軟骨淺表區缺失是引發骨關節炎的一個重要因素，探究軟骨淺表區缺損對其表面形貌及力學性能的影響非常重要。本文取成年豬膝關節軟骨，分別采用糜蛋白酶酶解處理和電摩擦筆物理去除方法，對其表面進行處理，將正常軟骨和表面處理后的軟骨分為五組：對照組（正常軟骨組）、糜蛋白酶浸泡組、糜蛋白酶擦拭組、電摩擦筆去除10%組、電摩擦筆去除20%組。使用激光光譜共聚焦顯微鏡和環境場掃描電子顯微鏡對五組樣本進行表面形貌及結構表征，并開展拉伸實驗評估每組樣本力學性能。研究表明，對照組的表面算術平均高度最小、斷裂強度最小、斷裂應變最大；電摩擦筆去除20%組的表面算術平均高度最大、斷裂強度最大、斷裂應變最小，其余三組表面算術平均高度、斷裂強度和斷裂應變值均介于上述兩組之間，其中電摩擦筆去除10%組、糜蛋白酶擦拭組、糜蛋白酶浸泡組表面算術平均高度和斷裂強度依次降低，斷裂應變依次增大。此外，課題組對不同組彈性模量展開研究，結果表明，對照組彈性模量最小，電摩擦筆去除20%組彈性模量最大。以上研究發現，軟骨淺表區的缺損改變了其表面形貌和結構，降低了其力學性能。本文研究成果或對軟骨損傷預防及缺損修復具有重要意義。
引用本文： 王雅博, 劉婕, 高麗蘭, 譚沿松, 陳瑞琦, 張春秋. 去除軟骨淺表區后對軟骨表面形貌及力學行為的影響. 生物醫學工程學雜志, 2024, 41(2): 328-334. doi: 10.7507/1001-5515.202308032 復制
版權信息： ?四川大學華西醫院華西期刊社《生物醫學工程學雜志》版權所有，未經授權不得轉載、改編
0 引言
隨著老齡化現象的加重，骨關節炎患者急劇增加。我國骨關節炎的發病率約為10%，而55歲以上人群的發病率高達80%。骨關節炎疾病的產生與軟骨的損傷直接相關。在日常生活中，由于劇烈運動或長久承載，難免會使關節軟骨出現不同程度的損傷[1]。關節軟骨在組織學上分為4個區，即淺表區（切向區）、中層區、深層區和鈣化區[2-3]。關節軟骨的淺表區損傷被認為是引發早期骨關節炎的重要原因之一[4-5]。軟骨淺表區大約占軟骨總厚度的10%～20%[6]。陳崇偉等[7]和Fujioka等[3]采用光學顯微鏡等手段對軟骨淺表區進一步研究，發現淺表區又可以分為3層，即黏液層、細膠原纖維網層和含梭形細胞的膠原纖維層。淺表區處于軟骨的表面區域，對骨關節潤滑功能至關重要[1]。淺表區缺損后，其表面形貌和摩擦系數會發生變化，生理載荷下就可能會加速軟骨損傷，促進炎癥發生。因此，有必要深入研究淺表區損傷后軟骨的表面形貌及對應的力學性能。
常規的物理方法可以去除軟骨的淺表區，但樣品制備過程中可能將軟骨損傷。學者們嘗試采用酶解法去除軟骨淺表區。Jurvelin等[8]發現淺表區不能被硫酸軟骨素酶ABC消除或完全消化。Stanescu[9]研究結果表明，淺表區對透明質酸酶和硫酸軟骨素酶ABC具有抗性，但可以被堿性蛋白酶消化。Kumar等[1]對比堿性蛋白酶、透明質酸酶和硫酸軟骨素酶ABC對軟骨淺表區的溶解效果，發現堿性蛋白酶的溶解效果最佳。基于此，本文采用糜蛋白酶（一種堿性蛋白酶）和電摩擦筆分別對軟骨表面進行處理，獲得軟骨淺表區不同損傷程度的試樣開展研究。
壓縮載荷是軟骨承受的一種主要生理載荷。Neu等[10]發現軟骨在承受壓縮載荷時，淺表區會產生平行于其表面的張力，即膠原纖維被拉伸。又由于淺表區的膠原纖維呈網狀結構[7]，纖維具有較大的剛度，并平行于軟骨表面[11-13]，因此淺表區能夠承受較高的拉伸應力[14-18]。Kempson[15]研究也發現淺表區是承受拉伸應力的關鍵區域。軟骨拉伸模量在與主要膠原纖維取向平行的方向上最大[19-21]，并且拉伸模量隨深度而減小。淺表區剛度近似為深層區剛度的5倍[22-25]。由于淺表區可直接影響軟骨表面拉伸力學性能，故本文將詳細探究軟骨淺表區不同程度損傷與其拉伸性能的關系。
