引用本文： 姚雨佳, 李佳駿, 王蘇豫, 李柯然. G蛋白抑制性α亞單位1/3介導神經軸突導向因子-1信號轉導并調控血管生成. 中華眼底病雜志, 2024, 40(10): 781-789. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20240222-00078 復制
版權信息： ?四川大學華西醫院華西期刊社《中華眼底病雜志》版權所有，未經授權不得轉載、改編
糖尿病視網膜病變（DR）是糖尿病的重要并發癥，尤其在工作年齡段人群中是視力損害的主要原因[1]。高血糖引發的神經炎癥和微血管損傷破壞血視網膜屏障，促進病理性血管生成，是DR發展的關鍵環節[2]。軸突導向因子-1（NTN1）是一種在神經發育中促進軸突生長的蛋白，也被發現參與內皮細胞活化和血管生成，具有濃度依賴性的雙相效應。低濃度的NTN1可激活內皮細胞，促進血管生成，但具體機制尚不完全清楚[3-5]。G蛋白抑制性α亞單位（Gαi1/Gαi3）在多種生長因子信號轉導中發揮作用，通過活化蛋白激酶B（Akt）-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和細胞外信號調節激酶（Erk）-絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等通路，影響細胞增殖和遷移[6-11]。Gαi1/Gαi3介導的血管內皮生長因子（VEGF）信號通路對視網膜血管新生至關重要，提示其在病理性血管生成中作為潛在治療靶點的重要性[11-12]。本研究旨在探索Gαi1/Gαi3在NTN1信號轉導和血管生成中的作用及其分子機制，通過建立糖尿病小鼠模型，深入了解血管生成的分子基礎，以期為DR的早期干預和治療策略提供新的理論依據和潛在靶標。
1 材料和方法
1.1 實驗動物及主要材料、儀器
雄性C57BL/6J小鼠55只，其中6～8周齡20只，體重20～25 g；2周齡35只，體重約10 g；均為無特定病原體級，由南京君科生物工程有限公司提供。所有小鼠飼養于標準（12 h明/暗循環）清潔級環境中。飼養環境及實驗操作均符合國家科學技術委員會《實驗動物管理條例》規定，并獲得南京醫科大學實驗動物倫理委員會許可[許可證號：SYXK（蘇）2018-0020]。
人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）細胞株由本實驗室自行保存。攜綠色熒光蛋白（GFP）Gαi1/Gαi3 shRNA重組腺相關病毒（AAV5）載體（AAV5-TIE1-Gαi1/Gαi3 shRNA）、僅攜帶GFP的空白AAV5載體、Gαi1/Gαi3 shRNA重組慢病毒、僅攜帶GFP的空白慢病毒（上海吉凱基因醫學科技股份有限公司）。無水葡萄糖（德國Biofroxx公司）；內皮細胞培養基（ECM培養基）（美國Sciencell公司）；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、嘌呤霉素、辣根過氧化物酶（HRP）二抗（上海碧云天生物技術有限公司）；鏈脲佐菌素（STZ）、磷酸鹽緩沖液（PBS）（北京蘭杰柯科技有限公司）；20倍洗膜緩沖液（TBST）（北京索萊寶科技有限公司）；核糖體蛋白S6激酶（S6K）抗體、磷酸化S6K（p-S6K）抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；Erk1/2抗體、磷酸化Erk1/2（p-Erk1/2）抗體、Akt抗體、磷酸化Akt（p-Akt）抗體（杭州華安生物技術有限公司）；NTN1（美國Enzo公司）；β-肌動蛋白（actin）抗體（成都正能生物技術有限責任公司）。EdU-555細胞增殖檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；Transwell共培養板、高蛋白濃度基質膠（美國Corning公司）；同工凝集素B4（IB4）（美國Sigma公司）；細胞/組織總RNA提取試劑盒、逆轉錄預混液、通用型高靈敏度染料法定量聚合酶鏈反應（qPCR）檢測試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）；PIKOReal 96實時熒光qPCR（qRT-PCR）儀（美國Thermo公司）；倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。
1.2 實驗動物分組和糖尿病模型建立
采用隨機數字表法將20只6～8周齡小鼠分為正常對照組、糖尿病組，每組各10只。糖尿病組小鼠空腹饑餓12 h（期間可自由進水）后，按10 mg/kg劑量予以小鼠腹腔注射STZ。1周后測空腹血糖≥16.7 mmol/L為造模成功，繼續高糖、高脂飼養，期間定期監測血糖，使血糖維持在成模范圍內直至實驗結束。
將35只2周齡小鼠隨機分為正常對照組、玻璃體腔注射NTN1組（NTN1組）、視網膜內皮細胞Gαi1/Gαi3特異性敲低+玻璃體腔注射NTN1組（Gαi1/Gαi3 eKD+NTN1組），其中正常對照組、NTN1組每組各15只，Gαi1/Gαi3 eKD+NTN1組5只。NTN1組于小鼠2周齡時玻璃體腔注射50 ng/ml NTN1 2 μl。Gαi1/Gαi3 eKD+NTN1組于小鼠2周齡時玻璃體腔注射AAV5-TIE1-Gαi1/Gαi3 shRNA 2 μl，1周后玻璃體腔注射50 ng/ml NTN1 2 μl。玻璃體腔注射方式：腹腔注射氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉小鼠，散瞳后微量注射器抽取AAV5-TIE1-Gαi1/Gαi3 shRNA 2 μl于小鼠眼鼻上方角膜緣后約1 mm處垂直穿刺進入玻璃體腔，向眼球中心方向進針，將藥液緩慢注入玻璃體腔，眼內停留約30 s后拔出針頭，涂左氧氟沙星眼膏。
1.3 細胞培養、轉染分組
細胞培養。將HUVEC細胞株置于含5%胎牛血清和1%雙抗的ECM培養基中常規培養。取對數生長期細胞用于實驗。
將HUVEC分為陰性對照慢病毒組（shC組）、陰性對照慢病毒+NTN1處理組（shC+NTN1組）、Gαi1/Gαi3敲低組（shGαi1/Gαi3組）、Gαi1/Gαi3敲低+NTN1處理組（shGαi1/Gαi3+NTN1組）。shC組細胞加入空白慢病毒；shGαi1/Gαi3組細胞加入Gαi1/Gαi3 shRNA重組慢病毒誘導。轉染20 h后換為正常完全培養基，然后正常傳代，穩定細胞株通過含有嘌呤霉素的完全培養基篩選1周。shC+NTN1組細胞及shGαi1/Gαi3+NTN1組細胞在嘌呤霉素篩選后使用NTN1（50 ng/ml）預處理24 h后進行后續實驗。
