引用本文： 魏熙翔, 楊暉, 尹雪, 傅征, 熊薇薇. 嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型感染與視網膜血管阻塞之間不存在因果關系：來自兩樣本孟德爾隨機化證據. 中華眼底病雜志, 2024, 40(11): 860-868. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20240530-00213 復制
版權信息： ?四川大學華西醫院華西期刊社《中華眼底病雜志》版權所有，未經授權不得轉載、改編
嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型（SARS-CoV-2）不僅影響人體呼吸系統，還可對其他多系統造成損害[1]。其中，SARS-CoV-2感染者多部位血栓形成即是血管系統損傷的顯著特征，其原因與血液高凝狀態、血小板激活及內皮功能障礙密切相關[2-3]。視網膜血管阻塞為視網膜血管性疾病，是SARS-CoV-2感染患者中觀察到的血管異常并發癥之一[4-5]。Invernizzi等[6]發現SARS-CoV-2感染患者具有與視網膜中央靜脈阻塞（CRVO）類似的凝血異常和炎癥模式。但對這些報告的結果需謹慎解讀。Rego Lorca等[7]報道的病例中，發生視網膜血管阻塞的SARS-CoV-2感染患者出現玻璃體積血且伴有高糖化血紅蛋白水平（13%），提示發生視網膜血管阻塞的首要因素可能是糖尿病視網膜病變而非SARS-CoV-2感染。此外，Walinjkar等[8]觀察發現，發生視網膜血管阻塞的SARS-CoV-2感染患者具有多囊卵巢綜合癥及砷暴露病史，而這二者均為靜脈血栓的獨立風險因素[9-10]。因此，發生視網膜血管阻塞的SARS-CoV-2感染患者中缺乏直接因SARS-CoV-2感染而引發的凝血或炎癥標志，并存在高血壓等混淆變量，其與視網膜血管阻塞間的確切因果路徑尚未明確[11-13]。孟德爾隨機化（MR）是一種統計模型，其利用與暴露因素具有強相關的遺傳變異作為工具變量（IV），能規避觀察性研究帶來的潛在混雜、反向因果等偏倚風險，在某種程度上與隨機對照研究相似，可用于評估暴露因素與結局因素之間的因果關系[14-15]。本研究采用MR分析方法，系統探索SARS-CoV-2不同感染表型與視網膜血管阻塞之間有無因果關聯。現將結果報道如下。
1 對象和方法
1.1 研究設計
MR分析中必須滿足以下3個關鍵假設：（1）有效IV與暴露密切相關；（2）IV與可能影響暴露和結果的任何混雜因素無關；（3）IV僅通過暴露影響結果[16]（圖1）。本研究涉及以下關鍵步驟：選擇與暴露相關的遺傳IV，利用各種MR方法對結果的敏感性（包括異質性以及基因的多效性）進行綜合分析。研究遵循《使用孟德爾隨機化加強流行病學觀察性研究的報告：STROBE-MR聲明》[17]。
圖1
孟德爾隨機化研究設計框架 假設1：工具變量與暴露因素相關；假設 2：工具變量不與任何混雜因素相關；假設 3：工具變量不能通過除暴露外的因素與視網膜血管阻塞相關；SNP：單核苷酸多態性
1.2 數據來源
SARS-CoV-2感染及視網膜動脈阻塞（RAO）和視網膜靜脈阻塞（RVO），包括CRVO、視網膜分支靜脈阻塞（BRVO）等視網膜血管阻塞數據均采用歐洲人群全基因組關聯研究（GWAS）的匯總統計數據。
SARS-CoV-2感染的GWAS數據源于新型冠狀病毒感染（COVID-19）宿主遺傳學計劃公布的第七版數據庫（https://www.covid19hg.org/results/r7/），包含SARS-CoV-2普通感染者、感染住院者、重癥感染者，分別為2 597 856、2 095 324、1 086 211例。
RAO、RVO數據來自FinnGen數據庫（
1.3 統計方法