本文以新鮮的豬股骨髁關節軟骨為實驗對象，通過糜蛋白酶酶解方法和電摩擦筆物理方法制備淺表區不同損傷程度的軟骨試樣，采用激光光譜共聚焦顯微鏡（KC-X1000，南京凱視邁科技有限公司，中國）和環境場掃描電子顯微鏡（Quanta FEG 250，FEI Co., 美國）表征軟骨的表面形貌，通過開展拉伸實驗測試其力學性能，以期對軟骨損傷預防及缺損修復奠定基礎。
1 材料和方法
1.1 實驗材料
實驗樣本制備流程如圖1所示。6只新鮮豬股骨由天津當地屠宰場提供。首先，使用帶鋸機（JBS-200A，上海寧乾實業有限公司，中國）從豬膝關節股骨髁處取出30 mm × 15 mm的矩形骨軟骨樣本；然后，去除軟骨下骨，得到完整全層軟骨樣本；使用醫用手術刀，制作尺寸為20 mm × 4 mm的軟骨試樣用于拉伸實驗；制作尺寸為5 mm × 5 mm的軟骨試樣用于形貌和結構表征。制樣過程中，應確保軟骨表面無劃痕，實驗前試樣均放置在磷酸鹽緩沖液中浸泡。
圖1
樣本制備流程圖
Figure1.
Diagram of sample preparation process
根據處理方式的不同，將軟骨分成以下5組：
（1）對照組：正常軟骨；
（2）糜蛋白酶浸泡組：將0.1 mg/mL的糜蛋白酶（chymotrypsin）（GlpBio Technology Inc.，美國）溶液倒入試管中，然后將用改性丙烯酸酯封住側面以及底面的軟骨樣本浸泡在糜蛋白酶溶液中12 h；12 h后將軟骨取出并用去離子水沖洗3 min；
（3）糜蛋白酶擦拭組：將裹有紗布的棉簽蘸上0.1 mg/mL的糜蛋白酶溶液，并對軟骨表面進行反復擦拭2 h，然后用去離子水在軟骨表面沖洗3 min；
（4）電摩擦筆去除10%組：制備表面光滑且平整的圓柱形蠟臺，使用α－氰基丙烯酸乙酯將蠟臺與軟骨粘連，將帶有軟骨的蠟臺放置在實驗臺上，先用電摩擦筆打磨軟骨表面，然后再用2 000目的細砂紙打磨，直至去除全層軟骨的10%；
（5）電摩擦筆去除20%組：制備表面光滑且平整的圓柱形蠟臺，使用α－氰基丙烯酸乙酯將蠟臺與軟骨粘連，將帶有軟骨的蠟臺放置在實驗臺上，先用電摩擦筆打磨軟骨表面，然后再用2 000目的細砂紙打磨，直至去除全層軟骨的20%。
1.2 實驗設備和方法
采用激光光譜共聚焦顯微鏡（KC-X1000，南京凱視邁科技有限公司，中國）表征軟骨的宏觀形貌和粗糙度。具體操作如下：將軟骨中心放在置樣臺上且坐標為（0，0，0），觀察的區域為1 000 μm × 1 000 μm，鏡頭（KC-H020，南京凱視邁科技有限公司，中國）掃描間距為5 μm，采樣頻率為1 000 Hz，掃描速度為2 500 μm/s。
采用環境場掃描電子顯微鏡（Quanta FEG 250，FEI Co., 美國）觀察關節軟骨的表面微觀形貌。具體操作如下：將軟骨樣本先放入無水乙醇中浸泡24 h，然后進行靜置脫水，脫水完成后對軟骨淺表區進行噴金，噴金完成后，鏡下觀察其表面微觀形貌。
采用拉伸試驗機（M-100，凱爾測控試驗系統（天津）有限公司，中國）開展關節軟骨的單軸拉伸實驗。試樣夾持操作如下：將α－氰基丙烯酸乙酯與軟骨兩端粘連，然后與壓敏膠帶一并放入夾具并固定，粘連兩端的距離各為5 mm。實驗流程設置如下：位移加載，加載速度為0.2 mm/s，加載至14 mm，誤差閾值為0.001 mm。
2 實驗結果
2.1 軟骨表面形貌的表征
激光光譜共聚焦顯微鏡（KC-X1000，南京凱視邁科技有限公司，中國）下軟骨表面形貌如圖2所示。正常關節軟骨的表面高度差為20 μm。糜蛋白酶浸泡和擦拭后，軟骨表面的高度差分別為75 μm和90 μm，與正常軟骨相比，其高度差明顯增加。電摩擦筆去除10%、20%后，軟骨表面高度差繼續增大，分別為140 μm和175 μm。
圖2
激光光譜共聚焦顯微鏡下的軟骨表面形貌
Figure2.