1.4 IB4染色法檢測Gαi1/Gαi3敲低對NTN1誘導的視網膜新生血管的影響
正常對照組、NTN1組、Gαi1/Gαi3 eKD+NTN1組小鼠4周齡時腹腔注射氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉，將彎鑷沿顳側眶壁進入呈先垂直再平行向鼻側走形，至眼球下方夾住視神經，摘取完整眼球，置于4%多聚甲醛中固定40 min，轉移至含PBS的10 cm細胞培養皿中。用眼科剪和眼科鑷去除眼球周圍組織，沿角膜緣剪開眼球，去除眼前節，移除晶狀體和玻璃體，分離視網膜，切成4瓣。固定、通透封閉，IB4染料（1∶50）4℃孵育過夜，PBS洗滌3次，10 min/次。在每個視網膜瓣的中間區域隨機選取視野，于熒光顯微鏡下按序拍攝。
1.5 EdU實驗觀察細胞增殖能力
shC組、shC+NTN1組、shGαi1/Gαi3組、shGαi1/Gαi3+NTN1組細胞以8×104個/孔的密度接種于24孔板中，每孔加入10 μmol/L EdU工作液，于37℃孵育箱中培養2 h，固定及洗滌后，DAPI避光染色10 min，PBS洗滌3次，5 min/次。熒光顯微鏡觀察并計數。細胞核呈藍色熒光。實驗重復3次。
1.6 Transwell實驗觀察細胞的遷移能力
shC組、shC+NTN1組、shGαi1/Gαi3組、shGαi1/Gαi3+NTN1組細胞以8×104個/孔的密度接種于Transwell小室上室內，無血清培養基培養；下室加入含5%胎牛血清的ECM培養基。細胞培養板置于孵箱中培育24 h，多聚甲醛固定下室表面細胞15 min，棉簽擦去上室未向下室遷移的細胞，常規結晶紫染色3 min。光學顯微鏡下觀察拍照。每組隨機選取6～8個視野以計數小室底膜上、下室側附著的細胞，即為發生遷移的細胞數。每組各設3個復孔，重復3次。
1.7 Matrigel實驗檢測細胞管腔形成能力
將4℃高蛋白濃度基質膠40 μl緩慢加入24孔板中，于37℃孵育箱中培養30 min。shC組、shC+NTN1組、shGαi1/Gαi3組、shGαi1/Gαi3+NTN1組細胞以8×104個/孔的密度接種于24孔板中孵育，6 h后觀察管腔形成情況。計數相同視野面積下的管腔形成數量。實驗重復3次。
1.8 qPCR檢測小鼠視網膜及HUVEC中Ntn1、Gαi1、Gαi3、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Gapdh）基因的mRNA相對表達量
過量麻醉處死小鼠，摘除眼球剝離視網膜，RNA提取試劑盒提取總RNA；HUVEC傳代后鋪于6孔板，細胞匯合度為90%～100%時RNA提取試劑盒提取總RNA。反轉錄試劑逆轉錄成cDNA，按相應基因配置SYBR Green qPCR擴增反應體系進行qPCR檢測。應用Express 3.0軟件設計引物序列（表1）。置于qRT-PCR儀中進行擴增并輸出循環閾值（Ct值），以GAPDH為內參照，依照公式2-ΔΔCt計算mRNA相對表達量。
表1
引物序列
1.9 蛋白質免疫印跡法（Western blot）檢測小鼠視網膜組織及HUVEC中NTN1、Gαi1、Gαi3、Akt、p-Akt、S6K、p-S6K、Erk1/2、p-Erk1/2蛋白表達
收集各組細胞總蛋白，調整蛋白濃度。每個樣孔加入10 μl待測樣品，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳中上樣電泳；140 V恒壓50 min，400 mA轉膜40 min。5%脫脂牛奶封閉2 h，1∶1 000一抗4℃孵育過夜（β-actin作為陽性對照），TBST洗膜10 min，重復3次；加入辣根過氧化物偶聯的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min，重復3次；加入化學發光劑，暗室曝光。Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值，目的蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/內參照β-actin蛋白條帶灰度值，磷酸化蛋白相對總蛋白相對表達量=磷酸化蛋白條帶灰度值/總蛋白條帶灰度值。
1.10 統計學方法
采用SPSS20.0軟件進行統計學分析。計量數據以均數±標準差（x±s）表示。兩組間比較采用t檢驗；三組間比較采用單因素方差分析；多因素比較采用事后Dunnett檢驗。采用Graph-prism軟件對所獲得數據進行圖表整理。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 DR模型小鼠視網膜組織中Ntn1、Gαi1、Gαi3 mRNA和蛋白表達升高
與正常對照組比較，糖尿病組小鼠視網膜內Ntn1、Gαi1、Gαi3 mRNA和蛋白相對表達量顯著增加，差異有統計學意義（t=11.800、9.298、10.620、7.503、3.432、8.037，P＜0.000 1）（圖1）。
圖1
正常對照組、糖尿病組小鼠視網膜中Ntn1、Gαi1、Gαi3 mRNA及蛋白相對表達量比較（n=3） 1A示Ntn1、Gαi1、Gαi3 mRNA相對表達量，****P＜0.000 1；1B示NTN1、Gαi1、Gαi3蛋白表達電泳圖；1C示NTN1、Gαi1、Gαi3蛋白相對表達量比較，**P＜0.01，***P＜0.001 NTN1：軸突導向因子1；Gαi1：G蛋白抑制性α亞單位1；Gαi3：G蛋白抑制性α亞單位3；正常對照組：不做任何處理；糖尿病組：腹腔注射鏈脲佐菌素10 mg/kg
2.2 Gαi1/Gαi3 shRNA重組慢病毒誘導后HUVEC中 Gαi1、Gαi3 mRNA和蛋白相對表達量受到抑制
與shC組比較，shGαi1/Gαi3組HUVEC中Gαi1、Gαi3 mRNA和蛋白相對表達量顯著降低，差異有統計學意義（t=16.310、16.300、13.600、9.068，P＜0.000 1）（圖2）。
圖2
