過程。解析單細胞數據，需懷揣開放的思維，扎根于病理學表型，持以全局綜合的判斷以及滴水穿石的耐心，方能在看似常規的基因表達中發掘不一樣的視角。
3 小結及展望
單細胞測序技術為眼底疾病發病機制的探究提供了強有力的手段，能以前所未有的分辨率研究細胞的基因表達，觀察某種細胞甚至某種細胞亞型對疾病發生和發展的作用。然而，盡管目前單細胞測序技術在眼底疾病領域得到了迅猛的發展和廣泛的應用，絕大多數單細胞測序的研究僅限于描述性研究，而數據的深度分析、相應的深度思考以及機制驗證相對欠缺。其原因主要有以下方面：（1）單細胞差異基因分析較為籠統：研究過于依賴基因聚類分析手段以闡釋基因信息，而遺漏基因自身獨特或新型功能。（2）對視網膜稀有細胞類型測序的缺乏：絕大多數視網膜細胞為光感受器細胞，而真正具有致病功能的細胞如內皮細胞、RPE細胞、小膠質細胞等在單細胞測序中往往難以捕獲。為了深入分析組織中稀有細胞類型在疾病發展中的作用，可以利用抗原抗體結合的原理通過流式細胞術或免疫磁珠分選技術從而更多地獲得稀有細胞類型甚至其亞型的基因表達信息[25]，然而鑒定及利用特異的細胞表面標志物是該方法的瓶頸。（3）缺乏對單細胞數據的可持續性挖掘：從2009年單細胞測序方法的問世到現如今，單細胞測序技術已逐漸從技術創新轉變為家喻戶曉的研究方法，因此研究者的心態也應相應從技術運用導向轉變為研究問題導向，將單細胞測序技術作為提出研究假說的輔助手段。此外，隨著技術水平的不斷提升，根據基因表達的各個環節，包括染色質可及性分析、DNA甲基化等多維基因組學分析精度如今也能聚焦到單個細胞水平。更有趣的是，單細胞蛋白質組學、代謝組學的聯合研究模式有助于更有效地挖掘表型-基因之間的調控關系[26]；空間轉錄組學的結合還能提供空間位置信息，從而全方面解析疾病分子特征[27]。
目前，單細胞轉錄組測序技術的廣泛應用誕生了大量的包括臨床樣本和動物模型的測序數據，鑒于眼底疾病的復雜性和細胞的高度異質性，充分考慮這些難點并從信息學的視角進行深入研究是十分重要的。由于單細胞測序數據的分析對科研人員的編程能力和分析經驗的要求非常高，而交叉領域人才的培養所需要的人力、物力及時間成本巨大，各單獨數據的研究結果的可信度受到極大的限制。此外，數據的分析與實驗/臨床水平的相互佐證對于科學假說的形成缺一不可。因此，如何有效高效地利用現有的大量數據得到可靠的結論是目前亟待突破的技術難關。或許促進眼底疾病單細胞數據庫的構建是一突破口：（1）可以效仿腫瘤領域數據匯總的方法[28]，通過算法或者人工收集，在數據進行嚴格質檢的基礎上，實時收錄眼底疾病樣本的單細胞測序轉錄組數據，構成包含各個眼底疾病種類的共享的匯總網站。（2）通過將數據以細胞種類進行聚類，展示細胞標志物，以便研究者根據細胞的特征性基因和特征性生物學功能定義每一個細胞亞群。最后，通過人工、機器對數據進行整合，使數據庫能為研究者提供各種眼底疾病的各種細胞類型準確的基因表達譜資源，從而更大程度地提高數據的利用率、可信度和普適性。眼底疾病多維組學單細胞數據庫的構建將使得高質量數據能夠得到更加深入的探究，為眼科科研工作者提供分析平臺。