The surface morphology of cartilage under laser confocal microscopy
基于激光光譜共聚焦顯微鏡（KC-X1000，南京凱視邁科技有限公司，中國）下的軟骨表面形貌圖，按照如式(1)、式(2)所示計算，獲得了不同軟骨組表面算術平均高度和表面最大高度，結果如表1所示。
表1
不同處理方法下的膝關節軟骨表面的平面粗糙度和最大高度
Table1.
Plane roughness and maximum height of the cartilage surface of the knee under different treatments
 |
式中，Sa是軟骨表面算數平均高度，l是測量長度，y(x)是表面高度函數。
 |
式中，Sz是軟骨表面的最大高度，Sp是最大波峰高度，Sv是最大波谷深度。
由表1可知，電摩擦筆去除20%組，表面算術平均高度和表面最大高度值最大，分別為30.753 μm和187.344 μm；對照組，表面算術平均高度和表面最大高度值最小，僅為2.373 μm和23.067 μm，遠小于被處理后的結果。電摩擦筆去除10%組、糜蛋白酶擦拭組、糜蛋白酶浸泡組表面算術平均高度和表面最大高度分別為：27.35 μm和169.386 μm、16.718 μm和103.073 μm、13.395 μm和86.343 μm。即，當軟骨表面淺表區產生不同程度的損傷后，會使軟骨表面算術平均高度和最大高度增加。
2.2 軟骨表面微觀結構的分析
軟骨表面的微觀結構如圖3所示。可以發現，正常軟骨淺表區中的黏液層將軟骨表面封住，因此無法觀測到黏液層以下結構。當使用糜蛋白酶酶解軟骨表面后，黏液層被成功擦除，黏液層以下的膠原纖維網狀結構清晰可見，這與陳崇偉等[7]對軟骨淺表區的組成描述一致。
圖3
軟骨表面的微觀結構
Figure3.
The microstructure of the surface of cartilage
2.3 力學測試
分別對不同軟骨組試樣開展拉伸實驗，結果如圖4和圖5所示。由圖4可以看出，對照組，正常軟骨的單軸拉伸性能表現為非線性粘彈性特征，其斷裂應變為48.3%、斷裂強度為5.85 MPa，這與Mow等[26]研究結果一致。電摩擦去除10%軟骨組的斷裂應變為34.78%，為對照組的0.72倍，斷裂強度為6.14 MPa，是對照組的1.05倍；電摩擦去除20%軟骨組斷裂應變繼續減小，為28.98%，是對照組的0.6倍，斷裂強度為6.34 MPa，是對照組的1.08倍。
圖4
對照組、電摩擦筆去除10%組與20%組應力-應變曲線
Figure4.
Stress-strain curves of contrast group, removal 10% and 20% groups with electric friction pen
圖5
對照組、糜蛋白酶浸泡組與擦拭組應力-應變曲線
Figure5.