shC組、shGαi1/Gαi3組HUVEC中Gαi1、Gαi3 mRNA及蛋白相對表達量比較（n=3） 2A示Gαi1、Gαi3 mRNA相對表達量結果，****P＜0.000 1；2B示Gαi1、Gαi3蛋白表達電泳圖；2C示中Gαi1、Gαi3蛋白相對表達量，***P＜0.001, ****P<0.000 1 HUVEC：人臍靜脈內皮細胞；Gαi1：G蛋白抑制性α亞單位1；Gαi3：G蛋白抑制性α亞單位3；actin：肌動蛋白；shC組：空白慢病毒誘導；shGαi1/Gαi3組：加入Gαi1/Gαi3 shRNA重組慢病毒誘導
2.3 敲低Gαi1/Gαi3基因抑制NTN1誘導的HUVEC增殖、遷移與管腔形成能力
與shC組比較，shC+NTN1組HUVEC增殖率、遷移數量、管腔形成數量均顯著增加，shGαi1/Gαi3組、shGαi1/Gαi3+NTN1組HUVEC增殖率、遷移數量、管腔形成數量均顯著減少，差異均有統計學意義（F=62.750、49.830、54.900，P＜0.000 1）（圖3~5）。
圖3
shC組、shC+NTN1組、shGαi1/Gαi3組、shGαi1/Gαi3+NTN1組HUVEC增殖率比較（n=3） 3A～3D分別示shC組、shC+NTN1組、shGαi1/Gαi3組、shGαi1/Gαi3+NTN1組熒光顯微鏡像（DAPI染色，標尺：50 μm），與shC組比較，shC+NTN1組細胞增殖率顯著增加，shGαi1/Gαi3組、shGαi1/Gαi3+NTN1組細胞增殖率無明顯變化；3E示四組細胞增殖率比較，***P＜0.001，****P＜0.000 1 NTN1：軸突導向因子1；Gαi1：G蛋白抑制性α亞單位1；Gαi3：G蛋白抑制性α亞單位3；shC組：加入空白慢病毒誘導；shC+NTN1組：加入空白慢病毒，用50 ng/ml NTN1誘導；shGαi1/Gαi3組：加入Gαi1/Gαi3 shRNA重組慢病毒誘導；shGαi1/Gαi3+NTN1組：加入Gαi1/Gαi3 shRNA重組慢病毒，用50 ng/ml NTN1誘導；DAPI：4'，6-二脒基-2-苯基吲哚
圖4
shC組、shC+NTN1組、shGαi1/Gαi3組、shGαi1/Gαi3+NTN1組HUVEC遷移數量比較（n=3） 4A～4D分別示shC組、shC+NTN1組、shGαi1/Gαi3組、shGαi1/Gαi3+NTN1組光學顯微鏡像（結晶紫染色，標尺：50 μm），與shC組比較，shC+NTN1組細胞遷移數量顯著增加，shGαi1/Gαi3組、shGαi1/Gαi3+NTN1組細胞遷移數量無明顯變化；4E示四組細胞遷移數量比較，**P＜0.01，****P＜0.000 1 NTN1：軸突導向因子1；Gαi1：G蛋白抑制性α亞單位1；Gαi3：G蛋白抑制性α亞單位3；shC組：加入空白慢病毒誘導；shC+NTN1組：加入空白慢病毒，用50 ng/ml NTN1誘導；shGαi1/Gαi3組：加入Gαi1/Gαi3 shRNA重組慢病毒誘導；shGαi1/Gαi3+NTN1組：加入Gαi1/Gαi3 shRNA重組慢病毒，用50 ng/ml NTN1誘導
圖5
shC組、shC+NTN1組、shGαi1/Gαi3組、shGαi1/Gαi3+NTN1組HUVEC管腔形成情況比較（n=3） 5A～5D分別示shC組、shC+NTN1組、shGαi1/Gαi3組、shGαi1/Gαi3+NTN1組細胞倒置相差顯微鏡像（標尺：50 μm），與shC組比較，shC+NTN1組細胞管腔形成數量顯著增加，shGαi1/Gαi3組、shGαi1/Gαi3+NTN1組細胞管腔形成數量顯著減少；5E示四組細胞管腔形成數目比較，*P＜0.05 ，****P＜0.000 1 NTN1：軸突導向因子1；Gαi1：G蛋白抑制性α亞單位1；Gαi3：G蛋白抑制性α亞單位3；shC組：加入空白慢病毒誘導；shC+NTN1組：加入空白慢病毒，用50 ng/ml NTN1誘導；shGαi1/Gαi3組：加入Gαi1/Gαi3 shRNA重組慢病毒誘導；shGαi1/Gαi3+NTN1組：加入Gαi1/Gαi3 shRNA重組慢病毒，用50 ng/ml NTN1誘導
2.4 敲低Gαi1/Gαi3基因檢測結果抑制NTN1誘導的Gαi1、Gαi3 mRNA和蛋白表達
qPCR、Western blot檢測結果顯示，與正常對照組比較，Gαi1/Gαi3 eKD+NTN1組小鼠視網膜組織中Gαi1、Gαi3 mRNA和蛋白相對表達量顯著下降，差異有統計學意義（t=10.920、13.460、9.219、10.500，P＜0.000 1）（圖6）。
圖6
正常對照組、Gαi1/Gαi3 eKD組小鼠視網膜組織中Gαi1、Gαi3 mRNA及蛋白相對表達量比較（n=3） 6A示Gαi1、Gαi3 mRNA相對表達量；6B示Gαi1、Gαi3蛋白表達電泳圖；6C示Gαi1、Gαi3蛋白相對表達量，****P＜0.000 1 Gαi1：G蛋白抑制性α亞單位1；Gαi3：G蛋白抑制性α亞單位3；AAV：腺相關病毒；TIE1：人酪氨酸蛋白激酶受體tie-1；正常對照組：不做任何處理；Gαi1/Gαi3 eKD+NTN1組：玻璃體腔注射AAV5-TIE1-Gαi1/Gαi3，1周后玻璃體腔注射 50 ng/ml NTN1 2 μl
2.5 敲低Gαi1/Gαi3基因抑制NTN1誘導的視網膜新生血管形成
免疫熒光染色結果顯示，與正常對照組相比，NTN1組視網膜新生血管形成面積顯著增加，Gαi1/Gαi3 eKD+NTN1組視網膜新生血管形成面積顯著減小，差異有統計學意義（F=24.010，P＜0.000 1）（圖7）。
圖7
正常對照組、NTN1組、Gαi1/Gαi3 eKD+NTN1組視網膜新生血管面積比較（n=3） 7A～7C分別示正常對照組、NTN1組、Gαi1/Gαi3 eKD+NTN1組視網膜熒光顯微鏡像（IB4染色，標尺：200 μm），下圖為上圖黃框區域放大像，與正常對照組相比，NTN1組視網膜新生血管形成面積顯著增加，Gαi1/Gαi3 eKD+NTN1組視網膜新生血管形成面積顯著減小；7D示三組視網膜新生血管面積比較，*P＜0.05，**P＜0.01 NTN1：軸突導向因子1；Gαi1：G蛋白抑制性α亞單位1；Gαi3：G蛋白抑制性α亞單位3；AAV：腺相關病毒；正常對照組：不做任何處理；NTN1組：玻璃體腔注射2 μl 50 ng/ml NTN1；Gαi1/Gαi3 eKD組+NTN1組：玻璃體腔注射AAV5-TIE1-Gαi1/Gαi3 shRNA 2 μl，1周后玻璃體腔注射 50 ng/ml NTN1 2 μl；IB4：同工凝集素B4
圖8