IV選擇。使用R軟件從GWAS數據中選擇與SARS-CoV-2感染和視網膜血管阻塞相關的單核苷酸多態性（SNP）作為IV。選擇標準：（1）P＜5×10-8，若此條件下IV數量＜5，則條件放寬為P＜5×10-5；（2）連鎖不平衡參數（R2）＜0.001，且遺傳距離＜10 000 kb；（3）采用F統計量篩除弱效工具變量（F＜10），以防偏倚[19]。排除離群值SNP（rs10850097、 rs550057）及存在連鎖不平衡的SNP，最終納入13個與普通SARS-CoV-2感染相關的SNP、33個與SARS-CoV-2感染住院相關的SNP、26個與重癥SARS-CoV-2感染相關的SNP作為MR分析的IV。分析方式采用比值比（OR）及95%可信區間（CI）。
MR分析策略。采用逆方差加權（IVW）、隨機效應模型作為主要分析方法[20]。該方法假設所有遺傳變異的因果效應估計相等且沒有水平異質性。通過回歸分析估計每個變異體與表型之間的相關效應和標準誤差。同時使用MR-Egger、加權中位數（WM）、簡單模式和加權模式作為補充方法檢測主分析的穩健性[21-23]。只有當IVW顯示統計學意義，且MR Egger、WM、簡單模式和加權模式的效應值方向與IVW一致時，該MR研究才能得出暴露對結局具有因果影響的結論。
敏感性分析。首先，采用IVW、MR-Egger進行Cochran's Q檢驗，以評估SNP之間的異質性，P＜0.05表示存在異質性[24]。其次，采用MR多態性殘差和離群值（MR-Presso）檢測SNP離群值及多效性殘差，迭代次數設定為5 000[25]，P＜0.05表示存在異常值，將其刪除并重新進行分析。最后，通過MR-Egger截距檢驗評估水平多效性，若截距項的估計值接近于0，并且對應的P值＞0.05，則認為結果不存在顯著的水平多效性。
MR分析通過R軟件（版本4.2.1）的“TwoSampleMR”包進行[23]。
2 結果
2.1 SARS-CoV-2感染與視網膜血管阻塞的MR分析
IVW、隨機效應模型、MR-Egger、WM、加權模式分析結果顯示，SARS-CoV-2普通感染、感染住院、重癥感染均與視網膜血管阻塞無顯著關聯（P＞0.05）；簡單模式下SARS-CoV-2重癥感染與RVO存在關聯（P＜0.05）（表1；圖2，3）。
表1
SARS-CoV-2感染與視網膜血管阻塞的MR分析結果
圖2
不同SARS-CoV-2感染表型與RAO發病風險的森林圖 SARS-CoV-2：嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型；RAO：視網膜動脈阻塞；SNP：單核苷酸多態性；MR：孟德爾隨機化；OR：比值比；CI：可信區間
圖3
不同SARS-CoV-2感染表型與RVO發病風險的森林圖 SARS-CoV-2：嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型；RVO：視網膜靜脈阻塞；SNP：單核苷酸多態性；MR：孟德爾隨機化；OR：比值比；CI：可信區間
2.2 視網膜血管阻塞與SARS-CoV-2感染的MR分析
IVW、隨機效應模型、MR-Egger、WM、加權模式結果顯示，RAO、RVO與SARS-CoV-2普通感染、感染住院、重癥感染均無顯著關聯（P＞0.05）；簡單模式下RVO與SARS-CoV-2普通感染存在關聯（P＜0.05）（表2；圖4，5）。
表2
視網膜血管阻塞與SARS-CoV-2感染的MR分析結果
圖4
RAO與不同SARS-CoV-2感染表型的森林圖 RAO：視網膜動脈阻塞；SARS-CoV-2：嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型；SNP：單核苷酸多態性；MR：孟德爾隨機化；OR：比值比；CI：可信區間
圖5
RVO與不同SARS-CoV-2感染表型的森林圖 RVO：視網膜靜脈阻塞；SARS-CoV-2：嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型；SNP：單核苷酸多態性；MR：孟德爾隨機化；OR：比值比；CI：可信區間