Stress-strain curves of contrast group, chymotrypsin immersion group and chymotrypsin wiping group
如圖5所示，經糜蛋白酶處理后，與對照組相比，軟骨的斷裂應變減小，但斷裂強度增大。對照組，斷裂應變為48.3%，斷裂強度為5.85 MPa；糜蛋白酶擦拭組，軟骨表面的斷裂應變為38.15%，是對照組的0.79倍，斷裂強度為6.02 MPa，是對照組的1.03倍；糜蛋白酶浸泡組，斷裂應變與強度分別為47.5%、5.86 MPa。因此可知，軟骨淺表區黏液層經糜蛋白酶酶解后，其拉伸性能改變。
軟骨的彈性模量是衡量其力學性能的一個重要指標，可以通過計算應力—應變曲線中直線段的斜率得到[27]。本文依據不同組軟骨的應力—應變曲線計算其彈性模量，結果如圖6所示。通過圖6可知，彈性模量最大為電摩擦筆去除20%組的軟骨（0.3 MPa），最小為對照組（0.06 MPa）。糜蛋白酶擦拭組的軟骨彈性模量（0.19 MPa）介于電摩擦筆去除10%組（0.25 MPa）與糜蛋白酶浸泡組（0.1 MPa）的彈性模量之間，高于對照組。結果說明，淺表區的損傷增大了軟骨彈性模量。
圖6
不同軟骨組彈性模量
Figure6.
Elastic modulus of each group
3 討論
關節軟骨的淺表區對于軟骨維持其完整性和功能具有重要的作用[8]。淺表區損傷是引發骨關節炎的重要原因之一[4-5]。因此本文旨在研究淺表區不同程度損傷對軟骨表面形貌及力學行為的影響。為了研究淺表區的結構，Kumar等[1]采用堿性蛋白酶酶解關節軟骨淺表區中的黏液層，從而暴露出下方的纖維狀結構。本課題中為了獲得淺表區不同損傷程度的軟骨樣本，采用糜蛋白酶酶解軟骨表面，通過表面形貌表征發現，糜蛋白酶對軟骨淺表區黏液層具有較好的溶解效果。對比糜蛋白酶浸泡和糜蛋白酶擦拭兩種表面處理方法，發現糜蛋白酶擦拭后的軟骨表面算術平均高度大于糜蛋白酶浸泡后的軟骨表面算術平均高度，說明糜蛋白酶浸泡后的軟骨，如果未經擦拭則已經消化的黏液層仍殘留在軟骨淺表區。通過觀察微觀結構發現，采用糜蛋白酶擦拭的方法能夠去除表面的黏液層，露出內部的膠原纖維網絡結構如圖3所示。
關節軟骨沿厚度方向從表面到底部分為四層，最上面的淺表區約占軟骨厚度的10%～20%。基于此，本研究使用電摩擦筆分別去除軟骨厚度的10%和20%，測量了去除后軟骨表面的粗糙度。結果發現，去除軟骨厚度10%的樣本的表面算術平均高度小于去除20%的樣本表面算術平均高度。使用電摩擦筆方法去除全層軟骨的10%后，淺表區未被完全去除，膠原纖維呈現與關節面近似平行分布；使用電摩擦筆方法去除全層軟骨的20%后，軟骨淺表區被完全去除，而且也可能去除了小部分的中層區，即暴露出中層區。曹紅等[28]指出關節軟骨的中層區，膠原纖維間隙增大且不規則，與關節面之間的成角增大。相較于淺表區的粗糙度而言，中層區的粗糙度更大，這與本文發現一致，即去除20%的軟骨表面算術平均高度大于去除10%的軟骨。
關節軟骨的單軸拉伸性能是評價關節軟骨力學生物學性能的重要指標[29]。本研究不同軟骨組應力—應變曲線的結果表明，在軟骨淺表區損傷后，軟骨的斷裂應變減小、斷裂強度增大，這主要與軟骨的結構有關。關節軟骨的結構骨架由II型膠原纖維網絡組成，其中包裹著多種蛋白多糖和其他大分子[30]。膠原纖維網絡結構使關節軟骨具有一定的強度和剛度，主要承擔關節軟骨承受的拉伸載荷，尤其是淺表區的膠原纖維結構具有很好的抗拉伸性能。當使用糜蛋白酶酶解軟骨表面時，會破壞淺表區的黏液層。黏液層存在大量的水分，黏液層被破壞會導致軟骨淺表區水分流失，膠原纖維失水導致韌性下降；因此，糜蛋白酶酶解軟骨后其斷裂應變減小，彈性模量和斷裂強度略微增大，如圖4～圖6所示。當淺表區被部分或完全去除后，即與關節面近似平行的膠原纖維結構被破壞，進而使軟骨的抗拉伸性能大大降低，即表現為軟骨的斷裂應變降低如圖4所示。沿著軟骨厚度方向，中層區的纖維與表面呈一定角度交錯分布，深層區的膠原纖維基本垂直于表面分布，且膠原纖維的直徑更粗，即中、深層區的膠原纖維具有更高的強度和剛度。所以，當從軟骨表面去除其厚度的20%后，會使軟骨的斷裂強度和彈性模量增大，如圖4～圖6所示。