shC組、shC+NTN1組、shGαi1/Gαi3組、shGαi1/Gαi3+NTN1組HUVEC中p-Akt、Akt、p-S6K、S6K、p-Erk1/2、Erk1/2蛋白表達情況（n=3） 8A示電泳圖；8B示各組HUVEC中p-Akt相對Akt、p-S6K相對S6K、p-Erk1/2相對Erk1/2蛋白相對表達量比較，*P＜0.05，**P＜0.01，****P＜0.000 1 Akt：蛋白激酶B；p-Akt：磷酸化Akt；S6K：核糖體蛋白S6激酶；p-S6K：磷酸化S6K；Erk1/2：細胞外調節蛋白激酶；磷酸化Erk1/2；NTN1：軸突導向因子1；Gαi1：G蛋白抑制性α亞單位1；Gαi3：G蛋白抑制性α亞單位3；shC組：加入空白慢病毒誘導；shC+NTN1組：加入空白慢病毒，用50 ng/ml NTN1誘導；shGαi1/Gαi3組：加入Gαi1/Gαi3 shRNA重組慢病毒誘導；shGαi1/Gαi3+NTN1組：加入Gαi1/Gαi3 shRNA重組慢病毒，用50 ng/ml NTN1誘導
2.6 敲低Gαi1/Gαi3基因抑制NTN1誘導的HUVEC中Akt-mTOR和Erk的信號通路激活
Western blot檢測結果顯示，與shC組相比，shC+NTN1組p-Akt相對Akt、p-S6K相對S6K、p-Erk1/2相對Erk1/2蛋白相對表達量顯著增加，shGαi1/Gαi3組、shGαi1/Gαi3+NTN1組p-Akt相對Akt、p-S6K相對S6K、p-Erk1/2相對Erk1/2蛋白相對表達量顯著減少，差異有統計學意義（F=78.610、144.400、77.010，P＜0.000 1）（圖8）。
3 討論
DR作為一種典型的微血管并發癥，其發病機制涉及多種生長因子和信號通路的復雜交互。Gαi1/Gαi3介導的VEGF信號通路的活化是VEGF促視網膜血管新生的核心機制，為病理性血管新生提供了新的治療靶點。通過敲低Gαi1和Gαi3基因可顯著抑制堿燒傷誘導的小鼠角膜新生血管形成，并減少了氧誘導視網膜病變（OIR）小鼠的視網膜新生血管形成[11-12]。磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1作為催化糖異生的關鍵限速酶，通過促進Gαi3蛋白表達增加和Akt-mTOR信號通路激活，在體內外發揮促新生血管作用[13]。此外，Gαi1和Gαi3還是R-脊椎蛋白3誘導的Akt-mTOR激活和新生血管生成所需的關鍵信號蛋白[14]。
研究表明，NTN1具有雙向調節血管活性的作用。在大鼠角膜堿燒傷模型中，角膜上皮中Ntn1 mRNA的表達水平降低，抑制角膜新生血管形成[15]。NTN1也可以作為促血管生成因子，正向調控內皮細胞遷移，促進DR等血管新生相關疾病的進程[16-17]。研究報道，在OIR小鼠模型中，視網膜組織Ntn1基因表達水平顯著升高，抑制Ntn1基因表達后視網膜新生血管減少[18]。在大鼠DR模型中，靜脈注射100 ng/ml NTN1加速視網膜新生血管的形成[6]。研究報道，大鼠DR模型的視網膜組織中Ntn1 mRNA及蛋白表達均明顯增加，這提示其可能促進內皮細胞的增殖和分化，進而誘導視網膜新生血管形成[19]。NTN1在不同模型及微環境下的差異性表達和作用，反映其可能在血管生成調控中具有復雜性和多功能性。
本研究發現，12周糖尿病模型小鼠視網膜中Ntn1、Gαi1和Gαi3基因的mRNA和蛋白表達均顯著增加，這提示DR過程中持續異常分泌的NTN1蛋白在血管生成過程中的重要作用。外源性添加低濃度NTN1（50 ng/ml）蛋白刺激后，HUVEC增殖、遷移與細胞成管能力增強，小鼠視網膜新生血管增多，這與以往研究結果一致[15-16]。為了進一步明確Ntn1基因促進新生血管的具體機制，我們在HUVEC中轉染shRNA Gαi1和shRNA Gαi3沉默Gαi1/Gαi3，隨后發現NTN1誘導的促血管生成作用被抑制，這表明Gαi1和Gαi3介導了NTN1誘導的體內外促血管生成作用。既往研究報道，NTN1誘導下游Akt-mTOR信號通路和Erk激活[20-22]。本研究證實，NTN1可以在HUVEC中誘導下游Akt-mTOR信號通路和Erk激活，而這種激活作用在Gαi1和Gαi3基因敲除后幾乎被完全抑制。據此我們推測，Gαi1和Gαi3蛋白是介導NTN1誘導的下游Akt-mTOR與Erk-MAPK信號通路激活和血管生成的信號蛋白。這進一步表明，NTN1-Gαi1/Gαi3信號轉導增加可能與DR異常血管生成有關。
在DR的進程中，NTN1可能作為一種促血管生成因子，誘導新生血管的形成。而這種作用可能與NTN1與細胞膜上特定受體，如結腸癌缺失蛋白、不協調5同系物、黑色素瘤細胞黏附分子等的結合有關，從而激活下游的信號通路[23-24]。Gαi1和Gαi3是包括VEGF受體及白細胞介素-4受體內吞和內化的關鍵蛋白，而接頭蛋白Grb2關聯結合蛋白1招募往往在Gαi1和Gαi3蛋白誘導的下游信號轉導中發揮重要作用[11, 14, 25]。這說明在DR中，Gαi1和Gαi3基因可能通過類似的機制參與NTN1誘導的血管生成過程。
DR被認為是一種微血管疾病，以選擇性視網膜周細胞丟失、基底膜增厚、毛細血管閉塞等毛細血管內皮損害、血視網膜屏障功能受損、微血管滲漏、廣泛的視網膜缺血缺氧促發VEGF等生長因子表達增加，最終導致視網膜新生血管形成。目前臨床使用的VEGF單克隆抗體在一定程度上能夠阻止血管滲漏和新生血管的形成，但由于DR病理性血管生成過程涉及其他生長因子和各種炎癥細胞因子的參與，部分患者對VEGF單克隆抗體敏感性有限且治療后易復發[26]。因此確定控制DR進展的新的治療靶點是極其重要的。本研究結果表明，NTN1-Gαi1/Gαi3信號轉導可能是DR異常血管生成的重要原因之一，這種級聯反應提示DR分子治療的新靶點。然而目前研究存在一定局限性。首先，目前結果側重于體外細胞實驗，尚無法全方位立體模擬錯綜復雜的體內環境。其次，在研究方法上，本研究僅通過敲低Gαi1和Gαi3基因以觀察其對血管生成的影響，雖揭示Gαi1和Gαi3基因在介導NTN1促血管生成效應中的作用，但對于這一信號通路更深入的分子機制、調控細節及其與其他信號通路的交互作用，并未進行深入探究。為實現以干預NTN1-Gαi1/Gαi3信號為靶點的治療方法，未來需進一步探索體內外實驗，通過基因敲低、敲除、過表達、顯性陰性突變、挽救Ntn1、Gαi1、Gαi3基因等多種方法，正負向調節NTN1、Gαi1、Gαi3蛋白表達或活化水平，探索影響其血管生成的具體機制。結合蛋白和轉錄組學技術，全面分析NTN1刺激下細胞內的基因轉錄和蛋白質表達的變化。在未來需重點關注NTN1-Gαi1/Gαi3參與血管新生調控的具體機制，為視網膜新生血管性疾病的治療提供新的思路和策略。