2.3 敏感性分析
異質性檢驗：IVW、MR-Egger未觀察到不同暴露與結局存在異質性（P＞0.05）。水平多效性分析：MR-Egger無水平多效性證據（P＞0.05）；MR-Presso：未發現離群的SNP（表3，4）。
表3
SARS-CoV-2感染對視網膜血管阻塞風險的敏感性分析
表4
視網膜血管阻塞對SARS-CoV-2感染風險的敏感性分析
3 討論
本研究探討了SARS-CoV-2感染與視網膜血管阻塞之間的潛在聯系。結果顯示，SARS-CoV-2感染與視網膜血管阻塞之間不存在直接因果聯系。反向MR分析結果也表明，視網膜血管阻塞不會增加或減少SARS-CoV-2感染風險。盡管簡單模式下SARS-CoV-2重癥感染對RVO的因果影響以及RVO與SARS-CoV-2普通感染之間的關聯顯示有統計學意義，但對此結果需謹慎解讀。考慮到其他分析方法并未一致支持這一關聯，因此尚不能僅憑簡單模式結果就認為SARS-CoV-2重癥感染對RVO有因果影響以及RVO患者更容易被SARS-CoV-2感染的結論。因此，進一步的研究和驗證是必要的，以確保結論的準確性和可靠性。
目前關于SARS-CoV-2感染與RAO之間關聯性仍然存在爭議。有學者認為，兩者之間可能具有相關性[26-27]，但由于這類觀察性研究未能提供患者是否患有系統性疾病（如高血壓）的資料，因此對其結果的解釋面臨挑戰。值得關注的是，一項多中心、回顧性、非連續性病例研究針對2020年3月至2021年3月確診的RAO或CRVO并發SARS-CoV-2感染患者進行了分析，研究者排除了年齡＞50歲以及合并有高血壓、糖尿病、青光眼、肥胖、血液高凝狀態和SARS-CoV-2重癥感染等病史者。然而，受限于樣本量較小和非連續性研究設計等因素，此項研究同樣未能證實SARS-CoV-2感染是導致視網膜血管阻塞的獨立風險因素[28]。
近期的觀察性及回顧性研究致力于探索SARS-CoV-2感染與視網膜血管阻塞之間的可能聯系。然而，這些研究受限于未能充分校正糖尿病、高血壓等潛在混雜因素，并缺少研究對象的凝血與炎癥指標數據，因而難以直接證實因果關系。MR分析通過有效控制未知混雜變量，為解決此類觀察性研究所固有的因果推斷問題提供了有力工具，尤其適用于SARS-CoV-2感染這類自然暴露情況。MR分析通過評估終身暴露效應，補充了隨機臨床試驗的不足。
本研究還回顧了兩項隊列研究結果[29-30]。第一項回顧性隊列研究旨在分析COVID-19大流行期間RAO或RVO的新發病例是否有所增加。研究發現，在COVID-19大流行的早期階段，RAO和RVO的新發病例占所有新發視網膜疾病的比例有所上升，特別是CRAO、CRVO、BRAO。但隨時間推移，這些疾病的新發病例比例又恢復至與大流行前相似的水平[29]。然而，該研究存在一些偏倚，如缺乏詳盡臨床數據和基線對照，且研究在私人視網膜診所開展，可能由于COVID-19大流行期間的社會管控措施，部分視網膜血管阻塞患者傾向于選擇私人診所就診，導致該診所在大流行初期視網膜血管阻塞患者比例上升。第二項在美國進行的隊列研究則發現，在COVID-19診斷后6個月內，與診斷前比較，RVO的發生風險有所增加，但這種增加可能與大流行期間的其他因素相關，如因COVID-19大流行期間降壓藥物購買不便而出現血壓控制不佳或戶外活動減少而引起的血栓狀態。該研究納入432 515例診斷為COVID-19的患者，平均年齡40.9歲，其中女性患者占53.6%。結果顯示，在COVID-19診斷后6個月內，發生RAO、RVO分別為16、65例。由于該研究為觀察性隊列研究，缺乏隨機對照，因此無法確立因果關系。需進一步大規模流行病學研究來深入探索視網膜血管阻塞與SARS-CoV-2感染之間的關聯[30]。