以上結果表明，當軟骨淺表區出現損傷后，會使軟骨表面的潤滑性降低，增大軟骨表面的粗糙度，進而加速軟骨摩擦磨損和炎癥產生；另外，淺表區的破壞會降低軟骨的抗拉伸性能，無法緩解作用于軟骨上的載荷引起的損傷，進而加速全層軟骨的損傷。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：高麗蘭、王雅博、劉婕在實驗設計、數據分析和論文寫作中有重要貢獻；數據收集主要由王雅博完成；張春秋、高麗蘭、譚沿松、劉婕、陳瑞琦在數據分析和論文的修改中有重要貢獻。
0 引言
隨著老齡化現象的加重，骨關節炎患者急劇增加。我國骨關節炎的發病率約為10%，而55歲以上人群的發病率高達80%。骨關節炎疾病的產生與軟骨的損傷直接相關。在日常生活中，由于劇烈運動或長久承載，難免會使關節軟骨出現不同程度的損傷[1]。關節軟骨在組織學上分為4個區，即淺表區（切向區）、中層區、深層區和鈣化區[2-3]。關節軟骨的淺表區損傷被認為是引發早期骨關節炎的重要原因之一[4-5]。軟骨淺表區大約占軟骨總厚度的10%～20%[6]。陳崇偉等[7]和Fujioka等[3]采用光學顯微鏡等手段對軟骨淺表區進一步研究，發現淺表區又可以分為3層，即黏液層、細膠原纖維網層和含梭形細胞的膠原纖維層。淺表區處于軟骨的表面區域，對骨關節潤滑功能至關重要[1]。淺表區缺損后，其表面形貌和摩擦系數會發生變化，生理載荷下就可能會加速軟骨損傷，促進炎癥發生。因此，有必要深入研究淺表區損傷后軟骨的表面形貌及對應的力學性能。
常規的物理方法可以去除軟骨的淺表區，但樣品制備過程中可能將軟骨損傷。學者們嘗試采用酶解法去除軟骨淺表區。Jurvelin等[8]發現淺表區不能被硫酸軟骨素酶ABC消除或完全消化。Stanescu[9]研究結果表明，淺表區對透明質酸酶和硫酸軟骨素酶ABC具有抗性，但可以被堿性蛋白酶消化。Kumar等[1]對比堿性蛋白酶、透明質酸酶和硫酸軟骨素酶ABC對軟骨淺表區的溶解效果，發現堿性蛋白酶的溶解效果最佳。基于此，本文采用糜蛋白酶（一種堿性蛋白酶）和電摩擦筆分別對軟骨表面進行處理，獲得軟骨淺表區不同損傷程度的試樣開展研究。
壓縮載荷是軟骨承受的一種主要生理載荷。Neu等[10]發現軟骨在承受壓縮載荷時，淺表區會產生平行于其表面的張力，即膠原纖維被拉伸。又由于淺表區的膠原纖維呈網狀結構[7]，纖維具有較大的剛度，并平行于軟骨表面[11-13]，因此淺表區能夠承受較高的拉伸應力[14-18]。Kempson[15]研究也發現淺表區是承受拉伸應力的關鍵區域。軟骨拉伸模量在與主要膠原纖維取向平行的方向上最大[19-21]，并且拉伸模量隨深度而減小。淺表區剛度近似為深層區剛度的5倍[22-25]。由于淺表區可直接影響軟骨表面拉伸力學性能，故本文將詳細探究軟骨淺表區不同程度損傷與其拉伸性能的關系。
本文以新鮮的豬股骨髁關節軟骨為實驗對象，通過糜蛋白酶酶解方法和電摩擦筆物理方法制備淺表區不同損傷程度的軟骨試樣，采用激光光譜共聚焦顯微鏡（KC-X1000，南京凱視邁科技有限公司，中國）和環境場掃描電子顯微鏡（Quanta FEG 250，FEI Co., 美國）表征軟骨的表面形貌，通過開展拉伸實驗測試其力學性能，以期對軟骨損傷預防及缺損修復奠定基礎。
1 材料和方法
1.1 實驗材料
實驗樣本制備流程如圖1所示。6只新鮮豬股骨由天津當地屠宰場提供。首先，使用帶鋸機（JBS-200A，上海寧乾實業有限公司，中國）從豬膝關節股骨髁處取出30 mm × 15 mm的矩形骨軟骨樣本；然后，去除軟骨下骨，得到完整全層軟骨樣本；使用醫用手術刀，制作尺寸為20 mm × 4 mm的軟骨試樣用于拉伸實驗；制作尺寸為5 mm × 5 mm的軟骨試樣用于形貌和結構表征。制樣過程中，應確保軟骨表面無劃痕，實驗前試樣均放置在磷酸鹽緩沖液中浸泡。
圖1
樣本制備流程圖
Figure1.