糖尿病視網膜病變（DR）是糖尿病的重要并發癥，尤其在工作年齡段人群中是視力損害的主要原因[1]。高血糖引發的神經炎癥和微血管損傷破壞血視網膜屏障，促進病理性血管生成，是DR發展的關鍵環節[2]。軸突導向因子-1（NTN1）是一種在神經發育中促進軸突生長的蛋白，也被發現參與內皮細胞活化和血管生成，具有濃度依賴性的雙相效應。低濃度的NTN1可激活內皮細胞，促進血管生成，但具體機制尚不完全清楚[3-5]。G蛋白抑制性α亞單位（Gαi1/Gαi3）在多種生長因子信號轉導中發揮作用，通過活化蛋白激酶B（Akt）-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和細胞外信號調節激酶（Erk）-絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等通路，影響細胞增殖和遷移[6-11]。Gαi1/Gαi3介導的血管內皮生長因子（VEGF）信號通路對視網膜血管新生至關重要，提示其在病理性血管生成中作為潛在治療靶點的重要性[11-12]。本研究旨在探索Gαi1/Gαi3在NTN1信號轉導和血管生成中的作用及其分子機制，通過建立糖尿病小鼠模型，深入了解血管生成的分子基礎，以期為DR的早期干預和治療策略提供新的理論依據和潛在靶標。
1 材料和方法
1.1 實驗動物及主要材料、儀器
雄性C57BL/6J小鼠55只，其中6～8周齡20只，體重20～25 g；2周齡35只，體重約10 g；均為無特定病原體級，由南京君科生物工程有限公司提供。所有小鼠飼養于標準（12 h明/暗循環）清潔級環境中。飼養環境及實驗操作均符合國家科學技術委員會《實驗動物管理條例》規定，并獲得南京醫科大學實驗動物倫理委員會許可[許可證號：SYXK（蘇）2018-0020]。
人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）細胞株由本實驗室自行保存。攜綠色熒光蛋白（GFP）Gαi1/Gαi3 shRNA重組腺相關病毒（AAV5）載體（AAV5-TIE1-Gαi1/Gαi3 shRNA）、僅攜帶GFP的空白AAV5載體、Gαi1/Gαi3 shRNA重組慢病毒、僅攜帶GFP的空白慢病毒（上海吉凱基因醫學科技股份有限公司）。無水葡萄糖（德國Biofroxx公司）；內皮細胞培養基（ECM培養基）（美國Sciencell公司）；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、嘌呤霉素、辣根過氧化物酶（HRP）二抗（上海碧云天生物技術有限公司）；鏈脲佐菌素（STZ）、磷酸鹽緩沖液（PBS）（北京蘭杰柯科技有限公司）；20倍洗膜緩沖液（TBST）（北京索萊寶科技有限公司）；核糖體蛋白S6激酶（S6K）抗體、磷酸化S6K（p-S6K）抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；Erk1/2抗體、磷酸化Erk1/2（p-Erk1/2）抗體、Akt抗體、磷酸化Akt（p-Akt）抗體（杭州華安生物技術有限公司）；NTN1（美國Enzo公司）；β-肌動蛋白（actin）抗體（成都正能生物技術有限責任公司）。EdU-555細胞增殖檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；Transwell共培養板、高蛋白濃度基質膠（美國Corning公司）；同工凝集素B4（IB4）（美國Sigma公司）；細胞/組織總RNA提取試劑盒、逆轉錄預混液、通用型高靈敏度染料法定量聚合酶鏈反應（qPCR）檢測試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）；PIKOReal 96實時熒光qPCR（qRT-PCR）儀（美國Thermo公司）；倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。
1.2 實驗動物分組和糖尿病模型建立
采用隨機數字表法將20只6～8周齡小鼠分為正常對照組、糖尿病組，每組各10只。糖尿病組小鼠空腹饑餓12 h（期間可自由進水）后，按10 mg/kg劑量予以小鼠腹腔注射STZ。1周后測空腹血糖≥16.7 mmol/L為造模成功，繼續高糖、高脂飼養，期間定期監測血糖，使血糖維持在成模范圍內直至實驗結束。
將35只2周齡小鼠隨機分為正常對照組、玻璃體腔注射NTN1組（NTN1組）、視網膜內皮細胞Gαi1/Gαi3特異性敲低+玻璃體腔注射NTN1組（Gαi1/Gαi3 eKD+NTN1組），其中正常對照組、NTN1組每組各15只，Gαi1/Gαi3 eKD+NTN1組5只。NTN1組于小鼠2周齡時玻璃體腔注射50 ng/ml NTN1 2 μl。Gαi1/Gαi3 eKD+NTN1組于小鼠2周齡時玻璃體腔注射AAV5-TIE1-Gαi1/Gαi3 shRNA 2 μl，1周后玻璃體腔注射50 ng/ml NTN1 2 μl。玻璃體腔注射方式：腹腔注射氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉小鼠，散瞳后微量注射器抽取AAV5-TIE1-Gαi1/Gαi3 shRNA 2 μl于小鼠眼鼻上方角膜緣后約1 mm處垂直穿刺進入玻璃體腔，向眼球中心方向進針，將藥液緩慢注入玻璃體腔，眼內停留約30 s后拔出針頭，涂左氧氟沙星眼膏。
1.3 細胞培養、轉染分組
細胞培養。將HUVEC細胞株置于含5%胎牛血清和1%雙抗的ECM培養基中常規培養。取對數生長期細胞用于實驗。
將HUVEC分為陰性對照慢病毒組（shC組）、陰性對照慢病毒+NTN1處理組（shC+NTN1組）、Gαi1/Gαi3敲低組（shGαi1/Gαi3組）、Gαi1/Gαi3敲低+NTN1處理組（shGαi1/Gαi3+NTN1組）。shC組細胞加入空白慢病毒；shGαi1/Gαi3組細胞加入Gαi1/Gαi3 shRNA重組慢病毒誘導。轉染20 h后換為正常完全培養基，然后正常傳代，穩定細胞株通過含有嘌呤霉素的完全培養基篩選1周。shC+NTN1組細胞及shGαi1/Gαi3+NTN1組細胞在嘌呤霉素篩選后使用NTN1（50 ng/ml）預處理24 h后進行后續實驗。