盡管本研究主要分析了歐洲血統人群，并未考慮非線性關聯及部分未知混雜因素，但基于大規模GWAS數據的雙向MR分析結果強烈提示，SARS-CoV-2感染與視網膜血管阻塞之間不存在因果效應。本研究加強了SARS-CoV-2感染與視網膜血管阻塞之間無直接因果關系的論斷。未來的研究應進一步驗證這一結論，并利用MR分析探索其他可能的交互影響因素。
嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型（SARS-CoV-2）不僅影響人體呼吸系統，還可對其他多系統造成損害[1]。其中，SARS-CoV-2感染者多部位血栓形成即是血管系統損傷的顯著特征，其原因與血液高凝狀態、血小板激活及內皮功能障礙密切相關[2-3]。視網膜血管阻塞為視網膜血管性疾病，是SARS-CoV-2感染患者中觀察到的血管異常并發癥之一[4-5]。Invernizzi等[6]發現SARS-CoV-2感染患者具有與視網膜中央靜脈阻塞（CRVO）類似的凝血異常和炎癥模式。但對這些報告的結果需謹慎解讀。Rego Lorca等[7]報道的病例中，發生視網膜血管阻塞的SARS-CoV-2感染患者出現玻璃體積血且伴有高糖化血紅蛋白水平（13%），提示發生視網膜血管阻塞的首要因素可能是糖尿病視網膜病變而非SARS-CoV-2感染。此外，Walinjkar等[8]觀察發現，發生視網膜血管阻塞的SARS-CoV-2感染患者具有多囊卵巢綜合癥及砷暴露病史，而這二者均為靜脈血栓的獨立風險因素[9-10]。因此，發生視網膜血管阻塞的SARS-CoV-2感染患者中缺乏直接因SARS-CoV-2感染而引發的凝血或炎癥標志，并存在高血壓等混淆變量，其與視網膜血管阻塞間的確切因果路徑尚未明確[11-13]。孟德爾隨機化（MR）是一種統計模型，其利用與暴露因素具有強相關的遺傳變異作為工具變量（IV），能規避觀察性研究帶來的潛在混雜、反向因果等偏倚風險，在某種程度上與隨機對照研究相似，可用于評估暴露因素與結局因素之間的因果關系[14-15]。本研究采用MR分析方法，系統探索SARS-CoV-2不同感染表型與視網膜血管阻塞之間有無因果關聯。現將結果報道如下。
1 對象和方法
1.1 研究設計
MR分析中必須滿足以下3個關鍵假設：（1）有效IV與暴露密切相關；（2）IV與可能影響暴露和結果的任何混雜因素無關；（3）IV僅通過暴露影響結果[16]（圖1）。本研究涉及以下關鍵步驟：選擇與暴露相關的遺傳IV，利用各種MR方法對結果的敏感性（包括異質性以及基因的多效性）進行綜合分析。研究遵循《使用孟德爾隨機化加強流行病學觀察性研究的報告：STROBE-MR聲明》[17]。
圖1
孟德爾隨機化研究設計框架 假設1：工具變量與暴露因素相關；假設 2：工具變量不與任何混雜因素相關；假設 3：工具變量不能通過除暴露外的因素與視網膜血管阻塞相關；SNP：單核苷酸多態性
1.2 數據來源
SARS-CoV-2感染及視網膜動脈阻塞（RAO）和視網膜靜脈阻塞（RVO），包括CRVO、視網膜分支靜脈阻塞（BRVO）等視網膜血管阻塞數據均采用歐洲人群全基因組關聯研究（GWAS）的匯總統計數據。
SARS-CoV-2感染的GWAS數據源于新型冠狀病毒感染（COVID-19）宿主遺傳學計劃公布的第七版數據庫（https://www.covid19hg.org/results/r7/），包含SARS-CoV-2普通感染者、感染住院者、重癥感染者，分別為2 597 856、2 095 324、1 086 211例。
RAO、RVO數據來自FinnGen數據庫（
1.3 統計方法
IV選擇。使用R軟件從GWAS數據中選擇與SARS-CoV-2感染和視網膜血管阻塞相關的單核苷酸多態性（SNP）作為IV。選擇標準：（1）P＜5×10-8，若此條件下IV數量＜5，則條件放寬為P＜5×10-5；（2）連鎖不平衡參數（R2）＜0.001，且遺傳距離＜10 000 kb；（3）采用F統計量篩除弱效工具變量（F＜10），以防偏倚[19]。排除離群值SNP（rs10850097、 rs550057）及存在連鎖不平衡的SNP，最終納入13個與普通SARS-CoV-2感染相關的SNP、33個與SARS-CoV-2感染住院相關的SNP、26個與重癥SARS-CoV-2感染相關的SNP作為MR分析的IV。分析方式采用比值比（OR）及95%可信區間（CI）。