自“雙脫氧終止法”快速測DNA序列的技術首次提出后，生物科學領域迎來了測序時代[1]。隨著下一代測序技術的發展，轉錄組測序技術的應用也越來越廣泛[2]。普通轉錄組測序技術對成千乃至上百萬的細胞大樣本進行分析，對大量細胞測序分析得出平均結果，反映數量占優勢的細胞數據，但該技術會掩蓋部分重要信息，忽略細胞之間或細胞亞型之間的異質性，并不利于生物多樣性的理解和研究[3]。細胞異質性是生物組織的普遍特征，相同類型的細胞受周圍微環境的影響會出現基因表達的差異[4]。為了深入理解復雜組織各種組成細胞轉錄組的表達，2009年，單細胞轉錄組測序技術首次出現，近年來更出現了爆發式的發展和普及，廣泛應用于多個生物學領域[5]。隨著單細胞轉錄組測序成本的降低，近年來已有非常可觀的數據積累，同時衍生出多個單細胞數據平臺，用于對現有的覆蓋各個領域的數據進行匯總[6]。在眼科領域，率先出現的是正常視網膜的單細胞解析，隨之是胚胎及類器官為平臺的視網膜發育單細胞測序研究[7]。近年來，對遺體捐贈的視網膜退行性病變眼球的探討開始了單細胞測序在眼底疾病領域的運用[8]。然而與其他領域相比，尚有許多眼底疾病缺少單細胞方面的研究，同時各類細胞在疾病發生和發展過程中的相互作用亟需揭示。現就單細胞轉錄組學在眼底疾病領域的研究進展作一綜述。
1 單細胞測序技術對眼底疾病研究必要性
眼底疾病通常是不可逆盲的首位病因，其患者占全部致盲眼病患者的54.7%，嚴重威脅人類的健康和生活質量，是世界衛生組織防盲行動中的重點[9]。眼底指眼球全部可見的內表面，主要包括視網膜、黃斑區、視盤、視網膜血管、脈絡膜等。眼底結構復雜，組織類型豐富，細胞種類繁多，眼底疾病的發生和發展往往涉及多種細胞類型的共同作用。由于眼底手術屬于利用光學放大設備和顯微外科器材的精細手術，因此眼底疾病的臨床樣本極其微量且十分珍貴。傳統的分析方法如免疫組織化學染色僅能對組織進行有限的切片并進行數個生物學標記物的定位檢測，其獲得的信息非常局限。蛋白質免疫印跡法、實時定量聚合酶鏈反應和酶聯免疫吸附實驗等可對病理組織進行平均化檢測，但存在空間位置信息和細胞特異性的生物學特征喪失的局限性；視網膜電圖、動物視覺分析儀通過對視覺功能檢測以推斷損傷的細胞類型，但均不能精確檢測到某種細胞類型在疾病情況下的生物學特征。此外，由于大多眼底疾病致病因素的復雜性，例如增生型糖尿病視網膜病變（PDR）、萎縮型老年性黃斑變性（AMD）等尚無理想的動物模型，從而更加依賴于臨床樣本的采集與檢測[10]。因此，充分利用眼底疾病的臨床樣本并進行深度檢測是十分必要的。
在單細胞樣品制備流程中，首先需將組織酶解成單個細胞懸液，其次利用微流控技術將單個細胞分離，分別用單細胞轉錄組測序技術進行測序，最終得到細胞特異性的基因表達譜[11]。由于眼底組織的復雜性和細胞類型的多樣性，通過單細胞測序技術能夠獲得疾病環境下某種細胞類型，甚至亞型的成千上萬個基因表達情況。其次，單細胞測序技術特別適用于眼科臨床樣本微量的組織檢測，能夠在充分利用好珍貴的臨床樣本基礎上體現樣本細胞的異質性。因此，單細胞測序技術在眼底疾病樣本中的應用存在明顯優勢。
2 單細胞測序技術在眼底疾病中的應用價值
2.1 發現新型致病細胞類型
PDR是糖尿病視網膜病變（DR）晚期疾病階段，以視網膜病理性新生血管和纖維血管增生膜形成為特征，兩者常常相伴而生，被稱為纖維血管膜（FVM）[12]。FVM的增生、收縮進一步并發玻璃體積血和牽拉性視網膜脫離，造成患者視力的嚴重受損或致盲[13]。既往認為，FVM的細胞組成與增生性玻璃體視網膜病變的視網膜前膜較為一致，包括視網膜色素上皮（RPE）細胞、膠質細胞、成纖維細胞。因此，在無合適的動物模型的前提下，FVM體外模型可借鑒RPE細胞的間質化作為發病模型[14]。多種針對RPE間質化的靶點在FVM的預防和治療效果上甚微。時至今日，FVM的治療仍然局限于手術治療，藥物研發舉步維艱。