1.4 IB4染色法檢測Gαi1/Gαi3敲低對NTN1誘導的視網膜新生血管的影響
正常對照組、NTN1組、Gαi1/Gαi3 eKD+NTN1組小鼠4周齡時腹腔注射氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉，將彎鑷沿顳側眶壁進入呈先垂直再平行向鼻側走形，至眼球下方夾住視神經，摘取完整眼球，置于4%多聚甲醛中固定40 min，轉移至含PBS的10 cm細胞培養皿中。用眼科剪和眼科鑷去除眼球周圍組織，沿角膜緣剪開眼球，去除眼前節，移除晶狀體和玻璃體，分離視網膜，切成4瓣。固定、通透封閉，IB4染料（1∶50）4℃孵育過夜，PBS洗滌3次，10 min/次。在每個視網膜瓣的中間區域隨機選取視野，于熒光顯微鏡下按序拍攝。
1.5 EdU實驗觀察細胞增殖能力
shC組、shC+NTN1組、shGαi1/Gαi3組、shGαi1/Gαi3+NTN1組細胞以8×104個/孔的密度接種于24孔板中，每孔加入10 μmol/L EdU工作液，于37℃孵育箱中培養2 h，固定及洗滌后，DAPI避光染色10 min，PBS洗滌3次，5 min/次。熒光顯微鏡觀察并計數。細胞核呈藍色熒光。實驗重復3次。
1.6 Transwell實驗觀察細胞的遷移能力
shC組、shC+NTN1組、shGαi1/Gαi3組、shGαi1/Gαi3+NTN1組細胞以8×104個/孔的密度接種于Transwell小室上室內，無血清培養基培養；下室加入含5%胎牛血清的ECM培養基。細胞培養板置于孵箱中培育24 h，多聚甲醛固定下室表面細胞15 min，棉簽擦去上室未向下室遷移的細胞，常規結晶紫染色3 min。光學顯微鏡下觀察拍照。每組隨機選取6～8個視野以計數小室底膜上、下室側附著的細胞，即為發生遷移的細胞數。每組各設3個復孔，重復3次。
1.7 Matrigel實驗檢測細胞管腔形成能力
將4℃高蛋白濃度基質膠40 μl緩慢加入24孔板中，于37℃孵育箱中培養30 min。shC組、shC+NTN1組、shGαi1/Gαi3組、shGαi1/Gαi3+NTN1組細胞以8×104個/孔的密度接種于24孔板中孵育，6 h后觀察管腔形成情況。計數相同視野面積下的管腔形成數量。實驗重復3次。
1.8 qPCR檢測小鼠視網膜及HUVEC中Ntn1、Gαi1、Gαi3、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Gapdh）基因的mRNA相對表達量
過量麻醉處死小鼠，摘除眼球剝離視網膜，RNA提取試劑盒提取總RNA；HUVEC傳代后鋪于6孔板，細胞匯合度為90%～100%時RNA提取試劑盒提取總RNA。反轉錄試劑逆轉錄成cDNA，按相應基因配置SYBR Green qPCR擴增反應體系進行qPCR檢測。應用Express 3.0軟件設計引物序列（表1）。置于qRT-PCR儀中進行擴增并輸出循環閾值（Ct值），以GAPDH為內參照，依照公式2-ΔΔCt計算mRNA相對表達量。
表1
引物序列
1.9 蛋白質免疫印跡法（Western blot）檢測小鼠視網膜組織及HUVEC中NTN1、Gαi1、Gαi3、Akt、p-Akt、S6K、p-S6K、Erk1/2、p-Erk1/2蛋白表達
收集各組細胞總蛋白，調整蛋白濃度。每個樣孔加入10 μl待測樣品，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳中上樣電泳；140 V恒壓50 min，400 mA轉膜40 min。5%脫脂牛奶封閉2 h，1∶1 000一抗4℃孵育過夜（β-actin作為陽性對照），TBST洗膜10 min，重復3次；加入辣根過氧化物偶聯的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min，重復3次；加入化學發光劑，暗室曝光。Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值，目的蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/內參照β-actin蛋白條帶灰度值，磷酸化蛋白相對總蛋白相對表達量=磷酸化蛋白條帶灰度值/總蛋白條帶灰度值。
1.10 統計學方法
采用SPSS20.0軟件進行統計學分析。計量數據以均數±標準差（x±s）表示。兩組間比較采用t檢驗；三組間比較采用單因素方差分析；多因素比較采用事后Dunnett檢驗。采用Graph-prism軟件對所獲得數據進行圖表整理。P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 DR模型小鼠視網膜組織中Ntn1、Gαi1、Gαi3 mRNA和蛋白表達升高
與正常對照組比較，糖尿病組小鼠視網膜內Ntn1、Gαi1、Gαi3 mRNA和蛋白相對表達量顯著增加，差異有統計學意義（t=11.800、9.298、10.620、7.503、3.432、8.037，P＜0.000 1）（圖1）。
圖1
正常對照組、糖尿病組小鼠視網膜中Ntn1、Gαi1、Gαi3 mRNA及蛋白相對表達量比較（n=3） 1A示Ntn1、Gαi1、Gαi3 mRNA相對表達量，****P＜0.000 1；1B示NTN1、Gαi1、Gαi3蛋白表達電泳圖；1C示NTN1、Gαi1、Gαi3蛋白相對表達量比較，**P＜0.01，***P＜0.001 NTN1：軸突導向因子1；Gαi1：G蛋白抑制性α亞單位1；Gαi3：G蛋白抑制性α亞單位3；正常對照組：不做任何處理；糖尿病組：腹腔注射鏈脲佐菌素10 mg/kg
2.2 Gαi1/Gαi3 shRNA重組慢病毒誘導后HUVEC中 Gαi1、Gαi3 mRNA和蛋白相對表達量受到抑制
與shC組比較，shGαi1/Gαi3組HUVEC中Gαi1、Gαi3 mRNA和蛋白相對表達量顯著降低，差異有統計學意義（t=16.310、16.300、13.600、9.068，P＜0.000 1）（圖2）。
圖2
shC組、shGαi1/Gαi3組HUVEC中Gαi1、Gαi3 mRNA及蛋白相對表達量比較（n=3） 2A示Gαi1、Gαi3 mRNA相對表達量結果，****P＜0.000 1；2B示Gαi1、Gαi3蛋白表達電泳圖；2C示中Gαi1、Gαi3蛋白相對表達量，***P＜0.001, ****P<0.000 1 HUVEC：人臍靜脈內皮細胞；Gαi1：G蛋白抑制性α亞單位1；Gαi3：G蛋白抑制性α亞單位3；actin：肌動蛋白；shC組：空白慢病毒誘導；shGαi1/Gαi3組：加入Gαi1/Gαi3 shRNA重組慢病毒誘導