MR分析策略。采用逆方差加權（IVW）、隨機效應模型作為主要分析方法[20]。該方法假設所有遺傳變異的因果效應估計相等且沒有水平異質性。通過回歸分析估計每個變異體與表型之間的相關效應和標準誤差。同時使用MR-Egger、加權中位數（WM）、簡單模式和加權模式作為補充方法檢測主分析的穩健性[21-23]。只有當IVW顯示統計學意義，且MR Egger、WM、簡單模式和加權模式的效應值方向與IVW一致時，該MR研究才能得出暴露對結局具有因果影響的結論。
敏感性分析。首先，采用IVW、MR-Egger進行Cochran's Q檢驗，以評估SNP之間的異質性，P＜0.05表示存在異質性[24]。其次，采用MR多態性殘差和離群值（MR-Presso）檢測SNP離群值及多效性殘差，迭代次數設定為5 000[25]，P＜0.05表示存在異常值，將其刪除并重新進行分析。最后，通過MR-Egger截距檢驗評估水平多效性，若截距項的估計值接近于0，并且對應的P值＞0.05，則認為結果不存在顯著的水平多效性。
MR分析通過R軟件（版本4.2.1）的“TwoSampleMR”包進行[23]。
2 結果
2.1 SARS-CoV-2感染與視網膜血管阻塞的MR分析
IVW、隨機效應模型、MR-Egger、WM、加權模式分析結果顯示，SARS-CoV-2普通感染、感染住院、重癥感染均與視網膜血管阻塞無顯著關聯（P＞0.05）；簡單模式下SARS-CoV-2重癥感染與RVO存在關聯（P＜0.05）（表1；圖2，3）。
表1
SARS-CoV-2感染與視網膜血管阻塞的MR分析結果
圖2
不同SARS-CoV-2感染表型與RAO發病風險的森林圖 SARS-CoV-2：嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型；RAO：視網膜動脈阻塞；SNP：單核苷酸多態性；MR：孟德爾隨機化；OR：比值比；CI：可信區間
圖3
不同SARS-CoV-2感染表型與RVO發病風險的森林圖 SARS-CoV-2：嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型；RVO：視網膜靜脈阻塞；SNP：單核苷酸多態性；MR：孟德爾隨機化；OR：比值比；CI：可信區間
2.2 視網膜血管阻塞與SARS-CoV-2感染的MR分析
IVW、隨機效應模型、MR-Egger、WM、加權模式結果顯示，RAO、RVO與SARS-CoV-2普通感染、感染住院、重癥感染均無顯著關聯（P＞0.05）；簡單模式下RVO與SARS-CoV-2普通感染存在關聯（P＜0.05）（表2；圖4，5）。
表2
視網膜血管阻塞與SARS-CoV-2感染的MR分析結果
圖4
RAO與不同SARS-CoV-2感染表型的森林圖 RAO：視網膜動脈阻塞；SARS-CoV-2：嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型；SNP：單核苷酸多態性；MR：孟德爾隨機化；OR：比值比；CI：可信區間
圖5
RVO與不同SARS-CoV-2感染表型的森林圖 RVO：視網膜靜脈阻塞；SARS-CoV-2：嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型；SNP：單核苷酸多態性；MR：孟德爾隨機化；OR：比值比；CI：可信區間
2.3 敏感性分析
異質性檢驗：IVW、MR-Egger未觀察到不同暴露與結局存在異質性（P＞0.05）。水平多效性分析：MR-Egger無水平多效性證據（P＞0.05）；MR-Presso：未發現離群的SNP（表3，4）。