2022年，筆者團隊通過對PDR患者的FVM進行手術剝離取樣，成功獲得首例眼底病變組織的單細胞轉錄組測序數據。數據發現，FVM細胞的基因譜包括小膠質細胞、單核細胞、成纖維細胞、內皮細胞、周細胞和樹突狀細胞。其中，構成FVM的最主要細胞類型是小膠質細胞。通過基因功能分析進一步發現，此類新型的小膠質細胞有同時促纖維化和纖維合成的雙重作用[15]。該研究首次證明免疫細胞在眼底纖維化病變中的重要作用，通過臨床證據的直接支持，糾正或規范動物/細胞模型的造模偏差，為FVM的靶向治療提供了理論基礎。
越來越多的研究表明，小膠質細胞參與DR發生和發展的多個環節，致病作用涉及血視網膜屏障的破壞、神經元凋亡等多個環節。因此，調控小膠質細胞的激活是目前DR治療的新型研究方向[16]。為了達到DR不同疾病分期的精準治療，細化小膠質細胞病理屬性的分類則是制定小膠質細胞精準干預策略的第一步；而在此研究目標的實現過程中，單細胞測序技術將成為強有力的手段。
2.2 發現經典致病細胞的新致病機制
眼底新生血管是眼底病變的一大疾病譜，包括AMD、DR、病理性近視和早產兒視網膜病變等。當新生血管侵犯脈絡膜血管、視網膜光感受器細胞層等眼底組織，患眼視功能嚴重受損。目前，玻璃體腔注射抗血管內皮生長因子（VEGF）藥物是目前臨床治療新生血管性疾病的普適方法[17-18]。但遺憾的是，抗VEGF藥物需頻繁注射，往往停止用藥后眼底新生血管復發；另外，部分患者存在耐藥性，反復用藥可能導致患者眼底萎縮性改變[19]。VEGF是內皮細胞賴以存活的細胞因子，廣譜阻斷VEGF存在潛在的血管風險。因此，特異性靶向致病性細胞是未來眼底新生血管性疾病精準治療的發展方向。
內皮細胞是視網膜/脈絡膜中的微量細胞類型，是新生血管性眼病的主要效應細胞。然而，如何在微量細胞類型中鑒別出主要致病細胞亞型，從而進行靶向治療是非常困難的。最近，科學家利用單細胞測序技術對內皮細胞致病亞型的鑒定進行嘗試。對正常小鼠脈絡膜內皮細胞和脈絡膜新生血管模型的內皮細胞進行單細胞測序分析，對脈絡膜內皮細胞進行細致的分群，包括靜脈內皮細胞、動脈內皮細胞、毛細血管內皮細胞和新生血管相關內皮細胞（CNV-EC）[20]。將CNV-EC單獨提取后行單細胞軌跡分析，首次鑒定出毛細血管后微靜脈內皮細胞向CNV-EC轉變的轉錄組動態變化過程，以及此過程中蘊藏著的代謝可塑性改變[21]。該發現提示內皮細胞的代謝調控在脈絡膜新生血管形成中抗血管生成治療的潛在價值。
研究報道，通過單細胞測序技術發現小膠質細胞中存在一簇特異性出現的小膠質細胞亞型，聚集于新生血管芽周圍。其差異基因中富集著大量與糖酵解相關的基因，如PFKFB3、PKM2基因等，其表達差異預示著異常升高的糖酵解水平。小膠質細胞中特異性敲除PFKFB3基因可顯著降低內皮細胞新生血管表型并抑制氧誘導視網膜病變（OIR）小鼠新生血管[22]。該研究進一步闡釋了代謝異質性在眼底新生血管發病中的重要性，靶向特異代謝通路將成為治療新生血管的新思路。單細胞測序對細胞類型的精準界定促進致病機制的精準化認知，筑建了治療精準化的基石。
目前，異常新生血管產生的機制研究通常局限于對某一細胞類型的病理性改變或調控，但異常血管所處的疾病微環境卻很少有研究報道。對前期OIR小鼠視網膜單細胞測序的分析，發現除了內皮細胞外，Müller細胞、星形膠質細胞、周細胞的細胞衰老特征明顯，PDR及OIR小鼠視網膜p16INK4A陽性的衰老細胞數量顯著升高[23]。靶向消除p16INK4A陽性細胞可明顯減少病理性新生血管數量，而并不影響野生型小鼠的新生血管再生；及時清除視網膜中衰老細胞來治療病理性新生血管是另一種特異性治療手段。凋亡抑制基因BCL-xL靶向的小分子抑制劑，現已作為眼底新生血管性疾病治療藥物正在進行Ⅲ期臨床試驗[23]。