2.3 敲低Gαi1/Gαi3基因抑制NTN1誘導的HUVEC增殖、遷移與管腔形成能力
與shC組比較，shC+NTN1組HUVEC增殖率、遷移數量、管腔形成數量均顯著增加，shGαi1/Gαi3組、shGαi1/Gαi3+NTN1組HUVEC增殖率、遷移數量、管腔形成數量均顯著減少，差異均有統計學意義（F=62.750、49.830、54.900，P＜0.000 1）（圖3~5）。
圖3
shC組、shC+NTN1組、shGαi1/Gαi3組、shGαi1/Gαi3+NTN1組HUVEC增殖率比較（n=3） 3A～3D分別示shC組、shC+NTN1組、shGαi1/Gαi3組、shGαi1/Gαi3+NTN1組熒光顯微鏡像（DAPI染色，標尺：50 μm），與shC組比較，shC+NTN1組細胞增殖率顯著增加，shGαi1/Gαi3組、shGαi1/Gαi3+NTN1組細胞增殖率無明顯變化；3E示四組細胞增殖率比較，***P＜0.001，****P＜0.000 1 NTN1：軸突導向因子1；Gαi1：G蛋白抑制性α亞單位1；Gαi3：G蛋白抑制性α亞單位3；shC組：加入空白慢病毒誘導；shC+NTN1組：加入空白慢病毒，用50 ng/ml NTN1誘導；shGαi1/Gαi3組：加入Gαi1/Gαi3 shRNA重組慢病毒誘導；shGαi1/Gαi3+NTN1組：加入Gαi1/Gαi3 shRNA重組慢病毒，用50 ng/ml NTN1誘導；DAPI：4'，6-二脒基-2-苯基吲哚
圖4
shC組、shC+NTN1組、shGαi1/Gαi3組、shGαi1/Gαi3+NTN1組HUVEC遷移數量比較（n=3） 4A～4D分別示shC組、shC+NTN1組、shGαi1/Gαi3組、shGαi1/Gαi3+NTN1組光學顯微鏡像（結晶紫染色，標尺：50 μm），與shC組比較，shC+NTN1組細胞遷移數量顯著增加，shGαi1/Gαi3組、shGαi1/Gαi3+NTN1組細胞遷移數量無明顯變化；4E示四組細胞遷移數量比較，**P＜0.01，****P＜0.000 1 NTN1：軸突導向因子1；Gαi1：G蛋白抑制性α亞單位1；Gαi3：G蛋白抑制性α亞單位3；shC組：加入空白慢病毒誘導；shC+NTN1組：加入空白慢病毒，用50 ng/ml NTN1誘導；shGαi1/Gαi3組：加入Gαi1/Gαi3 shRNA重組慢病毒誘導；shGαi1/Gαi3+NTN1組：加入Gαi1/Gαi3 shRNA重組慢病毒，用50 ng/ml NTN1誘導
圖5
shC組、shC+NTN1組、shGαi1/Gαi3組、shGαi1/Gαi3+NTN1組HUVEC管腔形成情況比較（n=3） 5A～5D分別示shC組、shC+NTN1組、shGαi1/Gαi3組、shGαi1/Gαi3+NTN1組細胞倒置相差顯微鏡像（標尺：50 μm），與shC組比較，shC+NTN1組細胞管腔形成數量顯著增加，shGαi1/Gαi3組、shGαi1/Gαi3+NTN1組細胞管腔形成數量顯著減少；5E示四組細胞管腔形成數目比較，*P＜0.05 ，****P＜0.000 1 NTN1：軸突導向因子1；Gαi1：G蛋白抑制性α亞單位1；Gαi3：G蛋白抑制性α亞單位3；shC組：加入空白慢病毒誘導；shC+NTN1組：加入空白慢病毒，用50 ng/ml NTN1誘導；shGαi1/Gαi3組：加入Gαi1/Gαi3 shRNA重組慢病毒誘導；shGαi1/Gαi3+NTN1組：加入Gαi1/Gαi3 shRNA重組慢病毒，用50 ng/ml NTN1誘導
2.4 敲低Gαi1/Gαi3基因檢測結果抑制NTN1誘導的Gαi1、Gαi3 mRNA和蛋白表達
qPCR、Western blot檢測結果顯示，與正常對照組比較，Gαi1/Gαi3 eKD+NTN1組小鼠視網膜組織中Gαi1、Gαi3 mRNA和蛋白相對表達量顯著下降，差異有統計學意義（t=10.920、13.460、9.219、10.500，P＜0.000 1）（圖6）。
圖6
正常對照組、Gαi1/Gαi3 eKD組小鼠視網膜組織中Gαi1、Gαi3 mRNA及蛋白相對表達量比較（n=3） 6A示Gαi1、Gαi3 mRNA相對表達量；6B示Gαi1、Gαi3蛋白表達電泳圖；6C示Gαi1、Gαi3蛋白相對表達量，****P＜0.000 1 Gαi1：G蛋白抑制性α亞單位1；Gαi3：G蛋白抑制性α亞單位3；AAV：腺相關病毒；TIE1：人酪氨酸蛋白激酶受體tie-1；正常對照組：不做任何處理；Gαi1/Gαi3 eKD+NTN1組：玻璃體腔注射AAV5-TIE1-Gαi1/Gαi3，1周后玻璃體腔注射 50 ng/ml NTN1 2 μl
2.5 敲低Gαi1/Gαi3基因抑制NTN1誘導的視網膜新生血管形成
免疫熒光染色結果顯示，與正常對照組相比，NTN1組視網膜新生血管形成面積顯著增加，Gαi1/Gαi3 eKD+NTN1組視網膜新生血管形成面積顯著減小，差異有統計學意義（F=24.010，P＜0.000 1）（圖7）。
圖7
正常對照組、NTN1組、Gαi1/Gαi3 eKD+NTN1組視網膜新生血管面積比較（n=3） 7A～7C分別示正常對照組、NTN1組、Gαi1/Gαi3 eKD+NTN1組視網膜熒光顯微鏡像（IB4染色，標尺：200 μm），下圖為上圖黃框區域放大像，與正常對照組相比，NTN1組視網膜新生血管形成面積顯著增加，Gαi1/Gαi3 eKD+NTN1組視網膜新生血管形成面積顯著減小；7D示三組視網膜新生血管面積比較，*P＜0.05，**P＜0.01 NTN1：軸突導向因子1；Gαi1：G蛋白抑制性α亞單位1；Gαi3：G蛋白抑制性α亞單位3；AAV：腺相關病毒；正常對照組：不做任何處理；NTN1組：玻璃體腔注射2 μl 50 ng/ml NTN1；Gαi1/Gαi3 eKD組+NTN1組：玻璃體腔注射AAV5-TIE1-Gαi1/Gαi3 shRNA 2 μl，1周后玻璃體腔注射 50 ng/ml NTN1 2 μl；IB4：同工凝集素B4
圖8