Diagram of sample preparation process
根據處理方式的不同，將軟骨分成以下5組：
（1）對照組：正常軟骨；
（2）糜蛋白酶浸泡組：將0.1 mg/mL的糜蛋白酶（chymotrypsin）（GlpBio Technology Inc.，美國）溶液倒入試管中，然后將用改性丙烯酸酯封住側面以及底面的軟骨樣本浸泡在糜蛋白酶溶液中12 h；12 h后將軟骨取出并用去離子水沖洗3 min；
（3）糜蛋白酶擦拭組：將裹有紗布的棉簽蘸上0.1 mg/mL的糜蛋白酶溶液，并對軟骨表面進行反復擦拭2 h，然后用去離子水在軟骨表面沖洗3 min；
（4）電摩擦筆去除10%組：制備表面光滑且平整的圓柱形蠟臺，使用α－氰基丙烯酸乙酯將蠟臺與軟骨粘連，將帶有軟骨的蠟臺放置在實驗臺上，先用電摩擦筆打磨軟骨表面，然后再用2 000目的細砂紙打磨，直至去除全層軟骨的10%；
（5）電摩擦筆去除20%組：制備表面光滑且平整的圓柱形蠟臺，使用α－氰基丙烯酸乙酯將蠟臺與軟骨粘連，將帶有軟骨的蠟臺放置在實驗臺上，先用電摩擦筆打磨軟骨表面，然后再用2 000目的細砂紙打磨，直至去除全層軟骨的20%。
1.2 實驗設備和方法
采用激光光譜共聚焦顯微鏡（KC-X1000，南京凱視邁科技有限公司，中國）表征軟骨的宏觀形貌和粗糙度。具體操作如下：將軟骨中心放在置樣臺上且坐標為（0，0，0），觀察的區域為1 000 μm × 1 000 μm，鏡頭（KC-H020，南京凱視邁科技有限公司，中國）掃描間距為5 μm，采樣頻率為1 000 Hz，掃描速度為2 500 μm/s。
采用環境場掃描電子顯微鏡（Quanta FEG 250，FEI Co., 美國）觀察關節軟骨的表面微觀形貌。具體操作如下：將軟骨樣本先放入無水乙醇中浸泡24 h，然后進行靜置脫水，脫水完成后對軟骨淺表區進行噴金，噴金完成后，鏡下觀察其表面微觀形貌。
采用拉伸試驗機（M-100，凱爾測控試驗系統（天津）有限公司，中國）開展關節軟骨的單軸拉伸實驗。試樣夾持操作如下：將α－氰基丙烯酸乙酯與軟骨兩端粘連，然后與壓敏膠帶一并放入夾具并固定，粘連兩端的距離各為5 mm。實驗流程設置如下：位移加載，加載速度為0.2 mm/s，加載至14 mm，誤差閾值為0.001 mm。
2 實驗結果
2.1 軟骨表面形貌的表征
激光光譜共聚焦顯微鏡（KC-X1000，南京凱視邁科技有限公司，中國）下軟骨表面形貌如圖2所示。正常關節軟骨的表面高度差為20 μm。糜蛋白酶浸泡和擦拭后，軟骨表面的高度差分別為75 μm和90 μm，與正常軟骨相比，其高度差明顯增加。電摩擦筆去除10%、20%后，軟骨表面高度差繼續增大，分別為140 μm和175 μm。
圖2
激光光譜共聚焦顯微鏡下的軟骨表面形貌
Figure2.