表3
SARS-CoV-2感染對視網膜血管阻塞風險的敏感性分析
表4
視網膜血管阻塞對SARS-CoV-2感染風險的敏感性分析
3 討論
本研究探討了SARS-CoV-2感染與視網膜血管阻塞之間的潛在聯系。結果顯示，SARS-CoV-2感染與視網膜血管阻塞之間不存在直接因果聯系。反向MR分析結果也表明，視網膜血管阻塞不會增加或減少SARS-CoV-2感染風險。盡管簡單模式下SARS-CoV-2重癥感染對RVO的因果影響以及RVO與SARS-CoV-2普通感染之間的關聯顯示有統計學意義，但對此結果需謹慎解讀。考慮到其他分析方法并未一致支持這一關聯，因此尚不能僅憑簡單模式結果就認為SARS-CoV-2重癥感染對RVO有因果影響以及RVO患者更容易被SARS-CoV-2感染的結論。因此，進一步的研究和驗證是必要的，以確保結論的準確性和可靠性。
目前關于SARS-CoV-2感染與RAO之間關聯性仍然存在爭議。有學者認為，兩者之間可能具有相關性[26-27]，但由于這類觀察性研究未能提供患者是否患有系統性疾病（如高血壓）的資料，因此對其結果的解釋面臨挑戰。值得關注的是，一項多中心、回顧性、非連續性病例研究針對2020年3月至2021年3月確診的RAO或CRVO并發SARS-CoV-2感染患者進行了分析，研究者排除了年齡＞50歲以及合并有高血壓、糖尿病、青光眼、肥胖、血液高凝狀態和SARS-CoV-2重癥感染等病史者。然而，受限于樣本量較小和非連續性研究設計等因素，此項研究同樣未能證實SARS-CoV-2感染是導致視網膜血管阻塞的獨立風險因素[28]。
近期的觀察性及回顧性研究致力于探索SARS-CoV-2感染與視網膜血管阻塞之間的可能聯系。然而，這些研究受限于未能充分校正糖尿病、高血壓等潛在混雜因素，并缺少研究對象的凝血與炎癥指標數據，因而難以直接證實因果關系。MR分析通過有效控制未知混雜變量，為解決此類觀察性研究所固有的因果推斷問題提供了有力工具，尤其適用于SARS-CoV-2感染這類自然暴露情況。MR分析通過評估終身暴露效應，補充了隨機臨床試驗的不足。
本研究還回顧了兩項隊列研究結果[29-30]。第一項回顧性隊列研究旨在分析COVID-19大流行期間RAO或RVO的新發病例是否有所增加。研究發現，在COVID-19大流行的早期階段，RAO和RVO的新發病例占所有新發視網膜疾病的比例有所上升，特別是CRAO、CRVO、BRAO。但隨時間推移，這些疾病的新發病例比例又恢復至與大流行前相似的水平[29]。然而，該研究存在一些偏倚，如缺乏詳盡臨床數據和基線對照，且研究在私人視網膜診所開展，可能由于COVID-19大流行期間的社會管控措施，部分視網膜血管阻塞患者傾向于選擇私人診所就診，導致該診所在大流行初期視網膜血管阻塞患者比例上升。第二項在美國進行的隊列研究則發現，在COVID-19診斷后6個月內，與診斷前比較，RVO的發生風險有所增加，但這種增加可能與大流行期間的其他因素相關，如因COVID-19大流行期間降壓藥物購買不便而出現血壓控制不佳或戶外活動減少而引起的血栓狀態。該研究納入432 515例診斷為COVID-19的患者，平均年齡40.9歲，其中女性患者占53.6%。結果顯示，在COVID-19診斷后6個月內，發生RAO、RVO分別為16、65例。由于該研究為觀察性隊列研究，缺乏隨機對照，因此無法確立因果關系。需進一步大規模流行病學研究來深入探索視網膜血管阻塞與SARS-CoV-2感染之間的關聯[30]。
盡管本研究主要分析了歐洲血統人群，并未考慮非線性關聯及部分未知混雜因素，但基于大規模GWAS數據的雙向MR分析結果強烈提示，SARS-CoV-2感染與視網膜血管阻塞之間不存在因果效應。本研究加強了SARS-CoV-2感染與視網膜血管阻塞之間無直接因果關系的論斷。未來的研究應進一步驗證這一結論，并利用MR分析探索其他可能的交互影響因素。