shC組、shC+NTN1組、shGαi1/Gαi3組、shGαi1/Gαi3+NTN1組HUVEC中p-Akt、Akt、p-S6K、S6K、p-Erk1/2、Erk1/2蛋白表達情況（n=3） 8A示電泳圖；8B示各組HUVEC中p-Akt相對Akt、p-S6K相對S6K、p-Erk1/2相對Erk1/2蛋白相對表達量比較，*P＜0.05，**P＜0.01，****P＜0.000 1 Akt：蛋白激酶B；p-Akt：磷酸化Akt；S6K：核糖體蛋白S6激酶；p-S6K：磷酸化S6K；Erk1/2：細胞外調節蛋白激酶；磷酸化Erk1/2；NTN1：軸突導向因子1；Gαi1：G蛋白抑制性α亞單位1；Gαi3：G蛋白抑制性α亞單位3；shC組：加入空白慢病毒誘導；shC+NTN1組：加入空白慢病毒，用50 ng/ml NTN1誘導；shGαi1/Gαi3組：加入Gαi1/Gαi3 shRNA重組慢病毒誘導；shGαi1/Gαi3+NTN1組：加入Gαi1/Gαi3 shRNA重組慢病毒，用50 ng/ml NTN1誘導
2.6 敲低Gαi1/Gαi3基因抑制NTN1誘導的HUVEC中Akt-mTOR和Erk的信號通路激活
Western blot檢測結果顯示，與shC組相比，shC+NTN1組p-Akt相對Akt、p-S6K相對S6K、p-Erk1/2相對Erk1/2蛋白相對表達量顯著增加，shGαi1/Gαi3組、shGαi1/Gαi3+NTN1組p-Akt相對Akt、p-S6K相對S6K、p-Erk1/2相對Erk1/2蛋白相對表達量顯著減少，差異有統計學意義（F=78.610、144.400、77.010，P＜0.000 1）（圖8）。
3 討論
DR作為一種典型的微血管并發癥，其發病機制涉及多種生長因子和信號通路的復雜交互。Gαi1/Gαi3介導的VEGF信號通路的活化是VEGF促視網膜血管新生的核心機制，為病理性血管新生提供了新的治療靶點。通過敲低Gαi1和Gαi3基因可顯著抑制堿燒傷誘導的小鼠角膜新生血管形成，并減少了氧誘導視網膜病變（OIR）小鼠的視網膜新生血管形成[11-12]。磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1作為催化糖異生的關鍵限速酶，通過促進Gαi3蛋白表達增加和Akt-mTOR信號通路激活，在體內外發揮促新生血管作用[13]。此外，Gαi1和Gαi3還是R-脊椎蛋白3誘導的Akt-mTOR激活和新生血管生成所需的關鍵信號蛋白[14]。
研究表明，NTN1具有雙向調節血管活性的作用。在大鼠角膜堿燒傷模型中，角膜上皮中Ntn1 mRNA的表達水平降低，抑制角膜新生血管形成[15]。NTN1也可以作為促血管生成因子，正向調控內皮細胞遷移，促進DR等血管新生相關疾病的進程[16-17]。研究報道，在OIR小鼠模型中，視網膜組織Ntn1基因表達水平顯著升高，抑制Ntn1基因表達后視網膜新生血管減少[18]。在大鼠DR模型中，靜脈注射100 ng/ml NTN1加速視網膜新生血管的形成[6]。研究報道，大鼠DR模型的視網膜組織中Ntn1 mRNA及蛋白表達均明顯增加，這提示其可能促進內皮細胞的增殖和分化，進而誘導視網膜新生血管形成[19]。NTN1在不同模型及微環境下的差異性表達和作用，反映其可能在血管生成調控中具有復雜性和多功能性。
本研究發現，12周糖尿病模型小鼠視網膜中Ntn1、Gαi1和Gαi3基因的mRNA和蛋白表達均顯著增加，這提示DR過程中持續異常分泌的NTN1蛋白在血管生成過程中的重要作用。外源性添加低濃度NTN1（50 ng/ml）蛋白刺激后，HUVEC增殖、遷移與細胞成管能力增強，小鼠視網膜新生血管增多，這與以往研究結果一致[15-16]。為了進一步明確Ntn1基因促進新生血管的具體機制，我們在HUVEC中轉染shRNA Gαi1和shRNA Gαi3沉默Gαi1/Gαi3，隨后發現NTN1誘導的促血管生成作用被抑制，這表明Gαi1和Gαi3介導了NTN1誘導的體內外促血管生成作用。既往研究報道，NTN1誘導下游Akt-mTOR信號通路和Erk激活[20-22]。本研究證實，NTN1可以在HUVEC中誘導下游Akt-mTOR信號通路和Erk激活，而這種激活作用在Gαi1和Gαi3基因敲除后幾乎被完全抑制。據此我們推測，Gαi1和Gαi3蛋白是介導NTN1誘導的下游Akt-mTOR與Erk-MAPK信號通路激活和血管生成的信號蛋白。這進一步表明，NTN1-Gαi1/Gαi3信號轉導增加可能與DR異常血管生成有關。
在DR的進程中，NTN1可能作為一種促血管生成因子，誘導新生血管的形成。而這種作用可能與NTN1與細胞膜上特定受體，如結腸癌缺失蛋白、不協調5同系物、黑色素瘤細胞黏附分子等的結合有關，從而激活下游的信號通路[23-24]。Gαi1和Gαi3是包括VEGF受體及白細胞介素-4受體內吞和內化的關鍵蛋白，而接頭蛋白Grb2關聯結合蛋白1招募往往在Gαi1和Gαi3蛋白誘導的下游信號轉導中發揮重要作用[11, 14, 25]。這說明在DR中，Gαi1和Gαi3基因可能通過類似的機制參與NTN1誘導的血管生成過程。
DR被認為是一種微血管疾病，以選擇性視網膜周細胞丟失、基底膜增厚、毛細血管閉塞等毛細血管內皮損害、血視網膜屏障功能受損、微血管滲漏、廣泛的視網膜缺血缺氧促發VEGF等生長因子表達增加，最終導致視網膜新生血管形成。目前臨床使用的VEGF單克隆抗體在一定程度上能夠阻止血管滲漏和新生血管的形成，但由于DR病理性血管生成過程涉及其他生長因子和各種炎癥細胞因子的參與，部分患者對VEGF單克隆抗體敏感性有限且治療后易復發[26]。因此確定控制DR進展的新的治療靶點是極其重要的。本研究結果表明，NTN1-Gαi1/Gαi3信號轉導可能是DR異常血管生成的重要原因之一，這種級聯反應提示DR分子治療的新靶點。然而目前研究存在一定局限性。首先，目前結果側重于體外細胞實驗，尚無法全方位立體模擬錯綜復雜的體內環境。其次，在研究方法上，本研究僅通過敲低Gαi1和Gαi3基因以觀察其對血管生成的影響，雖揭示Gαi1和Gαi3基因在介導NTN1促血管生成效應中的作用，但對于這一信號通路更深入的分子機制、調控細節及其與其他信號通路的交互作用，并未進行深入探究。為實現以干預NTN1-Gαi1/Gαi3信號為靶點的治療方法，未來需進一步探索體內外實驗，通過基因敲低、敲除、過表達、顯性陰性突變、挽救Ntn1、Gαi1、Gαi3基因等多種方法，正負向調節NTN1、Gαi1、Gαi3蛋白表達或活化水平，探索影響其血管生成的具體機制。結合蛋白和轉錄組學技術，全面分析NTN1刺激下細胞內的基因轉錄和蛋白質表達的變化。在未來需重點關注NTN1-Gαi1/Gαi3參與血管新生調控的具體機制，為視網膜新生血管性疾病的治療提供新的思路和策略。