The surface morphology of cartilage under laser confocal microscopy
基于激光光譜共聚焦顯微鏡（KC-X1000，南京凱視邁科技有限公司，中國）下的軟骨表面形貌圖，按照如式(1)、式(2)所示計算，獲得了不同軟骨組表面算術平均高度和表面最大高度，結果如表1所示。
表1
不同處理方法下的膝關節軟骨表面的平面粗糙度和最大高度
Table1.
Plane roughness and maximum height of the cartilage surface of the knee under different treatments
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式中，Sa是軟骨表面算數平均高度，l是測量長度，y(x)是表面高度函數。
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式中，Sz是軟骨表面的最大高度，Sp是最大波峰高度，Sv是最大波谷深度。
由表1可知，電摩擦筆去除20%組，表面算術平均高度和表面最大高度值最大，分別為30.753 μm和187.344 μm；對照組，表面算術平均高度和表面最大高度值最小，僅為2.373 μm和23.067 μm，遠小于被處理后的結果。電摩擦筆去除10%組、糜蛋白酶擦拭組、糜蛋白酶浸泡組表面算術平均高度和表面最大高度分別為：27.35 μm和169.386 μm、16.718 μm和103.073 μm、13.395 μm和86.343 μm。即，當軟骨表面淺表區產生不同程度的損傷后，會使軟骨表面算術平均高度和最大高度增加。
2.2 軟骨表面微觀結構的分析
軟骨表面的微觀結構如圖3所示。可以發現，正常軟骨淺表區中的黏液層將軟骨表面封住，因此無法觀測到黏液層以下結構。當使用糜蛋白酶酶解軟骨表面后，黏液層被成功擦除，黏液層以下的膠原纖維網狀結構清晰可見，這與陳崇偉等[7]對軟骨淺表區的組成描述一致。
圖3
軟骨表面的微觀結構
Figure3.
The microstructure of the surface of cartilage
2.3 力學測試
分別對不同軟骨組試樣開展拉伸實驗，結果如圖4和圖5所示。由圖4可以看出，對照組，正常軟骨的單軸拉伸性能表現為非線性粘彈性特征，其斷裂應變為48.3%、斷裂強度為5.85 MPa，這與Mow等[26]研究結果一致。電摩擦去除10%軟骨組的斷裂應變為34.78%，為對照組的0.72倍，斷裂強度為6.14 MPa，是對照組的1.05倍；電摩擦去除20%軟骨組斷裂應變繼續減小，為28.98%，是對照組的0.6倍，斷裂強度為6.34 MPa，是對照組的1.08倍。
圖4
對照組、電摩擦筆去除10%組與20%組應力-應變曲線
Figure4.
Stress-strain curves of contrast group, removal 10% and 20% groups with electric friction pen
圖5
對照組、糜蛋白酶浸泡組與擦拭組應力-應變曲線
Figure5.
Stress-strain curves of contrast group, chymotrypsin immersion group and chymotrypsin wiping group
如圖5所示，經糜蛋白酶處理后，與對照組相比，軟骨的斷裂應變減小，但斷裂強度增大。對照組，斷裂應變為48.3%，斷裂強度為5.85 MPa；糜蛋白酶擦拭組，軟骨表面的斷裂應變為38.15%，是對照組的0.79倍，斷裂強度為6.02 MPa，是對照組的1.03倍；糜蛋白酶浸泡組，斷裂應變與強度分別為47.5%、5.86 MPa。因此可知，軟骨淺表區黏液層經糜蛋白酶酶解后，其拉伸性能改變。
軟骨的彈性模量是衡量其力學性能的一個重要指標，可以通過計算應力—應變曲線中直線段的斜率得到[27]。本文依據不同組軟骨的應力—應變曲線計算其彈性模量，結果如圖6所示。通過圖6可知，彈性模量最大為電摩擦筆去除20%組的軟骨（0.3 MPa），最小為對照組（0.06 MPa）。糜蛋白酶擦拭組的軟骨彈性模量（0.19 MPa）介于電摩擦筆去除10%組（0.25 MPa）與糜蛋白酶浸泡組（0.1 MPa）的彈性模量之間，高于對照組。結果說明，淺表區的損傷增大了軟骨彈性模量。
圖6
不同軟骨組彈性模量
Figure6.