研究報道，通過單細胞測序技術發現生理性血管再生過程中存在一種靶向清除衰老血管系統的生理機制即中性粒細胞胞外陷阱。中性粒細胞胞外陷阱的抑制作用可阻止衰老血管的退化和血管修復[24]。單細胞數據蘊藏著極為豐富的信息，對數據的解析呈現一種螺旋上升的過程。解析單細胞數據，需懷揣開放的思維，扎根于病理學表型，持以全局綜合的判斷以及滴水穿石的耐心，方能在看似常規的基因表達中發掘不一樣的視角。
3 小結及展望
單細胞測序技術為眼底疾病發病機制的探究提供了強有力的手段，能以前所未有的分辨率研究細胞的基因表達，觀察某種細胞甚至某種細胞亞型對疾病發生和發展的作用。然而，盡管目前單細胞測序技術在眼底疾病領域得到了迅猛的發展和廣泛的應用，絕大多數單細胞測序的研究僅限于描述性研究，而數據的深度分析、相應的深度思考以及機制驗證相對欠缺。其原因主要有以下方面：（1）單細胞差異基因分析較為籠統：研究過于依賴基因聚類分析手段以闡釋基因信息，而遺漏基因自身獨特或新型功能。（2）對視網膜稀有細胞類型測序的缺乏：絕大多數視網膜細胞為光感受器細胞，而真正具有致病功能的細胞如內皮細胞、RPE細胞、小膠質細胞等在單細胞測序中往往難以捕獲。為了深入分析組織中稀有細胞類型在疾病發展中的作用，可以利用抗原抗體結合的原理通過流式細胞術或免疫磁珠分選技術從而更多地獲得稀有細胞類型甚至其亞型的基因表達信息[25]，然而鑒定及利用特異的細胞表面標志物是該方法的瓶頸。（3）缺乏對單細胞數據的可持續性挖掘：從2009年單細胞測序方法的問世到現如今，單細胞測序技術已逐漸從技術創新轉變為家喻戶曉的研究方法，因此研究者的心態也應相應從技術運用導向轉變為研究問題導向，將單細胞測序技術作為提出研究假說的輔助手段。此外，隨著技術水平的不斷提升，根據基因表達的各個環節，包括染色質可及性分析、DNA甲基化等多維基因組學分析精度如今也能聚焦到單個細胞水平。更有趣的是，單細胞蛋白質組學、代謝組學的聯合研究模式有助于更有效地挖掘表型-基因之間的調控關系[26]；空間轉錄組學的結合還能提供空間位置信息，從而全方面解析疾病分子特征[27]。
目前，單細胞轉錄組測序技術的廣泛應用誕生了大量的包括臨床樣本和動物模型的測序數據，鑒于眼底疾病的復雜性和細胞的高度異質性，充分考慮這些難點并從信息學的視角進行深入研究是十分重要的。由于單細胞測序數據的分析對科研人員的編程能力和分析經驗的要求非常高，而交叉領域人才的培養所需要的人力、物力及時間成本巨大，各單獨數據的研究結果的可信度受到極大的限制。此外，數據的分析與實驗/臨床水平的相互佐證對于科學假說的形成缺一不可。因此，如何有效高效地利用現有的大量數據得到可靠的結論是目前亟待突破的技術難關。或許促進眼底疾病單細胞數據庫的構建是一突破口：（1）可以效仿腫瘤領域數據匯總的方法[28]，通過算法或者人工收集，在數據進行嚴格質檢的基礎上，實時收錄眼底疾病樣本的單細胞測序轉錄組數據，構成包含各個眼底疾病種類的共享的匯總網站。（2）通過將數據以細胞種類進行聚類，展示細胞標志物，以便研究者根據細胞的特征性基因和特征性生物學功能定義每一個細胞亞群。最后，通過人工、機器對數據進行整合，使數據庫能為研究者提供各種眼底疾病的各種細胞類型準確的基因表達譜資源，從而更大程度地提高數據的利用率、可信度和普適性。眼底疾病多維組學單細胞數據庫的構建將使得高質量數據能夠得到更加深入的探究，為眼科科研工作者提供分析平臺。