Elastic modulus of each group
3 討論
關節軟骨的淺表區對于軟骨維持其完整性和功能具有重要的作用[8]。淺表區損傷是引發骨關節炎的重要原因之一[4-5]。因此本文旨在研究淺表區不同程度損傷對軟骨表面形貌及力學行為的影響。為了研究淺表區的結構，Kumar等[1]采用堿性蛋白酶酶解關節軟骨淺表區中的黏液層，從而暴露出下方的纖維狀結構。本課題中為了獲得淺表區不同損傷程度的軟骨樣本，采用糜蛋白酶酶解軟骨表面，通過表面形貌表征發現，糜蛋白酶對軟骨淺表區黏液層具有較好的溶解效果。對比糜蛋白酶浸泡和糜蛋白酶擦拭兩種表面處理方法，發現糜蛋白酶擦拭后的軟骨表面算術平均高度大于糜蛋白酶浸泡后的軟骨表面算術平均高度，說明糜蛋白酶浸泡后的軟骨，如果未經擦拭則已經消化的黏液層仍殘留在軟骨淺表區。通過觀察微觀結構發現，采用糜蛋白酶擦拭的方法能夠去除表面的黏液層，露出內部的膠原纖維網絡結構如圖3所示。
關節軟骨沿厚度方向從表面到底部分為四層，最上面的淺表區約占軟骨厚度的10%～20%。基于此，本研究使用電摩擦筆分別去除軟骨厚度的10%和20%，測量了去除后軟骨表面的粗糙度。結果發現，去除軟骨厚度10%的樣本的表面算術平均高度小于去除20%的樣本表面算術平均高度。使用電摩擦筆方法去除全層軟骨的10%后，淺表區未被完全去除，膠原纖維呈現與關節面近似平行分布；使用電摩擦筆方法去除全層軟骨的20%后，軟骨淺表區被完全去除，而且也可能去除了小部分的中層區，即暴露出中層區。曹紅等[28]指出關節軟骨的中層區，膠原纖維間隙增大且不規則，與關節面之間的成角增大。相較于淺表區的粗糙度而言，中層區的粗糙度更大，這與本文發現一致，即去除20%的軟骨表面算術平均高度大于去除10%的軟骨。
關節軟骨的單軸拉伸性能是評價關節軟骨力學生物學性能的重要指標[29]。本研究不同軟骨組應力—應變曲線的結果表明，在軟骨淺表區損傷后，軟骨的斷裂應變減小、斷裂強度增大，這主要與軟骨的結構有關。關節軟骨的結構骨架由II型膠原纖維網絡組成，其中包裹著多種蛋白多糖和其他大分子[30]。膠原纖維網絡結構使關節軟骨具有一定的強度和剛度，主要承擔關節軟骨承受的拉伸載荷，尤其是淺表區的膠原纖維結構具有很好的抗拉伸性能。當使用糜蛋白酶酶解軟骨表面時，會破壞淺表區的黏液層。黏液層存在大量的水分，黏液層被破壞會導致軟骨淺表區水分流失，膠原纖維失水導致韌性下降；因此，糜蛋白酶酶解軟骨后其斷裂應變減小，彈性模量和斷裂強度略微增大，如圖4～圖6所示。當淺表區被部分或完全去除后，即與關節面近似平行的膠原纖維結構被破壞，進而使軟骨的抗拉伸性能大大降低，即表現為軟骨的斷裂應變降低如圖4所示。沿著軟骨厚度方向，中層區的纖維與表面呈一定角度交錯分布，深層區的膠原纖維基本垂直于表面分布，且膠原纖維的直徑更粗，即中、深層區的膠原纖維具有更高的強度和剛度。所以，當從軟骨表面去除其厚度的20%后，會使軟骨的斷裂強度和彈性模量增大，如圖4～圖6所示。
以上結果表明，當軟骨淺表區出現損傷后，會使軟骨表面的潤滑性降低，增大軟骨表面的粗糙度，進而加速軟骨摩擦磨損和炎癥產生；另外，淺表區的破壞會降低軟骨的抗拉伸性能，無法緩解作用于軟骨上的載荷引起的損傷，進而加速全層軟骨的損傷。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：高麗蘭、王雅博、劉婕在實驗設計、數據分析和論文寫作中有重要貢獻；數據收集主要由王雅博完成；張春秋、高麗蘭、譚沿松、劉婕、陳瑞琦在數據分析和論文的修改中有重要貢獻。
